Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Cincias Bsicas da Sade

Laboratrio de Virologia

Polymerase
Chain
Reaction
Equipe de Virologia UFRGS & IPVDF
www.ufrgs.br/labvir

PCR
Desenvolvida em meados dos anos 80
Revolucionou a Biologia Molecular
Sntese enzimtica de cpias de DNA a
partir de uma seqncia alvo
Reao baseada na replicao do DNA

PCR
Importncia no diagnstico virolgico
Requer um mnimo de material gnico
para sua realizao
Pode aliar alta sensibilidade com alta
especificidade
Resultado em poucas horas

PCR
Replicao do DNA in vivo
Protenas SSP

ou DNA girase

PCR
Sntese de DNA in vitro
Reagentes
DNA molde

Primers

Taq polimerase

DNTPs

Tampo da enzima

H2O

MgCl2

Outros: DMSO, glicerol

PCR - Amplificao
Temperatura

Fonte: wps.prenhall.com

PCR - Amplificao

PCR - Amplificao

PCR - Amplificao

PCR
Ciclos consistindo de 3 etapas:
Desnaturao (15seg-1min a 94-95C)

Anelamento (15seg-1min a 50-55C*)

Extenso (15seg-3min** a 72C)

*Temperatura determinada pela Tm dos

primers
**Tempo determinado
produto

pelo

tamanho

do

PCR
*O que Tm? Melting temperature

PCR
A caracterstica da sequncia alvo tambm
vai determinar a Tm
P. ex.: Herpesvrus bovino 1 ou 5 apresentam
um contedo de GC em torno de 72%
Herpesvrus ovino tipo 2: 52% de GC
SV 40 (poliomavrus): 40% GC

PCR
Taq polimerase: enzima que sintetiza DNA
Oriunda do Thermus aquaticus

Temperatura tima: 72oC

Processividade em torno de 1000 pb/min
Produto de 500 pb: 30 seg de extenso
Produto de 1500 pb: 1 min e 30 seg

PCR

Fonte: Dieffenbach & Dveksler, 1995

PCR
Primers = oligonucleotdeos
Pequenas sequencias de nucleotdeos
desenhados para serem complementares
a sequncia alvo

O tamanho pode variar entre 15-30pb

Normalmente apresentam 50% de GC

PCR
Outros reagentes:
MgCl2: cofator da enzima

PCR
Outros reagentes:
DNTPs: deoxinucleotideos trifosfato
dATP (adenina), dTTP (timina), dCTP (citosina) e
dGTP (guanina)

gua (diluente)

PCR
Outros reagentes:
Tampo: oferece as condies bsicas
(50mM KCl; 10 mM Tris-HCl) para que a
reao ocorra
Glicerol; DMSO: diminuem a temperatura de
fuso e separao das fitas, aumentando a
especificidade de anelamento dos primers

DNA molde: extrao de DNA

Extrao de cidos nuclicos

Extrao de DNA total
A partir de tecido remetido ao laboratrio
Etapas bsicas no processo:
Lise celular
Extrao dos cidos nuclicos
Precipitao dos cidos nuclicos

Extrao de cidos nuclicos

Composio qumica de uma clula procaritica

RNA
20%

Monmeros (aa)
3%

ons inorgnicos
1%

DNA
3%
Protena
56%

Lipopolissacardeo
3%
Lipdeo
9%

Polissacardeo
5%
Fonte: Madigan, 2004

Extrao de cidos nuclicos

Anlise da extrao de DNA total
1

2 3

4 5

6 7 8

B
1

1: Marcador x Hind III

2: 400nm de DNA bacterifago Lambda
3 - 8: DNA total extrado de gnglios
trigmeos de bovinos

1 e 14: Marcador x Hind III

2 - 13: DNA total extrado de
gnglios trigmeos de bovinos

Temos o DNA, falta a sequncia alvo?

Fotos: Fabrcio Campos

9 10 11 12 13 14

PCR
Sequncia alvo

PCR
Sequncia alvo

PCR
Sequncia alvo vai dar origem ao produto de
PCR
TATGGAGAAGGAAGAGCCCGATACGCTCGCACCACGAGCTTCACGTGACGCTCCGGG
GACGCCAAAAGTGCCCGCGATGCCCGGTGTGACCCCGGAGCCATCAGGAAACGCCTC
GGAGCCCGCCGACCCGGCGGAGCTCCGGGCGGACTTGCGGGGTCTAAAAGGCTCCA
GCGACGATCCTAATTTCTACGTGTGCCCCCCTCCCACCGGTGCGACCGTGGTGCGGCT
CGAGGAGCCGCGCCCGTGCCCGGAGTTGCCCAAGGGGCTCAACTTCACCGAGGGCAT
CGCCGTAACTTTCAAGGAGAACCTCGCGCCGTACAAGTTTAAGGCCACTATGTACTACAA
GGCCGTGACTGTCGCTAGCGTGTGGTCCGGGTACTCGTATAACCAGTTTATGAATATCTT
TGAGGACCGTGCCCCTATACCGTTCGAGGAAATCGTCGACCGGATACACGGCCGGGGT
ATGTGTTTGTCCACGGCAAAGTACGTCAGGAACAACCTTGAGACCACCGCATTCCATAAT
GATGCCGACGAACATGAGATGAAGCTGGTGCCCGCCGAGTCCGCCCCTGGGTTGCATC
GCGGATGGCACACCACGCGGCTAAAAA

Bovine herpesvirus type 2 glycoprotein B gene

BoHV-2F: TATGGAGAAGGAAGAGCCCG
BoHV-2R: TTTTTAGCCGCGTGGTGTGC

Produto da PCR:
608 pb

PCR
Fatores que podem interferir na amplificao

Reagentes
DNA molde

Primers

Taq polimerase

DNTPs

Tampo da enzima

H2O

MgCl2

Outros: DMSO, glicerol

PCR
Excesso MgCl2

PCR
Excesso DNA

PCR
Excesso primers

PCR
Curva DMSO

10%

12%

14%

Fase exponencial da PCR

Acmulo de seqncias-alvo durante a PCR em funo do n de
ciclos:
1012

Fonte: Dieffenbach & Dveksler, 1995

PCR
Inibidores
Excesso de DNA
Fenol, clorofrmio
Etanol, isopropanol
Protenas

H20 (ons,
pesados)

metais

Manipulador

Taq, primers, DNTPs

Falta de MgCl2

PCR
Pode sofrer alteraes em relao ao tipo
de tecido, condies da reao,
experincia do manipulador
Exige a padronizao do teste (in house)
Ocorrncia de contaminaes que levam
a resultados falsos positivos e falsos
negativos

Questo 1
Como podemos evitar a ocorrncia de
resultados falso-positivos?

Fontes de contaminao
Combatendo
contaminao

as

fontes

Identificao (fontes pr e ps-PCR)

Reduo
Programa de controle

de

Fontes de contaminao
Pr-PCR
Manipulao de clones de plasmdeos
Extraes repetidas do cido nuclico
molde
Preparao do mix da reao

Fontes de contaminao
Ps-PCR
Execuo da PCR
Gerao de aerossis associada com
a anlise dos produtos
Disseminao da seqncia-alvo

Esquema do processamento e anlise de amostras

Pr-PCR

Ps-PCR

Fonte: Theodore E. Mifflin

Laboratrio de diagnstico
Contaminaes
Anlises repetidas
(template)

da

Baixo limite
(sensibilidade)

deteco

de

seqncia
da

Principal fonte de contaminao

Contaminao ps-PCR pr-PCR

alvo
PCR

Controle da contaminao
Dividir
em
reas
separadas
manipulao do DNA/RNA
Extrao
Preparao do mix (DNTPs, MgCl2, buffer)
Execuo da PCR
Manipulao e anlise dos produtos da PCR

Salas pr e ps-PCR

Fonte: Theodore E. Mifflin

Programa de controle
Esterilizao dos reagentes
Aliquotar os reagentes da PCR
gua
deonizada,
equipamentos,
pipetadores, ponteiras em cada sala
Adio de controles positivo, negativo e
branco (gua)

Programa de controle
Pipetar a amostra com DNA molde como
ltimo passo
Uso de ponteiras com filtro, de luvas
Descontaminao do ambiente (luz UV)

Controle e remoo dos amplicons como

base do controle da contaminao

Questo 2
Como podemos evitar a ocorrncia de
resultados falso-negativos?

Controle interno
Seqncia de DNA, diferente da
seqncia-alvo, adicionada a cada
amostra para ser co-amplificada
Detecta falhas na amplificao devido a
presena de inibidores
Seqncia baseada na seqncia do
produto amplificado

Controle interno
Utiliza os mesmos oligonucleotdeos
Presente em todas as reaes

Variaes da tcnica de PCR

Variaes da PCR
RT-PCR

PCR
RNA

AAAAA

DNA
DNA fs
ou cDNA

RT

PCR
PCR

Variaes da tcnica de PCR

Variaes da PCR
PCR
DNA

Nested-PCR
DNA fd
PCR
1 par de primers

PCR
DNA fd

2o

Multiplex-PCR
DNA fd

PCR

PCR
par de primers
Possveis mltiplos
pares de primers

PCR

Nested PCR
570 pb
Produto da 1 PCR

BoHV-1

161 pb

BoHV-5

236 pb

Semi-Nested PCR
608 pb
Produto da 1 PCR

BoHV-2

512 pb

Real time PCR

Deteco da amplificao associada a
cada ciclo durante a PCR
Quantificao do DNA ou RNA viral
(cDNA)
Ciclos ultra-rpidos (30 min a 2 horas)
Nenhuma anlise no final da reao de
PCR

Real time PCR

Fonte: www.i-med.ac.at/.../genotyping_unit/index.html

Referncias

THEODORE E. MIFFLIN. Setting up a PCR laboratory. Department of Pathology,

University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908.

VERLENGIA, R.; CRESPO HIRATA, R.D., HIRATA, M.H. Biologia Molecular Preveno e controle da contaminao nas reaes de amplificao de cidos
nuclicos. NewsLab 43; p.69-80; 2000.

ESTEVES, P.A.; SILVA, A.D.; SPILKI, F.R.; PINTO, L.S.; DELAGOSTIN, O.A.;
FRANCO, A.C.; RIJSEWIJK, F.A.M.; ROEHE, P.M. Differentiation between bovine
herpesvirus types 1.1; 1.2 and 5 (BoHV) by polymerase chain reaction followed by
restriction enzyme analysis (PCR REA) of a carboxy-terminal region of glycoprotein C
(gC) gene.In press.

VAN ENGELENBURG, F.A.C.; MAES, R.K.; VAN OIRSCHOT, J.T.; RIJSEWIJK,

F.A.M. Development of a Rapid and Sensitive Polymerase Chain Reaction Assay for
Detection of Bovine Herpesvirus Type 1 in Bovine Semen. Journal of Clinical
Microbiology. Vol. 31, No. 12 - p. 3129-3135. 1993.

Grato pela ateno!

Contato:
camposvet@gmail.com