PRACTICA #6: DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI-BRUCELLA

1.- explique el fundamento de esta tcnica?

La prueba del rosa de bengala o prueba del antgeno tamponada de brucella es
una prueba rpida de aglutinacin para la deteccin de anti-brucella en suero de
animales y humanos. la suspensin bacteriana es reactivo tanto con anticuerpos
IgG como IgM, siendo los primeros detectados mas precozmenten ( infecciones
pre-clnicas) y por periodos mas largos de tiempo (fase crnica) que con el
procedimiento convencional de tubo.
2.- qu otras pruebas hay para el diagnstico de brucelosis?
a) Aglutinacin lenta en tubo de Wright (SAT): es la ms antigua (1897) y la ms
utilizada an para el diagnstico de brucelosis animal y humana. Bases
metodolgicas: se realizan diluciones crecientes del suero a investigar que se
enfrentan con cantidades constantes de antgeno observndose la presencia o no
de aglutinacin luego de un perodo de incubacin. De esa forma se determina el
ttulo como la mxima dilucin aglutinante. Antgeno: suspensin de B. abortus
1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: IgM, IgG1 e IgG2. Ttulo significativo: no existe
consenso en cuanto al ttulo que indica una infeccin activa, por lo que debe
establecerse regionalmente.
b) Prueba de aglutinacin con y sin 2-mercaptuetanol (2-ME): es una variante de
la anterior que emplea el tratamiento previo con 2-ME como agente reductor que
inactiva los anticuerpos de clase IgM. Bases metodolgicas: se realizan
simultneamente las pruebas de aglutinacin en tubo con y sin tratamiento del
suero con 2-ME. La diferencia de ttulo obtenida entre ambas pruebas
corresponde a los anticuerpos IgM. Antgeno: suspensin de B. abortus 1119-3 al
4,5%. Anticuerpos: IgG e IgM. Ttulo significativo: mayor de 1:20.
c) Reaccin de Huddleson: es una reaccin de aglutinacin rpida en placa. Bases
metodolgicas: se enfrentan cantidades decrecientes del suero a investigar con
cantidades constantes de antgeno y se observa la presencia o no de aglutinacin.
Existe una escala de ttulos, establecida por convencin, que permite la expresin
de resultados. Antgeno: suspensin de B. abortus al 3-10% de grmenes en fenol,
con verde brillante y cristal violeta. Anticuerpos: IgM, IgG1, IgG2 e IgA. Ttulo
significativo: mayor de 1:40. En ocasiones se observa el fenmeno de prozona,
donde puede estar ausente la aglutinacin en los ttulos ms altos a causa de un

exceso de anticuerpos (38). Este hecho debe tenerse en cuenta para evitar falsos
resultados negativos por esa causa.
d) Prueba de Rosa de Bengala: es una prueba rpida en placa utilizada como
tamiz. Bases metodolgicas: se pone en contacto una alcuota del suero (30L)
con 30L de antgeno y se observa la presencia de aglutinaciones. Antgeno:
suspensiones de B. abortus al 8,5%, ajustadas a pH cido, con el agregado del
colorante Rosa de Bengala. Anticuerpos: IgM e IgG1. Se informa como positiva o
negativa.
e) Antgeno Tamponado en Placa (BPA): es otra de las pruebas tamices que se
realiza en placa. Bases metodolgicas: se ponen en contacto 80 L de suero con
30 L de antgeno y se observa la presencia de aglutinacin. Antgeno: suspensin
de B. abortus al 11% con cristal violeta y verde brillante. Anticuerpos: IgM e IgG1.
Se informa como positiva o negativa segn el resultado de la aglutinacin.
f) Prueba de Coombs: es una prueba de aglutinacin en tubo que permite detectar
tanto anticuerpos completos como incompletos. Bases metodolgicas: se realizan
diluciones seriadas del suero a investigar, que se incuban con una suspensin
antignica de B. abortus para que se produzca la aglutinacin mediada por los
anticuerpos completos. Las suspensiones correspondientes a las diluciones
mayores se lavan adecuadamente y se agrega suero antiespecie (Coombs) para
detectar de esta forma la aglutinacin mediada por los anticuerpos incompletos.
Antgeno: suspensin de B. abortus 1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: aglutinantes y no
aglutinantes de la clase IgG. Ttulo significativo: el ttulo obtenido es, como mnimo
el de la aglutinacin de la primera etapa y frecuentemente mucho ms elevado.
Este incremento es tanto mayor cuanto mayor es la concentracin de anticuerpos
no aglutinantes o incompletos.
g) Fijacin de complemento: es una prueba altamente especfica y es la prueba
de referencia internacional. Bases metodolgicas: en la primera etapa de la
reaccin se incuban diluciones del suero inactivado con el antgeno y el
complemento. En la segunda etapa se agrega el sistema hemoltico y se compara
la hemlisis con los estndares correspondientes a 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis.
Antgeno: puede utilizarse una dilucin 1:200 del antgeno empleado en la
reaccin de Huddleson, o un antgeno soluble denominado HS que se prepara a
partir de una suspensin bacteriana tratada con solucin salina caliente.
Anticuerpos: IgG1. Ttulo significativo: mayor de 1:20.
h) Inmunofluorescencia indirecta: es una prueba de interaccin primaria. Bases
metodolgicas: se incuban diluciones crecientes del suero a investigar sobre una
impronta de Brucella. Se agrega luego el anticuerpo anti-especie marcado con una
sustancia fluorescente y se observa en un microscopio de fluorescencia,

determinndose el ttulo. Antgeno: suspensin de bacterias fijadas a un

portaobjeto. Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes. Ttulo significativo: mayor
de 1:80 (39).
i) ELISA: es una tcnica altamente sensible, especfica y verstil (40), emplea
muy pequea cantidad de suero (41) y da muy buenos resultados aun en
presencia de hemlisis. * ELISA indirecto (ELISA-I): Bases metodolgicas: el
antgeno se fija a placas de poliestireno, luego se incuba con el suero a investigar,
posteriormente con un anti-especie conjugado con una enzima, se agrega el
sustrato correspondiente y se mide el color desarrollado a la longitud de onda
determinada. Pueden usarse conjugados que reconozcan las distintas clases de
inmunoglobulinas. Antgeno: los antgenos pueden ser particulados o solubles,
LPS u otras protenas bacterianas. Se ha obtenido un antgeno libre de LPS
(antgeno CP), que es altamente eficaz en detectar la respuesta a IgG durante una
infeccin activa evitando al mismo tiempo las reacciones cruzadas debidas al LPS
(42). Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes.
La interpretacin de esta prueba debe ser an convalidada. * ELISA competitivo
(ELISA-C): Bases metodolgicas: se emplea un anticuerpo monoclonal que
reconoce el epitope O del LPS-S, que compite con los anticuerpos del suero por la
unin al antgeno fijado en la placa. El revelado se efecta con un anticuerpo antiratn conjugado con una enzima. Antgeno: LPS-S. Anticuerpos: aglutinantes y no
aglutinantes. Se consideran positivos aquellos sueros con un porcentaje de
inhibicin mayor del 28% (43).
j) Polarizacin de fluorescencia (FPA): esta tcnica puede realizarse en sangre
entera y leche. Bases metodolgicas: los anticuerpos al unirse al antgeno
cambian la velocidad de rotacin de la molcula. Si se hace incidir un haz de luz
fluorescente polarizada, el ngulo de difraccin cambia en funcin del anticuerpo
unido. Este cambio es medido por un detector que lo traduce en una seal (44).
Antgeno empleado: PSO de B. abortus conjugado con isotiocianato de
fluorescena (45)(46). La interpretacin de esta prueba es similar al ELISA-I.
k) Prueba de inmunodifusin en agar (IDAG): es una tcnica de doble difusin en
geles. Bases metodolgicas: se efecta la reaccin de doble difusin del suero a
investigar frente a un suero control observando las reacciones de identidad.
Antgeno: antgeno soluble HS. Anticuerpos detectados: IgG e IgM.
Los mtodos sugeridos por la OIE (Organizacin Mundial de la Salud Animal)
para el estudio de brucelosis en las distintas especies animales son: - en bovinos:
BPA, Rosa de Bengala, fijacin de complemento, ELISA-I, ELISA-C, FPA. - en
caprinos: Rosa de Bengala, fijacin de complemento. - en ovinos: fijacin de
complemento, ELISA-I, IDAG. - en porcinos: BPA, fijacin de complemento,

ELISA-C, ELISA-I, FPA. - en caninos: Huddleson, aglutinacin con y sin 2-ME,

aglutinacin lenta en tubo, ELISA-I, IDAG. Para el diagnstico de brucelosis
humana se emplean habitualmente como pruebas tamices BPA, Rosa de Bengala
o Huddleson y como pruebas confirmatorias aglutinacin lenta en tubo con y sin 2ME, Coombs y fijacin de complemento

3.describe
la
respuesta
a
los
patgenos
Inmunidad natural: Fagocitosis por neutrfilos y macrfagos.

intracelulares:

Algunas resisten degradacin por macrfagos.

Su eliminacin depende de mecanismos de inmunidad celular dependiente de
clulas T
Detectadas por clulas T que reconocen antgenos presentados en MHC II a
clulas T CD4 que activan fagocitos y en MHC I y CD1 a CTL CD8+ y clulas T
dobles negativas gamma/delta. Cmo gamma/delta.

Introduccin:
En el serodiagnstico de la brucelosis humana, la prueba de Rosa Bengala tiene
un valor importante en el campo epidemiolgico al permitir agrupar los casos con
alto riesgo de infeccin del resto de la poblacin estudiada. En el campo
veterinario es frecuente su utilizacin como prueba diagnstica en cabaas de
vacuno y porcino en las que la incidencia de brucelosis es relativamente alta,

aplicndose slo como prueba de control rpido en reas de baja incidencia. En el

diagnstico clnico, los resultados de la determinacin de los anticuerpos antiBrucela deben ser considerados siempre en relacin a los hallazgos clnicos y
otras pruebas de laboratorio.

Caractersticas funcionales
La unidad mnima detectable (sensibilidad analtica) es de aproximadamente 25
UI/mL, frente al 2 Patrn Internacional de suero anti-Brucella abortus
(NIBS/OMS)6 . La especificidad diagnstica es del 100%. Efecto prozona: No se
observa hasta concentraciones de 1000 UI/mL. Los resultados obtenidos con este
reactivo no muestran diferencias significativas al ser comparados con un reactivo
de referencia. Los datos analticos del estudio comparativo estn disponibles bajo
solicitud. Hemoglobina (2,5 mg/dL) interfiere con el ensayo. Otras sustancias
pueden interferir7 .
Fundamento:
La prueba de Rosa Bengala o prueba del antgeno tamponado de Brucela, es una
tcnica rpida de aglutinacin en porta para la deteccin de anticuerpos antiBrucela en sueros animales y humanos. La suspensin bacteriana es reactiva
tanto con anticuerpos IgG como IgM, siendo los primeros detectados ms
precozmente (infecciones sub-clnicas) y por un perodo ms largo de tiempo (fase
crnica) que con el procedimiento convencional de tubo. La determinacin se
efecta ensayando la suspensin tamponada (pH 3,6) de Brucella coloreada con
Rosa Bengala frente a los sueros problema. La presencia o ausencia de
aglutinacin visible es indicativa de la presencia o ausencia de anticuerpos en las
muestras ensayadas.
Mtodo cualitativo
1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad
del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 L de la muestra a ensayar y una gota de cada uno de los
controles Positivo y Negativo, sobre crculos distintos de un porta.
3. Homogeneizar suavemente el reactivo de R. de Bengala antes de usar.
Depositar una gota (50 L) junto a cada una de las gotas.
4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del crculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.

5. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80 100 r.p.m. durante 4 minutos.

El exceso de tiempo de agitacin puede originar la aparicin de falsos positivos.

Resultados:
Se obtuvieron los siguientes resultados:
La lectura se realizo frente a una de luz para facilitar la obcervacion de la reaccion,
el titulo de cada muestra se dertermina tomando en cuenta l numero de la dilucion
esto en caso de que existiera un resulado positivo, sin embargo, se puede
observar un resultado negativo ya que en todos los pocillos se observa un botn al
centro.
Paciente: Mayra Ramrez Duran
Sexo y edad: mujer de 22 aos

Interpretacin y conclusin:
Para un resultado positivo: formacin de una malla de aglutinacin en el fondo del
pozo con clarificacin del medio.
Para un resultado negativo: permanece la turbidez del medio y en el fondo se
aprecia un acumulo de clulas sedimentadas en forma de un botn.

Se puedo concluir que se cumpli con el objetivo de nuestra prctica ya que se

logr identificar y cuantificar de forma favorable puesto que nos dio un resultado
negativo.
Bibliografa:
1.Young E J. Clinical Infectious Diseases 1995; 21: 283-290.
2. Alton GC. Techniques for Brucellosis Laboratory INRA Paris, 1988.
3. Ariza J. Current Opinion in Infectious Diseases 1996; 9: 126-131.
4. Comit mixto FAO/OMS de expertos en Brucelosis. WLD Health Org Tech Rep
Ser 1958; 148: 1-60.
5. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory test, 4th ed. AACC Press,
1995.