Piretroides Detecção Carne Bovina

RICA PACHECO SILVA
VALIDAO DE MTODO DE EXTRAO E

ANLISE MULTIRRESDUO DE AGROTXICOS
EM CARNE BOVINA POR CROMATOGRAFIA
GASOSA
Dissertao
apresentada
Universidade Federal de Viosa, como

parte das exigncias do Programa de
Ps-Graduao em Agroqumica, para
obteno do ttulo de Magister Scientiae.
VIOSA
MINAS GERAIS BRASIL
2008
RICA PACHECO SILVA
VALIDAO DE MTODO DE EXTRAO E

ANLISE MULTIRRESDUO DE AGROTXICOS
EM CARNE BOVINA POR CROMATOGRAFIA
GASOSA
Dissertao
apresentada
Universidade Federal de Viosa, como

parte das exigncias do Programa de
Ps-Graduao em Agroqumica, para
obteno do ttulo de Magister Scientiae.
Aprovada: 13 de outubro de 2008

_____________________________
_____________________________
Prof. Dr. Antnio Augusto Neves

(Co-orientador)
Prof. Dr. Jos Humberto de Queiroz

(Co-orientador)
_____________________________
Prof. Dr Robson Jos de C. F. Afonso
_____________________________
Profa. Dra. Regina Clia S. Mendona
____________________________________
Profa. Dra. Maria Eliana L. R. de Queiroz

(Orientadora)
Deus,
Aos meus pais Geraldo e Ana,
minha irm Leidiane,
Ao Rodrigo,
Que bom que o seu amor me escolheu, que bom que o seu sorriso deu a
fora, me deu coragem...
Com amor dedico
.
iii
AGRADECIMENTOS
Aos professores, Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz e Antnio

Augusto Neves, pela oportunidade, apoio, ensinamentos transmitidos, pela
fora e orientao.
Ao professor Cludio Lima, pela idia e professor Jos Humberto pela
co-orientao.
Aos professores Robson Afonso e Regina Mendona pela participao
na banca.
Universidade Federal de Viosa, particularmente ao Departamento de
Qumica, que contribuiu para a realizao deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico,
CNPq pela concesso da bolsa de estudos.
A todos os amigos do laboratrio de qumica analtica LAQUA: Aline,
Ana Beatriz, Ana Cludia, Armanda, Deyse, Elenice, Elisa, Flaviane, Igor,
Kamilla, Leila, Maria Antnia, Ricardo Martins e Simone pelo auxlio, amizade e
agradvel convvio. A Gevany pelos conselhos preciosos e pela ateno. Ao
Ricardo, pela ajuda na execuo do trabalho e pela pacincia.
Shisley por toda fora, apoio, incentivo, cuidado, convivncia,
aprendizado de vida, momentos alegres e pela amizade. Bruna e Cludia,
morar com vocs foi maravilhoso, obrigado a todas vocs por viverem comigo
cada momento dessa dissertao. Emanuel pela amizade e convivncia no
laboratrio sempre to agradvel, divertida e confidente. Leandro, Kamilla,
Cssia, Carol, Marina, Thas, pela amizade preciosa. Levo vocs no meu
corao pra sempre.
Marisa pela ajuda com todas as documentaes e dvidas
administrativas, aos vigias da segurana da Vila Gianetti - UFV e do
condomnio Mundial Azul, pela segurana e a todos os amigos que de todas as
formas contriburam para a realizao desse trabalho.
iv
BIOGRAFIA
RICA PACHECO SILVA, filha de Geraldo da Silva e Ana de Ftima

Pacheco Silva, nasceu em So Paulo, So Paulo, em 05 de Novembro de
1983.
Em maro de 2002, iniciou o Curso de Graduao em Qumica, pela
Universidade Federal de Ouro Preto, diplomando-se como bacharel em julho de
2006.
Em outubro de 2006, iniciou o curso de ps-graduao em Agroqumica,
em nvel de mestrado, na Universidade Federal de Viosa, submetendo-se
defesa de dissertao em outubro de 2008.
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS .....................................................................................................................ix
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................... xiii
RESUMO..................................................................................................................................... xiv
ABSTRACT ................................................................................................................................. xvi
1.
INTRODUO ............................................................................................................................... 1
1.1. AGROTXICOS ............................................................................................................................. 1
1.2. RESDUOS DE AGROTXICOS EM ALIMENTOS.................................................................... 3
1.3. O USO DE CARRAPATICIDAS EM REBANHOS BOVINOS .................................................... 4
1.4. PIRETRIDES ................................................................................................................................ 6
1.5. ORGANOCLORADOS ................................................................................................................... 7
1.6. ORGANOFOSFORADOS............................................................................................................... 9
1.7. CARNE BOVINA.......................................................................................................................... 10
1.8. METODOLOGIAS DE EXTRAO DE AGROTXICOS EM ALIMENTOS......................... 11
1.8.1. Extrao Slido-Lquido com Purificao em Baixa Temperatura ................................................ 13
1.8.2. Disperso de Matriz em Fase Slida .............................................................................................. 14
1.9. CROMATOGRAFIA ..................................................................................................................... 15
1.10. EFEITO DE MATRIZ ................................................................................................................... 15
1.11. VALIDAO ................................................................................................................................ 20
1.12. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 22
1.12.1. Objetivos Gerais:............................................................................................................................ 22
1.12.2. Objetivos especficos: .................................................................................................................... 22
2.
MATERIAIS E MTODOS .......................................................................................................... 24
2.1. PREPARO DE SOLUES PADRO......................................................................................... 24
2.2. AMOSTRAS DE CARNE ............................................................................................................. 24
2.3. EXTRAO SLIDO-LQUIDO COM PURIFICAO EM BAIXA TEMPERATURA
ESL-PBT.................................................................................................................................................... 25
2.3.1. Fortificao das amostras de carne................................................................................................. 25
2.3.2. Extrao dos agrotxicos em carne bovina por ESL-PBT Tcnica geral.................................... 25
2.3.3. Otimizao da tcnica extrao slido-lquido com purificao em baixa temperatura
(ESL-PBT) ................................................................................................................................................. 26
2.3.3.1.
Ensaios preliminares........................................................................................................... 27
2.3.4. Planejamento fatorial 23 ................................................................................................................. 27
2.3.5. Efeito do ultra-som na eficincia de extrao dos analitos em carne bovina ................................. 29
2.3.6. Eficincia de adsorventes no clean up dos extratos obtidos na ESL-PBT de amostras de carne
bovina ........................................................................................................................................................ 30
2.4. DISPERSO DE MATRIZ EM FASE SLIDA DMFS............................................................ 31
2.4.1. Fortificao das amostras de carne................................................................................................. 31
2.4.2. Extrao dos agrotxicos em carne bovina por DMFS Tcnica Geral........................................ 31
2.4.3. Avaliao do adsorvente e eluente para a tcnica de extrao DMFS ........................................... 32
2.5. ANLISE CROMATOGRFICA ................................................................................................ 33
2.6. Anlise quantitativa dos agrotxicos em carne bovina................................................................... 34
2.7. VALIDAO DO MTODO ANALTICO................................................................................. 34
2.7.1. Seletividade .................................................................................................................................... 35
2.7.2. Linearidade de resposta do mtodo proposto ................................................................................. 35
2.7.3. Limite de deteco e limite de quantificao do CG-DCE............................................................. 35
2.7.4. Preciso .......................................................................................................................................... 36
vi
2.7.4.1.
Repetitividade..................................................................................................................... 36
2.7.4.2.
Preciso intermediria ........................................................................................................ 36
2.7.5. Exatido.......................................................................................................................................... 36
2.7.5.1.
Ensaio de recuperao ........................................................................................................ 37
2.8. AVALIAO DO EFEITO DE MATRIZ NA PORCENTAGEM DE RECUPERAO DOS
AGROTXICOS ....................................................................................................................................... 37
2.8.1. Superposio de matriz .................................................................................................................. 37
2.8.2. Variao da resposta do detector em funo da saturao do sistema de injeo .......................... 38
2.9. APLICAO DA TCNICA ESL-PBT EM AMOSTRAS DO COMRCIO DE VIOSA-MG 38
3.
RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................................... 40
3.1. ANLISE CROMATOGRFICA ................................................................................................ 40
3.2. CURVAS ANALTICAS E LINEARIDADE DA RESPOSTA DO DETECTOR ....................... 42
3.3. OTIMIZAO DA TCNICA DE EXTRAO SLIDO-LQUIDO COM PURIFICAO
EM BAIXA TEMPERATURA (ESL-PBT). ............................................................................................. 44
3.3.1. Avaliao da massa de carne bovina .............................................................................................. 44
3.3.2. Tempo de contato entre os agrotxicos e as amostras de carne bovina.......................................... 46
3.4. PLANEJAMENTO FATORIAL NA OTIMIZAO DA TCNICA DE ESL-PBT ................... 47
3.5. EFEITO DA AGITAO MECNICA E SONICAO NA EFICINCIA DA EXTRAO
DOS AGROTXICOS EM CARNE BOVINA ........................................................................................ 56
3.6. EFICINCIA DE ADSORVENTES NO CLEAN UP DOS EXTRATOS OBTIDOS NA
ESL-PBT DE AMOSTRAS DE CARNE BOVINA.................................................................................. 58
3.7. MTODO OTIMIZADO DA ESL-PBT E ANLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA DE
QUATRO AGROTXICOS EM CARNE BOVINA................................................................................ 62
3.8. DISPERSO DE MATRIZ EM FASE SLIDA DMFS............................................................ 62
3.8.1. Avaliao do adsorvente e eluente para a tcnica de extrao DMFS ........................................... 62
3.9. VALIDAO DO MTODO ANALTICO................................................................................. 66
3.9.1. Seletividade .................................................................................................................................... 66
3.9.2. Limite de deteco (LD) e limite de quantificao (LQ) ............................................................... 69
3.9.3. Linearidade da metodologia otimizada .......................................................................................... 70
3.9.4. Preciso .......................................................................................................................................... 72
3.9.4.1.
Repetitividade..................................................................................................................... 72
3.9.4.2.
Preciso intermediria ........................................................................................................ 73
3.9.5. Exatido.......................................................................................................................................... 74
3.10. EFEITO DE MATRIZ NO MTODO MULTIRRESDUO ......................................................... 75
3.11. DETERMINAO DOS AGROTXICOS CLORPIRIFS, ENDOSULFAN, CIPERMETRINA
E DELTAMETRINA EM AMOSTRAS COMERCIAIS DE ALCATRA E FGADO BOVINO ............ 88
4.
CONCLUSES.............................................................................................................................. 89
5.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................................... 91
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ESL-PBT
Extrao Slido-Lquido com purificao em baixa temperatura
DMFS
Disperso de Matriz em Fase Slida
LMR
Limite Mximo de Resduo
GARP
Grupo de Anlise de Resduo de Pesticida
AGARP
Associao Grupo de Anlise de Resduo de Pesticida
PARA
Programa de Anlise de Resduo de Agrotxico
PNCR
Programa Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes

em Carne
CCPR
Comit do Codex Alimentarius sobre resduos de pesticidas
JMPR
Joint Meeting on Pesticides Residues
CG
Cromatografia Gasosa
CL
Cromatografia Lquida
EM
Espectrmetro de Massa
DCE
Detector por Captura de Eltrons
ELL
Extrao Lquido-Lquido
EFS
Extrao em Fase Slida
ESL
Extrao Slido-Lquido
CPG
Cromatografia por Permeasso em Gel
DFC
Detector fotoeltrico de chama
ANVISA
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
INMETRO
Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade

Industrial
LD
Limite de Deteco
LQ
Limite de Quantificao
CV
Coeficiente de Variao
C-18
Octadecil
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura
1.1.
Estrutura da (S)--cyano-3-phenoxybenzyl(1R,3R)-3-(2,2dibromovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate
(Deltametrina)
Figura 1.2. - Estrutura da (RS)--cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

(Cipermetrina)
Figura 1.3. - Estruturas moleculares do 1,4,5,6,7,7-hexachloro-8,9,10trinorborn-5-en-2,3-ylenebismethylene)sulfite - -Endosulfan
(A), -Endosulfan (B) e Sulfato de Endosulfan (C)
Figura 1.4. - Estrutura do O-3,5,6-tricloro-O,O-dietil-2-piridilfosforotioato Clorpirifs
Figura 1.5. Injetor de cromatgrafo a gs.
Figura 1.6 - Possveis adsores que ocorrem na superfcie do vidro e l de
vidro do liner em uma injeo com diviso do fluxo (split). A)
Agrotxicos preparados em solvente puro. B) Agrotxicos
preparados em extratos da matriz (branco) (PINHO et al, 2008).
Figura 2.1. Representao da eluio de cartuchos de polietileno contendo
amostras dispersas em uma fase slida.
Figura 3.1. Cromatograma de uma soluo padro de 100,0 g L-1 dos
princpios ativos em acetonitrila, onde tR= 2,6: clorpirifs, tR=
3,3: -endosulfan, tR= 3,8: -endosulfan, tR= 5,0: bifentrina (PI),
tR= 7,3: cipermetrina, tR= 8,8: deltametrina.
Figura 3.2. Curvas analticas dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan,
cipermetrina e deltametrina utilizando como padro interno (PI)
a bifentrina.
Figura 3.3. - Influncia da massa na porcentagem de recuperao de quatro
agrotxicos de amostras de alcatra (a) e fgado (b)
ix
Figura 3.4 - Grfico de Pareto - amostras de alcatra

Figura 3.5 - Grfico de Pareto - amostras de fgado
Figura 3.6. - Efeito da agitao mecnica e diferentes tempos de agitao por
ultra-som na porcentagem de recuperao do clorpirifs,
endosulfan, cipermetrina e deltametrina para amostras de alcatra.
endosulfan, cipermetrina e deltametrina para amostras de fgado.
Figura 3.8. - Influncia dos adsorventes, slica e florisil, na porcentagem de
recuperao do clorpirifs, endosulfan, deltametrina e
cipermetrina de extratos de fgado.
Figura 3.9. - Influncia de diferentes quantidades de carvo ativado, na
porcentagem de recuperao do clorpirifs, endosulfan,
deltametrina e cipermetrina em amostras de fgado.
Figura 3.10. - Espectros de absoro dos extratos no UV-visvel ( = 250 a 780
nm), obtidos a partir de diferentes tcnicas de extrao e seus
adsorventes para extratos de fgado.
Figura 3.11. - Influncia de diferentes solventes na porcentagem de
cipermetrina para a DMFS utilizando florisil em amostras de
alcatra.
cipermetrina para a DMFS utilizando slica.
Figura 3.13. - Influncia de diferentes adsorventes e eluentes na porcentagem
de recuperao do clorpirifs, endosulfan, deltametrina e
cipermetrina para a DMFS e comparao com a ESL-PBT.
Figura 3.14. - (A) Cromatograma do extrato obtido da matriz de alcatra isenta
dos princpios ativos estudados e (B) cromatograma da amostra
fortificada com 50,0 g kg-1 dos princpios ativos estudados,
onde: tR= 2,6: clorpirifs, tR= 3,2: -endosulfan, tR= 3,3: endosulfan, tR= 5,0: bifentrina (PI), tR= 7,3: cipermetrina, tR= 8,8:
deltametrina
Figura 3.15. - (A) Cromatograma do extrato obtido da matriz de fgado isenta
x

deltametrina
Figura 3.16. - Curvas analticas dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan,
cipermetrina e deltametrina obtidos da aplicao da tcnica
ESL-PBT em amostras de alcatra.
ESL-PBT em amostras de fgado.
Figura 3.18 Curvas analticas dos princpios ativos (a) clorpirifs, (b)
endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina em acetonitrila
e em extratos de alcatra bovina.
Figura 3.19 Curvas analticas dos princpios ativos (a) clorpirifs, (b)
endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina em acetonitrila e
em extrato de fgado bovino.
Figura 3.20 Variao relativa das respostas (rea do analito/rea do padro
interno) calculadas para os princpios ativos (a) clorpirifs, (b)
endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada
a curva analtica em solvente (100%) e no extrato de alcatra.
Figura 3.21 Variao relativa das respostas (rea do analito/rea do padro
interno) calculadas para os princpios ativos (a) clorpirifs, (b)
endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a
curva analtica em solvente (100%) e no extrato de fgado.
Figura 3.22 Variao relativa das respostas (rea do analito) calculadas para
os princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan, (c)
cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica
em solvente (100%) e em extratos de alcatra.
Figura 3.23 Variao relativa das respostas (rea do analito) calculadas para
os princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan, (c)
cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica
em
solvente
(100%)
e
em
extratos
de
fgado.
xi
Figura 3.24.a Avaliao da taxa de aumento da resposta do detector para os

agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina, deltametrina e
para o padro interno, bifentrina, em acetonitrila aps
saturao do sistema cromatogrfico com componentes da
matriz de alcatra.
Figura 3.24b Avaliao da taxa de aumento da resposta do detector para os
matriz de fgado.
Figura 3.25.a Avaliao do aumento da resposta do detector para os
agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
e
deltametrina em acetonitrila aps saturar o sistema
cromatogrfico, utlizando a razo rea do padro pela rea
do padro interno para obter a porcentagem utilizando
extratos de alcatra.
Figura 3.25.b Avaliao do aumento da resposta do detector para os
agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
e
cromatogrfico, utilizando a razo rea do padro pela rea
extratos de fgado.
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1. - Propriedades Fsico-qumicas dos piretrides deltametrina e

cipermetrina e os LMR em Carne bovina e fgado
Tabela 2.1. - Planejamento fatorial 23 para as amostras de carne bovina
fortificadas.
Tabela 2.2 - Adsorventes e eluentes avaliados na otimizao da DMFS
Tabela 3.1. - Parmetros das curvas analticas obtidas para os quatro
agrotxicos estudados.
Tabela 3.2. - Porcentagens de recuperao mdia, efeitos de cada fator e
interaes entre os fatores ( estimativa do erro experimental)
na extrao de cada um dos agrotxicos, obtidos nos
experimentos do planejamento fatorial para amostras de alcatra
bovina.
experimentos do planejamento fatorial para amostras de fgado
bovino.
Tabela 3.4. - Equaes das retas e coeficientes de correlao obtidos para os
agrotxicos.
Tabela 3.5 - Porcentagens de recuperao (% R), desvio padro (DP) e
coeficientes de variao (CV) obtidos aps sete extraes de
agrotxicos em amostras de alcatra e fgado.
Tabela 3.6 - Porcentagens de extrao e coeficientes de variao (CV) obtidos
aps anlise em diferentes dias, pelo mesmo analista.
Tabela 3.7 - Avaliao da exatido do mtodo de ESL-PBT, para os ensaios de
recuperao e coeficiente de variao.
xiii
RESUMO
SILVA, rica Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, Outubro de

2008. Validao de mtodo de extrao e anlise multirresduo de
agrotxicos em carne bovina por cromatografia gasosa. Orientadora:
Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz. Co-orientadores: Antnio Augusto
Neves e Jos Humberto de Queiroz.
O objetivo deste trabalho foi otimizar e validar a tcnica extrao slidolquido com purificao em baixa temperatura (ESL-PBT) para anlise de
resduos dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina
em amostras de carne bovina. Na etapa de otimizao, as condies ideais
para extrao dos agrotxicos de interesse de amostras de alcatra e fgado
bovino
fortificados,
foram
determinadas
empregando
planejamento
experimental. Foram avaliados a massa de amostra, solvente extrator, fora

inica, tempo de extrao e de fortificao e forma de agitao. As amostras de
alcatra e fgado bovino e a mistura extratora em fase nica foram agitadas e
deixadas em freezer por aproximadamente 12 horas. A matriz e a fase aquosa
congeladas foram separadas da fase superior ainda lquida. A fase superior foi
filtrada e submetida anlise cromatogrfica utilizando bifentrina como padro
interno. A tcnica otimizada consiste em acrescentar a 3,0000 g de carne
bovina, 1,0 mL de gua, 6,5 mL de acetonitrila, 1,5 mL de acetato de etila, para
amostras de alcatra e 1,0 mL de gua e 8,0 mL de acetonitrila para amostras
de fgado bovino e submeter essa mistura a agitao por ultra-som durante 10
minutos seguida de congelamento. Aps separao das fases pelo
congelamento da fase aquosa o sobrenadante lquido (10 mL) foi removido e
analisado por cromatografia gasosa com detector por captura de eltrons.
Avaliou-se a etapa de clean up para os extratos de fgado bovino, porm, esta
etapa, alm de aumentar o tempo e o custo da anlise, reduziu a porcentagem
de recuperao dos analitos. Com o intuito de comparar a ESL-PBT com outras
xiv
tcnicas, submeteram-se as amostras de alcatra e fgado bovino extrao por

disperso de matriz em fase slida (DMFS). Porm esta metodologia
apresentou recuperaes inferiores s obtidas pela ESL-PBT em amostras de
alcatra. Para amostras de fgado, a tcnica DMFS se mostrou pouco seletiva,
apresentando extratos mais impuros do que os obtidos pela ESL-PBT, devido
maior extrao de componentes da matriz. O mtodo otimizado foi validado
determinando-se a seletividade, linearidade, limites deteco e quantificao
do mtodo, preciso e exatido. Os resultados mostraram que a ESL-PBT
otimizada eficiente para anlise de resduos dos agrotxicos de interesse em
alcatra e fgado bovino com porcentagens de recuperao superior a 70 % e
limites de deteco abaixo dos limites mximos de resduos (LMR)
estabelecidos pelo Codex Alimentarius para estes pesticidas neste tipo de
alimento. Alm disso, a metodologia apresenta um pequeno consumo de
solvente e ausncia de etapas de purificao dos extratos antes da anlise
cromatogrfica. O efeito de matriz mostrou-se presente na quantificao dos
pesticidas por cromatografia gasosa. Para contornar esse efeito curvas de
calibrao foram preparadas em extratos orgnicos, obtidos da extrao de
alcatra e fgado bovino isento dos contaminantes. A tcnica otimizada e
validada foi aplicada em amostras de carne bovina adquiridas no comrcio da
cidade de Viosa-MG, no sendo detectada a presena de resduos de
clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina nas amostras de alcatra e
fgado analisadas.
xv
ABSTRACT
SILVA, rica Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, October, 2008.

Validation of method for extraction and pesticide multiresidue analysis
in beef by gas chromatography. Advisor: Maria Eliana Lopes Ribeiro de
Queiroz. Co-advisors: Antnio Augusto Neves and Jos Humberto de
Queiroz.
The objective of this study was to optimize and validate the liquid-solid
extraction with low-temperature purification (LSE-LTP) method for the analysis
of chlorpyrifos, endosulfan, cypermethrin and deltamethrin pesticides residues
in beef samples. Ideal conditions for the extraction of the pesticides of interest
from the rump and liver cattle samples were determined by the employment of
experimental planning to optimize the process. Sample mass, solvent extractor,
ionic force, extraction time and agitation form were all evaluated. Rump and
liver cattle samples were agitated with one-phase solvent mixtures and placed
in a freezer for approximately 12 hours. The solids matrix and frozen aqueous
phase were separated from the superior liquid phase. This superior phase was
filtered and submitted to chromatography analysis using bifenthrin as an internal
standard. The optimal technique consisted of supplementing 3.0000 g of beef
with 1.0 mL of water, 6.5 mL of acetonitrile, 1.5 mL of ethyl acetate for the rump
samples or 1.0 mL of water and 8.0 mL of acetonitrile for the liver samples, and
submitting this mixture to ultrasound agitation for 10 minutes, followed by
freezing. After separating the phases by freezing the aqueous phase, the
supernatant liquid (10 mL) was removed and analyzed by gas chromatography
with an electron capture detector. The clean up stage was evaluated for the
liver extracts, however, during this stage, not only was the analysis time and
cost increased, the percentage of analyte recovery diminished. With the
intention of comparing the LSE-LTP with other techniques, the rump and liver
samples were submitted to matrix solid phase dispersion (MSPD) extraction.
xvi
However, this methodology presented recoveries inferior to those of the LSELTP in rump samples. For the liver samples, the MSPD technique showed to be
little selective, presenting extracts less pure than those obtained by LSE-LTP,
due to the greater extraction of matrix components. The optimized method was
validated according to selectivity, linearity, detection limits and quantification of
the method, precision and accuracy. The results showed that optimized LSELTP is efficient for the analysis of the pesticide residues of interest in rump and
liver cattle with recovery percentages greater than 70 % and detection limits
below the maximum residue limits (MRL) established by Codex Alimentarius the
for these pesticides in the studied beef samples. This methodology also
presents the small consumption of solvent and absence of purification steps of
extracts before chromatography analysis. The effect of the matrix was found to
be present in the quantification of pesticides by gas chromatography. To
overcome these effects, calibration curves were prepared from organic extracts,
obtained from rump and liver cattle free of contaminants. The optimized and
validated technique was applied in beef samples acquired commercially in the
city of Viosa, Minas Gerais, Brazil. No trace of chlorpyrifos, endosulfan,
cypermethrin or deltamethrin residues were found in either rump or liver
samples.
xvii
Introduo
1. INTRODUO
1.1.
AGROTXICOS
Um grande nmero de substncias tem sido utilizado para eliminar
formas de vida vegetal ou animal, consideradas indesejveis nas culturas

agrcolas, na pecuria, na sade pblica e no combate de vetores de doenas
transmissveis (LARA & BATISTA, 1992). Essas substncias so conhecidas
como agrotxicos.
No Brasil, a Lei n. 7.802/1989, regulamentada por meio de decreto
4.074, de 4 de janeiro de 2002, no artigo 2, inciso I, define agrotxico como
produtos e componentes de processos fsicos, qumicos e biolgicos
destinados ao uso nos setores de produo, armazenamento e beneficiamento
de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas nativas ou
implantadas e de outros ecossistemas, ambientes urbanos e industriais, cuja
finalidade seja alterar a composio da flora e fauna, a fim de preserv-la da
ao danosa de seres vivos considerados nocivos. Inclui tambm substncias
e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e
inibidores de crescimento. Essa definio exclui fertilizantes e qumicos
administrados
animais
para
estimular
crescimento
ou
modificar
comportamento reprodutivo (BRASIL, 1989).

Quanto s pragas que controlam, os agrotxicos so classificados em
inseticidas, fungicidas, herbicidas, desfolhantes, fumigantes, rodenticidas,
raticidas, moluscocidas, nematicidas e acaricidas.
A utilizao de agrotxicos pode causar problemas de ordem ecolgica e
de sade pblica, tais como desequilbrios no ecossistema, resistncia de
insetos e de microrganismos aos princpios ativos, ocorrncia de resduos
txicos nos alimentos, como resultado da contaminao ambiental, alm da
1
Introduo
persistncia no meio ambiente e contaminao da gua e do solo de onde

podem ser transferidos para vrias formas de vida (LARA & BATISTA, 1992).
Como os agrotxicos so os mais eficazes no controle de pragas, o
monitoramento de resduos, decorrente de seu emprego, no meio ambiente
de fundamental importncia para assegurar a qualidade dos alimentos que
chegam at o consumidor.
No Brasil, o controle de resduos de agrotxicos em alimentos comeou
a se desenvolver isoladamente a partir da dcada de 1970, com o primeiro
laboratrio de anlise de resduos, trabalhando na determinao de
organoclorados em leite, estendendo suas atividades tambm para anlise de
agrotxicos em carne bovina, devido s exigncias nas exportaes. Em 1980,
foi criado o Grupo de Anlise de Resduos de Pesticidas (GARP), que se
fortaleceu transformando-se em Associao Grupo de Anlise de Resduos de
Pesticidas (AGARP) com competncia para resolver problemas de aquisio
de padro analtico puro, exigir maior qualidade dos solventes para anlise,
padronizao de metodologia analtica, etc. (LARA & BATISTA, 1992).
Em 2001, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria do Ministrio da
Sade (ANVISA), implantou o Programa de Anlise de Resduos de
Agrotxicos em Alimentos (PARA) com objetivo de monitorar os principais
agrotxicos encontrados em frutas, verduras, hortalias e outros alimentos.
No entanto, somente em 30 de maro de 2007, pela instruo normativa
n 9 do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento foi aprovado o
Programa Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes em Carne
(bovina, aves, suna e eqina), leite, mel, ovos e pescado (PNCR),
estabelecendo
os
Limites
Mximos
de
Resduos
para
agrotxicos,
organoclorados, Bifenilas Policloradas, antiparasitrios, anabolizantes, etc.,

para as diversas matrizes, permitindo assim uma melhor avaliao da
qualidade dos alimentos consumidos em relao presena desses compostos
(BRASIL, 2007).
Introduo
1.2.
RESDUOS DE AGROTXICOS EM ALIMENTOS

Resduos de agrotxicos o termo utilizado para descrever quantidades
muito pequenas de substncias, incluindo os seus derivados, produtos de

degradao e converso, que so encontradas em diversas matrizes
(MOREIRA, 1995).
O Limite Mximo de Resduo (LMR) definido, pelo Codex Alimentarius,
como sendo a concentrao mxima do resduo de um agrotxico (expresso
em mg kg-1), recomendado pelo Comit do Codex Alimentarius sobre resduos
de pesticidas (CCPR) como sendo legalmente permitido no alimento ou rao
animal. Os valores dos LMR so baseados nos dados obtidos a partir de boas
prticas agrcolas e de alimentos derivados de culturas onde se respeitou o
respectivo valor de LMR, pretendendo-se assim, que sejam toxicologicamente
aceitveis.
A princpio os valores dos LMR estabelecidos pelo Codex Alimentarius
so aplicados ao comrcio internacional e so provenientes de estimativas
feitas pela Joint Meeting on Pesticides Residues (JMPR) considerando a
determinao toxicolgica dos agrotxicos e de seus resduos, e considerando
tambm as revises dos dados de resduos obtidos de testes e usos
supervisionados (FAOSTAT, 2008).
No Brasil, estabelecer limites mximos de resduos (LMRs)
competncia do Ministrio da Sade. No caso de no estarem estabelecidos
pela ANVISA, utilizam-se os definidos pelo MERCOSUL, ou os recomendados
por rgos internacionais como o Codex Alimentarius, os constantes nas
Diretivas da Unio Europia e os utilizados pelo FDA/USA (BRASIL, 1999).
Quando nenhum resduo encontrado no alimento, aps o uso dos
agrotxicos de acordo com as boas prticas agrcolas, o LMR estabelecido
no limite de quantificao do mtodo analtico padro. Com o avano da
instrumentao analtica, o limite de quantificao para vrios compostos
decresceu significativamente nas ltimas dcadas (CALDAS & SOUZA, 2000).
Alguns estudos tm demonstrado que a carne, o leite e seus derivados e
os ovos so para o homem as principais fontes de exposio alimentar a
alguns agrotxicos e essa exposio pode ocorrer como conseqncia da
aplicao direta de produtos qumicos no animal ou quando estes ingerem
3
Introduo
alimentos (pastagens, forragens e raes) que os contenham (CARVALHO et

al, 1980). Devido s suas caractersticas fsico-qumicas, esses produtos
qumicos so veiculados pelas secrees, musculaturas e vsceras dos animais
ou metabolizados antes ou depois da absoro pelo trato intestinal sendo
excretados pela urina, fezes e glndulas mamrias, podendo levar
contaminao do leite e da carne (WHO, 1990). Tais resduos podem atingir
propores bem acima dos nveis admitidos como "tolerncia" e "seguros", com
implicaes toxicolgicas para o homem, que o ltimo elo da cadeia alimentar
(HUBER, 1975). A presena de resduos de inseticidas tem dificultado a
exportao do produto para mercados mais exigentes, como a Comunidade
Europia, Rssia e Japo, grandes importadores de carne bovina do Brasil.
Porm importante frisar que nem todos os compostos qumicos aos
quais os animais ficam expostos, deixam resduos perigosos sade humana
e animal e mesmo aqueles reconhecidos como potencialmente nocivos,
somente permitem tal condio, quando ultrapassam o valor de concentrao
dado pelo LMR, que o alimento pode conter, sem prejuzo da integridade
orgnica de seres humanos e animais (BRASIL, 1999)
1.3.
O USO DE CARRAPATICIDAS EM REBANHOS BOVINOS

Dentre os parasitas encontrados em bovinos, o carrapato (Boophilus
microplus), a mosca dos chifres e os vermes gastrointestinais podem ser

considerados os de maior importncia econmica (BRAGA, 2002), porm, o
carrapato Boophilus microplus considerado um dos principais ectoparasitas
que acometem bovinos causando prejuzos pecuria brasileira (WENZEL et
al, 2004).
O controle do B. microplus feito principalmente por meio de produtos
qumicos, aplicados sobre o animal, com objetivo de combater as fases
parasitrias do carrapato. Porm, este mtodo caro devido aos custos das
drogas e da mo de obra exigida para a sua aplicao.
Os carrapaticidas podem ser classificados em: de contato ou sistmicos.
Os carrapaticidas de contato so aplicados por meio de pulverizao, imerso
ou pour-on (lombo do animal). So divididos basicamente nos grupos:
Introduo
aminidinicos, piretrides, fosforados, fenilpirazois e cymiazol. Os carrapaticidas

sistmicos so aplicados por meio de injees, atuando pela circulao
sangnea. O grupo mais conhecido o das avermectinas. Esses produtos tm
a desvantagem de serem contra-indicados para animais 30 dias antes do
abate, ou em perodo de lactao, devido ao nvel de resduos que permanece
no leite e na carne (EMBRAPA, 2000).
Os carrapaticidas de contato mais utilizados fazem parte da classe dos
piretrides, que so compostos sintticos muito utilizados na agropecuria em
funo de sua eficcia no controle de uma variedade de insetos e parasitas do
gado. Eles apresentam estruturas semelhantes piretrina, substncia existente
nas flores do Pyrethrum (Chrysanthemum cinerariaefolium). Dentre os vrios
carrapaticidas utilizados da classe dos piretrides, destacam-se: aletrina,
resmetrina, deltametrina, cipermetrina e fenpropanato (WHO, 1990).
O uso de acaricidas qumicos, que constitui o principal instrumento de
controle do carrapato nos bovinos, a rigor busca a eliminao da infestao,
diminuindo o contato entre o parasita e o animal, e os prejuzos diretos ou
indiretos causados por estes. Porm o uso desses acaricidas apresenta como
desvantagens a poluio de mananciais, a reduo da populao de insetos e
outros organismos benficos para a agropecuria e causam efeitos deletrios
ao meio ambiente e ao homem e contaminam os produtos de origem animal.
Observou-se que a freqente exposio dos carrapatos aos
carrapaticidas tem levado a que as populaes se acostumem com o produto,
chegando ao ponto em que algumas delas no morrem quando os produtos
so aplicados. a chamada resistncia dos carrapatos aos carrapaticidas
(EMBRAPA, 2004). Logo, o manejo inadequado, na maioria dos casos,
contribui substancialmente para o problema da resistncia.
A utilizao estratgica dos carrapaticidas (por exemplo: tratamentos a
intervalos fixos de trs semanas no incio da primavera, em setembro, ou
durante os meses mais quentes do ano) associada a prticas de manejo de
pastagens, auxilia muito no retardo do desenvolvimento da resistncia,
reduzindo o nvel de resduo no leite e na carne conseqentemente. Sabe-se
que uma vez instalada a resistncia a um grupo qumico numa populao de
carrapatos, a primeira atitude aumentar a concentrao do produto para o
qual a populao de carrapatos resistente, aumentando assim o risco de
5
Introduo
contaminao do leite e da carne (BRAGA, 2002; LEAL et al, 2003).
1.4.
PIRETRIDES
Os piretrides tm sido considerados como uma das classes de
inseticidas e acaricidas mais utilizados na agricultura, pecuria, horticultura,

silvicultura, e tratamentos domissanitrios, estando presentes ainda em sprays
de uso domstico (VIEIRA, 2007). Estes compostos apresentam amplo
espectro de atividade, ao rpida, eficincia em pequenas doses, baixo poder
residual e, adicionalmente, so praticamente atxicos para mamferos, quando
comparados a outros inseticidas (HIRATA, 1995), porm, estudos toxicolgicos
mostram que os piretrides esto entre os agrotxicos mais txicos para
organismos aquticos (BARRIONUEVO & LANAS, 2001).
Estes inseticidas so lipoflicos, de ao prolongada, com ao
neurotxica atuando na transmisso axnica, interferindo no fluxo normal dos
ons sdios envolvido na transmisso do impulso nervoso, levando os
organismos paralisia e morte (ANGERER & RITTER, 1997, SODERLUND et
al, 2002).
Quando comparados com as piretrinas, os piretrides so mais
eficientes no controle das pragas, mais estveis e menos txicos ao meio
ambiente (SODERLUND et al, 2002). So compostos que respeitado o
intervalo de segurana, no deixam resduos txicos ao meio ambiente, sendo
necessrias pequenas quantidades para a aplicao.
Normalmente os piretrides so aplicados na parte area de culturas tais
como: algodo, arroz, alho, batata, berinjela, tomate, etc. (ANVISA, 2008) ou
aplicados por meio de pulverizao, banhos de imerso ou pour-on para
tratamento de ectoparasitas de bovinos. Os piretrides de maneira geral so
utilizados tambm no controle dos insetos de broca-pequena-do-fruto, brocagrande-do-fruto, lagartas, grilos, bicheiras, etc. (SARAIVA, 2004).
Os piretrides, deltametrina e cipermetrina, so exemplos de piretrides
utilizados no controle de carrapatos. As frmulas estruturais destes compostos
esto representadas nas Figuras 1.1 e 1.2 e suas propriedades fsico-qumicas
Introduo
e os limites mximos de resduos (LMR) estabelecidos pelo Codex Alimentarius

em carne bovina so mostrados na Tabela 1.1.
Figura
1.1.
Estrutura da (S)--cyano-3-phenoxybenzyl(1R,3R)-3-(2,2dibromovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate
(Deltametrina)
Figura 1.2. - Estrutura da (RS)--cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

(Cipermetrina)
Tabela 1.1. - Propriedades Fsico-qumicas dos piretrides deltametrina e
cipermetrina e os LMR em Carne bovina e fgado
LMR
LMR
Solubilidade em
Massa molar
Piretrides
(g kg-1)
(g kg-1)
gua (mg L-1)
-1
g mol
(20 C)
Droga veterinria
Agrotxico
Deltametrina
505
0,002
30,0* e 50,0**
500,0* e 30,0**
Cipermetrina
416
* carne bovina
0,004
50,0
200,0
(FAO/WHO, 2008)
** fgado
1.5.
ORGANOCLORADOS
Os agrotxicos organoclorados foram amplamente empregados contra
pragas da agricultura e ectoparasitas bovinos. Estes compostos so

extremamente txicos e apresentam elevada estabilidade e capacidade de
bioacumulao. Muitos agrotxicos desta classe tiveram seu uso proibido
7
Introduo
devido possibilidade de suas frmulas favorecerem a formao de tumores

cancergenos ou causarem vrios outros problemas sade humana (GALLI et
al, 2006).
Embora eficientes, contribuem fortemente para o depsito de seus
resduos, principalmente na frao lipdica do prprio homem (HUBER, 1975).
So considerados os mais persistentes e de sua degradao originam-se
metablitos tambm persistente e de efeitos nocivos (LARA & BATISTA, 1992).
O Endosulfan, inseticida desenvolvido pela Hoechst Aktiengesellschaft
na Alemanha, foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial de
Thiodan (GOEBEL et al, 1982; STUMPF & ABHAVER, 1986). O ingrediente
ativo do Endosulfan consiste na mistura de dois ismeros, sendo 70 % de endosulfan e 30 % de -endosulfan. Entre os produtos derivados do
metabolismo do Endosulfan em mamferos, o sulfato de endosulfan o
principal metablito devido sua importncia toxicolgica. A Ingesto Diria
Aceitvel (IDA) de Endosulfan total (somatrio de Endosulfan alfa, beta e
sulfato) (Figura 1.3) para o homem foi estabelecida, em 1989, pelo Joint
Meeting on Pesticide Resdue (JMPR) em 0,006 mg kg-1 de peso corpreo
(DEEMA et al, 1966; DOROUGH & GIBSON, 1972; LEHR, 1992; STUMPF &
ABHAVER, 1986; FAO/WHO, 1992).
O Endosulfan um inseticida e acaricida que atua em uma grande
variedade de insetos e caros. utilizado principalmente em culturas
alimentares, incluindo ch, caf, frutas e legumes, arroz, milho, e outros gros
e viabiliza a produo das culturas. Sua utilizao na pecuria no
autorizada, mas so encontrados resduos na alimentao animal, sendo assim
metabolizados e absorvidos, podendo ser encontrado na carne e no leite
(FAO/WHO, 2008).
praticamente insolvel (0,32 mg L-1 a 22 C), sua massa molar igual
a 406,0 g mol-1. O LMR de 0,2 mg kg-1 em carne bovina e 0,1 mg kg-1 em
fgado bovino (FAO/WHO, 2008).
Introduo
Figura 1.3. - Estruturas moleculares do 1,4,5,6,7,7-hexachloro-8,9,10trinorborn-5-en-2,3-ylenebismethylene)sulfite - -Endosulfan (A),

-Endosulfan (B) e Sulfato de Endosulfan (C)
1.6.
ORGANOFOSFORADOS
Os agrotxicos organofosforados constituem uma classe importante de
inseticidas, acaricidas, nematicidas e fungicidas. So freqentemente os

preferidos nas lavouras, devido ao seu controle efetivo para uma ampla
variedade de pragas. Embora estes compostos se degradem rapidamente em
gua, existe sempre a possibilidade de permanecerem resduos e subprodutos
em nveis relativamente nocivos para o consumo humano (SILVA et al, 1999).
Os compostos pertencentes classe dos organofosforados apresentam
o mecanismo de ao com inibio da enzima colinesterase, e conseqente
acmulo de acetilcolina nas fibras nervosas, que impede a transmisso de
novos impulsos gerando uma srie de efeitos no organismo tais como
convulses, paradas respiratrias e coma. Apresenta um grau de toxicidade
bastante elevado, porm, tm a vantagem de no apresentarem propriedades
bioacumulativas e de serem menos persistentes no solo (SILVA et al, 2001;
SILVA et al, 1999, LAMBROPOULOU & ALBANIS, 2002).
Os organofosforados so o grupo qumico de agrotxicos formado por
steres de cido fosfrico e outros cidos base de fsforo. Nesta classe
destaca-se o Clorpirifs (Figura 1.4), com modo de ao de contato, ingesto e
9
Introduo
fumigao. Inseticida utilizado como tratamento pr e ps-plantio para controlar

insetos do solo, em culturas de milho, cereais, feijo, cebola, cenouras, nabos,
alface e tabaco e como carrapaticida de contato (INCHEM, 1972).
S
Cl
Cl
OP(OCH2CH3)2
Cl
Figura 1.4. - Estrutura do O-3,5,6-tricloro-O,O-dietil-2-piridilfosforotioato Clorpirifs

A preocupao com a presena de clorpirifs e seus produtos de
degradao em alimentos tem motivado a realizao de vrios trabalhos, como
por exemplo, o estudo de clorpirifs em casca e polpa de pepino (FERST,
1991), tomates (GOBO, 2001) e em diversos vegetais (VIANA et al, 1996),
ma (CELLA, 2002), etc.
O clorpirifs um slido cristalino de massa molar igual a 350,5 g mol-1,
ponto de fuso de aproximadamente 43 C, apresenta baixa solubilidade em
gua (2,00 mg/L a 25 C), no sendo sensvel radiao ultravioleta, estvel
em solues cidas, porm hidrolisa em solues bsicas, termicamente
instvel em temperaturas superiores a 50 C (EXTOXNET, 2002). O LMR
permitido em carne bovina de 1,0 mg kg-1 (FAO/WHO, 2008).
1.7.
CARNE BOVINA
Entre os alimentos, a carne e seus derivados so amplamente
consumidos, sendo, um alimento importante em vrias dietas como fonte de

protenas de alta qualidade, cidos graxos essenciais, vitaminas do complexo B
(tiamina, riboflavina, niacina, biotina, cido pantotnico, folacina, vitaminas B6 e
B12) e minerais como ferro, zinco e fsforo.
A carne bovina constituda de aproximadamente 75 % de gua, 20 a
25 % de protenas e em menor quantidade esto as vitaminas, os lipdeos, os
10
Introduo
minerais e os carboidratos. Alm do seu valor nutricional a carne apresenta

todas as vitaminas lipossolveis (A, D, E e K), as hidrossolveis do compelxo B
e um pouco de vitamina C, que so responsveis pela regulao dos
processos fisiolgicos e exercem funes indispensveis ao crescimento e
manuteno do corpo humano.
A gordura presente na carne, alm do aspecto energtico, importante
devido presena dos cidos graxos essenciais, colesterol e vitaminas
lipossolveis.
Todos os minerais essenciais esto presentes na carne bovina,
destacando-se a presena de ferro, fsforo, sdio, magnsio e zinco. Cabe
destacar que a carne apresenta-se como fonte expressiva de ferro, onde de 40
a 60 % desse elemento altamente absorvvel (EMBRAPA, 1999).
Devido utilizao de carrapaticidas e drogas veterinrias pelos
pecuaristas, faz-se necessrio o desenvolvimento de metodologias analticas
capazes de detectar e quantificar os resduos desses produtos e assim
assegurar a qualidade alimentar.
1.8.
METODOLOGIAS
ALIMENTOS
DE
EXTRAO
DE
AGROTXICOS
EM
Geralmente, os alimentos e as amostras ambientais no podem ser

analisados sem tratamento preliminar da amostra, porque os contaminantes se
encontram muito diludos e as matrizes so muito complexas. Devido aos
baixos nveis de deteco requeridos pelas agncias reguladoras e a natureza
complexa das matrizes em que os componentes alvos esto presentes, o
preparo da amostra, a deteco e as identificaes em nvel de traos so
aspectos importantes dos mtodos analticos. A preparao da amostra, tal
como a extrao, concentrao, e determinao dos analitos, influenciam
extremamente na confiabilidade e exatido da anlise.
Devido ao fato de que as medidas so normalmente efetuadas em
baixos nveis de concentrao, as interferncias so problemas freqentes que
devem ser considerados. O objetivo principal do preparo da amostra ,
portanto, promover o fracionamento e o enriquecimento da mesma, com todos
os analitos de interesse, e os deixar o mais livre possvel das interferncias
11
Introduo
provenientes dos componentes da matriz, que certamente estaro no extrato.

Qualquer perda do analito que ocorrer nessa etapa no pode ser compensada
por nenhuma das etapas subseqentes. Dessa maneira, o preparo da amostra
uma etapa crucial dentro de todo o processo analtico.
A principal dificuldade na extrao de amostras da carne a co-extrao
do material lipdico (cidos graxos, esteris, glicerdeos) da matriz que
incompatvel com o sistema cromatogrfico, por exemplo, o cromatgrafo a gs
(CG). Uma etapa crtica, e geralmente o aspecto mais laborioso, no
procedimento analtico o clean up dos extratos.
Os mtodos mais freqentemente usados para determinar agrotxicos
em alimentos, em geral empregam a extrao lquido-lquido (ELL), extrao
em fase slida (EFS), extrao slido-lquido (ESL), extrao com fludo
supercrtico (EFS) e disperso de matriz em fase slida (DMFS) (GOBO et al,
2004). Estes mtodos costumam empregar um grande nmero de "etapas de
bancada", alm do tempo de anlise bastante elevado e grande consumo de
solventes (NUNES et al, 2002).
Um mtodo recentemente publicado, que utiliza as vantagens e
possibilidades oferecidas pela instrumentao analtica moderna, o mtodo
Quechers, o qual foi desenvolvido para gerar extratos que so diretamente
aplicveis tanto para anlises por CG quanto por LC. O mtodo Quechers um
procedimento simples e rpido, com baixo custo e consumo de solventes alm
de cobrir um amplo espectro de agrotxicos extrados (PIZZUTTI, 2006).
Porm, para amostras de carne so mais relatadas etapas de clean up
utilizando cromatografia por permeao em gel (CPG) e outras tcnicas como
partio lquido-lquido, EFS e precipitao a baixa temperatura tem sido
revisada e comparada (JUHLER, 1997).
A anlise dos extratos geralmente feita por mtodos cromatogrficos.
Estes so os mais utilizados por apresentarem um alto grau de preciso e
determinao em nveis de nanogramas. Muitos agrotxicos so volteis e
estveis termicamente, sendo separados por cromatografia gasosa acoplada a
sistemas de deteco seletivos e sensveis, como detector por captura de
eltrons, detector de nitrognio fsforo e espectrometria de massa
(SANNINO et al, 2004, STOPPELLI & MAGALHES, 2005).
Os agrotxicos no volteis termolbeis e altamente polares tm surgido
12
Introduo
nos ltimos anos, incluindo carboxamidas, quinazolinas, pirimidinas, tiazol,

carbamato, neonicotinides e morfolina. Nestes casos, a cromatografia lquida
acoplada espectrometria de massa largamente utilizada. A tcnica de
ionizao em presso atmosfrica proporciona grande sensibilidade e
seletividade (SANNINO et al, 2004, STOPPELLI & MAGALHES, 2005).
1.8.1.
Extrao Slido-Lquido
Temperatura
com
Purificao
em
Baixa
O mtodo de precipitao em baixa temperatura foi desenvolvido para

simplificar a etapa de clean up, utilizando solventes orgnicos menos txicos e
prejudiciais, permitindo a quantificao em nvel de ppb (g kg-1, g L-1) por
cromatografia gasosa (JUHLER, 1997).
Utilizando como princpio a precipitao em baixa temperatura, Goulart
(2004), desenvolveu uma metodologia, para extrao e anlise de deltametrina
e cipermetrina em leite por cromatografia gasosa. Posteriormente, a mesma
tcnica foi aplicada para diversas matrizes, como por exemplo, solo e gua
(VIEIRA, 2005), batata (DARDENGO, 2007), tomate (PINHO, 2007) para
extrao
simultnea
de
agrotxicos
das
classes
dos
piretrides
organofosforados. A metodologia se mostrou simples e eficiente, alm da

vantagem de menor consumo de solventes, reduzindo ou evitando etapas de
evaporao e troca de solventes.
O mtodo consiste em colocar a amostra lquida ou slida em contato
com um solvente extrator, miscvel em gua. Posteriormente, a amostra
agitada e levada ao freezer por um perodo mnimo de seis horas. Nesta etapa,
a fase aquosa juntamente com a amostra, congela ficando na parte inferior do
recipiente utilizado e a fase superior contendo o solvente e os analitos
extrados so filtrados utilizando sulfato de sdio anidro com o intuito de
eliminar possveis resduos de gua. Finalmente, o extrato analisado por
cromatografia gasosa.
Apenas alguns solventes podem ser empregados nesta tcnica, como a
acetonitrila, o acetato de etila e a acetona, pois necessrio que o solvente
forme uma mistura extratora homognea, seja menos denso que a gua e
somente aps o abaixamento da temperatura ocorra a separao das fases e
13
Introduo
se mantenha lquido a -20 C. A acetonitrila o solvente mais utilizado porque

apresenta todas as caractersticas listadas acima alm de apresentar
compatibilidade com a maioria dos analitos, com o preparo da amostra, na
anlise cromatogrfica e pode ser empregada para analisar agrotxicos de
diferente polaridades. A ESL-PBT apresenta como vantagens, alm do baixo
consumo de solvente, a ausncia de outras etapas de clean up, muitas vezes
requeridas em vrios outros mtodos de extrao.
1.8.2.
Disperso de Matriz em Fase Slida
A Disperso de Matriz em Fase Slida (DMFS) foi desenvolvida por

Barker em 1989 (BARKER, 2000a e b) e tm encontrado aplicao particular
como um processo analtico de preparao, extrao e fracionamento de
slidos, semi-slido e/ou amostras biolgicas altamente viscosas.
Esta tcnica foi utilizada por Ling & Huang (1995) em anlise de
agrotxicos em alimentos para determinao de piretrides em vegetais. A
maior vantagem desta tcnica que o processo de extrao e clean up da
amostra so realizados simultaneamente. Alm disso, uma tcnica simples
com baixo consumo de solventes, amostras e reagentes (ALBERO et al, 2003).
A DMFS baseia-se em vrios princpios simples de qumica e fsica,
envolvendo foras aplicadas amostra em mistura mecnica para produzir
ruptura completa da amostra e as interaes da matriz com um adsorvente
slido (EFS). Consiste em combinar pequena quantidade da matriz com um
adsorvente (slica, florisil, C18, etc), misturar at homogeneizao, transferir o
material (matriz e adsorvente) para a coluna e submeter o sistema a uma
eluio com um solvente apropriado. O filtrado concentrado e analisado por
cromatografia gasosa (LANAS, 2004; BARKER, 2000a e b).
Pode ser aplicado a diversos tipos de matrizes, como por exemplo,
tecidos animais ou vegetais, ou amostras constitudas por material no
homogneo, matriz gordurosas e/ou outros tecidos, como as fibras e celulose,
no caso das plantas.
14
Introduo
1.9.
CROMATOGRAFIA
Ao analisar uma amostra, freqentemente, tm-se uma mistura de vrios
componentes em uma matriz complexa. Para amostras que contenham

componentes desconhecidos, eles precisam ser separados dos demais, de
modo que cada componente individual possa ser identificado e at mesmo
quantificado por um determinado mtodo analtico.
Os componentes dessa mistura podem ser separados utilizando as
diferenas nas propriedades fsicas e qumicas dos componentes individuais.
As propriedades fsicas que permitem separar compostos so: solubilidade,
ponto de ebulio, presso de vapor, densidade, tamanho das partculas, etc.
Nas
anlises
multirresduos
de
agrotxicos
em
alimentos,
tradicionalmente, a Cromatografia gasosa (CG) ou a cromatografia lquida,

acoplada ou no Espectrometria de Massas (EM), tm sido as tcnicas
analticas escolhidas, devido as suas excelentes caractersticas, de eficincia
de separao cromatogrfica e sensibilidade. At o presente momento, os
agrotxicos investigados em amostras alimentares tm sido inseticidas,
acaricidas e fungicidas, os quais, em geral, so analisados de forma adequada
por CG (HERNNDEZ et al, 2005, PIZZUTTI, 2006).
O sistema de deteco utilizado em anlise de resduos em alimentos
depende do tipo de substncia a ser analisada, ou seja, quais elementos esto
presentes nos ingredientes ativos dos agrotxicos. O Detector por Captura de
Eltrons (DCE) destina-se principalmente anlise de compostos que tm
afinidade por eltrons como compostos halogenados, aldedos conjugados,
nitrilas, nitratos e organometlicos. Este detector possui a vantagem de ser um
dos mais sensveis entre todos os detectores, sendo possvel com a sua
utilizao a deteco de 10-12 a 10-14 g de espcies eletroafins, porm, possui
uma faixa de linearidade dinmica relativamente pequena o que constitui um
problema para as anlises quantitativas.
1.10. EFEITO DE MATRIZ

A determinao de resduos de agrotxicos em alimentos constitui-se
15
Introduo
um problema especial para a Qumica Analtica, visto que se deve determinar

em nveis de traos, de microgramas (10-6) a picogramas (10-12), de uma
determinada substncia, seus metablitos ou produtos de degradao, em
presena de uma grande quantidade de material estranho, inerente da
amostra. A presena de todos esses compostos, analitos e componentes da
matriz, pode interferir durante a anlise cromatogrfica, influenciando na
quantidade do analito que transferido para a coluna. Esta interferncia dos
componentes
da
matriz,
na
quantificao
dos
analitos
na
anlise
cromatogrfica, denominada de efeito de matriz (GONZALEZ et al, 2002).

O efeito da matriz pode gerar srios problemas analticos, devido a
possvel superestimao da concentrao dos analitos (ZROSTLKOV et al,
2001) ou diminuio da resposta do detector de um analito presente no extrato
da amostra comparado ao mesmo analito em solvente orgnico (HAJLOV et
al, 1998; EURACHEM, 1998; BRUCE et al, 1998; ZROSTLKOV et al, 2001,
THOMPSON et al, 2002; CARDOSO, 2008).
O efeito de matriz pode ocorrer em diversas partes do sistema
cromatogrfico como: injetor, coluna ou detector. No injetor o liner (tubo de
vidro) o principal responsvel pelo efeito de matriz, pois os stios ativos deste
material podem adsorver ou induzir a degradao trmica de alguns analitos.
Os stios ativos so formados por grupos silanis livres e metais
potencialmente presentes na superfcie do liner. Alm disso, stios ativos
adicionais podem surgir a partir de co-extrativos no volteis que se depositam
na entrada do sistema cromatogrfico durante repetidas anlises (PINHO et al,
2008).
A Figura 1.5 apresenta um esquema geral do injetor de um CG:
1- Septo (silicone)
2- Alimentao de gs de arraste
3- Bloco metlico aquecido
4- Ponta da coluna cromatogrfica
5- liner (stios ativos)
16
Introduo
Figura 1.5. Injetor de cromatgrafo a gs.

Quando as solues padro so preparadas no solvente puro e
analisadas por cromatografia, os stios ativos do liner esto disponveis para
interagir somente com os analitos, podendo ocorrer reteno destes analitos e,
assim,
menores
quantidades
so
transferidas
para
coluna
conseqentemente detectadas. Entretanto, quando se analisa os extratos

contendo esses analitos ocorre uma competio pelos stios ativos do liner.
Essa competio entre os compostos pelos stios ativos, como mostrado na
Figura 1.6, possibilita que maior quantidade de pesticida esteja disponvel para
ser introduzida na coluna cromatogrfica e posteriormente, detectada. Quando
a resposta do detector, atribuda ao analito, comparada com a resposta de
solues-padro do mesmo analito,
ocorre uma superestimao dos
resultados. (HAJSLOV & ZROSTLIKOVA, 2003; PINHO et al, 2008). Um fato

pouco relatado na literatura a possvel degradao dos analitos no liner,
levando a diminuio da resposta para esse composto quando comparada a
resposta do padro em solvente.
17
Introduo
Figura 1.6 - Possveis adsores que ocorrem na superfcie do vidro e l de

vidro do liner em uma injeo com diviso do fluxo (split). A)
Agrotxicos preparados em solvente puro. B) Agrotxicos
preparados em extratos da matriz (branco) (PINHO et al, 2008).
Os compostos analisados por cromatografia como os piretrides, os
organoclorados e organofosforados, apresentam efeitos de matriz diferentes,
relacionados
suas
caractersticas
fsico-qumicas
como
polaridade,
volatilidade, estabilidade em altas temperatura, as condies cromatogrficas e

a natureza da matriz (MENKISSOGLU-SPIROUDI & FOTOPOULOU, 2004).
Os piretrides, apesar de serem menos polares, apresentam efeito de matriz
significativo. Neste caso, a elevada massa molar dos agrotxicos (acima de
400 g mol-1) dificulta a volatilizao e menor quantidade de analito introduzida
na coluna cromatogrfica quando preparado em solvente puro, produzindo
menores respostas. Compostos hidrofbicos, porm, como os agrotxicos
organoclorados, no apresentam efeito de matriz pronunciado. Estes
compostos so menos susceptveis adsoro pelos stios ativos do liner. Uma
exceo o DDT, que pode ser termicamente degradado no injetor aps
acmulo de co-extrativos (SNCHEZ-BRUNETE et al, 2005; PINHO et al,
2008).
A intensidade do efeito de matriz pode variar de uma amostra para outra,
ou de acordo com a concentrao do analito na matriz. Hajslov et al, (1998),
verificaram que quanto menor a concentrao do analito na amostra, maior
ser o efeito de matriz.
18
Introduo
O prprio sistema cromatogrfico pode influenciar na intensidade do

efeito de matriz. Como exemplo, um cromatgrafo a gs utilizando como
detector um espectrmetro de massa (EM) apresentou maior efeito de matriz
em anlise de organofosforados que um detector fotomtrico de chama (DFC)
para os mesmos analitos. O espectrmetro de massa tambm contribui para o
aumento da resposta devido superfcie metlica do detector e o fato de no
ocorrer combusto neste (SCHENCK & LEHOTAY, 2000).
Normalmente, para corrigir estes erros nas taxas de recuperao, a
curva analtica pode ser preparada substituindo o solvente puro por extratos da
matriz isenta de agrotxicos, durante a diluio das solues padro nas
diversas concentraes (RIBANI et al, 2004). Muitos analitos tm se mostrado
estveis quando preparados em extratos da matriz (KOCOUREK et al, 1998).
Alm disso, numa tentativa de reduzir o efeito de matriz pode-se fazer o
uso de injeo on-column, para evitar a presena de stios ativos do sistema de
injeo, ou freqentes mudanas do liner do injetor, permitindo a entrada de
maior quantidade de agrotxicos na coluna cromatogrfica, quando comparada
com a tcnica de injeo de vaporizao no injetor. Porem, a injeo oncolumn ainda apresenta efeito de matriz, sendo atribudo coluna
cromatogrfica e no forma de injeo. A sua utilizao requer maior
freqncia de manuteno, sendo uma tcnica impraticvel para anlise de
rotina em matrizes complexas (ANASTASSIADES et al, 2003; PINHO et
al,2008).
Pode-se tambm utilizar o mtodo de adio de padro na prpria
matriz, ou ainda, etapas de clean up dos extratos para reduzirem co-extrativos
(POOLE, 2007; SCHENCK & LEHOTAY, 2000) e a adio de substncias
qumicas similares aos componentes da matriz nos padres preparados em
solvente puro, para ocupar os stios ativos do liner, impedindo a adsoro ou
degradao dos analitos. Tais substncias protetoras como o leo de oliva (ou
produtos de degradao destes) tm maior capacidade de fazer ligaes de
hidrognio que os agrotxicos com os grupos silanis do liner (vidro). Desta
forma, estes compostos mascaram os stios ativos e proporcionam maior
transferncia dos analitos para a coluna (SANCHEZ-BRUNETE et al, 2005).
19
Introduo
1.11. VALIDAO
Na rea de anlise de resduos de agrotxicos, o desenvolvimento de
mtodos analticos constitui-se em uma etapa extremamente importante, onde
a investigao deve sempre incluir a validao do mtodo desenvolvido e no
apenas a sua otimizao, principalmente quando envolve sua aplicao em
diferentes tipos de matrizes e no apenas estudos com soluo padro (BRITO
et al, 2002).
Do ponto de vista prtico, pode-se dizer que um mtodo, aps ser
selecionado e desenvolvido, deve ser submetido a um processo de avaliao
que estime sua eficincia e mrito. Este processo de avaliao costuma ser
chamado de validao. Um mtodo ser considerado validado se suas
caractersticas estiverem em conformidade com os pr-requisitos exigidos por
literaturas de referncia na rea (IMOTO, 2004).
Os principais parmetros a serem estudados durante o processo
analtico da validao do mtodo so seletividade, linearidade da resposta do
detector e linearidade do mtodo, Limite de Deteco (LD) e Limite de
Quantificao (LQ), preciso, exatido e robustez.
Seletividade: capacidade de medir com exatido e sem interferentes,

vrios analitos em uma mistura.
Linearidade:
capacidade
de
fornecer
resultado
proporcional
concentrao do padro, em uma faixa de trabalho apropriada.

A estimativa dos coeficientes de correlao de uma curva analtica
permite avaliar a qualidade da curva obtida, que quanto mais perto de 1,0,
menor ser a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a
incerteza dos coeficientes de regresso estimados a e b.
Para validao de mtodos para anlise de resduos de agrotxicos, um
valor de r que 0,99 usualmente requerido, podendo ser considerado livre de
tendncias (unbiased), se o corredor de confiana da reta de regresso linear
contiver a origem. A ANVISA (2003) estabelece que um coeficiente de
correlao mltipla r 0,99 desejvel, e o INMETRO (2003) um valor acima
de 0,90.
20
Introduo
Limite de deteco (LD): representa a menor concentrao do analito

em exame que pode ser diferenciada do rudo do sistema com
segurana, mas no necessariamente quantificada (RIBANI, 2004).
O Limite de deteco pode ser determinado das seguintes maneiras:
a) Pelo mtodo visual, em que se utiliza a adio de concentraes mnimas e

conhecidas dos analitos em solvente, de maneira que se possa distinguir os
sinais e a menor concentrao visvel detectvel do ativo.
b) Pelo mtodo da relao sinal/rudo, em que pode ser aplicado em sistemas
analticos que apresentam o rudo da linha base como em cromatografia
gasosa ou lquida, na proporo de 3:1.
c) Pelos parmetros da curva analtica, na qual pode ser expresso pela
equao:
LD = 3,3
s
S
(1)
Onde,
s= estimativa do desvio padro da resposta do coeficiente linear da equao;
S= inclinao da curva ou coeficiente angular da curva analtica.
Limite de quantificao (LQ): corresponde menor quantidade do analito

que pode ser quantificada com exatido.
Pode ser determinado da mesma forma que o limite de deteco, porm,
na relao sinal rudo utiliza-se a proporo 10:1, ou pelos parmetros da curva

utilizando a equao:
LQ = 10
s
S
(2)
Onde,
s= estimativa do desvio padro da resposta do coeficiente linear da equao;
S= inclinao da curva ou coeficiente angular da curva analtica.
Exatido: representa o grau de concordncia entre os resultados

individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de
referncia aceito como verdadeiro (INMETRO, 2003).
21
Introduo
Preciso: um termo geral para avaliar a disperso de resultados entre

ensaios independentes, repetidos sob condies definidas (INMETRO,
2003). atravs de ensaios de repetitividade e preciso intermediria de
resultados analisados de uma mesma amostra.
Expresso em termos de Coeficiente de variao (CV) para mtodos de
anlise de traos ou impurezas, so aceitos CV de at 20 %, dependendo da

complexidade da amostra (RIBANI et al, 2004)
Em anlise de resduos de agrotxicos, a validao do mtodo de ensaio
ocorre, usualmente, por meio de ensaios de recuperaes intralaboratorial, ou
seja, no prprio laboratrio onde se deseja validar o mtodo (THIER &
ZEUMER, 1987).
Robustez - A capacidade do mtodo em resistir a pequenas variaes

dos parmetros analticos, sendo realizadas sob pequenas mudanas nas
condies analticas.
1.12. OBJETIVOS
1.12.1.
Objetivos Gerais:
Analisar resduos de agrotxicos em carne bovina por cromatografia
gasosa.
Otimizar e validar uma metodologia para a extrao e anlise multirresduo
(deltametrina, cipermetrina, endosulfan e clorpirifs) em carne bovina.
1.12.2.
Objetivos especficos:
Estabelecer as condies de anlise da deltametrina, endosulfan, clorpirifs
e cipermetrina por cromatografia gasosa.
22
Introduo
Otimizar a anlise de multirresduo em amostras de fgado e msculo
bovino fortificados, empregando as Tcnicas de Extrao Slido Lquido com

Purificao em Baixa Temperatura (ESL-PBT).
Validar a metodologia otimizada para determinao dos agrotxicos
clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em carne bovina
Avaliar a tcnica DMFS em amostras de fgado e msculo bovino e
comparar com a ESL-PBT otimizada.
Empregar a metodologia otimizada para a extrao e quantificao dos
multirresduo em amostras de fgado e msculo bovino obtidos no comrcio de

Viosa.
23
Materiais e Mtodos
2. MATERIAIS E MTODOS
2.1.
PREPARO DE SOLUES PADRO

As solues padro dos princpios ativos foram preparadas a partir de
padres de clorpirifs (99,0 % m/m Chem Service), cipermetrina (92,4 % m/m

Chem Service), deltametrina (99,0 % m/m Chem Service) e endosulfan
(91,5 % m/m). Uma soluo estoque de 1.000,0 mg L-1 de cada um dos
compostos foi preparada em acetonitrila (Vetec/HPLC). A soluo de trabalho
contendo os quatro agrotxicos de interesse na concentrao de 10,0 mg L-1,
foi preparada em acetonitrila a partir da diluio da soluo estoque. As demais
solues foram obtidas a partir da diluio da soluo de 10,0 mg L-1.
Uma soluo de bifentrina (92,2 % m/m FMC do Brasil) a 10,0 mg L-1,
utilizada como padro interno, foi preparada em acetonitrila, a partir de uma
soluo estoque desse princpio ativo a 1000,0 mg L-1.
2.2.
AMOSTRAS DE CARNE
Devido aplicao por pulverizao de carrapaticidas sobre o lombo do
animal e possvel contaminao proveniente da alimentao, podendo assim,

ocorrer veiculao e acmulo dos princpios ativos na musculatura e vsceras
dos animais, levando a contaminao da carne e do leite, escolheu-se trabalhar
com amostras de msculo (alcatra) e fgado bovino.
Para o processo de otimizao e validao da metodologia de anlise
multirresduo
dos
agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
deltametrina, foram utilizadas amostras de carnes provenientes do comrcio de
24
Materiais e Mtodos
Viosa MG, cuja presena dos agrotxicos foi previamente avaliada pela
anlise dos extratos obtidos de amostra no fortificada, denominada branco.
temperatura ambiente as amostras de carne foram cortadas e
trituradas em liquidificador por aproximadamente 3 minutos. Em seguida, a
carne foi acondicionada em potes plsticos de PET, vedadas, identificadas e
armazenadas em freezer a -20 C. No momento da anlise, as amostras foram
deixadas temperatura ambiente at descongelarem.
2.3.
EXTRAO SLIDO-LQUIDO COM PURIFICAO EM BAIXA

TEMPERATURA ESL-PBT
2.3.1. Fortificao das amostras de carne

Amostras de carne bovina (alcatra e fgado) de massas igual a 3,0000 g,
medidas em balana analtica (Sartorius BP 2215 com preciso de 1 x 10-4 g),
foram fortificadas, com 0,10 mL da soluo de trabalho contendo os quatro
agrotxicos na concentrao de 10,0 mg L-1, a fim de se obter no extrato final,
aps a extrao, uma concentrao igual a 0,10 mg L-1 de cada analito.
Aps adio dos analitos, as amostras foram levadas ao ultra-som
(Unique, MAXICLEAN 750) por 3 minutos e deixadas em repouso por
aproximadamente 30 minutos para que houvesse maior interao dos
agrotxicos com a amostra. Posteriormente, estas amostras foram submetidas
aos procedimentos de extrao, e foram determinadas as condies timas
para
anlise
dos
agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
deltametrina, por cromatografia gasosa.
2.3.2. Extrao dos agrotxicos em carne bovina por ESL-PBT

Tcnica geral
Os ensaios da extrao slido-lquido com purificao em baixa
temperatura para anlise dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina em amostras de carne bovina foram adaptadas da tcnica descrita
para extrao de deltametrina e cipermetrina em leite (GOULART, 2004) e para
25
Materiais e Mtodos
extrao de piretrides e organoclorado em tomate (PINHO, 2007, PINHO et al,

2008).
3,0000 g das amostras fortificadas foram medidas (Balana analtica
Sartorius BP 2215 com preciso de 1 x 10-4 g) em frascos de vidro transparente
com tampa plstica (30 mL de capacidade). A estas amostras foram
adicionados 9,0 mL de solvente extrator (gua, acetonitrila, acetato de etila). A
mistura obtida foi mantida sob agitao em uma mesa agitadora (Tecnal TE 420) a 25 C e a 175 oscilaes por minuto (opm). A composio do solvente
extrator, a fora inica, o tempo e o tipo de agitao foram otimizados
posteriormente para se obter melhor eficincia na extrao dos princpios
ativos. Aps agitao as amostras foram colocadas em freezer a -20 C, por 12
horas. Aps este perodo, a amostra congelada foi descartada e a fase
orgnica lquida separada por filtrao simples em papel de filtro contendo 1,0
g de sulfato de sdio anidro (Vetec PA), sendo o papel de filtro previamente
lavado com acetonitrila resfriada. Os volumes dos extratos obtidos foram
ajustados em bales volumtricos para 10,0 mL com acetonitrila, transferidos e
armazenados em frascos de vidro no freezer at o momento da anlise
cromatogrfica.
2.3.3. Otimizao da tcnica extrao slido-lquido

purificao em baixa temperatura (ESL-PBT)
com
No processo de otimizao da tcnica ESL-PBT as condies de anlise

dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em carne
foram avaliadas procurando-se obter os melhores rendimentos com menor
tempo. Alguns parmetros que influenciam os resultados no processo de
extrao foram avaliados usando amostras de carne (alcatra e fgado bovino)
fortificadas. A quantificao dos analitos foi realizada por cromatografia gasosa
empregando deteco por captura de eltrons (CG-ECD) utilizando o mtodo
do padro interno.
Porm, antes da realizao das etapas de otimizao, alguns estudos
preliminares (2.3.3.1) foram realizados, de modo que esta fosse executada de
uma forma mais simples e eficiente.
26
Materiais e Mtodos
2.3.3.1.
Ensaios preliminares
Um dos estudos preliminares teve como objetivo determinar a

quantidade de amostra de carne necessria no processo de ESL-PBT. Para
esse estudo, massas de 2,0000; 3,0000 e 4,0000 g foram medidas
separadamente (Balana analtica Sartorius BP 2215 com preciso de 1 x 10-4
g) em frascos de vidro transparente com tampa de plstico (30,0 mL
capacidade) e fortificadas como descrito no item 2.3.1 a fim de se obter no
extrato final, aps a extrao, uma concentrao igual a 0,10 mg L-1 de cada
analito para todas as massas trabalhadas.
A avaliao da massa foi realizada tanto para amostras de alcatra como
de fgado bovino empregando a tcnica ESL-PBT descrita no item 2.3.2.
Outro estudo preliminar teve como objetivo determinar o tempo de
contato dos ingredientes ativos com a carne no processo de fortificao das
amostras. Para isso, a amostra in natura descongelada foi fortificada como
descrito no item 2.3.1 variando-se o perodo em que os analitos estavam em
contato com a amostra de carne aps sonicao de 3 minutos, ao ar e em
temperatura ambiente (aproximadamente 25 C) em: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16,
20, 24 horas. Decorrido o intervalo de tempo estipulado para as amostras,
essas foram submetidas a tcnica ESL-PBT descrita no item 2.3.2, sendo
determinado o intervalo de tempo ideal para fortificao das amostras de carne.
2.3.4. Planejamento fatorial 23

Goulart (2004) e Vieira et al (2007) recomendam na descrio da
metodologia usar 8,0 mL de uma mistura extratora contendo acetonitrila (6,5
mL) e acetato de etila (1,5 mL), na extrao de piretrides em leite, gua e
solo. Esta mistura, nessa proporo, permite formar uma fase nica com
amostra aquosa (4,0 mL). Com o abaixamento da temperatura a amostra
aquosa solidificada, restando ainda no estado lquido a mistura extratora.
A acetonitrila, alm de ser descrita como sendo um dos melhores
solventes na extrao de agrotxicos (MASTOVSKA & LEHOTAY, 2004), tem
as caractersticas necessrias para ser usada na tcnica de ESL-PBT. Para
27
Materiais e Mtodos
que a sua eficincia como solvente extrator seja ampliada necessrio

modificar sua polaridade para que seja aplicado para a extrao de pesticidas
de diferentes polaridades. Essas modificaes podem ser feitas pela adio de
acetato de etila ou metano e a proporo entre os solventes extratores no
podem alterar as caractersticas da mistura extratora com relao formao
da fase nica e das caractersticas de congelamento (PINHO, 2007).
No se encontrou nenhum estudo sistemtico realizado para extrao de
agrotxicos em amostras de carne utilizando a tcnica ESL-PBT. Assim, na
otimizao do mtodo para amostras de carne, foi estabelecida a composio
da mistura extratora e a fora inica, de forma que a mistura extratora
mantivesse as caractersticas necessrias para extrao e o tempo e tipo de
agitao.
Para uma avaliao mais precisa da influncia dessas variveis no
rendimento da extrao, foi realizado um planejamento experimental completo
23 para avaliar a eficincia e a influncia de determinados parmetros no
processo de extrao. As variveis independentes testadas em dois nveis,
representados por (-) e (+), foram tempos de agitao (ta): 30 e 45 min; fora
inica (fi): 0,00 e 0,20 mol L-1 de NaCl; e composio do solvente extrator (se):
A e B. Os solventes extratores foram constitudos de diferentes propores de
gua / acetonitrila / acetato de etila: Solvente A: 1 / 8,0 / 0,0; solvente B: 1 / 6,5
/ 1,5. A varivel dependente foi o rendimento de extrao obtidos em cada
ensaio.
Foram realizados 16 ensaios, que corresponderam a todas as
combinaes possveis para os nveis (-) e (+) com uma repetio. Na Tabela 1
est representado o planejamento fatorial 23, com os trs fatores codificados
F(); F() e F() em dois nveis (-1) e (1).
As porcentagens de recuperao obtidas no experimento para cada um
dos agrotxicos foram utilizadas para avaliar os efeitos de cada fator e suas
interaes sendo, avaliadas estatisticamente pelo programa STATISTICA.
28
Materiais e Mtodos
Tabela 2.1. - Planejamento fatorial 23 para as amostras de carne bovina

fortificadas.
Fatores codificados
Fatores originais
Ensaios
F(1)
1e2
(1) Tempo
de agitao
(min)
30
(2) Fora
Inica Na+
(mol L-1)
0,00
(3) Solvente
extrator
F(2)
F(3)
3e4
45
0,00
5e6
30
0,20
7e8
45
0,20
9 e 10
30
0,00
11 e 12
45
0,00
13 e 14
30
0,20
15 e 16
45
0,20
F1 = Tempo de agitao (min), F2 = Fora inica (soluo de NaCl) mol L-1, F3 = Solvente
extrator A (1,0 mL de gua, 8,0 mL de acetonitrila e 0,0 mL de acetato de etila ) e B (1,0 mL de
gua, 6,5 mL de acetonitrila e 1,5 mL de acetato de etila).
O planejamento fatorial foi aplicado tanto para amostras de alcatra como

de fgado, cada um dos ensaios foi realizado com 3,0000 g de amostra
fortificada (2.3.1) e empregando-se a tcnica geral de extrao ESL-PBT
descrita no item 2.3.2.
2.3.5. Efeito do ultra-som na eficincia de extrao dos analitos em

carne bovina
Com as condies otimizadas, avaliou-se o efeito das ondas ultrasnicas na extrao dos agrotxicos em carne bovina. Realizou-se testes em
amostras previamente fortificadas de acordo com o item 2.3.1, que foram
extradas com as misturas de solventes B para carne bovina tipo alcatra e
mistura de solventes A para o fgado bovino durante 5, 10 e 15 minutos de
banho ultra-snico e submetidas s etapas subseqentes descritas no item
2.3.2.
29
Materiais e Mtodos
Para efeito de comparao, foi realizada simultaneamente uma extrao

empregando 30 minutos de agitao em uma mesa agitadora (Tecnal TE - 420)
a 25 C e a 175 oscilaes por minuto (opm).
As etapas posteriores, tais como, congelamento e passagem por papel
de filtro com sulfato de sdio anidro, foram idnticas s descritas no item 2.2.2.
2.3.6. Eficincia de adsorventes no clean up dos extratos obtidos

na ESL-PBT de amostras de carne bovina
Os extratos orgnicos obtidos aps a ESL-PBT de amostras de fgado
bovino foram submetidos a uma etapa de clean up para melhorar a qualidade
dos mesmos com vistas anlise cromatogrfica. Aps o processo de
resfriamento a -20 C da mistura, a fase orgnica lquida foi filtrada sob
gravidade em cartucho de polietileno contendo 1,0000 g de sulfato de sdio
anidro e 1,5000 g de adsorvente na camada inferior, massa essa escolhida
para trabalhar com um proporo amostra:adsorvente igual a 2:1. Os extratos
foram recuperados para 10,0 mL em acetonitrila e armazenadas em freezer at
o momento da anlise cromatogrfica. Os adsorventes avaliados foram florisil
(J. Barcker) e slica (Mercker), escolhidos devido ao menor custo e maior
disponibilidade.
Com o objetivo de avaliar qual metodologia remove a cor dos extratos
de forma mais efetiva, foi avaliada a intensidade da cor dos extratos das
amostras de fgado. Foram analisadas por espectrofotometria amostras que
foram submetidas a tcnica ESL-PBT, ESL-PBT e clean up com filtrao em
adsorventes (florisil ou slica), DMFS com os adsorventes florisil ou slica
(procedimento descrito posteriormente no item 2.4). Foi realizada uma
varredura na regio do UV-visvel de 250 a 780 nm utilizando um
espectrofotmetro HITACHI, U-1100.
Tambm foi estudado o clean up dos extratos com adio de carvo
ativado diretamente na mistura da amostra com a fase extratora, antes do
processo de homogeneizao. Analisou-se o clean up com 0, 5, 10 e 15 mg de
carvo ativo.
30
Materiais e Mtodos
2.4.
DISPERSO DE MATRIZ EM FASE SLIDA DMFS
2.4.1. Fortificao das amostras de carne

Uma pequena quantidade de amostra (0,5000 g para carne tipo alcatra e
fgado bovino), foi fortificada, com 0,010 mL da soluo de trabalho contendo
os quatro agrotxicos na concentrao de 10,0 mg L-1, a fim de se obter no
extrato final (1,0 mL), aps a extrao, uma concentrao igual a 0,10 mg L-1
de cada analito.
Aps adio dos analitos, as amostras foram levadas ao ultra-som
(Unique, MAXICLEAN 750) por 3 minutos e deixadas em repouso por
aproximadamente 30 minutos para que houvesse maior interao dos
agrotxicos com a amostra.
2.4.2. Extrao dos agrotxicos em carne bovina por DMFS

Tcnica Geral
Amostras de alcatra e fgado fortificado (item 2.4.1), de massa igual a
0,5000g (Balana analtica Sartorius BP 2215 com preciso de 1 x 10-4 g),
foram colocadas em cadinhos de teflon onde foram acrescentados 0,5000 g de
adsorvente, condicionado em acetonitrila. Esta mistura foi macerada at a
completa disperso da amostra. A mistura (amostra + adsorvente) na
proporo de 1:1 foi transferida para uma coluna de polietileno (cartucho) de 10
mL contendo 1,0000 g de sulfato de sdio anidro retido por l de vidro.
O cartucho foi adaptado a um sistema de vcuo conforme a Figura 2.1.
31
Materiais e Mtodos
Figura 2.1. Representao da eluio de cartuchos de polietileno contendo

amostras dispersas em uma fase slida.
Em uma vazo de 0,4 mL min-1, aproximadamente, adicionaram-se 10,0
mL de solvente ao cartucho. Ao extrato coletado acrescentou-se 0,010 mL da
soluo de bifentrina (padro interno) a 10,0 mg L-1. Evaporou-se o solvente
sob corrente de ar e o extrato foi recuperado em 1,0 mL de acetonitrila para
anlise por cromatografia gasosa.
2.4.3. Avaliao do adsorvente e eluente para a tcnica de extrao

DMFS
O procedimento descrito no item 2.4.2 foi empregado para avaliar a
influncia de dois adsorvente, slica e florisil, e trs eluentes, acetato de etila,
acetonitrila e a mistura hexano:acetona, na porcentagem de recuperao dos
agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina e na remoo
de componentes da matriz, como mostrado na tabela 2.2.
32
Materiais e Mtodos
Tabela 2.2 - Adsorventes e eluentes avaliados na otimizao da DMFS

Ensaios
Adsorventes
Eluentes
Slica
Acetato de Etila
Slica
Acetonitrila
Slica
Hexano:Acetona (9:1)
Florisil
Acetato de Etila
Florisil
Acetonitrila
Florisil
Hexano:Acetona (9:1)
Os ensaios foram realizados em triplicatas. Cada combinao de

adsorvente e eluente foi acompanhada de um branco (extrato da matriz isenta
de agrotxicos).
2.5.
ANLISE CROMATOGRFICA
A anlise qualitativa e quantitativa dos princpios ativos estudados foi
realizada em um cromatgrafo a gs Shimadzu, modelo GC-17A equipado com

um detector por captura de eltrons (DCE).
As condies analticas otimizadas para as anlises, tais como,
temperatura da coluna, do injetor e do detector, vazo dos gases e escolha do
tipo de coluna cromatogrfica, foram determinadas visando um pequeno tempo
de anlise, com uma boa resoluo e separao entre os picos dos agrotxicos
de interesse.
Os padres de clorpirifs, endosulfan, deltametrina e cipermetrina foram
analisados por CG-EM, com o objetivo de confirmar a identificao dos
princpios ativos e a pureza para serem utilizados na metodologia ESL-PBT.
Essa determinao foi realizada em um cromatgrafo a gs Shimadzu,
modelo GC-17A equipado com um espectrmetro de massa (EM). As
condies ideais para anlise foram semelhantes utilizada no CG-ECD,
porm, utilizando gs hlio.
33
Materiais e Mtodos
2.6.
Anlise quantitativa dos agrotxicos em carne bovina

A identificao dos agrotxicos (clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina) nos extratos foi realizada pelo tempo de reteno dos mesmos
nos seus cromatogramas, comparando com os da soluo padro contendo os
mesmos princpios ativos.
A quantificao foi realizada utilizando o mtodo da padronizao
interna. Solues padro de concentraes crescentes dos analitos (5,0; 10,0;
25,0; 50,0; 125,0 250,0; 375,0; 500,0; 650,0; 750,0 g L-1), contendo como
padro interno (PI) bifentrina 100 g L-1, foram analisadas no cromatgrafo a
gs nas condies analticas pr-determinadas. Construram-se curvas
analticas, uma para cada princpio ativo, relacionando a razo entre as reas
do pico atribudo substncia de interesse e a rea do pico do padro interno
(rea do analito/rea do padro interno de concentrao constante) com a
concentrao (varivel) do analito.
Atravs da regresso linear destas curvas analticas, foram obtidas
equaes da reta que foram utilizadas para calcular as concentraes dos
agrotxicos nas amostras. Os extratos das amostras antes das anlises,
tambm receberam a adio de padro interno (mesma quantidade e
concentrao adicionado nas solues padro), permitindo pela razo das
reas determinar a concentrao dos compostos presentes.
2.7.
VALIDAO DO MTODO ANALTICO

Para garantir que um novo mtodo analtico gere informaes confiveis
e interpretveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliao denominada

validao (RIBANI, 2004). Na literatura, existem diversas formas de se conduzir
a validao de um mtodo analtico, no entanto, os principais parmetros so:
seletividade, linearidade de resposta do detector, limite de deteco e
quantificao, preciso, exatido e robustez (INMETRO, 2003).
O procedimento realizado para validao do mtodo proposto foi feito
baseando-se nas recomendaes do Instituto Nacional de Metrologia,
Normalizao
Qualidade
Industrial
(INMETRO,
2003),
RIBANI
34
Materiais e Mtodos
colaboradores (2004), Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA, 2003)

e Associao Grupo de Analistas de Resduos de Pesticidas (AGARP, 1999).
2.7.1. Seletividade
A seletividade do mtodo foi avaliada atravs da comparao de
cromatogramas dos extratos obtidos aps a extrao das amostras de alcatra e
fgado bovino isenta dos inseticidas clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina com os cromatogramas dos extratos obtidos da matriz fortificada
submetida ao procedimento otimizado.
2.7.2. Linearidade de resposta do mtodo proposto

A linearidade de resposta do mtodo proposto foi determinada pela
injeo de extratos obtidos de amostras fortificados com os princpios ativos
clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em acetonitrila em
concentraes crescentes: 10,0; 20,0; 30,0; 50,0; 100,0; 120,0 e 150,0 g L-1
para alcatra e 15,0; 30,0; 45,0; 75,0; 100,0; 120,0 e 150,0 g L-1 para fgado
bovino. Em todas as solues foram adicionados 0,10 mL da soluo padro
de bifentrina 10,0 mg L-1, utilizado como padro interno. Aps a anlise
cromatogrfica, foram construdas curvas analticas, relacionando as razes da
rea do analito e do padro interno com as concentraes dos produtos
estudados, conforme o procedimento descrito no item 2.5. A linearidade foi
avaliada, atravs da regresso linear destas curvas analticas.
2.7.3. Limite de deteco e limite de quantificao do CG-DCE

Os Limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) para cada um dos
agrotxicos foram determinados usando o mtodo da relao sinal/rudo, onde
a menor concentrao detectada ou quantificada deve ser aquela onde a rea
3 e 10 vezes, respectivamente, a rea do rudo do equipamento.
Foram injetadas extratos de amostras fortificadas com os princpios
ativos, clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em acetonitrila e em
35
Materiais e Mtodos
concentraes decrescentes de 15,0; 10,0; 5,0 e 3,0 g L-1, at ser observada

a relao sinal/rudo nas propores de 3:1 e 10:1.
2.7.4. Preciso
A preciso do mtodo ESL-PBT em alcatra e fgado bovino, foi estimada
por um estudo intralaboratorial, avaliando-se a repetitividade e a preciso
intermediria.
2.7.4.1. Repetitividade
A repetitividade do mtodo ESL-PBT para anlise de resduos dos
agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em carne
bovina, foi determinada realizando-se a extrao dos agrotxicos de amostras
fortificadas com concentraes prximas ao LMR para cada analito (50,0 g kg1
) seguindo o procedimento otimizado, em sete repeties, para o clculo da
estimativa do desvio padro relativo, conforme recomendaes do INMETRO

(2003).
2.7.4.2. Preciso intermediria

Para determinar a preciso intermediria do mtodo ESL-PBT, foi
efetuada em triplicatas, nas condies pr-estabelecidas no item 2.3.8, a
extrao dos quatros inseticidas de interesse de amostras de carne bovina
fortificada (50,0 g kg-1) em trs dias diferentes (1, 7, 30 dia). A preciso
intermediria foi avaliada pela porcentagem de recuperao, do desvio padro
e do coeficiente de variao, determinados para cada ensaio.
2.7.5. Exatido
Entre as maneiras de avaliar a exatido de um mtodo do mtodo ESLPBT pode-se recorrer aos ensaios de recuperao.
36
Materiais e Mtodos
2.7.5.1. Ensaio de recuperao

Nos ensaios de recuperao as substncias de interesse foram
adicionadas alcatra e ao fgado bovino em concentraes prximas a 1, 2 e 5
vezes o limite de quantificao (LQ) do CG-DCE (item 2.5.3). Desta forma, os
testes foram realizados extraindo-se conforme o procedimento descrito no item
2.3.8, os analitos das amostras de carne bovina (alcatra e fgado), Os valores
das recuperaes obtidas nos ensaios foram utilizados para avaliar este
parmetro.
2.8.
AVALIAO DO EFEITO DE MATRIZ NA PORCENTAGEM DE

RECUPERAO DOS AGROTXICOS
Para observar o efeito de matriz na ESL-PBT em amostras de carne
bovina na anlise de clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina por

cromatografia gasosa foram feitos dois estudos:
2.8.1. Superposio de matriz

Quando solues padro preparadas em solvente puro e analisadas
por cromatografia gasosa, apresentam respostas diferentes das mesmas
solues padro preparadas no extrato da matriz, isenta dos agrotxicos,
caracteriza-se o efeito de matriz. Para avaliar essa influncia dos compostos na
matriz na resposta do detector foram preparadas duas sries de solues
padro contendo os quatro agrotxicos nas concentraes de 5,0; 10,0; 25,0;
75,0; 150,0; 300,0; 500,0; 625,0 e 750,0 g L-1. A primeira srie foi preparada
pela diluio da soluo de trabalho (10,0 mg L-1) contendo os quatro analitos
em acetonitrila pura. A segunda srie dos padres foi preparada pela diluio
da mesma soluo de trabalho no extrato da matriz, obtido da ESL-PBT de
carnes (alcatra ou fgado) isentas dos princpios ativos.
37
Materiais e Mtodos
2.8.2. Variao da resposta do detector em funo da saturao do

sistema de injeo
A variao da resposta do detector foi avaliada pela rea de cada
agrotxico antes e aps a saturao do sistema com os co-extrativos da matriz
foi utilizada para estudar o efeito de matriz na determinao de resduos de
agrotxicos em carne. Foi avaliada pela comparao dos resultados de trs
injees sucessivas de uma soluo padro 100,0 g L-1 em acetonitrila,
seguida de cinco injees sucessivas de um extrato obtido da ESL-PBT de
amostras de carne bovina (alcatra ou fgado) isentas dos analitos. Com o
sistema cromatogrfico saturado foram injetadas trs vezes a soluo padro
100,0 g L-1 em acetonitrila e as respostas do clorpirifs, endosulfan,
cipermetrina e deltametrina antes e aps a saturao com os extratos da matriz
foram comparadas.
2.9.
APLICAO DA TCNICA ESL-PBT EM AMOSTRAS DO COMRCIO

DE VIOSA-MG
A tcnica ESL-PBT para determinao dos agrotxicos clorpirifs,
endosulfan, cipermetrina e deltametrina otimizada e validada, foi aplicada em

amostras de alcatra e fgado bovino coletadas no comrcio local da cidade de
Viosa, estado de Minas Gerais.
Aps o recebimento das amostras, essas foram trituradas at que uma
massa homognea fosse obtida e foram acondicionadas em potes de
polietileno, vedadas, identificadas e conservadas em freezer, no momento da
extrao
as
amostras
foram
deixadas
temperatura
do
ambiente
(aproximadamente 25 C) at descongelarem. Alquotas de 3,0000 g foram

retiradas e submetidas ao processo de extrao, os extratos obtidos foram
analisados no CG-DCE. Todas as anlises foram realizadas em triplicatas,
tomando-se cuidado especial na limpeza do material utilizado. Vidrarias e
liquidificador foram lavados com detergente, gua corrente, gua destilada e
acetona, aplicada com o auxlio de uma pisseta aps a triturao de cada
amostra.
O restante das amostras processadas foi acondicionado em recipientes
38
Materiais e Mtodos
plsticos, identificadas e armazenadas temperatura de -20 C, para eventual

necessidade de repetio do processo.
39
Resultados e discusso
3. RESULTADOS E DISCUSSO
3.1.
ANLISE CROMATOGRFICA
Para separao, identificao e quantificao dos resduos de
agrotxicos nos extratos de carne, foi utilizada cromatografia gasosa com

deteco por captura de eltrons. Devido ao alto poder de resoluo da tcnica
cromatogrfica e alta sensibilidade do detector aos compostos halogenados, foi
possvel quantificar os princpios ativos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina. Inicialmente foram estabelecidas as condies cromatogrficas,
otimizadas as temperaturas do injetor, da coluna, do detector e fluxo de gs de
arraste, de forma que, possibilitassem uma boa separao dos compostos
avaliados.
As condies ideais determinadas para anlise cromatogrfica foram:
Coluna capilar Agilent Technologies DB-5 com fase estacionria

composta de 5 % de fenil e 95 % de dimetilpolisiloxano, 30 m de
comprimento; 0,25 mm de dimetro interno e 0,1 m de espessura de
filme.
Programao da coluna: 200 C
10 C min
-1
290 C (2 min)
Tempo total de anlise: 11 minutos

Temperatura do injetor: 280 C
Temperatura do detector (DCE): 300 C
Volume injetado: 1,0 L
Gs de arraste: Nitrognio
Vazo do gs de arraste: 1,2 mL min-1
Diviso de fluxo: 1:5
40
Os agrotxicos estudados foram identificados pela comparao do

tempo de reteno dos compostos de interesse com os dos padres dessas
substncias, analisadas nas mesmas condies cromatogrficas.
A anlise cromatogrfica dos padres e da amostra foi realizada de
acordo com as condies descritas acima. Na Figura 3.1, est apresentado um
cromatograma obtido pela anlise de uma soluo padro na concentrao de
100,0 g L-1 em acetonitrila, com o tempo de anlise de 10 minutos.
Resposta do detector
200000
3,2
2,6
22500
3,8
15000
5,0
7,3
7500
8,8
0
0
10
Tempo de reteno (min)
Figura 3.1. Cromatograma de uma soluo padro de 100,0 g L-1 dos

princpios ativos em acetonitrila, onde tR= 2,6: clorpirifs, tR=
3,3: -endosulfan, tR= 3,8: -endosulfan, tR= 5,0: bifentrina (PI),
tR= 7,3: cipermetrina, tR= 8,8: deltametrina.
Os picos com tempo de reteno, tR, iguais a 2,6; 3,3; 3,8; 7,3 e 8,8
correspondem
aos
agrotxicos
clorpirifs,
-endosulfan,
-endosulfan,
cipermetrina e a deltametrina, respectivamente e o pico com tR igual a 5,0

corresponde ao padro interno bifentrina. A ordem de eluio foi definida pela
massa molar e presso de vapor crescentes dos compostos entre outras
propriedades fsicas.
A presena de mais de um pico para cada agrotxico est relacionado
com a converso em ismeros durante a injeo no cromatgrafo
(MATOVSK & LEHOTAY, 2004). Dessa maneira, considerou-se como o
valor de rea para endosulfan, cipermetrina e deltametrina, a soma das reas
dos picos dos seus ismeros.
41
Anlises por CG-EM permitiram confirmar os princpios ativos utilizados

e a pureza dos mesmos, sendo as solues de trabalho, obtidas a partir da
diluio das solues estoques dos padres, utilizadas na fortificao das
amostras de carne bovina durante a execuo do trabalho.
Atravs das condies cromatogrficas estabelecidas foi possvel
separar os agrotxicos estudados, com pequeno tempo de anlise e boa
separao dos analitos estudados
3.2.
CURVAS ANALTICAS
DETECTOR
LINEARIDADE
DA
RESPOSTA
DO
A quantificao dos quatro agrotxicos foi realizada pelo mtodo do

padro interno, onde se relaciona a concentrao dos analitos com a razo das
reas dos agrotxicos/rea do padro interno.
O padro interno tem sido utilizado para diminuir erros no volume de
injeo, pequenas variaes no fluxo do gs de arraste e na temperatura da
coluna, no afetando assim, significantemente as respostas cromatogrficas.
A bifentrina foi o piretride escolhido como padro interno, por ser um
analito semelhante s substncias quantificadas, possui o tempo de reteno
prximo, no faz parte da amostra, no reage com os componentes da matriz e
no degrada. O padro utilizado apresentou elevado grau de pureza, possui
pico com boa resoluo e separao nas condies cromatogrficas e
dificilmente encontrado em amostras de carne.
As curvas analticas (Figura 3.2) foram construdas atravs da injeo de
padro de clorpirifs, endosulfan, deltametrina, cipermetrina e bifentrina em
concentraes crescentes (10,0 a 750,0 g L-1) e analisadas nas condies
analticas pr-estabelecidas.
42
APadro/APadro interno
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
200
400
600
800
-1
Concentrao (ug L )
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Figura 3.2. Curvas analticas dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan,

cipermetrina e deltametrina utilizando como padro interno (PI)
a bifentrina.
A Linearidade da resposta do detector do sistema de deteco foi
verificada atravs da regresso linear dos dados das curvas analticas (Tabela
3.1).
Tabela 3.1. - Parmetros das curvas analticas obtidas para os quatro
agrotxicos estudados.
Analitos
Equao da reta
Coeficiente de correlao
(r)
Clorpirifs
Y = 0,012x + 0,2423
0,9975
Endosulfan
Y = 0,0618x - 0,2614
0,9982
Cipermetrina
Y = 0,0088x - 0,0542
0,9984
Deltametrina
Y = 0,0088x - 0,1013
0,9956
Pode-se observar que o detector mais sensvel ao endosulfan, pois o

princpio ativo que apresenta um elevado coeficiente angular (a), seguido do
clorpirifs, e dos piretrides. O endosulfan possui na sua molcula 6 tomos de
cloro e assim tm maior afinidade por eltrons livres, causando uma maior
diminuio da corrente eltrica e maior sinal na deteco. O clorpirifs
apresenta em sua estrutura 3 tomos de cloro, os piretrides apresentam 2
43
tomos de cloro e 2 tomos de bromo para cipermetrina e deltametrina

respectivamente, justificando a ordem de sensibilidade do detector.
Um coeficiente de correlao (r) maior que 0,999 considerado como
evidncia de um ajuste ideal dos dados para a linha de regresso. A ANVISA
recomenda um coeficiente de correlao igual a 0,99 (ANVISA, 2003, RIBANI
et al, 2004). Logo, observa-se que os valores de r obtidos so maiores que
0,99, indicando que existe uma resposta linear (uma relao direta
sinal/concentrao) do detector na faixa de 10,0 a 750,0 g L-1 para os analitos
estudados.
3.3.
OTIMIZAO DA TCNICA DE EXTRAO SLIDO-LQUIDO COM

PURIFICAO EM BAIXA TEMPERATURA (ESL-PBT).
Na otimizao da metodologia ESL-PBT para alcatra e fgado bovino,
alguns parmetros foram avaliados individualmente e em seguida foi realizado

um planejamento fatorial em que foram avaliadas trs variveis (tempo de
agitao mecnica, fora inica, composio do solvente) e as interaes entre
elas.
Segundo RIBANI, 2004, os intervalos aceitveis de recuperao para
anlise de resduos geralmente esto entre 70 e 120 %, com preciso de at
20 %. Porm, dependendo da complexidade analtica e da amostra, este valor
pode ser de 50 a 120 %, com preciso de at 15 %. O objetivo desse trabalho
foi otimizar todos os parmetros de forma que a porcentagem de recuperao
estivesse entre os intervalos aceitveis de 70 e 120 %.
A investigao de algumas variveis, tais como a massa de carne bovina
(fixada em 3,0000 g) e tempo de contato foram necessrias para auxiliar na
escolha de quais fatores e nveis seriam estudados no planejamento estatstico
da ESL-PBT.
3.3.1. Avaliao da massa de carne bovina

Para estabelecer as condies ideais da ESL-PBT e anlise dos
agrotxicos em carne bovina, foram feitos alguns testes preliminares no intuito
de identificar as massas de alcatra e fgado bovino adequadas para o processo.
44
A principal vantagem de se utilizar quantidades maiores de amostra que

maiores quantidades do analito so extrados em um mesmo volume de
solvente. Entretanto, o uso de quantidades maiores de amostra pode provocar
a contaminao do extrato pela extrao de interferentes da matriz, alm de
dificultar a etapa de congelamento.
Os resultados obtidos aps avaliao deste parmetro para alcatra e
% Recuperao
fgado esto representados na Figura 3.3.a e Figura 3.3.b respectivamente.
a)
120,0
110,0
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
% Recuperao
2,0000 g
3,0000 g
4,0000g
110,0
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
b)
Clorpirifs
Endosulfan Cipermetrina Deltametrina

Agrotxicos
2,0000 g
3,0000 g
4,0000g
Figura 3.3. - Influncia da massa na porcentagem de recuperao de quatro

agrotxicos de amostras de alcatra (a) e fgado (b)
45
Os resultados para todas as massas avaliadas foram semelhantes,

devido ao elevado valor de desvio padro obtido nos experimentos. Porm,
observa-se para amostras de alcatra que a massa com melhor porcentagem de
recuperao para os agrotxicos clorpirifs, cipermetrina e deltametrina a de
3,0000 g e para o endosulfan a de 2,0000 g. Para amostras de fgado, 4,0000 g
foi a massa com maior porcentagem de recuperao para o clorpirifs,
cipermetrina e deltametrina. Durante a conduo dos experimentos, observouse que a massa de 2,0000 g de carne bovina (alcatra e fgado) era pequena
para ser trabalhada que os extratos obtidos a partir de 4,0000 g de amostras de
fgado bovino apresentaram colorao amarelada mais intensa, possivelmente
devido a extrao de maiores quantidades de espcies coloridas (por exemplo
a mioglobina) e outros componentes da matriz, diminuindo a repetitividade na
determinao dos agrotxicos analisados, sendo os extratos considerados
inapropriados para anlise cromatogrfica.
Desta forma, decidiu-se trabalhar com a massa de 3,0000 gramas para
ambas as amostras de carne.
3.3.2. Tempo de contato entre os agrotxicos e as amostras de

carne bovina.
Outra etapa inicial do processo de otimizao da tcnica consistiu em
avaliar o tempo de contato entre os agrotxicos e amostras antes de realizar a
extrao. Foi avaliado o efeito causado na porcentagem de recuperao dos
agrotxicos, quando os mesmos eram deixados em contato com as amostras
de carne bovina, sem refrigerao, por diferentes intervalos de tempo.
O aumento do tempo de contato entre os agrotxicos e a amostra, pode
levar ao incio do processo de degradao destes compostos antes de serem
extrados, ou permitem que estes se liguem mais fortemente matriz slida,
diminuindo suas porcentagens de recuperao (PAULA, 2007). Porm, em se
tratando de amostras in natura, observa-se que, quando essas amostras
permanecem muito tempo sem refrigerao, ocorre a sua decomposio,
alterao enzimtica dos tecidos, podendo levar degradao dos compostos.
Ao analisar amostras de alcatra e fgado bovino em diferentes tempos de
fortificao, contados aps sonicao por 3 minutos, foi possvel observar que
46
no tempo de fortificao mnimo, extrao imediatamente aps sonicao por 3

minutos, at duas horas os valores de recuperao eram muito prximos.
Porm, aps perodo de 2 horas a anlise cromatogrfica era prejudicada,
devido ao aumento da linha de base. Para preservao do sistema
cromatogrfico, amostra com tempo de fortificao superior a 2 horas no
foram analisadas. Logo, para a realizao do planejamento fatorial a faixa de
tempo de contato entre os agrotxicos e a carne escolhida, aps sonicao por
3 minutos, foi de zero a duas horas.
3.4.
PLANEJAMENTO FATORIAL NA OTIMIZAO DA TCNICA DE

ESL-PBT
Estudo realizado por Vieira (2005) demonstrou que a proporo
gua:acetonitrila (1:2) resultou em melhores porcentagens de extrao de

agrotxicos na ESL-PBT. Com o objetivo de que a proporo gua:solvente
orgnico aproximasse da relao 1:2 e considerando que a massa de carne
bovina (3,0000 g) contm aproximadamente 75 % de gua, optou-se por
acrescentar 1,0 mL de gua e 6,5 mL de acetonitrila.
Na otimizao avaliou-se a composio do solvente extrator, sendo uma
utilizando somente acetonitrila (8,0 mL) e a outra com polaridade reduzida.
Para reduzir a polaridade da acetonitrila optou-se por adicionar acetato de etila.
Com essa combinao a extrao dos agrotxicos menos polares favorecida.
Entretanto, a miscibilidade do acetato de etila em acetonitrila e gua so
limitadas. Vieira et al (2007) determinou que para a proporo 1:2 (fase
aquosa:fase orgnica) a quantidade mxima de acetato de etila adicionado em
8 mL de fase orgnica fosse 1,5 mL para no romper o equilbrio da fase nica.
Por isso, adotou-se um volume mximo de 1,5 mL em 8,0 mL de fase extratora,
para garantir uma fase homognea.
Outro fator avaliado foi a fora inica, cujo o aumento sempre
recomendado na extrao de pesticidas em amostras aquosas, pois a adio
de um sal mistura extratora pode melhorar a taxa de recuperao,
particularmente, no caso de analitos polares. O aumento da fora inica
provoca reduo na solubilidade do analito na matriz, facilitando a sua extrao
pela fase orgnica (LANAS, 2004). Alm de melhorar a porcentagem de
47
extrao, o aumento da fora inica diminui a formao de emulses.

Entretanto, o aumento considervel da fora inica pode romper o
equilbrio da fase nica na ESL-PBT, antes do congelamento da amostra,
fenmeno denominado salting-out. Assim, para manter as caractersticas da
mixtura extratora (6,5 mL de acetonitrila, 1,0 mL de gua e 1,5 mL de acetato
de etila), e avaliar o efeito da fora inica, o volume de gua foi substitudo por
uma soluo de NaCl 0,20 mol L-1.
Neste trabalho, para uma avaliao mais precisa da influncia de cada
varivel e suas interaes sobre a porcentagem de recuperao de cada
agrotxico, com um mnimo de experimentos, foi realizado um planejamento
experimental do tipo fatorial completo 23, no programa STATISTICA, no qual
as variveis independentes foram tempo de agitao, fora inica e
composio do solvente e a varivel dependente a porcentagem de
recuperao. Devido a pequena diferena entre os nveis (+) e (-) das variveis
independentes, no foi realizada no planejamento a avaliao do ponto central,
pois o aumento da fora inica ou do volume de acetato de etila adicionado na
mistura extratora romperia o equilbrio da fase nica, separando as fases,
diminuindo a superfcie de contato entre os analitos e os solventes.
Na Tabela 3.2 e 3.3 esto apresentadas as taxas mdias de
recuperao de cada um dos agrotxicos, o efeito de cada fator, suas
interaes e as estimativas do erro experimental para alcatra e fgado
respectivamente. Para decidir se os efeitos calculados eram significativos,
realizou-se o teste de t (Student) para = 0,05 e = 8, ou seja, no nvel de 95
% de confiana o valor de t correspondente a 8 graus de liberdade 2,306.
Isso quer dizer que s ser considerado estatisticamente significativo, o efeito
cujo valor de tcalculado for maior que 2,306.
48

experimentos do planejamento fatorial para amostras de alcatra
bovina.
Efeito (%)
(%)
t (n=8) (%)
Clorpirifs
Recuperao mdia
79,11
0,77
102,82
(1) Tempo de agitao
0,06
1,54
0,04
(2) Fora inica
3,05
1,54
1,98
3,36
1,54
2,18
(1) e (2)
0,90
1,54
0,58
(1) e (3)
-1,92
1,54
-1,25
(2) e (3)
-0,36
1,54
-0,23
(3) Composio do
solvente
Endosulfan
Recuperao mdia
80,34
2,05
39,13
(1) Tempo de agitao
-10,59
4,11
-2,58
(2) Fora inica
-3,32
4,11
-0,81
-2,71
4,11
-0,66
(1) e (2)
5,94
4,11
1,45
(1) e (3)
-0,58
4,11
-0,14
(2) e (3)
-4,37
4,11
-1,06
(3) Composio do
solvente
Cipermetrina
Recuperao mdia
117,06
2,91
40,27
(1) Tempo de agitao
2,60
5,81
0,45
(2) Fora inica
0,33
5,81
0,06
solvente
13,57
5,81
2,33
(1) e (2)
1,72
5,81
0,30
(1) e (3)
-7,61
5,81
-1,31
(2) e (3)
-0,50
5,81
-0,09
(3) Composio do
49
Deltametrina
Recuperao mdia
87,38
4,33
20,19
(1) Tempo de agitao
1,42
8,65
0,16
(2) Fora inica
7,70
8,65
0,89
15,57
8,65
1,80
(1) e (2)
1,36
8,65
0,16
(1) e (3)
12,85
8,65
1,48
(2) e (3)
3,09
8,65
0,36
(3) Composio do
solvente
*(Em negrito) Efeito estatisticamente significativo ao nvel de 95 % de probabilidade pelo teste t

(ttab > t0,05; 8 = 2,306).

experimentos do planejamento fatorial para amostras de fgado
bovino.
Efeito (%)
(%)
t (n=8) (%)
Clorpirifs
Recuperao mdia
87,27
1,35
64,69
(1) Tempo de agitao
1,09
2,70
0,40
(2) Fora inica
2,17
2,70
0,80
2,01
2,70
0,75
(1) e (2)
-0,60
2,70
-0,22
(1) e (3)
-0,60
2,70
-0,22
(2) e (3)
-3,03
2,70
-1,12
(3) Composio do
solvente
Endosulfan
Recuperao mdia
78,56
1,30
60,27
(1) Tempo de agitao
-0,65
2,61
-0,25
(2) Fora inica
3,33
2,61
1,28
-1,97
2,61
-0,76
(1) e (2)
-1,61
2,61
-0,62
(1) e (3)
-2,94
2,61
-1,13
(2) e (3)
-1,74
2,61
-0,67
(3) Composio do
solvente
50
Cipermetrina
Recuperao mdia
114,71
2,21
51,97
(1) Tempo de agitao
1,09
4,41
0,25
(2) Fora inica
-2,37
4,41
-0,54
-1,90
4,41
-0,43
(1) e (2)
3,76
4,41
0,85
(1) e (3)
0,53
4,41
0,12
(2) e (3)
-0,33
4,41
-0,07
(3) Composio do
solvente
Deltametrina
Recuperao mdia
119,37
2,48
48,19
(1) Tempo de agitao
-2,99
4,95
-0,60
(2) Fora inica
-6,36
4,95
-1,28
-0,77
4,95
-0,16
(1) e (2)
-14,01
4,95
-2,83
(1) e (3)
-13,03
4,95
-2,63
(2) e (3)
-1,43
4,95
-0,29
(3) Composio do
solvente
*(Em negrito) Efeito estatisticamente significativo ao nvel de 95 % de probabilidade pelo teste t

(ttab > t0,05; 8 = 2,306).
Os resultados obtidos tambm podem ser fornecidos em forma de

grficos. O Grfico de Pareto mostra os valores dos efeitos, possibilitando
verificar se os mesmos so estatisticamente significativos.
As Figuras 3.4.(a, b, c e d) e 3.5.(a, b, c e d) apresentam os Grficos de
Pareto obtidos nos planejamentos experimentais para alcatra e fgado bovino
respectivamente para os agrotxicos analisados, no qual o efeito to
significativo na porcentagem de recuperao quanto mais direita da linha
vermelha ele estiver. Tambm so mostrados os efeitos das interaes das
variveis duas a duas.
51
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
2,182253
(2) Fora
Inica
(2)Var2
1,97972
1by3
-1,24522
1by2
2by3
(1) Tempo
de
(1)Var1
Agitao
,5837401
-,231822
,0401854
p=,05
Effect Estimate (Absolute Value)
(a) Clorpirifs
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
-2,57859
1by2
1,445734
2by3
-1,06307
(2) Fora
Inica
(2)Var2
-,808083
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
1by3
-,658866
-,141111
p=,05
(b) Endosulfan
52
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
2,334701
1by3
-1,30936
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
,4475992
1by2
,2953297
2by3
-,086455
(2) Fora
Inica
(2)Var2
,0575407
p=,05
(c) Cipermetrina
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
1,7991
1by3
1,484707
(2) Fora
Inica
(2)Var2
,8901925
2by3
,3574916
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
,1645749
1by2
,1566326
p=,05
(d) Deltametrina
Figura 3.4 - Grfico de Pareto - amostras de alcatra
Segundo os grficos 3.4 (a, b, c e d) e a tabela 3.2, para amostras de
alcatra,
somente
endosulfan
cipermetrina
apresentam
efeitos
significativos. O tempo de agitao a varivel que mais interfere na

porcentagem de recuperao para o endosulfan e isso ocorre de forma inversa
53
(valor negativo do coeficiente), ou seja, o aumento do tempo de agitao de 30

para 45 minutos diminui a porcentagem de recuperao. Para a cipermetrina a
composio do solvente aumenta o rendimento quando se trabalha com o nvel
(+) (6,5 mL de acetonitrila e 1,5 mL de acetato de etila). Logo, para determinar
as condies timas da ESL-PBT, foram consideradas as variveis
significativas de forma que se tivesse o aumento na porcentagem de
recuperao para todos os analitos estudados. Observou-se que a presena de
fora inica no foi significativa para nenhum dos agrotxicos estudados, desta
forma, decidiu-se trabalhar sem fora inica para tornar a metodologia mais
simples.
As condies que apresentaram maior rendimento para todos os
agrotxicos em amostras de alcatra foram, composio do solvente (6,5 mL de
acetonitrila + 1,5 mL de acetato de etila), 30 minutos de agitao mecnica e
ausncia de fora inica.
2by3
-1,12114
(2) Fora
Inica
(2)Var2
,8041253
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
,7457374
,4029922
1by3
-,222915
1by2
-,221555
p=,05
(a) Clorpirifs
54
(2) Fora
Inica
(2)Var2
1,277913
1by3
-1,12622
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
-,757304
2by3
-,667998
1by2
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
-,617089
-,251222
p=,05
(b) Endosulfan
1by2
,8526187
(2) Fora
Inica
(2)Var2
-,536455
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
1by3
2by3
-,43098
,2479303
,1198111
-,074931
p=,05
(c) Cipermetrina
55
1by2
-2,82722
1by3
-2,63051
(2) Fora
Inica
(2)Var2
-1,28463
(1) Tempo de
(1)Var1
Agitao
2by3
(3) Composio do
(3)Var3
solvente
-,603158
-,288641
-,156395
p=,05
(d) Deltametrina
Figura 3.5 - Grfico de Pareto - amostras de fgado
Para as amostras de fgado, possvel observar pelos grficos 3.5 (a, b,
c e d) e a tabela 3.3, que somente a deltametrina apresenta efeitos
significativos. As interaes das variveis, tempo de agitao com a fora
inica e tempo de agitao com a composio do solvente extrator, so as que
mais interferem na porcentagem de recuperao para a deltametrina. O efeito
das interaes apresentou valores de coeficiente negativo (-14,00 e -13,03
respectivamente). Desta, foram utilizadas como condies otimizadas pelo
planejamento, os nveis (-) para todas as variveis independentes.
As condies que apresentaram maior rendimento para todos os
agrotxicos em amostras de fgado foram, composio do solvente (8,0 mL de
acetonitrila), 30 minutos de agitao mecnica e ausncia de fora inica.
3.5.
EFEITO DA AGITAO MECNICA E SONICAO NA EFICINCIA

DA EXTRAO DOS AGROTXICOS EM CARNE BOVINA
Para realizar a otimizao da tcnica de ESL-PBT, os efeitos do tempo
de agitao mecnica e do ultra-som na eficincia da extrao de carne bovina

(alcatra e fgado) contaminada com os agrotxicos clorpirifs, endosulfan,
cipermetrina e deltametrina foram avaliados. Para uma extrao eficiente dos
56
agrotxicos, necessrio que o solvente extrator tenha contato efetivo com as

molculas dos princpios ativos. A agitao mecnica tem sido empregada para
auxiliar a extrao de molculas orgnicas de slidos. Entretanto, o banho
ultra-snico vem, nos ltimos anos, assumindo tambm esta funo (SANTOS
& CAPELO, 2007).
Neste trabalho, avaliou-se a agitao mecnica e a agitao por ultrasom dos frascos contendo carne bovina fortificada e solvente extrator. As
amostras foram submetidas a por tempos de 5, 10 e 15 minutos e comparados
a agitao mecnica de 30 minutos. Os valores encontrados esto
% Recuperao
apresentados nas Figuras 3.6 e 3.7 para alcatra e fgado, respectivamente.

140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
5 minutos
10 minutos
15 minutos
Mesa Agitadora 30'

endosulfan, cipermetrina e deltametrina para amostras de alcatra.
Observa-se para amostras de alcatra que no houve grande diferena
nos rendimentos de extrao em funo do tipo e do tempo de agitao.
Entretanto, o tempo de 10 minutos em agitao por ultra-som aumentou a
porcentagem de recuperao para todos os analitos estudados. Sendo assim,
10 minutos de ultra-som foi escolhido na etapa de agitao da ESL-PBT.
Porcentagens de recuperao superiores a 100 % foram obtidas para os
piretrides, o tempo de contato entre a amostra e o solvente extrator pode ter
levado maior extrao de componentes da matriz que interferiram na
quantificao desses princpios ativos que so largamente afetados pelo efeito
57
% Recuperao
de matriz.
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
5 minutos
10 minutos
15 minutos
Mesa Agitadora 30'

endosulfan, cipermetrina e deltametrina para amostras de fgado.
Para amostras de fgado bovino, 30 minutos de agitao em mesa
agitadora apresentou melhor porcentagem de recuperao para todos os
princpios ativos. Observa-se tambm que recuperaes maiores que 120 %
foram obtidas para os agrotxicos cipermetrina e deltametrina nessas
condies, devido a co-extrao de componentes da matriz, interferindo na
quantificao desses princpios ativos. O endosulfan apresentou porcentagem
de recuperao semelhante independente do tipo e tempo de agitao.
Analisando as porcentagens de recuperao obtidas pela agitao por ultrasom, observou-se que o tempo de 10 minutos apresenta melhores resultados
para o clorpirifs e endosulfan e prximos a 100 % para a cipermetrina e
deltametrina, sendo, portanto o tempo de agitao selecionado para as
anlises de fgado bovino.
3.6.
EFICINCIA DE ADSORVENTES NO CLEAN UP DOS EXTRATOS

OBTIDOS NA ESL-PBT DE AMOSTRAS DE CARNE BOVINA
Resultados satisfatrios foram obtidos na otimizao da ESL-PBT
para as amostras de carne bovina, porm, devido presena de pigmentos nos

58
extratos obtidos a partir de amostras de fgado, tornou-se necessrio avaliar o

clean up desses extratos com o objetivo de diminuir a presena de pigmentos e
componentes da matriz que possam danificar o sistema cromatogrfico. No
entanto, conforme ressaltado por Schenck & Lehotay (2000), a etapa de clean
up pode resultar na perda parcial dos agrotxicos alm de aumentar o tempo e
o custo das anlises.
Foram avaliados os adsorventes florisil e slica na etapa de filtrao do
extrato aps o congelamento e a adio de carvo ativado na mistura da
amostra com a fase extratora, antes do processo de homogeneizao. Os
% Recuperao
resultados obtidos so mostrados na Figura 3.8 e 3.9.

130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
Clean up com Florisil
Clean up com slica
ESL-PBT
Figura 3.8. - Influncia dos adsorventes, slica e florisil, na porcentagem de

cipermetrina de extratos de fgado.
Comparando os extratos obtidos pela ESL-PBT com e sem presena
de adsorventes verificou-se que a slica e o florisil no eliminaram os pigmentos
do extrato, isto , a etapa de clean up introduzida no procedimento no
proporcionou extratos mais claros. Alm disso, a incluso desta etapa,
resultou na diminuio da taxa de recuperao dos quatro agrotxicos
estudados, devido adsoro destes nos adsorventes. A perda foi mais
acentuada para os piretrides, chegando a 86,6 % para cipermetrina quando
utilizado slica e 66,5 % para deltametrina quando utilizado florisil como
adsorvente (Figura 3.8).
59
A adio de pequenas quantidades de carvo ativado durante o

processo de extrao se mostrou mais eficiente na remoo dos componentes
da matriz, observado pela reduo parcial na colorao do extrato e menor
perda dos agrotxicos pela adsoro destes no carvo ativado do que a slica e
o florisil. A Figura 3.9 mostra a influncia da adio de diferentes quantidades
de carvo, durante a extrao, na porcentagem de recuperao dos
agrotxicos. Observou-se que medida que a quantidade de carvo ativado foi
aumentada nos extratos, maior a remoo dos pigmentos, mas as
porcentagens de recuperao dos analitos diminuram, com exceo do
endosulfan cuja extrao foi pouco afetada pela presena do carvo ativado
durante a homogeneizao. Porm, devido reduo das taxas de
recuperao para valores abaixo de 70 % para os demais agrotxicos, a etapa
de clean up utilizando carvo ativado ou outro adsorvente no foi
% R ecu p erao
recomendada.
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxico
5 mg carvo ativado
10 mg de carvo ativado
15 mg de carvo ativado
ESL-PBT
Figura 3.9. - Influncia de diferentes quantidades de carvo ativado, na

porcentagem de recuperao do clorpirifs, endosulfan,
deltametrina e cipermetrina em amostras de fgado.
A remoo dos pigmentos observada nos extratos submetidos etapa
de clean up foi acompanhada por espectrometria na regio UV-visvel.
Avaliando o espectro de adsoro na regio 250 a 780 nm (Figura 3.10) para
os extratos de fgado, isentos de agrotxicos, obtidos de diferentes tcnicas de
extrao e diferentes adsorventes, a ESL-PBT com etapa de clean up
60
utilizando florisil o que apresenta menor quantidade de pigmentos e assim,

menor quantidade de componentes da matriz, seguido da ESL-PBT com clean
up utilizando slica e a ESL-PBT, comportamento esse observado pela menor
absorbncia em 330 nm (regio UV) e 450 nm (banda de soret, comprimento
de onda caracterstica de hemoprotenas). Porm, como observado na Figura
3.8, a utilizao de adsorventes diminui a porcentagem de recuperao dos
agrotxicos, alm de aumentar o custo e o tempo de anlise, tornando no
conveniente a etapa de clean up.
A aplicao de outra tcnica, como DMFS, extrai mais pigmentos e
componentes da matriz, tornando seus extratos mais coloridos e com maior
quantidade de componentes da matriz, como observado na Figura 3.10 pelo
aumento da absorbncia.
ESL-PBT
0,7
ESL-PBT + Clean-up
silica
0,6
Absorbncia
0,5
ESL-PBT + Clean-up
Florisil
0,4
DMFS - slica
0,3
DMFS - Florisil
0,2
0,1
0
200
300
400
500
600
Comprimento de onda (nm)
Figura 3.10. - Espectros de absoro dos extratos no UV-visvel ( = 250 a 780

nm), obtidos a partir de diferentes tcnicas de extrao e seus
adsorventes para extratos de fgado.
Em funo dos resultados obtidos, decidiu-se trabalhar com a ESLPBT sem etapa de clean up, devido ao pouco ganho na remoo de pigmentos
e componentes da matriz e perda dos agrotxicos estudados.
61
3.7.
MTODO
OTIMIZADO
DA
ESL-PBT
E
ANLISE
POR
CROMATOGRAFIA GASOSA DE QUATRO AGROTXICOS EM
CARNE BOVINA
Prope-se como metodologia otimizada extrair 3,0000 g de carne
bovina (alcatra e fgado), previamente homogeneizadas, com 1,0 mL de gua,

6,5 mL de acetonitrila e 1,5 mL de acetato de etila, para alcatra e 1,0 mL de
gua, 8,0 mL de acetonitrila para fgado. Agitar a mistura em ultra-som por 10
minutos e posteriormente deixar em freezer a aproximadamente -20 C por 12
horas. Aps o congelamento filtrar as amostras sob gravidade, na presena de
sulfato de sdio anidro. Recuperados os extratos em balo volumtrico de 10,0
mL e armazenar em freezer at o momento da anlise cromatogrfica.
A metodologia otimizada apresentou resultados satisfatrios para as
matrizes estudadas, apresentando extratos limpos sem necessidade de
adicionar etapas de clean up nem etapa de concentrao, alm de pequeno
consumo de solvente e por ser uma tcnica relativamente rpida e simples
3.8.
DISPERSO DE MATRIZ EM FASE SLIDA DMFS

3.8.1. Avaliao do adsorvente e eluente para a tcnica de extrao
DMFS
Trabalhos realizados com amostras de carne mostram que no existe
uma tcnica considerada de referncia e a maioria das tcnicas utilizadas

consome muito solvente, tempo, sendo necessrio ainda etapas de clean up
para essas matrizes devido a sua complexidade. As tcnicas mais empregadas
so ESL seguido ou no de ELL, EFS e etapa clean up com cromatografia por
permeao em gel entre outras (RONNING et al, 2006; COSTABEBER et al,
2006; GARRIDO-FRENICH et al, 2006; JUHLER, 1997; SALLAM & MOSHEDY,
2008; SEO et al, 2005; PATEL et al, 2005)
A DMFS uma tcnica que realiza extrao e clean up dos extratos
simultaneamente (KRISTENSON et al, 2006), e tem sido aplicada em amostras
slidas e semi-slidas, como por exemplo, tecidos de animais e em vrios
vegetais. Kishida (2007) utilizou DMFS em amostras de carne para
determinao de sulfonamidas por cromatografia lquida, utilizando como
62
adsorvente a alumina e como solvente extrator o etanol.

Com o objetivo de comparar a ESL-PBT otimizada com a DMFS, as
metodologias foram aplicadas a amostras de alcatra e fgado. Antes de
empregar a DMFS foi necessrio avaliar o adsorvente e o solvente adequado
para extrao dos princpios ativos utilizando a DMFS em amostras de carne
bovina. Neste estudo, foram avaliados os adsorventes slica e florisil, utilizando
a proporo amostra:adsorvente igual a 1:1, e os eluentes acetonitrila, acetato
de etila e a mistura hexano:acetona (9:1).
Para as amostras de fgado, independente do adsorvente utilizado, a
DMFS no se mostrou seletiva, ou seja, os extratos obtidos aps aplicao da
tcnica apresentaram picos referentes aos componentes da matriz coincidentes
com os picos dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina, tornando, nessas condies, impossvel determinar e quantificar
os analitos estudados.
Para amostras de alcatra, o mtodo se mostrou seletivo, sendo possvel
determinar e quantificar os analitos e assim avaliar as condies (adsorvente e
solvente) ideais para determinao dos agrotxicos estudados utilizando a
DMFS. Inicialmente, avaliou-se o florisil com os eluentes acetonitrila, acetato de
etila e a mistura hexano:acetona e os resultados so apresentados na Figura
3.11. No observada grande diferena nos rendimentos de extrao em
funo do eluente utilizado. A mistura hexano:acetona apresentou maior
porcentagem de recuperao para clorpirifs, endosulfan e deltametrina e
porcentagem de recuperao prxima a 70 % para cipermetrina sendo o
eluente escolhido para extrao com florisil.
63
% Recuperao
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
Acetonitrila
Acetato de etila
Hexano:acetona

cipermetrina para a DMFS utilizando florisil em amostras de
alcatra.
Para slica (Figura 3.11), entre os eluentes acetonitrila, acetato de etila e
a mistura hexano:acetona, escolheu-se tambm a mistura hexano:acetona por
apresentar maior porcentagem de recuperao para todos os princpios ativos.
100
90
% Recuperao
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina Deltametrina
Agrotxico
Acetonitrila
Acetato de etila
Hexano:acetona

cipermetrina para a DMFS utilizando slica.
64
Comparando os adsorvente slica e florisil (Figura 3.13), ambos

utilizando a mistura hexano:acetona como eluente, a slica apresentou melhor
porcentagem de recuperao para endosulfan, cipermetrina e deltarmetrina
sendo essa diferena acentuada para os piretrides. Para o clorpirifs, o florisil
foi o adsorvente mais adequado, com recuperao superior a 70 %. Porm,
faz-se necessrio avaliar outras variveis, como por exemplo, diferentes
propores amostras:adsorventes, etapas de clean up utilizando co-coluna,
homogeneizao da mistura amostra, adsorvente e eluente por ultra-som, entre
outras, de forma a melhorar a porcentagem de recuperao e a qualidade dos
% Recuperao
extratos.
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
Florisil - Hexano:acetona
Slica - Hexano:acetona
ESL-PBT
Figura 3.13. - Influncia de diferentes adsorventes e eluentes na porcentagem

de recuperao do clorpirifs, endosulfan, deltametrina e
cipermetrina para a DMFS e comparao com a ESL-PBT.
Observa-se para amostras de alcatra que no houve grande diferena
nos porcentagens de recuperao quando empregadas as tcnicas DMFS e
ESL-PBT e ambas se mostraram equivalentes quando comparados os
cromatogramas qualitativamente. Porm a ESL-PBT se mostrou mais eficiente
na recuperao de todos os princpios ativos e tem como vantagem o menor
nmero de etapas, no precisa concentrar os extratos e baixo consumo de
solvente. A DMFS utilizando slica/hexano:acetona como adsorvente e eluente,
possui como vantagens o menor tempo no preparo de amostra e utiliza
65
pequena quantidade de amostra (Figura 3.13), mas mais susceptvel

presena de interferentes nos extratos, proveniente dos adsorventes,
componentes da matriz em relao a ESL-PBT, maior custo devido a utilizao
de adsorventes no recuperveis ao final do experimento e necessrio que
os
adsorvente
sejam
previamente
condicionados,
que
aumenta
consideravelmente o consumo de solventes.

Portanto, a tcnica ESL-PBT uma alternativa de extrao dos
agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em amostras de
carne bovina, proporcionando resultados qualitativos e quantitativos mais
satisfatrios, quando comparado com a DMFS.
3.9.
VALIDAO DO MTODO ANALTICO

Para avaliar o desempenho do mtodo analtico, vrios parmetros
foram considerados: seletividade, limite de deteco (LD), limite de

quantificao (LQ), linearidade, preciso e exatido (INMETRO, 2003)
3.9.1. Seletividade
Este parmetro foi avaliado utilizando a ESL-PBT dos agrotxicos
clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em alcatra e fgado bovino,
comparando-se os cromatogramas de extratos da matriz isenta dos agrotxicos
com extratos da matriz fortificados com os compostos.
Na Figura 3.14 e 3.15, esto mostradas as comparaes dos
cromatogramas para alcatra e fgado respectivamente.
66
240000
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
A)
15000
10000
5000
0
-5000
0
10
180000
B)
160000
140000
120000
100000
2,6
15000
5,0
3,2
10000
8,8
3,8
5000
7,3
0
-5000
0
10
Figura 3.14. - (A) Cromatograma do extrato obtido da matriz de alcatra isenta

deltametrina
67
300000
A)
250000
200000
150000
20000
15000
10000
5000
0
-5000
0
10
Tem po de reteno (m in)
300000
B)
250000
200000
150000
2,6
20000
5,0
3,2
10000
3,8
8,8
7,3
0
0
10
Figura 3.15. - (A) Cromatograma do extrato obtido da matriz de fgado isenta

deltametrina
Os extratos das amostras de alcatra e fgado bovino, apesar de
possurem uma composio complexa, no apresentaram interferentes nos
mesmos tempos de reteno dos compostos analisados o que torna a
metodologia seletiva. A seletividade do detector (ECD) tambm contribuiu para
obteno desses resultados. Alm disso, os picos referentes aos princpios
68
ativos e padro interno apresentam boa separao, simetria adequada e,

portanto uma tima seletividade.
3.9.2. Limite de deteco (LD) e limite de quantificao (LQ)

O limite de deteco (LD) para mtodos cromatogrficos corresponde
menor concentrao da substncia de interesse que pode ser detectada, mas
no necessariamente quantificada como valor exato. O limite de quantificao
(LQ) corresponde menor concentrao da substncia de interesse que pode
ser quantificada com exatido (INMETRO, 2003).
Os limites de deteco e quantificao foram determinados pelo mtodo
da relao sinal-rudo, em que o LD encontrado foi referente concentrao
que proporcionou um sinal trs vezes maior que o rudo mdio do aparelho e o
LQ um sinal dez vezes maior que esse rudo. Esse mtodo visual, onde as
concentraes detectveis e quantificveis das substncias de interesse so
determinadas visualmente, considerando-se a quantidade de composto capaz
de produzir um sinal analtico trs e dez vezes maior que o nvel do rudo de
fundo (COLLINS et al, 1997).
Os limites mximos de resduos (LMR) estabelecidos pelo Codex
Alimentarius para os analitos deltametrina e cipermetrina quando utilizados
como drogas veterinrias apresentam valores menores quando comparados
aos mesmos quando utilizados como agrotxicos, sendo os valores utilizados
em amostras de alcatra, 50,0 e 30,0 g kg-1 e fgado 50,0 g kg-1 para
cipermetrina e deltametrina. O endosulfan e o clorpirifs apresentam limites
mais elevados porque esses compostos e seus metablitos apresentam baixa
persistncia e bioacumulao (KAN & MEIJER, 2007) e a transferncia da
alimentao para o tecido baixa, sendo seus limites 0,2 e 1,0 mg kg-1 para
clorpirifs e 0,1 e 0,01 mg kg-1 em amostras de alcatra e fgado
respectivamente.
Levando-se em conta os LMR acima, a massa da amostra utilizada no
mtodo em desenvolvimento (3,0000 g), o volume de extrato adquirido (10,0
mL) e as porcentagens de recuperao de cada composto, tem-se que as
concentraes mnimas a serem detectadas pelo CG-DCE nos extratos de
69
alcatra e fgado so aproximadamente 3,0, 2,85, 5,0 e 3,0 g kg-1, e as

concentraes mnimas a serem quantificadas so 10,0, 15,0, 9,75 e 10,0
g L-1 para deltametrina, cipermetrina, endosulfan e clorpirifs respectivamente.
Os valores de LQ esto abaixo do LMR exigido para o clorpirifs em carne
bovina e endosulfan nas duas matrizes e possui valores prximos para
clorpirifs em fgado e para cipermetrina e deltametrina nas matrizes avaliada.
3.9.3. Linearidade da metodologia otimizada

A linearidade a capacidade de um mtodo fornecer resultados
diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame, dentro de
uma faixa de aplicao (RIBANI et al, 2004).
Inicialmente foi determinada a linearidade da resposta do detector para
concentraes de 10,0 a 750,0 g L-1, obtendo coeficientes de correlao de
0,9975; 0,9982; 0,9984 e 0,9956 para o clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina respectivamente. Sendo, estes resultados foram apresentados no
item 3.2.
3
APadro/APi
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Concentrao (g L-1)
Clorpirifs
Endosulfan
Deltametrina
Cipermetrina

ESL-PBT em amostras de alcatra.
70
APadro/APi
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Concentrao (m g L-1)
Clorpirifs
Endosulfan
Deltametrina
Cipermetrina

ESL-PBT em amostras de fgado.
As equaes da reta e os dados de correlao so apresentados na
Tabela 3.4. Os coeficientes de correlao encontrados so maiores que 0,99
caracterizando um ajuste ideal dos dados para a regresso linear de acordo
com a ANVISA (2003) e o INMETRO (2003).
Tabela 3.4. - Equaes das retas e coeficientes de correlao obtidos para os
agrotxicos.
Matriz
Agrotxicos
Equao
r
Alcatra
Fgado
Clorpirifs
y = 0,0145x + 0,0556
0,997
Endosulfan
y = 0,0123x - 0,0175
0,996
Cipermetrina
y = 0,0188x - 0,1571
0,991
Deltametrina
y = 0,0067x + 0,0258
0,993
Clorpirifs
y = 0,0185x + 0,0871
0,999
Endosulfan
y = 0,0173x - 0,0276
0,999
Cipermetrina
y = 0,0242x - 0,1964
0,998
Deltametrina
y = 0,0121x - 0,0226
0,999
A faixa de concentraes foi escolhida de forma que o ltimo ponto da

curva fosse 10 e 15 vezes o limite de quantificao obtido para cipermetrina e
deltametrina, respectivamente, e a faixa de concentrao fosse coerente com
71
os LMRs dos piretrides, porm, para o endosulfan e o clorpirifs, como os

LMRs so maiores que os LQ, considerou-se para essa escolha somente os
LQs. Assim, a metodologia aplicada para amostras de alcatra e fgado bovino
apresenta linearidade de resposta na faixa de concentrao de 10,0 a 150,0 g
L-1, para os compostos estudados. Com a utilizao do mtodo de
padronizao interna foi possvel obter melhores resultados em comparao
com a padronizao externa. Pequenas variaes de injeo ou no
equipamento, como volume de amostra injetado, fluxo do gs de arraste e
temperatura da coluna, foram minimizados.
3.9.4. Preciso
A preciso um termo geral utilizado para avaliar a disperso de
resultados obtidos para uma mesma amostra (LANAS, 2004). Ela foi
considerada em dois nveis: repetitividade e preciso intermediria
3.9.4.1. Repetitividade
A repetitividade representa a concordncia entre os resultados de
medies sucessivas por um mesmo mtodo sob as mesmas condies de
medio. Ela pode ser expressa quantitativamente em termos da caracterstica
de disperso dos resultados determinada pelo desvio padro de sete
repeties ou mais (INMETRO, 2003).
72
Tabela 3.5 - Porcentagens de recuperao (% R), desvio padro (DP) e

coeficientes de variao (CV) obtidos aps sete extraes de
agrotxicos em amostras de alcatra e fgado.
Matriz
Alcatra
Fgado
Agrotxicos
%R
DP
CV (%)
Clorpirifs
79,52
8,04
10,12
Endosulfan
76,69
4,74
6,17
Cipermetrina
91,10
11,27
12,37
Deltametrina
82,24
5,96
7,24
Clorpirifs
74,86
4,59
6,13
Endosulfan
71,63
6,68
9,32
Cipermetrina
84,49
7,71
9,13
Deltametrina
80,37
4,49
5,59
Os resultados do coeficiente de variao (CV) obtidos para as amostras

de alcatra variam entre 6,17 e 12,37 % e para o fgado bovino entre 5,59 e 9,32
% (Tabela 3.5). Entretanto, esses valores demonstram repetitividade, uma vez
que os coeficientes de variao se encontram abaixo do recomendado para
amostras complexas. Segundo Ribani et al (2004), so aceitveis CV de at 20
% para amostras complexas. Um fato relevante que as sete extraes foram
realizadas em amostras fortificadas prximo ao Limite de Quantificao
(15 g L-1), regio que apresenta maior desvio na resposta cromatogrfica.
3.9.4.2. Preciso intermediria

Este parmetro analtico refere-se s variaes ocorridas dentro de um
mesmo laboratrio quando um ou mais fatores importantes so modificados,
como diferentes analistas, diferentes dias ou diferentes equipamentos (RIBANI
et al, 2004). A preciso intermediria do mtodo foi verificada pelas
porcentagens de recuperao dos analitos e respectivos coeficientes de
variao (CV) analisados em trs dias diferentes. As anlises foram realizadas
no 1, 7 e 30 dia, pelo mesmo analista, mesmo equipamento, etc. Os
resultados obtidos esto dispostos na Tabela 3.6.
73
Tabela 3.6 - Porcentagens de extrao e coeficientes de variao (CV) obtidos

aps anlise em diferentes dias, pelo mesmo analista.
Primeiro dia Stimo dia Trigsimo dia
Matriz
Agrotxicos
CV (%)
%R
%R
%R
Alcatra
Fgado
Clorpirifs
76,7 3,8
79,5 10,1
80,9 3,5
2,75
Endosulfan
69,0 4,7
76,69 6,2
80,8 10,7
7,93
Cipermetrina
106,1 5,7
91,1 12,4
103,8 4,2
8,05
Deltametrina
75,7 5,3
82,2 7,2
99,5 5,4
14,34
Clorpirifs
97,4 8,7
78,2 3,9
79,6 3,7
12,58
Endosulfan
76,4 6,8
70,6 7,8
75,2 13,4
4,13
Cipermetrina
111,6 7,5
133,6 6,1
119,4 9,4
9,18
Deltametrina
89,3 8,8
80,4 5,6
102,1 6,5
12,04
Observa-se (Tabela 3.6) que os valores do coeficiente de variao

encontrados para os agrotxicos em amostras de alcatra e fgado so menores
que 20,0 %, indicando que o mtodo ESL-PBT apresenta boa preciso
intermediria.
3.9.5. Exatido
Existem vrios processos para avaliar a exatido de um mtodo, como o
emprego dos materiais de referncia, a comparao de mtodos, e os ensaios
de recuperao. Neste trabalho, foi realizado o ensaio de recuperao, o qual
se baseia na eficincia de recuperao (% R) que definido como a proporo
da quantidade de substncia de interesse, previamente adicionada matriz,
que extrada e passvel de ser analisada (INMETRO, 2003). A exatido de um
mtodo representa o grau de concordncia entre os resultados individuais
encontrados em um ensaio e um valor de referncia aceito como verdadeiro
(INMETRO, 2003).
Na avaliao deste parmetro analtico, foi realizado um ensaio de
recuperao em que os extratos obtidos apresentavam concentrao de 10,0,
20,0, 50,0 e 100,0 g L-1 para clorpirifs, endosulfan e deltametrina, e 15,0,
30,0, 75,0 e 150,0 g L-1 para cipermetrina, que so aproximadamente 1, 2, 5 e
74
10 vezes o limite de quantificao. A porcentagem de recuperao (R) e o

coeficiente de variao so indicados na tabela 3.7.
Tabela 3.7 - Avaliao da exatido do mtodo de ESL-PBT, para os ensaios de
recuperao e coeficiente de variao.
Concentrao g L-1
Matriz
Agrotxicos
10,0* e 15,0** 20,0 e 30,0** 50,0* e 75,0** 100,0* e 150,0**
Clorpirifs
%R
86,9
CV
11,8
%R
78,1
CV
11,6
%R
85,6
CV
2,1
%R
93,7
CV
8,4
Endosulfan
78,6
6,9
69,6
3,7
73,7
6,1
98,5
6,5
Deltametrina 126,3
4,5
107,8
5,6
123,5
11,7
147,5
6,3
Cipermetrina
82,4
2,5
70,2
10,4
89,7
8,5
109,1
8,1
Clorpirifs
79,5
3,0
71,3
7,1
88,2
1,8
78,2
3,9
Endosulfan
59,0
11,7
52,7
7,4
66,8
2,0
70,6
7,8
Deltametrina 106,2
3,7
113,1
9,7
143,14
2,1
133,6
6,1
Cipermetrina
2,0
67,6
2,7
80,6
1,7
79,6
5,9
Alcatra
Fgado
70,3
Concentraes adotadas para *clorpirifs, endosulfan e deltametrina e para **cipermetrina.
Os intervalos de recuperao e os coeficientes de variao encontrados

so aceitveis, levando em considerao que valores de recuperao entre 70
e 120 %, com coeficiente de variao de at 20 % e, ainda, dependendo da
complexidade da amostra de 50 a 120 % com variao de 15 % (AGARP,
1999).
3.10. EFEITO DE MATRIZ NO MTODO MULTIRRESDUO

A avaliao do efeito de matriz na anlise dos compostos clorpirifs,
endosulfan, cipermetrina e deltametrina em carnes bovinas empregando
mtodo ESL-PBT, foi realizada de acordo com o procedimento descrito no item
2.3.6.
Para avaliar o efeito de matriz, as curvas analticas preparadas em
acetonitrila e em extrato de matriz foram comparadas para o clorpirifs,
endosulfan, cipermetrina e deltametrina. As Figuras 3.18 (a, b, c e d) e 3.19 (a,
b, c e d) apresentam os resultados obtidos para alcatra e fgado bovino
75
respectivamente.
Pela Figura 3.18 (a, b, c e d), possvel observar que h maior diferena
dos valores dos coeficientes angulares das curvas construdas em solvente
puro e em extrato de alcatra para os princpios ativos cipermetrina (c) e
endosulfan (b) evidenciando o efeito de matriz na resposta cromatogrfica. H
tambm diferenas nas curvas do clorpirifs e da deltametrina, porm menos
acentuadas, indicando que a presena dos componentes da matriz interfere
menos na resposta do detector para esses compostos.
Observa-se que a resposta (rea padro/rea do padro interno)
encontrada para endosulfan em uma dada concentrao menor em extrato da
matriz quando comparado ao padro preparado em acetonitrila. Para o
clorpirifs, cipermetrina e deltametrina, a resposta obtida em uma dada
concentrao em acetonitrila apresenta uma resposta menor quando
comparados aos mesmos preparados em extrato de matriz. Isso sugere que
componentes da matriz presentes na amostras podem bloquear os stios ativos
no injetor e desse modo prevenir ou estimular a possvel degradao e
adsoro de analitos nessa cmara de vaporizao, levando a diminuio
(endosulfan) ou aumento (piretrides e clorpirifs) da resposta dos analitos
quando presentes nos extratos da amostra.
Resultados e comportamentos semelhantes foram obtidos para o fgado,
como mostrado na Figura 3.19 (a, b, c e d), sendo observado efeito de matriz
mais acentuado para a cipermetrina, deltametrina e endosulfan e menos
acentuado para o clorpirifs.
Estudos realizados no LAQUA para o clorpirifs e para os piretrides em
diferentes matrizes, como tomate e batata (PINHO, 2007; DARDENGO, 2007)
mostraram resultados semelhantes aos obtidos para carne bovina. SnchezBrunete et al (2005) observaram que compostos menos polares, com maior
ponto de ebulio e maior massa molar, como os piretrides, tiveram suas
respostas cromatogrficas aumentadas quando extratos dos brancos das
matrizes foram fortificadas com padres e analisados.
76
a)
c)
b)
d)
Figura 3.18 Curvas analticas dos princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina em
acetonitrila e em extratos de alcatra bovina.
77
a)
b)
c)
d)
Figura 3.19 Curvas analticas dos princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina em
acetonitrila e em extrato de fgado bovino.
78
b)
a)
50,0
600,0
200,0
41,3
1652,5
539,3
557,5
182,0
122,0
50,0
200,0
600,0
c)
100,0
200,0
d)
200,0
50,0
600,0
600,0
160,2
539,3
442,6
121,9
41,7
18,0
Figura 3.20 Variao relativa das respostas (rea do analito/rea do padro interno) calculadas para os princpios ativos (a)
clorpirifs, (b) endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica em solvente (100%)
e no extrato de alcatra.
79
b)
a)
50,0
46,7
200,0
600,0
178,1
1635,2
531,1
528,4
117,0
50,0
600,0
200,0
c)
200,0
50,0
50,0
600,0
143,9
34,1
d)
447,8
200,0
35,9
600,0
158,2
484,1
Figura 3.21 Variao relativa das respostas (rea do analito/rea do padro interno) calculadas para os princpios ativos (a)
clorpirifs, (b) endosulfan, (c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica em solvente (100%)
e no extrato de fgado.
80
a)
50,0
600,0
200,0
32,6
b)
109,4
424,1
1263,4
420,0
138,3
200,0
50,0
600,0
c)
100,0
600,0
200,0
d)
200,0
50,0
600,0
121,3
406,5
331,5
89,1
14,3
28,3
Figura 3.22 Variao relativa das respostas (rea do analito) calculadas para os princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan,
(c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica em solvente (100%) e em extratos de alcatra.
81
b)
a)
50,0
600,0
200,0
137,5
34,9
1296,2
428,0
102,4
411,0
50,0
200,0
600,0
c)
100,0
200,0
55,7
600,0
113,8
d)
200,0
50,0
345,0
30,3
600,0
125,5
379,3
Figura 3.23 Variao relativa das respostas (rea do analito) calculadas para os princpios ativos (a) clorpirifs, (b) endosulfan,
(c) cipermetrina e (d) deltametrina quando utilizada a curva analtica em solvente (100%) e em extratos de fgado.
82
Resultados e Discusses
Para avaliar o efeito de matriz em funo da concentrao, trs valores

de resposta do detector (rea do analito/rea do padro interno) foram
utilizados para calcular as respectivas concentraes utilizando a curva
analtica em solvente e em extrato da matriz. A resposta de concentrao
obtida com a curva analtica preparada em solvente foi considerada 100 %,
sendo calculada posteriormente a porcentagem relativa para a curva preparada
no extrato da matriz. Nas respostas avaliadas (Figura 3.20) para alcatra, o
efeito de matriz mais acentuado para endosulfan e cipermetrina. A
deltametrina apresenta efeito de matriz acentuado quando em concentraes
mais baixas. Para clorpirifs, cipermetrina e deltametrina, o efeito de matriz
diminui com o aumento da concentrao, sendo mais acentuada essa
diminuio para os piretrides. O endosulfan apresenta um comportamento
diferente
dos
outros
compostos
tendo
maior
efeito
de
matriz
para
concentraes maiores.
Para amostras de fgado foi observado o mesmo comportamento (Figura
3.21), porm com efeito de matriz menos acentuado para o clorpirfs,
cipermetrina e deltametrina quando comparado com as amostras de alcatra.
No foi possvel observar diminuio aprecivel do efeito de matriz com o
aumento da concentrao para esses mesmos compostos.
Em artigos que reportam sobre efeito de matriz comenta-se que a adio
de um padro interno ao extrato diminui ou elimina o efeito de matriz. Para
estudar este parmetro, o comportamento do padro interno foi avaliado
comparando-se as variaes das respostas obtidas quando empregou-se
padro interno (rea do analito/rea do padro interno) com as repostas
obtidas sem considerar a adio de padro interno (rea do analito) quando
utilizadas as curvas em acetonitrila e em extrato da matriz. Os resultados
apresentados nas Figuras 3.22 e 3.23 para alcatra e fgado respectivamente,
mostram que o efeito de matriz utilizando como resposta a rea do analito ou a
razo rea do analito pela rea do padro interno, apresentam a mesma
tendncia de comportamento para as concentraes avaliadas. Porm,
observa-se que o efeito de matriz mais acentuado para o clorpirifs,
cipermetrina e deltametrina, quando no utilizado o padro interno. Desta
forma, o padro interno para esses compostos diminui o efeito de matriz alm
de diminuir erros no volume de injeo, corrigir pequenas variaes no fluxo do
83
gs e na temperatura da coluna, de forma que as respostas cromatogrficas

no sejam significativamente afetadas. O endosulfan utilizando como resposta
a rea do analito apresenta menor efeito de matriz do que quando o padro
interno empregado na curva analtica e no clculo da porcentagem de
recuperao, porm esta diferena no muito acentuada.
Outra maneira de avaliar este efeito de matriz verificar o aumento
gradativo da resposta (reas) na anlise cromatogrfica. Para avaliar a
variao da resposta do detector, na extrao dos agrotxicos por ESL-PBT,
solues padro dos agrotxicos, em acetonitrila, foram analisadas antes e
aps injees sucessivas de extrato de alcatra ou fgado obtido na aplicao da
metodologia ESL-PBT em amostra carne bovina isenta dos princpios ativos
estudados.
A Figura 3.24 (a e b) representam as variaes das reas dos
agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina e tambm do
padro interno, bifentrina, em alcatra e fgado respectivamente, comparando-se
as respostas do detector antes e aps a saturao do sistema cromatogrfico
por componentes da matriz.
Variao da resposta do detector

(%)
Antes
Depois
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Bifentrina
Cipermetrina Deltametrina
Padro dos analitos (Pa)
Figura 3.24.a Avaliao da taxa de aumento da resposta do detector para os

matriz de alcatra.
84
O clorpirifs, cipermetrina e deltametrina so os agrotxicos mais

afetados pelo efeito de matriz, pois o aumento da resposta foi de 26 %, 30 % e
29 %, respectivamente. A resposta do endosulfan no sofreu aumento aps a
saturao do sistema cromatogrfico. O padro interno utilizado tambm
apresentou efeito de matriz, pois se trata de um piretride que so compostos
largamente afetados pelo efeito de matriz, devido elevada massa molar, o
que dificulta a volatilizao desses no injetor (SANCHEZ-BRUNETE et al,
2005), sua resposta aumentou 11 % aps a saturao do sistema
cromatogrfico.
Variao da resposta do
detector (%)
Antes
Depois
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Endosulfan
Bifentrina
Cipermetrina
Deltametrina
Agrotxicos
Figura 3.24b Avaliao da taxa de aumento da resposta do detector para os

matriz de fgado.
O mesmo comportamento foi observado para os agrotxicos clorpirifs,
cipermetrina e deltametrina em amostras de fgado bovino, com aumento da
resposta de 53 %, 52 % e 50 %, respectivamente, porm a variao da
resposta foi mais pronunciada quando o sistema cromatogrfico saturado
com extratos de fgado quando comparados aos extratos de alcatra, isso
devido maior complexidade da matriz, sendo assim, extrada uma maior
quantidade de constituintes da matriz. O padro interno utilizado tambm
apresentou efeito de matriz com aumento da resposta de 22 % aps a
85
saturao do sistema cromatogrfico. Para o endosulfan o aumento da

resposta do detector tambm foi desprezvel.
Realizando a mesma avaliao, porm, utilizando a quantificao pelo
mtodo do padro interno, ou seja, a razo entre as reas do padro pela rea
do padro interno possvel avaliar o comportamento do padro interno sobre
o efeito de matriz (Figura 3.25.a e Figura 3.25.b para alcatra e fgado
detector (% )
respectivamente).
Antes
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Clorpirifs
Depois
Endosulfan Cipermetrina Deltametrina

Agrotxicos
Figura 3.25.a Avaliao do aumento da resposta do detector para os

agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
e
cromatogrfico, utlizando a razo rea do padro pela rea
extratos de alcatra.
A utilizao do padro interno diminui erros no volume de injeo,
pequenas variaes no fluxo do gs de arraste e na temperatura da coluna.
Porm, possvel observar atravs das Figuras 3.13 (a e b) que a utilizao do
padro interno, bifentrina, na construo da curva analtica e no clculo da
porcentagem de recuperao dos agrotxicos, diminui a variao da resposta
do detector aps saturao do sistema cromatogrfico, diminuindo o efeito de
matriz, para o clorpirifs, cipermetrina e deltametrina. Como um composto
que tambm apresenta efeito de matriz, ele diminui o efeito de matriz em
amostras com efeito de matriz acentuado. Entretanto para o endosulfan,
composto que no apresenta aumento da resposta, a sua utilizao no clculo
86
da porcentagem de recuperao faz com que ocorra a variao da resposta de

forma, h uma diminuio de 10,6 % da resposta do detector aps a saturao
do sistema cromatogrfico, correspondente porcentagem de aumento que a
detector (%)
bifentrina sofre aps a saturao do sistema cromatogrfico.

140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Antes
Clorpirifs
Endosulfan
Cipermetrina
Depois
Deltametrina
Agrotxicos
Figura 3.25.b Avaliao do aumento da resposta do detector para os
agrotxicos
clorpirifs,
endosulfan,
cipermetrina
e
cromatogrfico, utilizando a razo rea do padro pela rea
extratos de fgado.
Constata-se que entre os analitos estudados em matrizes de carne
bovina que o clorpirifs, a deltametrina e a cipermetrina sofrem um efeito de
matriz positivo, ou seja, a resposta do detector aumenta quando esses
analitos so injetados na presena de componentes da matriz. Foi possvel
observar que a utilizao da bifentrina, padro interno que para essa matriz
apresenta o efeito de matriz semelhante a deltametrina e cipermetrina, diminui
o efeito de matriz para esses compostos. Porm, no caso do endosulfan,
analito que em matrizes de carne bovina sofrem efeito de matriz negativo, ou
seja, a resposta do detector menor quando so injetados na presena de
componentes da matriz, a utilizao da bifentrina, que possui efeito de matriz
positivo acentua a diminuio da resposta.
87
3.11. DETERMINAO
DOS
AGROTXICOS
CLORPIRIFS,
ENDOSULFAN, CIPERMETRINA E DELTAMETRINA EM AMOSTRAS

COMERCIAIS DE ALCATRA E FGADO BOVINO
A tcnica de ESL-PBT otimizada foi aplicada em trs amostras de
alcatra e fgado bovino, obtidas em comrcios da cidade de Viosa MG
originrios de diferentes fornecedores.
Nas amostras analisadas, no foi constatada a presena de resduos de
nenhum dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina.
88
Concluses
4. CONCLUSES
Neste trabalho foi otimizada e validada a metodologia ESL-PBT, para

anlise simultnea dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina em alcatra e fgado bovino.
Na etapa de otimizao foram avaliados: massa da amostra, tempo de
fortificao, tempo de agitao, fora inica da soluo aquosa, composio da
mistura extratora, efeito do ultra-som e etapa de clean up para determinao
das melhores condies de anlise dos compostos de interesse.
A metodologia ESL-PBT mostrou-se eficiente para anlise dos resduos
dos agrotxicos estudados, com porcentagens de recuperao acima de 70 %.
Alm disso, a metodologia apresentou baixo consumo de solvente e extratos
limpos, no necessitando de etapas de purificao para anlise cromatogrfica,
que levam diminuio da porcentagem de recuperao dos analitos
estudados, alm de adicionar mais uma etapa ao procedimento de extrao,
tornando a tcnica mais dispendiosa e cara.
Os parmetros avaliados no processo de validao, tais como:
seletividade, limite de deteco, limite de quantificao, linearidade, preciso e
exatido indicaram que a metodologia ESL-PBT eficiente para a extrao dos
resduos de clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e deltametrina em carne
bovina com limites de deteco abaixo dos LMR estabelecidos para estes
agrotxicos neste tipo de matriz.
Foi observada a presena de efeito da matriz na anlise cromatogrfica
dos compostos de interesse, obtendo-se porcentagens de recuperao acima
de 70 % quando a curva analtica preparada em extratos orgnicos fortificados
foi utilizada para quantificao dos compostos. O efeito da matriz foi
semelhante tanto em alcatra e fgado bovino.
89
Concluses
Para utilizar a DMFS e a ESL-PBT associada DMFS em amostras de

carne necessrio realizar novas etapas na otimizao, avaliando outras
variveis.
A metodologia ESL-PBT otimizada e validada foi aplicada em amostras
de alcatra e fgado bovino adquiridos no comrcio de Viosa-MG, no sendo
encontrado resduo dos agrotxicos clorpirifs, endosulfan, cipermetrina e
deltametrina.
90
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102

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RICA PACHECO SILVA

VALIDAO DE MTODO DE EXTRAO E

Universidade Federal de Viosa, como

RICA PACHECO SILVA

VALIDAO DE MTODO DE EXTRAO E

Universidade Federal de Viosa, como

Aprovada: 13 de outubro de 2008

Prof. Dr. Antnio Augusto Neves

Prof. Dr. Jos Humberto de Queiroz

Prof. Dr Robson Jos de C. F. Afonso

Profa. Dra. Regina Clia S. Mendona

Profa. Dra. Maria Eliana L. R. de Queiroz

Aos professores, Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz e Antnio

RICA PACHECO SILVA, filha de Geraldo da Silva e Ana de Ftima

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................... viii

Extrao Slido-Lquido com purificao em baixa temperatura

Disperso de Matriz em Fase Slida

Limite Mximo de Resduo

Grupo de Anlise de Resduo de Pesticida

Associao Grupo de Anlise de Resduo de Pesticida

Programa de Anlise de Resduo de Agrotxico

Programa Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes

Comit do Codex Alimentarius sobre resduos de pesticidas

Joint Meeting on Pesticides Residues

Detector por Captura de Eltrons

Extrao em Fase Slida

Cromatografia por Permeasso em Gel

Detector fotoeltrico de chama

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade

Figura 1.2. - Estrutura da (RS)--cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

Figura 3.4 - Grfico de Pareto - amostras de alcatra

fortificada com 50,0 g kg-1 dos princpios ativos estudados,

Figura 3.24.a Avaliao da taxa de aumento da resposta do detector para os

Tabela 1.1. - Propriedades Fsico-qumicas dos piretrides deltametrina e

SILVA, rica Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, Outubro de

experimental. Foram avaliados a massa de amostra, solvente extrator, fora

tcnicas, submeteram-se as amostras de alcatra e fgado bovino extrao por

SILVA, rica Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, October, 2008.

formas de vida vegetal ou animal, consideradas indesejveis nas culturas

comportamento reprodutivo (BRASIL, 1989).

persistncia no meio ambiente e contaminao da gua e do solo de onde

organoclorados, Bifenilas Policloradas, antiparasitrios, anabolizantes, etc.,

RESDUOS DE AGROTXICOS EM ALIMENTOS

muito pequenas de substncias, incluindo os seus derivados, produtos de

alimentos (pastagens, forragens e raes) que os contenham (CARVALHO et

O USO DE CARRAPATICIDAS EM REBANHOS BOVINOS

microplus), a mosca dos chifres e os vermes gastrointestinais podem ser

aminidinicos, piretrides, fosforados, fenilpirazois e cymiazol. Os carrapaticidas

contaminao do leite e da carne (BRAGA, 2002; LEAL et al, 2003).

inseticidas e acaricidas mais utilizados na agricultura, pecuria, horticultura,

e os limites mximos de resduos (LMR) estabelecidos pelo Codex Alimentarius

Figura 1.2. - Estrutura da (RS)--cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

pragas da agricultura e ectoparasitas bovinos. Estes compostos so

devido possibilidade de suas frmulas favorecerem a formao de tumores

Figura 1.3. - Estruturas moleculares do 1,4,5,6,7,7-hexachloro-8,9,10trinorborn-5-en-2,3-ylenebismethylene)sulfite - -Endosulfan (A),

inseticidas, acaricidas, nematicidas e fungicidas. So freqentemente os

fumigao. Inseticida utilizado como tratamento pr e ps-plantio para controlar

Figura 1.4. - Estrutura do O-3,5,6-tricloro-O,O-dietil-2-piridilfosforotioato Clorpirifs

consumidos, sendo, um alimento importante em vrias dietas como fonte de

minerais e os carboidratos. Alm do seu valor nutricional a carne apresenta

Geralmente, os alimentos e as amostras ambientais no podem ser

provenientes dos componentes da matriz, que certamente estaro no extrato.

nos ltimos anos, incluindo carboxamidas, quinazolinas, pirimidinas, tiazol,