0001

TESIS DOCTORAL
Programo de Doctorado:
Ecologa y Gestin de
105
Recursos Vivos Marinos
Claudia Massiel Prez Gonzlez

Las
/J
Palmas de Gran Canaria - 2013
UNIVERS IDAD DE LAS PAUMS O[ GRAN CANAR IA
Departamento de Biologa
AD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA
D. JOS MANUEL VERGARA MARTN, SECRETARIO DEL
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA DE LA UNIVERSIDAD DE
LAS PALMAS DE GRAN CANARIA,
CERTIFICA,
Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesin de
fecha hoy tom el acuerdo de dar el consentimiento para su
tramitacin , a la tesis doctoral titulada "Caracterizacin
biolgica y qumica de Kappaphycus alvarezii de Panam ~
presentada por la doctoranda Da. Claudia Massiel Prez
Gonzlez y dirigida por el Dr. Rafael Robaina Romero y la Dra.
Pilar Garca Jimnez.
y para que as conste , y a efectos de lo previsto en el

ArtO 6 del Reglamento para la elaboracin, defensa, tribunal y
evaluacin de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas
de Gran Canaria , firmo la presente en Las Palmas de Gran
Canaria, a 8 de abril del 2013.
Fdo. Jos Manuel Vergara Martn

Universidad de Las Palmas de Gran Canaria
UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS

DE GRAN CANARIA
Programa de Doctorado
Ecologa y Gestin de los Recursos Vivos Marinos
Ca racterizacin biolgica y qumica de Kappaphycus alvarezii

de Panama
Tesis Doctoral presentada por Oa. Claudia Massiel Prez

Gonzlez
Dirigida por el Dr. Rafael Robaina Romero y la Dra. Pilar Garcia
Jimnez
El Director
La Directora
La Docto randa
Las Palmas de Gran Cana ria, 8 de abril del 2013.
~ UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS
! '-"
DE GRAN CANARIA
TESIS DOCTORAL
CARACTERIZACiN BIOLGICA Y QUMICA DE

KAPPAPHYCU5 ALVAREZ/I DE PANAM
CLAUDIA MASSIEL PREZ GONZLEZ
LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

2013
Cn memora de mi abuela Florentina Gonzlez

D.E:.P.
La libertad slo existe cuando existe el amor. Guien se
entrega totalmente, 9uien se sIente libre, ama al mxmo.

y 9uien ama al mximo, se siente libre. Pero en el amor, cada
uno de nosotros es r<",..sponsable por lo 9ue siente,.tJ no

puede cu lpar a l otro por eso.
Nadie pierde a nadie por9ue nadie posee a nadie.
y esta es la verdadera experiencia de la Ibertad: Tener lo ms
Importante del mundo sin poseerlo."
Once Minutos, Paulo Coelho.
Agradecimientos
Primero te quiero d,H las gracias Diosito , por darme la vida y
permitirme alcanzar uno de mis propsitos. Gracias Seor por
poner en mi camino a dos personas maravillosas como tutores
de esta tesis, gracias al Profe Rafa quien me brind la
oportunidad de realizar este doctorado y ha sido un gran apoyo
en todo momento . A Pili, a quien le debo que este objetivo hoy
sea una realidad, gracias por todo Pili!, no hay palabras
suficientes
que
expresen
mi
entera
gratitud,
aprecio
admiracin. De ambos he aprendido mucho, a nivel profesional

son un ejemplo a seguir, por esa pasin que manifiestan por la
ciencia, la investigacin y su trabajo. Y adems poseen una
calidad humana difcil de encontrar, siempre dispuestos a
ayudar, muchas gracias y que Dios los bendiga siempre.
Tambin te doy gracias Seor, por concederme algo que no

estaba en mis planes, que no buscaba, pero que ha llenado mi
vida de alegra y color. Gracias Alberto por tu amor, paciencia ,
comprensin, proteccin y cario, has hecho que la aoranza
causada por estar lejos de los mos haya sido ms llevadera.
Gracias por hacerme rer, por tu apoyo y por ser como eres , te
quiero!!!.
Agradezco tambin a la Agencia Espaola de Cooperacin

Internacional para el Desarrollo (AECID), Ministerio de Asuntos
Exteriores y de Cooperacin, Gobierno de Espaa, por la beca
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -
Agradecimientos
concedida para realizar los estudios de doctorado durante el
periodo 2008-2012.
A la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y al

Departamento de Biologia por permitirme el acceso a sus
instalaciones para realizar este doctorado.
Al Dr. Jess Prez Pea y Dr. Javier Araa, del Centro

Instrumental
Qumico-Fsico
para
el
Desarrollo
de
la
Investigacin Aplicada (CIDIA). Por la formacin y acceso al

anlisis de muestras mediante la tcnica del FTIR .
A la Dra. Gloria Batista por facilitarme las muestras de

Kappaphycus al igual que al Dr. Giuseppe Zuccarello, Dr.
Daniel Robledo y el Dr. Juan Luis Gmez Pinchetli.
Al Laboratorio Marino de Punta Galeta por las facilidades

prestadas para obtener las muestras. As como tambin al
Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales por las
fotos autorizadas para esta tesis.
A todos los compaeros que forman y han formado parte del

equipo de Fisiologa y Biotecnologa Vegetal Marina: Ancor,
Eva, Maite, Ole, Houda, Marina, Montse, Mario, Miguel. Al igual
Agradecimientos
que a los compaeros de grupos vecinos, Unai, Eli, Caro,
Migue, Javi, Edna y Andrea, muchas gracias a todos.
a toda
mi gente linda de Canarias,
gracias por su
hospitalidad, y por hacerme sentir como en casa . Que Dios

bendiga estas preciosas islas y a toda su gente hermosa.
Especialmente a esa gran familia Surez-Monzn, gracias por
permitirme entrar en sus hogares y hacerme sentir como parte
de la familia. Especialmente gracias a la Sra. Estrella por esos
deliciosos potajes y comidas.
A mi amiga majorera Eva y a toda su familia, gracias a todos

por su cario y hospitalidad los llevar siempre en mi corazn.
Isabel,
Adolfina
Norma
por
su
cario
amistad
desinteresada durante estos aos.
A mis compaeros de clases de canto Toms, Mari Carmen y

mis profesoras Kenia y Davinia, por compartir esos momentos
aprendiendo y disfrutando de la msica .
A mis amigas Malu, Arge y Gio gracias por su amistad a pesar

de la distancia y al igual que a mi primis Liz, se les quiere
mucho.
Agradecimientos
A la 1ra . Comunidad de Santa Mara La Antigua , por sus
oraciones especialmente a Loyda y Jos, gracias por estar alli
se les quiere mucho .
y por ltimo pero no menos importante, a mi madre a quien

admiro mucho y es mi mejor ejemplo de superacin. Gracias
por ensearme a valorar lo que verdaderamente importa en la
vida, por su apoyo y amor incondicional. A mi padre por todo su
amor y su apoyo. A mis hermanos, a mi sobrina, tas y tios ,
primos y primas, que de una u otra forma, me han apoyado y
animado desde la distancia .
y para finalizar este trocito de la cancin del trio Los Panchos

dedicada a estas encantadoras islas:
Islas Canarias las recuerdo con valor

porque en tus playas
Islas canarias qued mi amor
Qued mi amor en las Islas Canarias
En las Canarias mi vida quedo ...
Que Viva Canarias!!!

y
Que Viva Panam!!!
Formacin
y Participacin cientfica
La doctoranda Claudia Massiel Prez Gonzlez curs estudios

previos, obteniendo la Licenciatura en Biologa con orientacin
en Microbiologa y Parasitologa en la Universidad de Panam
en abril del 2008.
A lo largo del periodo de formacin , del programa
de
doctorado: Ecologa y gestin de los recursos vivos marinos,

bienio
2008/2010. La
doctoranda ha
participado
en
los
siguientes cursos, congreso y en la preparacin de trabajos por

publicar.
Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P,

Robaina
RR
Kappaphycus
(2009)
a/varezi
Batista VG ,
Cultivos
Ecosostenibles
en
costas
las
del
de
Caribe
Panameo y caracterizacin de la carragena . Congreso

XVIII Reunin de la Sociedad Espaola de Fisiologa
Vegetal (SEFV), Zaragoza, 8-11 de septiembre de 2009.
Poster.
Curso PCR cuantitativa a tiempo real. Universidad de

Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran
Canaria 22-26 marzo de 2010.
Curso de Postgrado, Filogenias y Genealogas del DNA:

Reconstruccin
Aplicaciones.
Universidad
de
Barcelona, Barcelona 5-15 de julio de 2011.
Formacin
y Participacin cientfica
Phycomorph net kick-off meeting. Universidad de Las

Palmas de Gran Canaria , Las Palmas de Gran Canaria
27-28 octubre 2011 .
Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P, Robaina RR.

Molecular
identification
and
characterization
of
Kappaphycus alvarezi from Panama using rbcL gene

and AFLP. (en preparacin) .
Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P, Robaina RR.

The
chemical
properties
of
carrageenan
from
Kappaphycus alvarezifrom Panama. (en preparacin) .
ndice General
Introduccin General: Cultivo de algas como recurso
ecosostenible ....... ................. ................................................... 1
Las algas marinas o macroalgas como fuente importante
de alimento y otros usos .... ....... ....................................... 1
Por sus caractersticas, propiedades y sus diferentes
usos, las algas marinas poseen un gran valor comercial
e industrial .......................................................................3
Explotacin de poblaciones o fuentes naturales de
algas ............................... ...................................... .4
Mtodos de cultivo intensivo (alta densidad) de
algas marinas de importancia comercial .... ........... 5
Establecimiento de los cultivos de algas marinas en
Panam como recurso ecosostenible ............................ 12
Consideraciones del cultivo de la especie comercial
"cottonii" a nivel mundia 1 ................................................ 19
La plasticidad un problema en la identificacin del
gnero Kappaphycus y Eucheuma ................................ 25
El mantenimiento de la calidad y mejora del cultivo
depende de la investigacin a nivel molecular .............. 32
Captulo 1: Caracterizacin molecular de Kappaphycus

alvarezii de Panam ............................................................... 37
Introduccin Captulo I ............................................................. 37
Los marcadores moleculares pueden ayudar en la
identificacin de especies .............................................. 37
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez .- - - - - - -
ndice General
La caracterizacin gentica de un cultivar depende de
marcadores moleculares para detectar diferencias
genticas dentro de poblacionales ..................... .. ........ .48
La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa ha
permitido incrementar la disponibilidad de marcadores
moleculares ... ........................... ............. .. ........... .. ......... 57
La tcnica de AFLP ha sido ampliamente empleada en la
caracterizacin de cultivares ......................................... 69
Restriccin-Ligacin .................... ............. .. ... ..... . 74
Pre-amplificacin o PCR Selectiva ..... .. ........ ... ... 77
Amplificacin Selectiva .. .................................... . 79
Objetivos ........................................ ................................ 81
Material y Mtodos Captulo 1. ................. ............ .. ............ ....... 83
Material Vegetal ....... .. ...... ..... .. ... ... ...... ... .. .. ...... ... .. .. ...... .83
Identificacin molecular de la especie mediante
marcadores gnicos ...................................................... 84
Diseo de primers para la amplificacin selectiva del
marcador molecular ...... ................................................. 88
Anlisis de identificacin molecular mediante software de
anlisis filogentico .. ............. .. ... ......... ... .......... ... .... ... ... .95
Caracterizacin molecular mediante AFLP ...... .. ........... 99
Comprobacin de idoneidad del ADN ................ " .... ... 101
Restriccin-Ligacin .......................................... 102
Pre-amplificacin. ...... ...... ....... ............. .............. 105
Amplificacin. ............ ...... .. ..... .. ..... ...... .. ..... ....... 106
ndice General
Identificacin de los especmenes cultivados en Panam
...................................... ............................................... 100
Caracterizacin de Kappaphycus y Eucheuma de otros
cultivares ...................................................................... 111
Anlisis in si/ico ............................................................ 112
Clonacin y secuenciacin de fragmentos de AFLP.
Bsqueda de un marcador gnico de inters .............. 114
Tai/ing ................................................................ 115
Ligacin ............................................................. 116
Transformacin. ............................................... . 117
Seleccin de transformantes .... ... ............. ........ . 120
Bsqueda de un marcador gnico de inters. .. 128
Resultados Capitulo l ............................................. ................ 131
Caracterizacin molecular media nte rbcL .......... .. .. ... ..131
Caracterizacin molecular de Kappaphycus alvarezii de
Panam mediante la tcnica de AFLP ........................ 135
Comparacin del perfil de AFLP de la especie de
Pana m con fas de otros sitios .. .................................. 139
Bsqueda de un marcador gnico de inters ..... ......... 147
Discusin Captulo I ............................. .. .......... .. ........... .. .. ..... 151
Identificacin molecular. La especie cultivada en
Pana m es Kappaphycus alvarezii.. ............................ 151
Caracterizacin molecular de los cultivares de Panam
mediante AFLP nos permite distinguir diferencias sutiles
.... ................................................................................. 159
ndice General
Identificacin de los especimenes cultivados en Panam
y de otros sitios ............. .............................................. .167
Bsqueda de un marcador gnico a partir de fragmentos

de AFLP para futura mejora ........................................ 168
Conclusiones . ................................ .. .... .. ..... .. .... .. ......... 170
Captulo 11: Caracterizacin qumica de Kappaphycus

alvarezii de Panam ............................................................. 171
Introduccin Captulo 11. ......................................................... 171
Los vegetales producen diferentes substancias de
naturaleza polisacrida con capacidad de gelificacin
comnmente llamados gomas ..................................... 171
Un grupo importante de gomas lo configura los
galactomananos. Estos se obtienen
principalmente del endospermo de las semillas de
leguminosas, y dan lugar a varios tipos .......... .. 172
Otras gomas se obtienen directamente de los
exudados de las plantas terrestres, destacando
entre ellas los tipos arbiga, ghati, karaya y
tragacanto .... .............. .................... ................... 173
Los procesos microbiolgicos y de modificacin
qumica de los productos vegetales tambin
favorecen la sntesis de gomas......................... 175
Destacan en este grupo, las modificaciones
qumicas de la celulosa y de la pectina,
ndice General
conducentes a la obtencin de hidro coloides con
propiedades gelificantes ................................... 176
Las algas marinas tambin producen gomas o
hidrocoloides. El cido algnico, el agar y el carragenano
son los de mayor importancia comercial ..................... 178
El carragenano es otro hidrocoloide parecido al agar,
que genera mayor volumen de ventas ........................ 182
Caractersticas del carragenano del gnero
Kappaphycus ............................................................... 189
Diferentes mtodos de anlisis estructurales de los
ficocoloides nos permiten conocer en detalle sus
propiedades de pureza, cantidad y calidad tales como
los colorimtricos, cromatogrficos, espectro mtricos y
espectroscpicos ....................... .. ....................... .. ....... 191
La tcnica de espectroscopia infrarroja (IR) ha sido una
herramienta muy til para el anlisis de ficocoloides en la
industria ..................................... .. ................................ 196
Objetivos ......................................................................201
Material y Mtodos Captulo 11. ............ ..... .. ........... .. ............... 203
Material Vegetal ........... ............. ... ................................ 203
Extraccin y cuantificacin del carragenano ............... 203
Mtodo de Fostier et al. (1992) (alcalino y natural)
... ...................................................................... 200

Mtodo de Oh no et al. (1996) (alcalino y cido)
... ....................................................................... 200

ndice General
Mtodo de Freile-Pelegrn et al. (2006)
(modificado) ....... ............................................... 207
Mtodo combinado de Fostier & Freile-Pelegrn
......................................................................... 2W
Valoracin cualitativa del carragenano ....... ....... .......... 209
Resultados Captulo 11 ............ ............. ... .......... .. ........... .. ....... 213
Extraccin y cuantificacin del carragenano ...... .. ...... 213
Valoracin cualitativa de carragenano ......................... 214
Discusin Captulo 11 . .......................... ................................... 219
Factores que influyen en la productividad y calidad de
los ficoloides ................................................................219
Valoracin cualitativa del carragenano mediante
espectrometra infraroja ...............................................239
Conclusiones ............... ......... .. .. ... ....... ... .. .... .. .. ... .. ..... ..245
Conclusiones ..................................................... .. ................. 247
Bibligrafa ................ .. ... .. ..... .. ..... .. .... .. ..... .. .... .. ..... .. .... .. ......... 249
Anexos ....... .. ........... .. ...................................... .. ......... .. .. ....... 289
Gua de uso rpido para el GeneMarker .......... ...........289
Gua de uso rpido para el GenAlex ................ .. ......... 295
ndice de Tablas
Tabla 1. Clasificacin seccional de Eucheuma. El tipo de

carragenano se muestra entre parntesis, (Doty & Norris
1985) .................................................................................... 28
Tabla 1.1
Resumen de marcadores moleculares con sus
respectivas regiones de amplificacin en algas ........ .. ........ .46

Tabla 1.2 Comparacin de los diferentes tipos de marcadores
(Mba & Tohme, 2005 modificada) ................................. 56
Tabla 1.3 Reactivos pa ra la preparacin del buffer CTAB ........ 85
Tabla 1.4 Preparacin del Tampn TE ................. .................... 86
Tabla 1.5 Reactivos de preparacin del Tampn TAE (50X) ... 87
Tabla 1.6 Cebadores o primers utilizados para la especie
cultivada en Panam ....................................................... .... 89
Tabla 1.7 Secuencias tomadas de la base de datos del NCBI
para obtener la secuencia consenso ................................... 90
Tabla 1.8 Tipo y sitios de corte de enzimas de restriccin en
AFLP ....... ............. ............................ ............ ............. .... ..... 100
Tabla 1.9 Preparacin de reactivos para comprobar efectividad
de las enzimas, tanto juntas y por separado, con sus
respectivos buffer, en muestras secas y frescas ............... 101
Tabla 1.10 Componentes de Mezcla de reaccin de las enzimas
de restriccin con sus respectivas concentraciones .......... 103

Tabla
1.11
Componentes de
la
mezcla de
reaccin
de
adaptadores con sus respectivas concentraciones ........ ... 104

Tabla 1.12 Combinaciones de primer utilizados en el anlisis de
AFLP en muestras de Kappaphycus alvarezi de Panam 107
ndice de Tablas
Tabla 1.13 Muestras de ADN de especmenes de Panam (con
su acrnimo), tipo de almacenamiento y el nmero de juego

de primer empleado .... ....................................................... 11 O
Tabla 1.14 Muestras de posibles especmenes de Kappaphycus
y Eucheuma de otros cultivares .. .... .. ........................ .. ....... 112

Tabla
1.15
Componentes
de
la
reaccin
de
taiJing,
concentraciones y volmenes reque ridos .......................... 115

Tabla 1.16 Componentes soluciones de la ligacin ................ 117
Tabla 1.17 Preparacin del medio de cultivo SOC (100 mL) .. 118
Tabla 1.18 Preparacin del medio LB lquido y slido para un
litro de solucin .... .. .......................... .. ................................ 119

Tabla
1.19
Reactivos,
soluciones
madres
volmenes
empleados para la reaccin en cadena de la polimerasa .. 123

Tabla 1.20 Reaccin de restriccin con la enzima EcoRI para el
plsmido transformado . Mezcla
de soluciones para
la
digestin del plsmido purificado con la EcoRI ................. 125

Tabla 1.21 Secuencias de primers seleccionados del vector
pGem T easy ...................................................................... 126

Tabla 1.22 Primers utilizados para la obtencin de la banda .129
Tabla 1.23 Test reproducibilidad de las 21 combinaciones de
primers de AFLP en Kappaphycus alvarezi de Panam ... 137

Tabla 1.24 Alelos generados a partir de las 16 combinaciones
de primers ..... ..... ................. ............................................... 138

Tabla 1.25 Alelos o bandas generados el las distintas muestras
de Kappaphycus y Eucheuma ........................................... 140

ndice de Tablas
Tabla 1.26 Genes propuestos por el BLAST por su similitud a la

secuencia introducida. Dicha secuencia es el resultado del
cctel de amplificacin con los primers de AFLP, TG/CAA,
clonados y secuenciados con el primer M13F del vector
pGem-Teasy ........ .. ............ ............. ... .......... .. ........... .. ....... 149
Tabla 11.1 Volumen de ventas, precios y valor de ventas de los
hidrocoloides marinos en la ultima dcada (Fuente: Bixler &
Porse 2011) ..................................... ... .......... .. ........... .. ....... 182
Tabla
11.2
Detalles
de
los
mtodos
de
extraccin
de
carragenano, adaptados, en nuestro laboratorio, para la

especie estudiada con indicacin del mtodo originario de
extraccin de carragenano segn los diferentes mtodos 205
Tabla 11.3 Bandas (cm,1) y sus correspondientes grupos
funcionales
dependiendo
de
los
diferentes
tipos
de
carragenano, obtenidas mediante la tcnica del FTIR .. .... 211

Tabla 11.4 Productividad de carragenano obtenida en los
diferentes mtodos de extraccin probados (los datos son la
media SE, n=6; n.d. no se obtuvo fibras de carragenano);
ns, diferencias no significativas fueron observadas en
comparaciones mltiples, p=0.05) .....................................214
Tabla 11.5 Bandas caractersticas del carragenano comercial y
aquellas generadas por los diferentes mtodos de extraccin
............................... ............................................................ 217
ndice de Figuras
Fig.
1 Produccin
mundial de plantas (algas) acuticas
cultivadas por principales o grupos de especies. (FAO,

Examen mundial de la pesca y acuicultura 2012) .... ............. 9
Fig. 2 Mapa de Panam y los sitios de establecimiento de los
cultivares "cottonii" ............................................................... 13

Fig. 3 Publicaciones nacionales a cerca del cultivo de algas en
Panam . A) Articulo tomado de la pgina web del MIDA, 1801-2011. B) Artculo publicado en prensa online por el diario
Panam Amrica fecha 3-4-2009 ........................................ 17
Fig. 4 Cultivos de "cottonii" en la poblacin indgena Ngobe
Bugle de Tierra Oscura, Bocas del Toro , Panam ... ....... .... 18
Fig.
5 Diferentes variedades de
Kappaphycus cultivadas
(Fuente: Hurtado et al. 2012) ............................................... 20

Fig. 6 Mtodos de cultivo ms comunes utilizados en los
cultivos de Eucheuma y Kappaphycus. A) Ejemplo de Cultivo

ecosostenible , B)
Mtodo fixed off-botfom,
C)
Mtodo
hanging long fine, D) Mtodo multiple-raft long ..... ... .... ....... 21
Fig. 1.1 Evolucin de los marcadores moleculares ............. ..... 50
Fig. 1.2 El anlisis de RAPDs ...................................... .., .......... 59
Fig. 1.3 La reaccin de restriccin-ligacin ....... ............. .... ...... .76
Fig. 1.4 La pre-amplificacin de los fragmentos de ADN .......... 78
Fig. 1.5 La amplificacin selectiva ........................................ .... 80
Fig. 1.6 Secuencia Consenso, generada mediante Geneious
v5.4, perteneciente a las 12 secuencias de Kappaphycus y

Eucheuma del gen rbcL .. ............. ........................................ 92
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez .- - - - - - - .
ndice de Figuras
Fig. 1.7 Esquema de' amplificacin del gen rbcL .................. .... 93
Fig. 1.8 Modelo de formato Nexus para introducir los datos en el
programa PAU P.. .. ............ ............. ... .......... .. ........... .. ......... 98

Fig. 1.9 Condiciones de PCR en la Pre-amplificacin ............ 106
Fig. 1.10 Condiciones de PCR establecidas para la
amplificacin selectiva .................... ... .......... .. ........... .. ..... ..109

Fig. 1.11 A) Seleccin de colonias blancas (tienen el inserto). B)
Placa madre .......................................................................122

Fig. 1.12 Resumen grfico de los pasos bsicos de clonacin
realizados para obtener el fragmento deseado. .. .......... _.. 126

Fig. 1.13 Localizacin de los primers localizados sobre una
secuencia usada como posible marcados gnico ............. 129

Fig.
1.14
Condiciones
de
PCR
establecidas
para
la
amplificacin de la secuencia ......... .. ................................ 130

Fig. 1.15 Electroforesis en gel de agarosa a11% en TAE (banda
amplificada con F2 y R753 Y escalera) ............................. 131

Fig.
1.16 rbol filogentico
de Kappaphycus alvarezii de
Panam ..... .. ....................................................................... 133

Fig. 1.17 Secuencia cloroplstica del rbcL de Kappaphycus
alvarezii de Panam ........... ......... .. .. ... ....... ............. ............ 134

Fig. 1.18 Anlisis de coordenadas principales de las especies
Kappaphycus alvarezii de Panam, de Tanzania, de Mxico

(morfotipos verde y pardo) y la especie de Eucheuma coffoni
.................. ......... .... ............. ............................................... 1~
ndice de Figuras
Fig. 1.19 AnUsis de coordenadas principales de las especies

Kappaphycus a/varezi de Panam, de Filipinas e Indonesia
y la especie de Eucheuma spinosum .......... .. ........... .. ....... 147
Fig. 11.1 Estructura qumica de los principales carragenanos

kappa, iota y lambda ......................................................... 185
Fig. 11.2 Proceso de extraccin a nivel industrial de los

carragenanos
refinidados.
Fuente:
eargill
Texturizing
Solutions ............................................................................189
Fig. 11.3 Esquema descriptivo de los componentes principales

del FTIR ........................................................................... ..198
Fig.11.4 Proceso de extraccin de carragenano y las diferentes

texturas presentadas por cada mtodo de extraccin ....... 208
Fig. 11.5 Proceso de elaboracin de las pastillas con Bromuro

de Potasio. A) Mortero con la muestra y 4 mg aprox. de
Bromuro de postasio. B) Pastilla obtenida de la prensa
hidrulica.
e)
Espectrofotometro
FTIR
modelo
RS/1
(UNleAM). D) Prensa hidrulica Perkin Elmer. ............... 210
Fig. 11.6 Espectro de bandas generadas por el FTIR entre los

6001300 cm 1 de las muestras de carragenano extrado de
los
cultivos
de
Kappaphycus
a/varezi
mediante
los
diferentes mtodos .............................................................216
Fig. 11.7 Formacin de la doble hlice del carragenano bajo

tratamiento alcalino ...........................................................242
Introduccin General - - - - - - - - Las algas marinas como fuente importante de alimento y

otros usos.
Desde la antigedad se han utilizado las algas marinas como

alimento humano , especialmente en China, Corea y Japn. El
trabajo realizado por Surey-Gent & Morris (1987) presenta
datos curiosos sobre la historia de las algas; documentan que
en las costas de Sudfrica se reportaron registros prehistricos
de consumo de algas. Los primeros reportes datan de 3 000
AC e indican que el emperador de China Shen-neng utilizaba
algas como alimento y medicina. En Japn , el consumo de
algas se describe, en el tributo anual realizado a la corte en el
siglo VIII. Se ha reportado que Pitgoras, los Aztecas, Indios y
Vikingos, todos ellos tambin consuman algas. En Gran
Bretaa, las personas que vivan en las costas tambin
consumian algas, aunque hay muy pocos casos registrados.
Los Romanos sealaron que los britnicos comian plantas del
mar. Hasta a finales de 1800, los talos de algas (Laminaria
saccharina)
con azcar eran vendidos en las calles de
Edimburgo. Los Romanos alimentaban sus caballos con una

racin de algas y otros alimentos. Las mujeres utilizaban el alga
para producir cosmticos, y para tinte de la ropa. En Francia
siglo XII, utilizaban los depsitos calcreos de algas rojas
llamados maerl como fertilizantes. En 1881, E.C. Stanford de
Escocia patent su descubrimiento de cido algnico derivado
1
Introduccin General - - - - - - - - de las algas. En 1934, los alginatos se utilizaron en la industria

y la alimentacin. Previo a esto, las algas se vendan como
fertilizantes y provisin de alimentacin en la planta de
produccin realizada en Escocia en 1950. El seor Stephenson
inici la venta de un fertilizante liquido de algas Maxicrop,
desarrollada por el Dr. Milton en 1944, y el cual lleg a ser en
1980 un producto destacado como fertilizantes en huertas y
jardinera, hasta la actualidad (ht!p ://www.maxicrop .co .ukD. En
la edad media, se quemaban las algas para obtener sal, y
hasta 1950 Francia fue el ltimo pa s en dejar de utilizar este
mtodo medieval de quemar las algas para obtener sal.
Gracias a los avances cientficos, hoy en da sabemos

muchas de las propiedades y utilidades que poseen estos
maravillosos organismos, y las que aun quedan por descubrir.
Dentro de algunas de sus utilidades podemos mencionar, su
utilidad como agentes espesantes, estabilizantes y gelificantes
en las industrias de la alimentacin y biomedicina. Los
extractos de algas son comnmente encontrados en un amplio
rango de productos de uso diario tales como, pasta de diente,
espuma de afeitar, helados, quesos, caramelos, cervezas ,
geles de bao, agar bacteriolgico y papel. Cada vez ms, las
algas son investigadas por la actividad biolgica de sus
extractos,
en
las
cuales,
han
encontrado
aplicaciones,
farmacuticas, biotecnolgicas y tambin en la preservacin de

2
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - alimentos. Adems, los productos de las algas son utilizados
en la industria textil y de pinturas, para mejorar la consistencia
de los colorantes, pinturas y tintes (Bixler & Porse 2011).
Muchas compaas producen una gran variedad de productos
de talasoterapia basados en algas, los cuales incluyen sales y
burbujas de bao, champ , geles, jabones, exfoliantes faciales,
mascarillas corporales e hidratantes (Turan & Neori 2010).
Tambin son utilizadas en el tratamiento de aguas residuales
por su capacidad de absorber nutrientes, metales, pesados
tales como el zinc y el cadmio (Gellenbeck 2011). En dcadas
recientes se han utilizado las algas como biocombustibles en la
produccin de biogs y bioetanol (Notoya 2010, Yanagisawa et
al. 2011). Yen medicina, se han reportado especies de algas
con actividad antileishmaniasis (Freile-Pelegrn et al. 2008) y
tambin presentan actividad anticoagulante (Farias et al. 2000),
antioxidante (Souza et al. 2012) y antiviral (Wang et al. 2007).
Por sus caractersticas, propiedades y sus diferentes usos,

las algas marinas poseen un gran valor comercial e
industrial.
Por todas estas caractersticas y propiedades, que caracterizan
a las algas, se han desarrollado diferentes mtodos o tcnicas
para la explotacin de fuentes o poblaciones naturales, as
como tambin el desarrollo de tcnicas de cultivo. Por mucho
tiempo la biomasa de algas que se utilizaban en esa amplia
3
Introduccin General - - - - - - - - gama de aplicaciones eran obtenidas de las poblaciones

naturales.
Sin
descontrolada,
embargo,
condujo
la
a una
explotacin
cada
intensiva
significativa
de
y
las
poblaciones naturales, particularmente aquellas con potencial

econmico (Lobban & Harrison 1997; Melo 1998).
Explotacin de poblaciones o fuentes naturales de

algas
En la actualidad, para evitar el dao a los ecosistemas a causa

de la sobreexplotacin de fuentes naturales de comunidades
de algales, se utiJizan estrategias tales como, mejorar la
productividad, tcnicas de soporte
estructural estables
proteccin de los impactos negativos causados por factores

antropognicos
naturales.
Teniendo
en
cuenta
estas
estrategias , se puede estimar la cantidad mxima a cosechar

de
estas
poblaciones
naturales
sin
que
se
afecte
su
ecosistema .
Las algas son ampliamente cosechadas a partir de
mantos o bancos-beds- de fuentes naturales que a menudo
son comunidades monodominantes. Por ejemplo, Ahnfeltia
tobuchiensis en el lejano oriente ruso Chondrus crispus en

Canad. Dentro de las algas, que crecen unidas a substratos
duros, se extraen de las comunidades formadas por Hypnea
musciformes en India, Gracilaria chilensis en Chile, Gigartina

atropurpurea en Nueva Zelanda, Gelidium sesquipidale en
4
Introduccin General - - - - - - - - Portugal, Sargasum spp. en Vietnam. Tambin podemos

mencionar otras poblaciones naturales de Macrocystis pyrifera
y M. integrifolia en Alaska, Macrosystis spp. y Ecklonia spp. en
Japn, y Macrocystis spp. en California (Titlyanov & Titlyanova
2010).
Mtodos de cultivo intensivo (alta densidad) de algas
marinas de importancia comercial
A principios de la dcada de 1970, lleg a ser evidente que la
mayora de las poblaciones naturales de algas haban sido
sobre explotadas y el
cu~ivo
de estas especies fue la mejor va
para incrementar la produccin (Lobban & Harrison 1997). As

el cultivo de algas lleg a ser visto no solo como una opcin
econmica sino tambin como una alternativa ecolgicamente
factible para conservar el recurso natural (Bezerra & MarinhoSoriano 2010).
Desde entonces el cultivo de algas marinas ofrece una
serie de ventajas sobre las poblaciones naturales. Mayor
productividad y especificidad puede obtenerse a travs de la
maricultura, a un costo de procesamiento menor despus de la
cosecha y con una produccin ajustable a la demanda del
mercado . Los estudios genticos actuales permiten la seleccin
productiva de individuos, haciendo los cultivos cada vez ms
efectivos. El cultivo requiere de una menor inversin en
comparacin con otras modalidades de la maricultura , como la
5
Introduccin General - - - - - - - - cra de camarones o pescado, e incluso puede formar parte de

estos cultivos, aumentando as los beneficios, sin la necesidad
de nuevas instalaciones y reduciendo al mnimo la descarga de
contaminantes de aguas residuales. Diferentes mtodos de
cultivo han sido desarrollados segn el tipo de especie a
cultivar y tambin en funcin de las condiciones ambientales de
la zona de cultivo (Titlyanov & Titlyanova 2010) . Las reas para
implementar los cultivos suelen ser en puntos de actividad de
bajamar, tales como
bahas, piscinas naturales, lagunas,
estuarios y tanques artificiales.

El policultivo, o granjas integradas de algas-animales, es
tambin considerado como un mtodo de cultivo intensivo, se
han desarrollado sistemas de policultivo, conocidos como IMTA
"Integrated multitrophic aquaculture" el cual consiste, en utilizar

las algas como biofiltradores, donde asimilan el amonio,
fosfatos y CO 2 excretados por los peces, convirtindose en una
biomasa potencialmente valiosa (Abreu et al. 2011). Dentro de
las especies que pueden ser componentes de este sistema
estn
Gracilaria,
Porphyra,
Eucheuma/Kappaphycus,
Laminaria, Undaria, Echlonia, Macrocystis, Ulva y Caulerpa.

Otras especies de importancia comercial como Palmaria ,
Chondrus,
Gigartina,
Hypnea,
Sargassum,
Cystoseira,
Asparagopsis/Falkenbergia, tambin tienen alto potencial para

estos sistemas. Actualmente se estn desarrollando muchos
proyectos con sistemas IMTA integrados alrededor del mundo ,
6
Introduccin General - - - - - - - - y el objetivo es desarrollar sistemas modernos rentables de

cultivo de algas, para aplicarlos en la acuicultura de diferentes
ambientes (Turan & Neori 2010).
Un cultivo a escala comercial necesita de muchos
estudios para establecer un mtodo de cultivo fcil de manejar,
con una relacin satisfactoria entre costes y beneficios, as
como el conocimiento de la ecologa, fisiologa y productividad
de las especies de inters econmico. Tal conocimiento
permite
el
establecimiento
de
granjas
productivas,
la
generacin de fuentes a Iternativas de ingresos para
las
poblaciones costeras tropicales, que por lo general dependen

exclusivamente
de
la
pesca
artesanal
como
medio
de
subsistencia (Bezerra & Marinho-Soriano 2010) .
Desde la dcada de 1970, se han desarrollado cultivos

experimentales de algas en tanques, en Estados Unidos y
Canad , y ms tarde establecidos en Chile (Titlyanov &
Titlyanova 2010) . Este mtodo es actualmente aplicado en
otros pases como Israel, Mx ico, Alemania, China y Japn . El
cultivo en tanques genera elevadas productividades por m 2 de
superficie en comparacin con otros mtodos de cultivo. Las
algas se
cu~ivan
en tanques con el fin de purificar los efluentes
generados por animales cultivados o para obtener productos de

valor como agarosa, las cuales se utilizan en investigaciones
cientficas o mdicas. Tambin se cultivan en grandes tanques
7
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - (decenas de metros cbicos) con el fin de obtener grandes

cantidades de biomasa para la produccin de biodiesel, entre
otros (Israel et al. 2005). Sin embargo, el
cu~ivo
en tanques
requiere de grandes cantidades de insumos, uso de materiales

y equipos caros. Requiere de un monitoreo constante, entre el
balance del pH del agua y la cantidad de CO 2 y tambin de la
adicin de nutrientes tales como nitrgeno y fosforo; adems
de presentar grandes problemas de epifitismo, no todas las
especies de algas pueden crecer en este tipo de cultivo (Lning
& Pang 2003; Israel et al. 2006). Por lo tanto, es un mtodo
muy costoso y laborioso, en comparacin con los cultivos en

mar abierto .
En la dcada de los 70 se reconoci que la demanda de

las algas marinas y sus productos derivados, superaba la oferta
y fue entonces que se increment la implantacin de cultivos
de algas o granjas marinas en diferentes pases (Crawford
2002). Segn datos de la FAO para el 2010, los mayores
pases productores de algas cultivadas han sido China (58.4%,
11.1 millones ton), Indonesia (20.6 %, 3.9 millones de ton),
Filipinas (9.5 %), Corea del Sur (4.7 %, 901 700 ton), Corea del
Norte (2.3 %, 432 300 ton), Japn (2.3 %, 432 800), Malasia
(1.1 %, 207 900 ton) y Tanzania (0.7"/0, 132 000 ton). La FAO
tambin reporta que para el 2010, las especies ms cultivadas
son Laminaria japonica y Saccharina japonica, seguida de
8
- - - - - - - - - Introducc in Gene ra l
Kappaphycus alvarezii y especies del glnero Eucheuma,

Gracilaria, Porphyra y Undaria (Fig. 1).
ti
~
.-""....,.,
..........,.-
, ---, ----
..
_w_-_..
--
.,.,.......-.,.....;;.
r_ _.
_ _
~.
---
""..........
ZOlO
Fig. 1. Produccin mundial de plantas (algas) acuticas

cultivadas por principales o grupos de especies. (FAD, Examen
mundial de la pesca y acuicultura 2012).
En Amrica Latina y el Caribe desde, la dcada del 70,
se realizaron los primeros cultivos experim entales los cuales
fueron reportados por Smith (1998) . El autor comenta el

desarrollo de cultivos experimentales en la isla de San Martn,
con la especie Eucheuma sp.. Posteriormente, a finales de los
80 en Venezuela se iniciaron cultivos de Gracilaria cornea y
Gracilariopsis sp. a escala piloto. En Cuba, tambin se iniciaron

programas para desarrollar el cultivo de Gracilaria domingensis,
y Bryofhamnion friquefum. Despus, en el ao 1991 , se

9
- - - - - - - Claudia Massie l Pi':rez Gonziez- - - - - - --
Introduccin General - - - - - - - - introducen las especies K. striatum y K. alvarezii. Estos cultivos

experimentales se llevaron a cabo para determinar el cultivo de
estas especies como potencial econmico.
En la dcada de los 80, los primeros pa ses en los que

se llev a cabo programas para el cultivo de algas a escala
comercial fueron Mxico, Brasil y Chile (Zertuche-Gonzlez
1993), inicindose con el cultivo de Gracilaria. Este proyecto de
la FAO luego se extendi a pases como Argentina, Per,
Colombia y Venezuela .
Actualmente , pases como Mxico exportan entre 300 a
400 toneladas por ao de algas marinas (Robledo & FreilePelegrn 2011) . Dentro de las especies comercializadas se
Macrocystis
encuentran
pyrifera ,
Gelidium
robustum ,
Chondracanthus canaliculatus, y Gracilariopsis lemaneiformis

los cuales son cosechadas de poblaciones naturales. Cultivos
experimentales se han desarrollado con las especies Solieria
filiformis,
Halymenia
floresii,
Eucheuma
isiforme
Kappaphycus alvarezii los cuales, han sido establecidos por su

potencial econmico como productores de carragenano.
Dentro
de
las
encuentran
Gracilaria
tenuifrons,
Hypnea
especies
cornea,
explotadas
G.
caudata,
musciformis,
Porphyra
en
Brasil,
se
Gracilariopsis
spiralis,
P.
acanthophora y Gracilaria domingensis (Oliveira 1998). En

10
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - 1995 se introdujo el cultivo de Kappaphycus alvarezi en la

costa Norte del Estado de Sao Paulo, debido a que los bancos
naturales
de
la
especie
carragenofita
nativa
Hypnea
musciformis se habian agotado (Hayashi & Reis 2012). Brasil,

en el 2006, gener una produccin de 500 toneladas por ao,
representando un 0.3 % de la produccin mundial en esta
especie.
En Chile, la mayoria de su produccin de algas, procede

de fuentes naturales de especies tales como Sarcothalia
crispata,
Mazzaella
laminarioides,
Gigartina
skoffsbergi,
Chondracanthus chamissoi, Porphyra columbina, Gelidium rex,

M. membrancea, Ahnfeltia plicata, Ahnfeltiopsis furcellata,
Callophyllis
variegata,
Mastocarpus papilltus
Chondrus
canaliculatus. Los cultivos de Gracilaria chilensis, establecidos

en la dcada de los 80, actualmente generan entre 74 Y 322 mil
toneladas por ao (Buschmann et al. 2001). Segn datos de la
FAO despus de los paises asiticos Chile es el mayor
productor de algas marinas.
11
Introduccin General - - - - - - - - Establecimiento de los cultivos de algas marinas en

Panam como recurso ecosostenible.
La situacin geogrfica de Panam es un punto a favor en el
establecimiento de granjas de algas marinas. La repblica de
Panam se encuentra ub.icada en el centro del Hemisferio
occidental, limitando al Norte con el Mar Caribe, al Sur con el
Ocano Pacfico, al este con Colombia y al Oeste con Costa
Rica. Panam posee 1 287.7 kilmetros de costa en el rea
del Caribe, pertenecientes a las provincias de Bocas del Toro,
Veraguas, Coln y la comarca de San Bias (conocida como
Kuna Yala). En dicha rea se cimientan ms de 1 000 islas,
isletas y cayos, sobre su plataforma continental, que varia en
amplitud desde 35 kilmetros en su posicin ms amplia y a
5.5 kilmetros, en la ms angosta . La misma posee una
superficie global de 6 000 kilmetros cuadrados, de fondos
duros compuestos mayormente de roca y cora I (AverzaColamarco et al. 2002) .
12
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - -
MarC8nbe
,~
a:
"
8"
'.
[ OOcano Pacifico
....
"...
Canal de. Panam~
e tivare Qe a
Fig. 2. Mapa de Panam y los sitios de establecimiento de los

cultivares "cottonii".
Panam es mundialmente conocida por su zona franca y
su Canal, construido entre los aos 1904 y 1914. El Canal de

Panam con su singular ubicacin es el punto ms angosto
entre el ocano Atlntico y el ocano Pacfico, proporciona una
va de comunicacin corta y relativamente menos costosa,
entre estos dos ocanos. Es una ruta de trnsito y carga de
conexiones martimas entre Norteamrica, Europa, frica,
Oceana, Asia y Suramrica, generando una circulacin de
tonelajes de 333.7 millones de toneladas por ao. Siendo una
de las instituciones de suma importancia econmica y de
orgullo para los panameos. En la entrada Norte del Canal de
Panam se encuentra la segunda zona franca ms grande del
mundo, y la primera del Hemisferio Occidental.
Por su
13
- - - - - - - Claudia Massief Prez Gonz/ez - - - - - - -
Introduccin General - - - - - - - - inigualable posicin geogrfica y su acceso a cuatro puertos de

gran
importancia
en
el
Caribe
uno
en
el
Pacfico ,
considerados los ms modernos de Latinoamrica, constituye

lo que podemos llamar un Centro Portuario Internacional
(www.zona libreinfo.coml.
La cultura de la utilizacin de las algas ya estaba

establecida en las poblaciones aborgenes de Panam, lo que
facilit en alguna medida el establecimiento de cultivos con
fines industriales (Batista 2009). El uso tradicional de las
macroalgas en el Caribe Panameo se remonta a comienzos
del ao 1850, periodo en el cual, afroantillanos provenientes de
diferentes islas del Caribe, llegaron a Panam como mano de
obra
para
la construccin del ferrocarril
posteriormente
para
la
construccin
del
interocenico
canal
francs,
introduciendo su cultura y tradiciones, entre ellas la utilizacin

de las macroalgas marinas. Dentro de las utilidades de las
algas, es la preparacin de bebidas, utilizadas por ellos como
bebida vigorizante y vitamnica, es la llamada isinglass o
seamos (Batista et al. 2006) . Otro de los grupos tnicos
establecidos en el Caribe Panameo, son los indios Kunas, los
cuales tienen por costumbre el uso de las macroalgas en
tratamientos medicinales. El trabajo descrito por Batista y
colaboradores (2006) detalla sus usos en la alimentacin y cura
de enfermedades.
Estas comunidades del Caribe, en su

14
Introduccin General - - - - - - - - mayora estn conformadas por pescadores artesanales que

viven en las cercanas de la lnea costera del Caribe. Debido a
que el Canal de Panam, es una rea de fuerte desarrollo que
trajo consigo la construccin de nuevos puertos, centros de
compras, tanques de reserva y movilidad de contenedores,
etc .. Est rea ha sufrido varios impactos ambientales , a partir
de los cuales se generaron estrategias para mitigar estos
daos, una de ellas fue el establecimiento de los cultivos de
macroalgas, como una manera de desarrollo ecosostenible
para las comunidades locales de la zona (Batista 2009).
Otro factor importante para el asentamiento de los

cultivos
en
el
Caribe
panameo,
son
los
parmetros
ambientales muy estables a lo largo del ao, que presenta la

zona, siendo uno de los requisitos para este tipo de cultivo .
Debido a que esta zona costera est protegida por el impacto
de los huracanes tpicos de la regin del Caribe (Batista 2009).
Estas condiciones ambientales y geogrficas hacen del

Caribe panameo una zona ideal para el establecimiento del
cultivos
experimentales
de
algas,
los
cuales
fueron
establecidos en el ao 2000 con la especie conocida con

nombre comercial de Eucheuma coffonii (Batista et al. 2006) en
la entrada norte del Canal de Panam, especficamente en
Baha Las Minas , Provincia de Coln. Estos cultivos dieron
15
Introduccin General - - - - - - - - como resultado una alta productividad en la zona del Caribe
panameo.
Adems
de
parmetros
ptimos
para
establecer
que
el
las
cultivo
condiciones
mantenga
y
una
productividad estable a lo largo de todo el ao (Batista 2009).
Esta actividad formaba parte de el Proyecto Desarrollo

Sostenible en la entrada
Norte del Canal de
Panam,
desarrollado por la Dra. Gloria Batista desde 1992, con el

apoyo de empresas como Chevron Texaco Refinera de
Panam S.A y Gracilarias de Panam, S.A. Esta ltima se
estableci como la manifestacin comercial del proyecto para
vender los productos en el mercado mundial. Las primeras
exportaciones fueron realizadas en 2003 a Francia . El objetivo
de este proyecto es proveer trabajos alternativos a los
moradores del rea utilizando lo recursos naturales del entorno
de manera eco-sostenible.
Otros cultivos fueron establecidos en Samba Bonita,

Coln gestionados por Christopher Shire y la comunidad
indgena Kuna, los cuales han creado su propia cooperativa
integrada por 140 miembros , han contado con mas apoyo por
parte de las instituciones gubernamentales tales como ARAP
(Autoridad de Recursos Acuticos de Panam), el MIDA
(Ministerio de Desarrollo Agropecuario) y la colaboracin de la
Embajada de Suiza. Gracias a ese apoyo la cooperativa se ha
16
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - - -
podido consolidar. En 2009 exportaron a China ms de 20

toneladas y su objetivo es generar una produccin mensual de
20
toneladas
(http://\\II,lI/'IN.laestrella.com.pa/on lineli mpreso/20 11/0 1/21/algasmarinas-unnegocio-flotante.asp) ver Fig. 3.
Eo
OE
e_. c-.
"1"II' ~E N .U!No:IllEII~~
~ l"""""""AS
u ..... COI< cuu",o
Proyecto de cultivo de algas marinas

beneficiar a pescadores artesanales
_
... l . " < _
~~~~~~~~ ~'"------ --~
Fig. 3 Publicaciones nacionales a cerca del cultivo de algas en

Panam. A) Articulo tomado de la pgina web del MIDA,18-012011. B) Artculo publicado en prensa online por el diario
Panam Amrica fecha 3-4-2009.
otro proyecto se inici en 2008, en las comunidades

indgenas Ngobe Bugle en Tierra Oscura, Provincia de Bocas
del Toro (Fig. 4). Este proyecto fue financiado por el BID
(Banco Interamericano de Desarrollo) y con la colaboracin de
ARAP a fin de integrar las comunidades indgenas en el
aprovechamiento sostenible de los recursos naturales y como
17
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - - -
fuente de ingresos. Sin embargo, a pesar de que el cultivo de la

especie (no endmica) fue desarrollado con xito en esta zona
del Caribe, la gestin del mercado de

producida
no
ha
tenido
la materia prima
tanto
xito
(http:ltwww.thebocasbreeze .com/previ ou s-j ss u es/oct obe r-
octubre-2011-volu.shtml ).
Fig. 4. Cultivos de "cottonii" en la poblacin indgena Ngobe

Bugle de Tierra Oscura, Bocas del Toro, Panam.
18
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - Consideraciones
del
cultivo
de
la
especie
comercial
"cottonii" a nivel mundial (Hayashi et al. 2010)
Kappaphycus alvarezi, comercialmente llamada "cottonii" es

considerada como la principal fuente de kappa carragenano,
mientras
Eucheuma
que
denticulatum,
conocida
como
"spinosum" es la principal fuente de iota carragenano. Ambas

especies son responsables de aproximadamente el 88% de la
materia prima procesada para la produccin de carragenano,
las cuales ascienden sobre los 120 000 toneladas de peso
seco
por
ao.
Los
principales
paises
productores
de
Kappaphycus alvarezi los son Filipinas (89 000 ton, 55%),

Indonesia (61
000, 38%),
Malasia (4 000 ton, 2.5 %),
CamboyaNietnam (2 200 ton, 1.4%), China (800 ton, 0.5%),

Kiribati
(1
100
ton,
0.7"/0),
India
(400
Tanzania/Madagascar (1500 ton, 0.9%) y
ton,
0.2%),
Brasil (500 ton,
0.3%). La figura 5. Muestra las diferentes variedades cultivadas

del gnero Kappaphycus.
19
Introduccin General - - - - - - - - -
K.
Fig. 5. Diferentes variedades de Kappaphycus cultivadas

(Fuente: Hurtado et al. 2012).
20
Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - - -
Desde que por primera vez se reportaron con xito el

cultivo de granjas de Kappaphycus en 1970 en Filipinas, las
tcnicas de cultivo han pasado por muchas modificaciones. El
tipo de mtodo de cultivo ms tradicional es el fixed off-bottom
(Fig. 6.8) utilizado mayormente en zonas de arrecifes poco
profundos. En aguas ms profundas se han desarrollado
mtodos como hanging long fine (Fig. 6.C) y multiple-raft long
fine (Fig. 6.D).
Fig.6. Mtodos de cultivo ms comunes utilizados en los

cultivos de Eucheuma y Kappaphycus. A) Ejemplo de Cultivo
ecosostenible, B) Mtodo fixed off-bol/om, C) Mtodo hanging
long fine, O) Mtodo multiple-raft long fine (Fuente: Foscarini &
Prakash 1990).
21
Introduccin General - - - - - - - - Diferentes estudios se han realizado en Kappaphycus

enfocndose en optimizar las condiciones para su cosecha. Por
ejemplo , Villa nueva y colaboradores (2011), establecieron las
condiciones optimas de cultivo
para cuatro especies de
Kappaphycus de Filipinas. En dicho estudio, para K. alvarezi la

mayor productividad de biomasa se obtuvo a las 8 semanas,
despus de est, tanto la dureza del gel como el peso
molecular del carragenano tiende a disminuir. Informacin que
es confirmada por Hayashi y colaboradores (2010), debido a
que
tanto
la
calidad y
cantidad
de carragenano
estn
relacionadas con la madurez de sus talos. Estos autores en el

2007, tambin reportan la influencia de la densidad de plantas
por metro cuadrado, obteniendo alta productividad en K.
alvarezi de Brasil, al cultivar 24 plntulas por metro cuadrado
durante 6 y 8 semanas. Los cultivos de K. alvarezi en Panam
son cosechados a los 60 das y con una densidad por metro
cuadrado de 33 plntulas (Batista 2009).
Otro factor importante a tener en cuenta es el contenido

de humedad , ya
que juega un papel importante en la
aceptacin del mercado y su valor comercial. Es difcil para los

productores medir este valor. Por ejemplo, en lugares como
Filipinas, las algas son secadas al sol, de uno a dos das, y
luego,
son
inmediatamente vendidas
con
contenidos
de
humedad entre 45-50%, dadas las condiciones locales y la
22
Introduccin General - - - - - - - - humedad. En Tanzania, obtienen valores entre el 15-20 %

despus de 2 a tres dias de secados al sol (Hayashi et al.
2010). En Panam debido a las condiciones ambientales de
humedad, y estacin lluviosa por casi 9 meses al ao, Batista
2009 en su trabajo evalu diferentes mtodos de secados,
obteniendo contenidos de humedad entre 10-15%.
Dentro de las enfermedades reportadas en los cultivos

de Kappaphycus a/varezi est la enfermedad de "ice-ice". Esta
enfermedad
se
presenta
normalmente
cuando
el
cultivo
presenta estrs debido a cambios a bruptos de temperatura y/o

salinidad. El trmino ice-ice fue acuado por los productores de
las granjas de Kappaphycus en Filipinas, en referencia al
termino ice en ingls para describir el tejido senescente carente
de pigmentos y que causa que los branching o ramificaciones
se partan o rompan (Hayashi et al. 2010). Los primeros
reportes para esta enfermedad fueron en 1974 durante los
inicios de cultivos de K. a/varezi en Tawi- Tawi, Filipinas.
Otro de los problemas que presentan los cultivos, son

los causados por las algas epifitas, reportados en paises como
Filipinas, Malasia, Tanzania e India. Dentro de las especies
epifitas se han descrito del gnero Neosiphonia, tales como N.
savatieri y N. apicu/ata, entre otros como Ceramium sp.,
Acanthophora sp. y Centroceras sp. (Vairappan 2006) . Ambos
23
Introduccin General - - - - - - - - tipos de infeccin o enfermedades ocurren como brotes y estn

comnmente ms relacionados con granjas de alta densidad
de plantas.
A pesar de las polmicas por la introduccin de especies

exticas, el gnero Kappaphycus ha sido introducido en 19
pases tropicales mientras que el gnero Eucheuma solo en 13
(Hayashi et al. 2010). Despus de ms de 30 aos de iniciarse
el cultivo comercial de Kappahycus, en los ltimos aos se han
referenciado casos de bio-invasin de esta especie, los casos
de mayor relevancia han sido reportados en Hawi. Diferentes
estudios se han realizado al respecto, pero en particular el
realizado por Zuccarello y colaboradores (2006), donde a
travs de marcadores moleculares, se pueden separar las
Kappaphycus de Hawi, de las cultivadas en frica y en el
resto del mundo, lo que puede indicar que las condiciones
ambientales en las que se ha desarrollado esta especie ha
influido en su naturaleza invasiva. Otros estudios realizados por
Conklin y colaboradores (2009), confirma que la especie de K.
alvarezi de
Hawaii,
pertenecientes a K.
forma
un
grupo
separado
alvarezi de Venezuela,
de
las
Tanzania y
Madagascar. Otros casos bio-invasivos han sido reportados en

la India (Chandrasekaran et al. 2008) y Venezuela (Barrios et
al. 2007), causando graves daos en los arrecifes coralinos.
24
Introduccin General - - - - - - - - Si bien es cierto, es claro el potencial invasivo del

gnero Kappaphycus o Eucheuma en el medioambiente , es un
peligro que prevalece y sigue siendo impredecible. En este
sentido,
autores
como
Titlyanov
&
Titlyanova
(2010)
recomiendan, organ izar los sitios de cultivos de manera que no

se cultive en el mismo lugar por mas de dos aos. Tanto el
alcance de la propagacin como el efecto en las especies
endmicas depende de la interaccin entre las condiciones
ambientales de
preocupacin,
las localidades y especies.
no es si la
La
principal
bio-invasin es causada
por
Kappaphycus o Eucheuma, lo importante es saber que lo

causa y como puede ser controlada la situacin. Hayashi y
colaboradores (2010) recomiendan tener opciones de eontrol
efectivas para los cultivos actuales y el establecimiento de
protocolos de cuarentena, antes de la introduccin de nuevas
especies de esta manera se evitaran problemas similares en
los arrecifes de todo el mundo.
La plasticidad un problema en la identificacin del gnero

Kappaphycus y Eucheuma.
La plasticidad fenotipica es entendida como la habilidad que
posee un mismo genotipo para producir diferentes fenotipos en
respuesta a cambios en las condiciones ambientales (Monro et
al. 2009). Este mecanis.mo es uno de los medios por los cuales
los organismos pueden ajustar su morfologa y fisiologia
25
Introduccin General - - - - - - - - permitindoles enfrentarse a la heterogeneidad ambiental de su

ambiente natural (Palacio-Lpez & Rodrguez-Lpez 2008) .
Segn Monro & Poore 2009, los organismos modulares ssiles
tales como las plantas, invertebrados coloniales y las algas ,
debido a que tienen que soportar grandes cambios ambientales
sin tener el lujo de la movilidad, son los que ms se benefician
de la plasticidad fenotpica.
Muchas algas son conocidas por su notable variacin

morfolgica dentro y entre poblaciones. Sin embargo, la
etiologa de esta plasticidad en las poblaciones naturales, los
beneficios y el costo de asumir las diversas formas han
permanecido inexplorados por el campo de experimentacin
(Taylor & Hay 1984). Por ejemplo, muchas algas intermareales
muestran formas de gradiente desde un individuo con talo
vertical hasta agregados estrechamente agrupados de ramas
verticales y laterales. Estas ltimas formas a menudo cubren el
sustrato en grandes esteras continuas, al que se le llaman
cspedes o "turfs". Los costos inherentes de la configuracin
del csped han sido investigados en corrientes templadas de
agua dulce y en arrecifes tropicales. Los resultados han
demostrado
un
rendimiento
fotosinttico
inversamente
relacionado con el grado de compactacin probablemente

debido a la poca disponibilidad de luz entre ellos y la limitacin
de los nutrientes dentro de la matriz del csped (Monro & Poore
26
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - 2009).

No obstante, las implicaciones de la plasticidad han ido
ms all de la ptica de aprovechamiento de los recursos.
Desde hace aos se viene Incidiendo en las dificultades que la
plasticidad plantea a la clasificacin taxonmica basndose
nicamente en su morfologa, y planteando que no todo en la
taxonoma de algas estaba correcto (Mathieson et al. 1981). En
particular las especies de Eucheuma y Kappahycus presentan
una notable similaridad. La revisin de su basinonimia ha
permitido datar o acercarnos al origen de ambas especies.
Eucheuma fue establecido como gnero por Jacob
Georg Agardh en 1847, la identificacin de este gnero est
basada en la presencia de tres tipos de tejido en el talo rgido:
(i) el centro medular rizoidal , (ii) clulas medulares compactas,
(iii) una corteza compuesta por filamentos radiantes de clulas
pequeas y elongadas (Doty 1985).
Doty y Norris en 1985 proporcionaron una gua prctica
para la identificacin de especies de Eucheuma de mejor
fuente de carragenano, basndose en los diferentes tipos de
carragenano
(descritas
como
alpha,
beta,
gamma,
iota,
lambda, kappa, mu, nu) y tambin tomando en cuenta el tipo

de ncleo central medular (rizoidal o hifas). As clasificaron las
especies de Eucheuma en cuatro secciones (tabla 1) :
27
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - -
E.
sect. Eucheuma
(Tipo:
Eucheuma
denticulatum
(Burman) Collins & Hervey).
E. sect. Anaxiferae Weber-van Bosse, emend . (Tipo:

Eucheuma arnoldiWeber-van Bosse).
E. sect. Gelatiformia (Tipo : Eucheuma gelatinae (Esper)

J. Agardh) .
E. sect. Cot!oniformia (Tipo: Eucheuma alvarezi Doty).
Tabla 1. Clasificacin seccional de Eucheuma. El tipo de

carragenano se muestra entre parntesis, (Doty & Norris 1985).
Seccin
Seccin
Seccin
Seccin
Eucheuma
Anaxiferae
Gelatiformia
Cot!oniformia
(iota)
(iota)
(kappa)
(kappa)
E. gelatinae
E. alvarezi
E. denticulatum E. arnoldi
E isiforme
E. striatum
E. uncinatum
Doty (1985) separ la especie Eucheuma alvarezi del

resto de especies de Eucheuma, por su singular morfologa y
fisiologa de su crecimiento. Adems la describi como la
principal especie productora de kappa carragenano y las ms
cultivada (del tipo "cot!onii" en la industria), de esta especie
reconoce tres variedades E. alvarezi varo alvarezii, E. alvarezi
varo tambalang, y E. alvarezivar. ajak-assi.
28
- - - - - - - - - Introduccin General - - - - - - - En 1988, Doty revis los cuatro grupos de Eucheuma

descritos por Doty & Norris (1985) y consider una nueva tribu
llamada Eucheumatoide (del gnero: Eucheuma J. Agardh) y
un nuevo gnero Kappaphycus (de las especies: E. alvarezi
Doty). Esta tribu comprende el gnero Eucheuma con sus tres
secciones (E. sect. Eucheuma; E. sec!o Anaxiferae; y E. sec!o

gelatiformia) y el gnero Kappaphycus con sus tres variedades
(K. alvarezii var. alvarezii , K. alvarezi var. tambalang, K.
alvarezi var. ajak-assi).
El gnero Eucheuma ha sido distinguido

indeterminado
con
ramas
determinadas
por el crecimiento
laterales como
espinas, y comprende:
E. denticulatum (N.L. Burman) Colllins & Hervey, de

Mozambique,
Indonesia,
Sabah,
Filipinas,
Nueva
Caledonia.
E. serra (J . Agardh); Mauricio.
E. isiforme (C. Agardh) J. Agardh; Caribe.
E. uncinatum Setchell et Gardner; Golfo de California,

Mxico.
E. arnoldii Weber-van Bosse; Queensland, Ryukyu,

Taiwn.
E. amakusaensis Okamura; Japn, Taiwn, Filipinas.
E. gelatinae (esper) J. Agaedh; Filipinas, Sur de China.
E. perplexum Doty; Taiwn.

29
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - --
E. kraftianum Doty; Centro de Indonesia.
E. speciosum (Sonder) J. Agardh; Oeste de Australia .
E. odontophorum Boergesen; Mauricio, Este de frica .
E. platycladum Schmilz; Este de frica.
Kappaphycus se distingue del resto por la ausencia de

espiras de espinas, raras veces con ramificacin opuesta,
cistocarpos en los ejes principales, y la produccin de kappa
carragenano. En corte transversal, el talo consta de una
corteza interna y externa; las clulas .corticales externas estn
radialmente elongadas y pigmentadas; las clulas corticales
internas estn tambin elongadas y de paredes gruesas.
Las clulas se hacen ms grandes hacia el interior para

formar la medula. Las clulas medulares son isodiamtricas y
forman el tejido pseudoparenquimatoso, con ncleo central
(especialmente evidente en los pices) de filamentos formando
una hifa axial. Raras veces encontramos talos frtiles, los
cistocarpos se pueden encontrar dispersos sobre la superficie
del talo.
E! gnero Kappaphycus comprende las siguientes especies :
K. alvarezi (Doty) Doty (Basinimo: E. alvarezi Doty);

colectadas en la Isla Karindingan, Creagh Reef, cerca de
Semporna.
30
Introduccin General - - - - - - - -
K. inerme (Smitz) Doty (Basinimo: E. inerme Schmitz);

de Tanzania.
K. striatum (Smitz) Doty (Basinimo : E. striata Smitz) o

comunmente conocida como E. striatum; de Zanzibar,
Este de frica, Indonesia, Este de Sabah, Filipinas .
K.
procrusteanum
(Kraft)
Doty
(Basinimo:
E.
procrustanum Kraft); Centro de Filipinas.
K. coffoni (Weber-van Bosse) Doty (Basinimo: E.

coffoni Weber-van Bosse; Tanzania, Islas de Hainan,
Filipinas, Guam, Mauricio .
Las tres principales variedades de K. alvarezi (antes E.

alvarezit) reconocidas son K.
alvarezi varo
alvarezi con
simples, pequeos talos abiertos. K. alvarezi var. Tambalang

con talo tupido que comprende ejes pequeos indeterminados
y segmentos cortos; K. alvarezi va r. ajak-assi (an se mantiene
como especie del gnero Eucheuma en Algaebase , Guiry &
Guiry 2011) con ejes principales largos . K. alvarezi var.
alvarezii crece en arrecifes llanos de piedra caliza; K. alvarezi
var. tambalang en aguas turbulentas e arrecifes llanos poco
profundos; y K. alvarezi Var. ajak-assi prefiere corrientes de
agua con alto contenido de nutrientes y luz.
31
El mantenimiento de la calidad y mejora del cultivo

depende de la investigacin a nivel molecular.
Se ha descrito, que desde que iniciaron los cultivos de

Eucheuma y Kappaphycus en el ao 1970, se ha producido
una disminucin en la calidad y robustez del carragenano (Ask
& Azanza 2002) . La industria del carragenao se enfrenta a
problemas con respecto a la materia prima, relacionadas con la

calidad, volmenes y suministros. En este sentido, autores
como Ask & Azanza 2002, recomienda que hay que hacer
esfuerzos para que la industria mantenga un futuro prspero.
Sealan que ha habido poco apoyo en la industria, ya que solo
unas pocas empresas se han dedicado a la investigacin y
desarrollo del manejo de la materia prima. Destacan la
importancia de realizar investigaciones en reas vitales, tales
como, el aumento del rendimiento por productor, (en la
disminucin de costes laborales y el mantenimiento de altas
tasas de crecimiento durante todo el ao), el aumento en la
calidad del carragenano extrado a travs de la manipulacin
de la materia prima post- cosecha y el mejoramiento de las
cepas. En este sentido, las mejoras a las cepas de cultivos de
las
Eucheumatoides,
objetivos:
i)
generar
carragenano , ii)
se
centran
alta
adems
en
principalmente
productividad
de
altas tasas
y
de
calidad
dos
de
crecimiento
estacional estable durante todo el ao, es decir, cepas de
32
Introduccin General - - - - - - - - resistentes a las condiciones ambientales, tales como a la

herbivora, etc. A travs de programas de seleccin de cepas
silvestres se han obtenido mejoras en la productividad y
resistencia, de la especie ms cultivada K.
alvarezi var
tambalang.
En este sentido, autores como Hurtado y colaboradores

(2012), proponen el establecimiento de cultivares "banco" o de
cepas con cualidades superiores en cuanto a rendimiento del
crecimiento , y su resistencia a factores biticos y abiticos.
Adems crear viveros en tierra-ma r (Iand-sea basecf) , para
mantener
sostener
los
propgulos,
para
proveer
proporcionar cepas de calidad superior a los productores. En

cuanto a la seleccin gentica, los autores como Ask & Azanza
(2002) en su trabajo, recomiendan que es necesario para la
exitosa manipulacin de la gentica de las especies a cultivar,
es necesario , i) mtodos para introducir genes;
ii) un
conocimiento detallado e la gentica molecular del individuo en

estudio. Segn estos autores, teniendo en cuenta estos
parmetros tanto de manejo de materia prima como la
seleccin y
mejora
garantizar,
un
de
futuro
las cepas,
brillante
de
para
esta
la
manera
industria
se
del
carragenano, incluyendo miles de decenas de productores de

algas en todo el mundo y todos los pases que han llegado a
33
Introduccin General - - - - - - - - depender de los numerosos beneficios derivados del cultivo

comercial de las Eucheumatodes.
Los gneros Eucheuma y Kappaphycus son un grupo de

algas de gran importancia para la industria, pero de difcil
distincin, debido a su elevada plasticidad morfolgica y la
escasez de caracteres morfolgicos de diagnstico para su
identificacin. Esto hace necesario, la utilizacin de las tcnicas
moleculares,
las
cuales
han
permitido
identificacin de especies de algas,
en
clarificado
las cuales,
la
los
caracteres morfolgicos son muy pobres o contradictorios

(Conklin et al. 2009) .
Desde que se inici el cultivo de algas marinas en

Panam en el ao 2000, bajo el nombre comercial de "cottonii"
y descrita como Eucheuma coffoni, uno de los objetivos
principales de este trabajo ha sido la confirmacin a travs de
marcadores moleculares de la identificacin de esta especie.
Por otro lado, era necesario la caracterizacin molecular que
nos permitiese conocer el perfil gentico de los cultivares de
Panam, como medio de control y seleccin de cultivo, para
asegurarnos de la efectividad de los mismos. Adems, de
conocer la calidad de los carragenanos producidos por los
cultivares de Panam, y de esa manera tener opciones en el
mercado comercial de las carragenofitas.
34
Introduccin General - - - - - - - - Por todo lo expuesto, en este trabajo se presentan

metodologas que han permitido la caracterizacin a nivel
biolgico y qumico del carragenano producido por el cultivar de
Cativ (Provincia de Coln, Panam) . Estas tecnologas son
factibles para ser transferidas al sector industrial a pesar de su

complejidad y el estado primitivo de la I+D+i en el sector de la
explotacin de macroalgas. Los resultados obtenidos abren
expectativas de su uso en la mejora del rendimiento de la
industria ficolgica del pas centroamericano.
35
INTRODUCCiN
--------~~--------CAPTULO I
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - Los
marcadores
moleculares
pueden
ayudar
en
la
tanto
en
la
identificacin de especies.
Los
marcadores
moleculares
son
tiles
investigacin bsica, para el anlisis filogentico y bsqueda

de genes, como en la aplicada, por ejemplo en la seleccin
asistida
por
marcador,
las
pruebas
de
paternidad,
la
trazabilidad de los alimentos, etc.
Los marcadores moleculares, basados en ADN, se

definen como segmentos particulares de ADN que evidencian
polimorfismos,
que
pueden
localizarse
en
una
regin
codificante o no codificante, y revelan la ocurrencia de cambios

genticos entre dos o ms individuos, que idealmente son
representativos, a nivel de genoma completo (Snchez-Chiang
& Jimnez 2009) . Hay marcadores especificos para el ADN
nuclear, cloroplstico y mitocondrial.
En las algas, los estudios filogenticos generalmente

han utilizado el gen rbcL del genoma cloroplstico, y la
subunidad pequea (SSU) y grande (LSU) del ADN ribosomal
nuclear. Otro de los marcadores utilizados en la mayoria de
estudios filogeogrficos son los ITS- "internal transcribed
spacers"- en el cistrn ribosomal del genoma nuclear. Sin
embargo, muchos de los marcadores mencionados, que han
37
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - demostrado ser informativos en casos particulares, a menudo

no son apropiados, debido a que no proporcionan suficiente
resolucin (a nivel de poblacin) o son muy variables y se
aproximan a la saturacin (a niveles taxonmicos altos). por tal
razn,
vez
cada
mas,
los
estudios
filogenticos
filogeogrficos requieren de dos o mas marcadores, con el fin

de resolver diferentes niveles de relaciones evolutivas.
El ADN nuclear contiene regiones nicas (de una sola

copia) y no nicas (duplicadas o regiones repetitivas) . Se
considera que los organismos diploides tienen dos copias de
cada regin gentica (locus) en los pares homlogos
de los
cromosomas, llamadas alelos, los cuales pueden contener

regiones codificantes (exones) o no codificantes (intrones o
regiones intergnicas). Dentro de los marcadores de ADN
nuclear, encontramos tres subunidades altamente conservadas
(18 S, 5.8 S Y 28 S), separadas por dos espaciadores del
transcrito interno de los cistrones ribosomales, con elevadas
tasas de sustitucin (ITS1 e ITS2). Estos ltimos, se utilizan
mucho para anlisis filogenticos tanto en plantas (Li et al.
2012), como en animales (Kobayashi et al. 2010), hongos
(Dong et al. 1998), yen algas (Conklin et al. 2009; Pareek et al.
2010) . La popularidad a la hora de utilizar este marcador es
atribuida
la
alta
taza
de
substitucin,
permitiendo
comparaciones entre taxones de divergencias relativamente

38
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - recientes (Provan et al. 2004). Los marcadores 18 S, 5.8S, y 28

S tambin llamados SSU (small subunit) y los LSU (Iarge
subunit) los cuales codifican para la subunidad pequea y
grande respectivamente, de los genes nucleares del ribosoma
(Lluisma & Ragan 1995; da Silva et al. 2006). Estas secuencias
son repeticiones en tndem, que se encuentran conservadas a
lo largo de todo un genoma y evolucionan concertada mente.
Debido a la baja tasa de sustitucin que presentan, son
extremadamente tiles en el planteamiento de hiptesis de
relaciones filogenticas de taxas cOn tiempos de divergencia
muy antiguos. En algas, se han realizado estudios filogenticos
utilizando
el
taxonmicos
marcador
entre
las
SSU
para
especies
resolver
Eucheuma
problemas
denticulatum,
Eucheuma isiforme y Kappaphycus alvarezi (Luisma & Ragan

1995) as como tambin el marcador LSU en algas rojas del
orden Ceramiales (Kurihara et al. 2010) .
El genoma mitocondrial tiene un tamao en los an imales

3
generalmente menor de 20 x 10 pares de bases (20 Kb) Y su

longitud (en IJm) vara cons'iderablemente entre especies: 20
IJm en Neurospora, 25 IJm en Levaduras, 30 IJm en plantas
superiores,
IJm
(multicelulares) . Se
en
algunos
considera
que
animales
la
metazoarios
mayora
del
ADN
mitocondrial de hongos y plantas contienen largas secuencias

que no codifican productos, ya que, su ARN mitocondrial
39
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - contiene intrones. Sin embargo , el ARN
mitocondrial en
animales carece de intrones y se transcribe como ARN

policistrnico que se parte en ARN monocistrnfco antes de la
traduccin
(Alcntara
2007) .
Dentro
de
los
marcadores
mitocondriales , se encuentra el gen de la citocromo oxidasa c,

formada por las subunidades cox 1, cox 2 y cox 3. Esta enzima,
forma parte del eslabn final en la cadena de transporte de
electrones de la membrana interna mitocondrial. Otro marcador
mitocondrial, es el gen citocromo b (cob) (Irwin et al. 1991;
Meinard et al. 2002).
Las molculas de ADN del cioroplasto y las mitocondrias

son
especialmente
filo geogrficas
importantes
de
estructura
trazar
historias
poblacional
gentica
para
estrechamente relacionada al linaje, porque son de herencia

uniparental y no se recombinan. Tambin , nos permiten inferir
cambios
demogrficos
de
dispersin
entre
especies
(Alcntara 2007).
En los organismos fotosintticos, el ADN cioroplstico

tiene entre 120 a 200 kb (Alcntara 2007) con intrones y
exones ; se considera muy conservado , ya que , se trata
fundamentalmente del mismo genoma desde las briofitas hasta
las
plantas superiores.
Cada
cioroplasto
contiene
varias
regiones nucieotdicas, cada una con 8 a 10 molculas de

40
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - ADN . Por ejemplo, el alga verde unicelular Euglena puede
contener de 40 a 50 cloroplastos, por lo que la clula entera
puede contener ms de 500 copias del genoma del cloroplasto.
La enzima mayoritaria presente en estos orgnulos es la
Rubisco (ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa/oxigenasa) que
facilita el paso de la fijacin primaria del CO 2 en la fotosntesis.
Basndose en las caractersticas estructurales de esta enzima,
se puede dividir en dos formas distintas, conocidas como la
forma I y forma 11. La forma I consiste en ocho subunidades
grandes y ocho subunidades pequeas, las cuales podemos
encontrar en las plantas superiores, la mayora de las algas,
cianobacterias, y en la mayora de bacterias fotosintticas.
Mientras que la forma 11, solo consiste en subunidades grandes
las cuales podemos encontrar en algunos dinoflagelados y
algunas bacterias fotosintticas. En esta estructura cuaternaria
de la enzima, se encuentran los marcadores moleculares de la
subunidad grande
(rbcL) , la subunidad pequea rbcS y
espaciador de la Rubisco (Freshwater et al. 1994; Zuccarello et

al. 1999a, 2006).
El gene rbcS es conocido por su transferencia del

genoma del cloroplasto al genoma nuclear, y luego duplicado
en el genoma nuclear de diferentes organismos durante la
evolucin. Sin embargo, en las algas rojas este gen es
codificado y sintetizado en el cloroplasto, hecho que las
41
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - diferencia de las algas verdes y plantas superiores. En algas

rojas se han realizado estudios con este marcador y han sido
recomendados como primers universales para amplificacin de
este gen en varias especies de algas rojas . En esta lnea, en
algas pardas tambin se han realizado estudios, autores como
Lee y colaboradores (2011), presentan este marcador como til
en
la determinacin filogentica
entre especies y en la
identificacin de especies crpticas con morfologa similar. En

su estudio concluyen que el rbcS se puede utilizar para
resolver las relaciones filogenticas
entre
varias de
las
especies de algas pardas. En las algas verdes, son pocos los

estudios
realizados
reportados,
en
las
de
estos
especies
podemos
mencionar
Chlamydomonas
los
reinhardtii,
Dunaliella tertiolecta, Nannochloris bacillaris, Ulva pertusa y

Ankistrodesmus eonvolutus, en los cuales se ha clonado y
caracterizado este marcador rbeS , a fin de comprender las
relaciones entre las caractersticas fisiolgicas, moleculares y
evolutivas en estas especies.
El espaciador de la Rubisco presenta una de las

caractersticas
que
lo
hace
un
buen
marcado r:
es
suficientemente variable y corto para que los productos de PCR

sean consistentemente obtenibles (Hughey et al. 2001) . Ha
sido tambin utilizado como marcador de especies crpticas, es
decir, especies muy parecidas entre s pero reproductiva mente
42
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - alejadas (Zuccarello et al. 2006) . En estos caso el cambio en 1

2
pares de bases puede llegar a indicar grupos parcial o
totalmente
aislados
reproductiva mente
o/y
especies
morfolgicamente identificables. Un ejemplo de la aplicacin de

este marcador fue puesto de manifiesto en el estudio realizado
por Zuccarello y colaboradores (2006) de Kapppaphycus
a/varezi procedentes de frica, Hawi y de otras zonas
cultivadas en el resto del mundo. Adems de
identificar o
separar estos tres grupos de K. a/varezi (frica, Hawi ,

cultivados en el resto del mundo), tambin pudo diferenciar la
variedad "sacol" conocida como una variedad de K. eoffoni. El
espaciador de la Rubisco muestra distancias genticas entre
0.8 y 5 % entre especies, y <0.8 % dentro de especies (Tan et
al. 2013).
La subunidad grande de la Rubisco (rbeL) , ha sido muy

utiJizado tanto en algas como en plantas superiores. Uno de los
trabajos de
Freswater & Rueness (1994), describen las
ventajas que presenta este marcador: i) su gran tamao (mas

de
1400 pares de
bases) , las cuales
proveen
muchos
caracteres para anlisis filogenticos, ii) su tasa de evolucin

relativamente lenta, la cual es apropiada para la exploracin o
anlisis de relaciones a nivel de familia, o niveles mas altos, iii)
la disponibilidad de primers conservadores que permitan la
rpida amplificacin y secuenciacin. En la mayora de los
43
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - casos, si no en todos, las diferencias observadas en la el

estudio de las filogenias atendiendo al marcador de rbcL ,
reflejan la diferencia de genes y organismos, la cual se puede
explicar por transferencia horizontal , duplicacin de genes y
prdidas diferenciales de una de las copias del gen durante la
evolucin (Tourova & Spiridonova 2009) .
En particular en las algas rojas, las primeras secuencias

completas del gen rbcL publicadas datan de 1989 (Valentin &
Zetsche 1989). Desde entonces el anlisis de estas, han sido
utiJizadas para estudios de inferencia fiJogentica a diferentes
niveles taxonmicos de especies del orden Gelidiales y
Gigartinales (Freshwater et aI.1994) , y posteriormente en el
resto de las especies de la clase Floridiophyceae, productoras
de agar y carragenano (Fredericq et al. 1996). El trabajo
realizado por Freshwater & Rueness (1994), obtuvieron valores
de divergencia de secuencia intraespecfica de O a 1.8 % Y a
nivel interespecifico de 1.2 a 4.8 % dentro de las especies
complejas y 1.2-10.7 % de un total de 37 secuencias rbcL de
Gelidium.
Hay que considerar que los primers no son universales

para
todas
las
especies.
En
este
sentido
Provan
colaboradores (2004) plantearon una serie de razones por las
44
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - cuales, los primers universales por ejemplo utilizados en las
plantas no son vlidos en las algas:
i)
Al comparar las secuencias del genoma cloroplstico

de las algas, estas muestran
altos niveles de
diversidad estructural y de secuencias comparado

con las plantas, incluso esas diferencias tambin se
muestran
en
las
divisiones
Chlorophyta
R hodo phyta.
ii)
Estas comparaciones tambin muestran que hay una

tendencia
tener
intergnicolintron
particularmente
bajos
porcentajes
en
genomas
en
los
genomas
de
ADN
algales,
cloro plsticos
altamente compactos de las Rhodophyta (con ciertas

excepciones en el espaciador rbcL-rbcS).
iii)
Por ultimo la disponibilidad en las bases de datos de

secuencias del genoma de algas es limitado : hasta
hace muy poco, las nicas secuencia completa del
genoma
cloroplstico
disponible
han
sido
de
Porphyra purpurea, Cyanophora paradoxa, Odontella

sinensis y Chlorella vulgaris.
Con estas consideraciones se han desarrollado primers
especficos para los marcadores moleculares en las algas. La
bibliografa representada en la tabla 1.1 muestra los diferentes
estudios realizados en algas.
45
Introduccin Captulo I
Tabla 1.1 Resumen de marcadores moleculares con sus
respectivas regiones de amplificacin en algas ,
Marcador
Especie
Secuencia
Referencia
Algas
p23SrV_f1 (S' GGA CAG AM GAC CCT ATG
Sherwood
eucarioti
AA 3')
& Presting
casy
p 23SrV _r1 (S' TCA GC C TGT TAT CCC TAG
2007
cianoba
AG3")
Molecular
23 s rDNA
cterias
Espacia-
Relacia
cox2 F (5'
Zuccarell o
dar cox2-3
nes
GTACC~CTTTDRGRRKDAAATGTGATGC
et al. 1999b
intra-
3')
especffi
cox3R (5'
eas en
GGATCTACWAGATGRAAWGGATGTC3')
algas
rojas
Espacia-
Kappa-
Amplificacin del espaciador Rubisco seguido
Zuccarello
dor
phycus
por procedimientos descritos por Zuccarello et
et al . 2006 .
Rubisco y
al. 1999a.
Mitocon-
Eucheu
Amplificacin y secuenciacin del espaciador
driaJ cox
ma
2-3
mitocondrial cox 2-3. siguiendo los

procedimientos descritos por Zuccarello et al .
1999b ,
Espacia-
Algas
dar Rubis-
rojas
co
(1 ) (rbcF1 ) (5' ATA
Zuccarello
CTTCT ACAGACACAGCTGA3')
et al. 1999a
(rbcR2-M2)
(S'ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGT
CAAATAATGGTAGTCCCCA 3' )
(2) F (5' TGTGGACCTCTACAAACAGC 3 ')
R (5' CCCCATAGTTCCCAAT 3') (Maggs el
al. 1992)
46
Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - -
Introduccin Captulo I
Marcador
Especie
Secuencia
Referencia
Molecular
Espacia-
Algas
Los espaciadores Rubisco fueron
Kamiya et
dor
rojas.
amplificados usando primers que contienen
al. 1998.
Ceramia-
la secuencia de la regin 54 pb upstream
Rubisco
les
desde la terminacin 39 del gen rbcL y

complementaria para la regin de 151 pb
downsfream desde la terminacin 59 del

gen rbeS , (primerrbc-1) 59TATACTTCTACAGACACAGCTGA-39 y
(primer rbc-4.2) 59TGTAAAACGACGGCCAGTA(CT)(AT)CCC

CA-39, respectivamente .
EJ ultimo primer
fue sintetizado el') la mezcla formada y fue

aadido a M-13 secuencia universal farward
(18pb) hasta terminacin 59,
Rubisco y
Algas
Cebadores complementarios con la regin
Robba et al.
cox
rojas
cox1 codificadora para la subunidad de la
2006.
citocromo oXidasa, fueron diseadas por

Saunders (2005).
GazF1 5' TCAACAAATCATAAAGATATTGG
3' y
GazR1 5'
ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA 3' .
La regin espaciadora de Rubisco fue
amplificada utilizando:
RUB5 5' TGTGGACCTCTACAAACAGC .3' ,
Maggs et al. 1992.
y RUB3 5' CCCATAATTCCCAGTA 3',

diseado por G. Barker)
47
Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - La caracterizacin gentica de un cultivar depende de

marcadores
moleculares
para
detectar
diferencias
genticas dentro de poblaciones

Los
marcadores genticos
poblacionales
bsicamente
se
dividen en dos categoras generales: los marcadores con

variacin gentica en segmentos especificos del genoma, y los
que identifican variacin gentica annima. Dentro de los
marcadores de la primera categora se encuentran a las
aloenzimas, las cuales miden la variacin de ADN en las
regiones codificadoras de las protenas de funcin conocida.
Los RFLP "Restriction fragment length polymorphism" (Botstein
et al. 1980) tambin pueden considerarse de esta categora, al
ser identificados durante el anlisis de genes conocidos, al
igual que los SNP "Single nucleotide polymorphism" cuando
son desarrollados a partir de secuencias expresadas (Liu &
Corde
2004).
Ambos
marcadores
pueden
tambin
ser
considerados en ambas categoras en funcin del objetivo de

estudio. De la segunda categora tenemos los marcadores
como AFLP "Amplified Fragment Length Polymorphism 0Ios et
al.
1995),
RAPD
"Random
Amplified
Polymorphic
ONA"(WiIUams et al 1990) y microsatlites (SSRs) "Simple
Sequence Repeats" los cuales detectan variacin en sitios de

restriccin annimos. En la tabla 1.2 estn resumidas las
principales caractersticas de cada marcador. Dependiendo del
48
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - tipo
de
estudio,
se
requieren
de
tipos
especificos
de
marcadores moleculares. Para ello se debe tener en cuenta

una gran variedad de factores entre ellos, su localizacin en el
genoma y su rol en la expresin del gen, su forma de mutacin
o la falta de expresin codominante , su factibilidad o aplicacin
econmica (Garvin et al. 2010) .
La evolucin de los marcadores moleculares desde las

aloenzimas hasta los SNPs, se refleja resumido en la Fig. 1.1 .
(tomada de Schl6tterer 2004) . Segn esta figura se clasifican
los marcadores moleculares basndose en tres tipos, aquellos
basados en variantes de protenas (aloenzimas), polimorfismo
de secuencia de AON , y variacin por repeticiones de AON.
Otra de forma de clasificacin : las tcnicas no basadas

en PCR "Polymerase Chain reaction" (aloenzimas y RFLP) Y
las que si se basan en esta tcnica (RAPO, SSR, SNP, EST y
AFLP) . En este estudio describiremos los marcadores en base
a esta ltima clasificacin .
49
- - - - - - - - - Inl roducdn Captulo I - - - - - - - -
i
i
Mirisat"""",
:::1
Fig.I .1. Vista subjetiva de los cambios de relativa importancia

en la utilizacin de los diferentes marcadores (SchlOtterer
2004). El eje horizontal indica la cronologa. En cada perodo,

el eje vertical indica el uso total del marcador molecular. Si mas
de un marcador molecular se utiliza en un punto de tiempo
dado, su importancia relativa se refleja por su proporcin en el

eje vertical.
50
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzfez - - - - - - -
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - Las isoenzimas fueron originalmente definidas como

formas moleculares mltiples de las enzimas, con funciones
idnticas o similares que estn presentes en el mismo
individuo. Pueden presentar varias formas allicas, conocidas
como
aloenzimas (Alcntara
selectivamente
hereditarios,
neutras
para
se
cuantificar
2007) . En
su
utilizan
como
las
mayora son
frecuencias
marcadores
allicas
genotpicas de los individuos, que son los estimadores bsicos,

de la composicin gentica de una poblacin (ver tabla 1.2). El
principio de la tcnica se basa en que las variantes de las
enzimas pueden ser distinguidas por gel de electroforesis de
acuerdo a las diferencias en el tamao y carga, causada por
las substituciones amino-cidas. Para visualizar las bandas de
aloenzimas, el gel de electroforesis se pone en contacto con
una solucin que contienen el sustrato de la enzima. y es
tratado con tintes especficos de la enzima que contiene el
substrato, cofactores y sales oxidadas (como por ejemplo
nitroblue tetrazolium) .
Las isoenzimas han sido utilizadas en estudios genticos
desde
1966, cuantificando
la
variacin
gentica
en
las
poblaciones humanas, en Drosophila (Johnson et al. 1966 ) Y

ms tarde, en estudios con plantas superiores (Rogers et al.
1966). Tambin se han utilizado en la cuantificacin de
heterocigosis, diversidad gentica, diferenciacin, gentica y
otras medidas de variacin
intra e interpoblacional. Sin

51
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - embargo, presentan un nmero de sitios informativos muy bajo ,

detectan bajos niveles de polimorfismo, y es considerado un
mtodo indirecto e insensible para detectar variacin en el ADN
(Schololterer 2004) .
En algas marinas son muy poco comunes los estudios
realizados con isoenzimas principalmente por las dificultades
tcnicas asociadas a su alto contenido de polisacridos,
especialmente en algas rojas y pardas (Sosa & Lindstron
1999). A pesar de ese hndicap autores como Benzie y
colaboradores (1997) utilizaron esta tcnica para un estudio
con siete especies y variedades del alga verde del gnero
Caulerpa. En su trabajo concluyeron que las aloenzimas son
una herramienta muy til para la definicin del limite de las
especies y el conocimiento de la estructura de la poblacin de
Caulerpa, pero no es adecuada para determinar las relaciones
filogenticas dentro del gnero. En este sentido, otro estudio
realizado en el alga parda Sargassum por los mismos autores
en el ao 2000, analizaron 13 especies de este gnero en
Great Barrier Reaf Australia, donde las aloenzimas resultaron
ser tiles en la identificacin de las especies de Sargassum en
ese sitio.
Por otro lado, trabajos como los de Brostoff & Gordon
(1997), en la especie Porphyra recolectada en 27 sitios
diferentes de Nueva Zelanda , revelaron mediante esta tcnica
la existencia de mas especies que las reportadas previamente.
52
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - En esta linea los trabajos realizados en la especie Gelidium

canariensis y G. arbuscula por Sosa y colaboradores (1998),
con la informacin revelada por las aloenzimas en tres sitios
ubicados entre la Isla de Gran Canaria y Tenerife, result ser
til
para
determinar
la
diferenciacin
gentica
en
las
poblaciones separadas entre 30 a 100 km en las especies en

estudio. Sin embargo, no es la herramienta ideal para las
macroalgas debido al bajo nmero de loci disponibles y al bajo
nivel de polimorfismo encontrado (Sosa & Lindstrom 1999).
Los RFLPs fueron desarroUados en programas de

investigacin tras el descubrimiento y aislamiento de las
endonucleasas de restriccin en 1960 por Arber, Smith y
Nathans, sentando las bases para este nuevo tipo de marcador
gentico. Este marcador era considerado el primer avance en
la revolucin del genoma marcando el inicio de una era
diferente en las ciencias biolgicas (Liu & Cordes 2004). Esta
tcnica permite, por primera vez, el anlisis de secuencias
codificadoras y no codificadoras o de cambios silenciosos en
la secuencia codificadora de una protena. Inicialmente, se
emple para el mapeo gentico de los adenovirus (Grodzicker
et al. 1974) Y en la construccin de un mapa de ligamiento
(Botstein et al. 1980) en humanos . El mapa de ligamiento
permite conocer el lugar cromosmico de los genes ligados
(asociacin de genes en el mismo cromosoma formando
53
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - grupos de ligamiento), y su relacin de distancia con otros

genes en un cromosoma dado.
Esta
tcnica
tambin
detecta
polimorfismos
entre
individuos dados por el tamao de los fragmentos. El ADN

genmico se trata con enzimas de restriccin, que lo rompen
en un nmero de fragmentos, cuyo tamao y nmero son
caractersticos del organismo y del tipo de endonucleasa
utilizada. El nmero de fragmentos obtenidos, corresponde a la
frecuencia con que aparece esta secuencia repetida, en el ADN
del individuo. La longitud de cada uno de los fragmentos, indica
las distancias entre cada uno de los sitios reconocidos.
Mediante Southern blot se transfieren los fragmentos de ADN
separados,
membrana
segn
su
y luego se
movilidad
hibridan
electrofortica ,
con
sondas
una
especficas
marcadas. Las secuencias homlogas a la sonda utilizada se

visualizan por impresin y revelado de una pelcula. Recientes
anlisis reemplazan el tedioso mtodo de Southern blot con
tcnicas basadas en reaccin en cadena de polimerasa (PCR)
la cual describiremos ms adelante.
La mayor ventaja de la tcnca de RFLP es ser un
marcador codominante, es decir, que ambos alelas en un
individuo son observados en el anlisis, por lo cual, son ms
informativos, desde el punto de vista gentico. Adems , las
diferencias de tamao al ser a menudo grandes, el anlisis es
relativamente fcil.
54
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - No obstante presenta una serie de desventajas entre

ellas: requiere de cantidades altas de ADN, es una tcnica muy
laboriosa y es necesaria una infraestructura adecuada para los
casos en que se trabaja con radioactividad para el marcaje
especfico
de
las
secuencias
de
inters.
Adems
el
polimorfismo detectado depende de la heterocigosidad de la

especie
estudiada,
generalmente
bajos
niveles
de
polimorfismo (Liu & Cordes 2004) (ver tabla 1.2)
55
(/)
'"
'"
'"
"O
(/)
..Q
(/)
Q)
Ti
:n'o"
a.
~
'"
.!,1
'e"
a.
(/)
()
'Q)
>-
"S
~
ro
O
e
'o
'0
(/)
"O
~
~
Q)
::J
"O
"O
e
e
(/)
o
a.
::
(/)
Q)
e~
~.
~ ~
"'C~
(/)"0
..Q
Q)
"OL{)
eO
'o
0
~
Q)
'" E
a...c
Eo
01-
Oo(j
N",
..Q
"'::2:
:n~
'" eQ)
1-
ro
ro
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - En algas son muy pocos los estudios que se han
realizado de RFLP, Teasdale y colaboradores (2002) utilizaron
en su estudio patrones RFLP del gen rbcL, en especies del
gnero
Porphyra,
del
Noroeste
Atlntico,
como
mtodo
confiable para la identificacin de especies de este gnero.

Para ello utilizaron estadios inmaduros o de reproduccin
vegetativa, y especies cripticas . En este sentido, otro estudio
fue realizado por Antaine & Fleurence (2003) en algas rojas y
pardas, con patrones RFLP de la regin del espaciador
mitocondrial IT8. Estos autores obtuvieron patrones de RFLP
solo en las algas rojas, debido a la falta de especificidad de las
enzimas utilizadas en las algas pardas.
Como se mencion anteriormente son muy pocos los
estudios realizados en algas, debido probablemente a lo
laborioso de la tcnica, y al bajo potencial que presenta para
revelar
la
variacin
gentica
comparado
con
los
otros
marcadores mas recientemente desarrollados.
La tcnica de. reaccin en cadena de la polimerasa ha

permitido incrementar la disponibilidad de marcadores
moleculares.
Dentro de las tcnicas desarrolladas con PCR se encuentran la

amplificacin aleatoria del ADN polimrfico o RAPO, (VVilliams
et al. 1990). Esta tcnica permite detectar mltiples sitios en el
57
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - genoma y consiste en la amplificacin de secuencias de ADN

al azar, con un primer generalmente de una longitud de diez
pares de bases de secuencia aleatoria (decmero), que hibrida
con el ADN, en varios sitios (Semagn et al. 2006). Segn la
secuencia del primer utilizado, la unin se dar en unos lugares
o en otros. Debido al tamao del primer hay una gran
probabilidad de que se encuentren varias regiones del ADN
que sean complementarias a los mismos. Esta unin servir de
punto de partida para sintetizar un fragmento continuo de ADN.
Por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se
obtienen, a partir de una pequea muestra de ADN, infinidad
de copias, en pocas horas y posteriormente, los fragmentos de
ADN, son separados segn su movilidad electrofortica y
visualizados, en un gel de agarosa o poliacrilamida teidos con
bromuro de etidio (ver Fig. 1.2). Las los diferentes patrones de
bandas, detectados entre individuos evidencian las diferencias
en sus secuencias de bases y esto permite comparar geno mas
entre individuos, poblaciones y especies. Esta tcnica, es
simple, efectiva, y permite determinar los polimorfismos, en
gran cantidad de muestras. Adems no necesita conocimiento
previo del genoma en estudio y requiere de pocas cantidades
de material biolgico .
58
- - - - - - - - Irtrod ucci n C~tLJ o I - - - - - - - -
iI 111 .. , i: ' ' 111 i i i i i I "
,.",,,
,""< ' "
" l . .. "
~ .. --~ <
'
"'!!"" '::. 1' ,,, .. , I'.

',IIlIlIIl i r",1111 ,,'
~t!!".,!t
._.... _,
l''''''
o
',"">
'.
Vi"",""I:I<i" ""
! ~ fU'.P!l> por
oon MImo> o OlidO,
Fig
1.2 El
anli~s
de RAPOs es una tcnica que envueJve
pocos pasos Paso 1, extraccin del ADN ; Paso 2, el ADN es

amplificado por PCR en 9JS respectivos pn'rTers. Paso 3 , lo s
productos RAPOs se corren en ge l de agamsa rrediante la
electruforesh y se visua li zan las bandas mediante la lindn de
bromuro de etidio (Fuente - l/VMe el al. 20 07) .
- - - - - - - Ciauda Massfei Prez Gonl&feZ - - - - - - --
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Sin embargo, muchas veces, es necesario evaluar una

gran cantidad de primers, y la combinacin adecuada, antes de
encontrar aquellos que son informativos. Adems, se obtiene
una muy baja reproducibilidad de los resultados y la presencia
de amplificaciones de bandas del mismo peso molecular, son
imposibles de distinguir, pudiendo corresponder a loci distintos.
Por otro lado, su naturaleza dominante, no permite distinguir
genotipos de cada individuo y esto genera una limitacin en la
informacin gentica obtenida . (White et al. 2007) (ver tabla
1.2) .
Los estudios de RAPOs en algas han sido exitosamente
utilizados
para
la
identificacin
de
especies,
estudios
biogeogrficos y la determinacin de relaciones genticas

dentro y entre poblaciones (Alberto et al. 1999; Sim et al.
2007). Los estudios realizados por Alberto y colaboradores
(1997) destacan esta tcnica como apropiada para caracterizar
la
variacin
gentica
entre
las poblaciones
de
Gelidum
sesquipedale del sur de Portugal.

Siguiendo con las algas rojas, otros estudios realizados
en poblaciones de Gelidium canariensis por Bouza (2002) en
las islas de Gran Canaria, Tenerife, La Palma y La Gomera
obtuvieron con la tcnica RAPO, niveles considerables de
diversidad gentica dentro de las poblaciones, adems de un
grado
considerable
de
diferenciacin
gentica
entre
las
poblaciones y aislamiento por distancia .

60
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Por otro lado, se han realizado estudios en algas pardas
como el de Billot y colaboradores (1999), en Laminaria digitata
en donde esta tcnica result ser til en los anlisis de
parentesco.
Sin embargo debido a que los RAPOs no
proporcionan informacin sobre la heterocigosidad del genoma,

esta tcnica
se debe complementar con otros tipos de
marcadores
codominantes,
como
por
ejemplo
los
microsatlites.
En
algas
verdes,
Prasad
colaboradores
(2009)
estudiaron a travs de RAPO el gnero Ulva de las costas de

Maharashtra, India. Caracterizaron 4 especies de este gnero y
determinaron la relacin entre las especies dentro de un
gnero, adems de desarrollar los perfiles genticos de cada
individuo . Se podra decir que los RAPOs son apropiados para
estudios de poblaciones intraespecficas en algas, debido a.
que muestran una variacin mucho mayor entre los individuos,
por lo que puede ser apropiada para este tipo de estudios
(Barreiro et al. 2006) .
Las
secuencias
sencillas
repetidas,
SSRs
microsatlites, son regiones hipervatiables, compuestas de

secuencias, de unos pocos pares de bases (uno a seis)
repetidas
muchas
veces.
Los
microsatlites
tienden
distribuirse de manera uniforme en el genoma de todos los

cromosomas y todas las regiones del cromosoma. Han sido
61
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - encontrados
dentro
de
regiones
codificadoras
no
codificadoras de genes, en intrones (Liu & Cordes 2004). La

mayora de los loci de
microsatlites son
relativamente
pequeos, y van desde unos pocos hasta un poco ms de

cientos de
repeticiones.
En
general,
los
microsatlites
contienen una gran cantidad de nmero de repeticiones que

detectan
ms
polimorfismo,
aunque
se
ha
detectado
polimorfismo con tan solo cinco repeticiones (ver tabla 1.2).

El polimorfismo de los microsatlites se basa en las
diferencias de tamao, debido a la diversidad de nmeros de
unidades repetidas contenidas por los alelos en un locus dado.
La ratio de mutacin en micro satlites ha sido reportada como
alta de hasta 10-2 por generacin y se cree que es causado por
el retraso de la polimerasa "polymerase slippage" durante la
replicacin del ADN, resultando diferencias en el nmero de
unidades repetidas (Liu & Cordes 2004). Las reacciones en
PCR, para los SSR, se llevan a cabo en presencia de primers
"forward" y
"reverse" especficos, para las regiones que
flanquean las secuencias repetidas. La interpretacin de los

polimorfismos est basada en la variabilidad del nmero de
repeticiones y, en
fragmentos
consecuencia,
amplificados .
Esta
por el tamao de
tcnica
permite
los
detectar
diferencias hasta de una base, que corresponde al mnimo de

longitud de un polimorfismo.
62
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Los SSRs tienen ventaja sobre los RAPDs debido a que
son codominantes, abundantes, con alto polimorfismo, y es
factible su semiautomatizacin, pudiendo ser identificados en
bases de datos. Sin embargo, los SSR requieren de mucho
trabajo, debido a que se puede analizar solo un locus a la vez,
al ser un marcador especifico de secuencia y requieren un
conocimiento previo, de las secuencias de ADN que flanquean
al segmento de inters. Para el diseo de primers, esta
condicin supone al mismo tiempo, una ventaja y desventaja,
puesto que Incrementa su especificidad, pero tambin su coste.
La aplicacin de esta tcnica en algas no es muy comn,
puesto que, se necesita conocimiento previo de la secuencia
del genoma, y en algas an hay mucho por determinar en este
tema. Sin embargo, en las que poseen gran inters comercial si
se han realizado algunos trabajos. Tal fue el caso de Gracilaria
chilensis donde los autores Guillemin et al. (2005) identificaron

seis loci de microsatlites como buenos candidatos para
evaluar el nivel de recurso gentico dentro de estas especies
de G. chilensis. De esta manera, se obtuvo marcadores tiles
para caracterizar la estructura gentica en las poblaciones
naturales y cultivadas de estas especies .
En
el
colaboradores
alga
parda Laminaria japnica,
(2007)
desarrollaron
18
Shi
y sus
marcadores
de
microsatlites polimrficos, los cuales facilitarn la gestin y

explotacin del germoplasma como recurso gentico de esta
63
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - especie, conservado como clones gametofitos y tambin ser

til en la determinacin de la diversidad gentica de L. japonica
distribuida naturalmente.
Otros trabajos utilizan los SSR en conjunto con los EST
"Expressed Sequence Tags", (se describirn en detalle mas
adelante) obteniendo secuencias a partir de los SSR, como es

el caso de Fucus serratus (Coyer et al. 2009) y Saccharina
japonica (Liu et al. 2012).
Los SNP o polimorfismo de nucletido nico describen

polimorfismos causados por puntos de mutacin que dan lugar
a alelos diferentes que contienen bases alternativas a esa
posicin de nucletido dentro del locus. Dicha diferencia de
secuencia, debido a las substituciones de bases, han sido bien
caracterizadas desde los comienzos de secuenciacin del ADN
en 1977, pero la habilidad de genotipar SNPs rpidamente en
grandes nmeros de muestras, no fue posible hasta la
aplicacin de la tecnologa de "gene chips" a finales de la
dcada de los 90 (Liu & Cordes 2004). Los SN Ps se estn
convirtiendo en el punto focal del desarrollo de los marcadores
moleculares ya que presentan el polimorfismo mas abundante
para cualquier organismo, es adaptable a la automatizacin, y
revela polimorfismo oculto, que otros marcadores y mtodos no
detectan (ver tabla 1.2).
64
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - La identificacin de la variacin en la secuencia de ADN

con SNPs ha llegado a ser una aplicacin de rutina en diversos
campos tales como forense, mejoramiento de cultivo, marcador
en reproduccin asistida, acuicultura, conservacin, y manejo
del recurso, adems de su amplia utilizacin en humanos para
aplicaciones de diagnstico (Garvin et al. 2010). El principal
potencial de los SNPs viene dado por el anlisis de secuencias
masivas, en los sistemas de nueva generacin (NGS), con
costes asequibles (Scholotterer 2004).
Sin embargo, a pesar de los avances tecnolgicos de esta
tcnica, el genotipado de SNPs es todava una tarea difcil y
requiere de equipo especializado (Liu & Cardes 2004). Adems
otro factor importante es la falta de datos disponibles para este
marcador en los organismos no modelos, como en el caso de
las algas, lo convierte en uno de los principales inconvenientes
de este marcador (Provan et al. 2013)
Un marcador clsico de SNP se centra en una nica
posicin de un nucletido en el genoma. Dentro de una
poblacin, sin embargo, muchas posiciones de nucletidos son
invariables, por lo que una informacin a priori sobre la
presencia de variacin allica a esa posicin genmica dada es
necesaria. La forma ms adecuada para identificar los SNPs a
lo largo del genoma es la generacin secuencias "shotgun"
enteras del genoma, utilizando un grupo de individuos como
donantes del ADN genmico para ser secuenciado. Se han
65
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - reportado estudios de SNPs en el alga roja Chondrus crispus

(Provan et al. 2013) y en el alga parda Fucus vesiculosus
(Canovas et al. 2011). En ambos trabajos se desarrollaron los
SNPs a partir de libreras de EST, al igual que los estudios de
microsatlites. El objetivo de aplicar esta tcnica en Chondrus
crispus era para evaluar los niveles y patrones de diversidad

gentica en las poblaciones naturales de esta especie en el
Atlntico Norte. En el alga parda, queran determinar con los
datos de SNP, mutaciones relacionadas con las adaptaciones
locales. La utilizacin de este marcador en las algas depender
del incremento de bases de datos de libreras de cONA en las
algas.
La creciente disponibilidad de datos de EST reportados
para muchas especies facilita el rpido desarrollo de primers
para amplificar y secuenciar mltiples loci, con los cuales se
puede desarrollar los SNP (Provan et al. 2013) . La produccin
de EST se da con la construccin de libreras de cONA. La
identificacin de EST ha avanzado rpidamente con mas de 6
millones de ESTs actualmente disponibles en bases de datos
computarizados (Semagn et al. 2006), aunque el volumen de
bases de datos de EST en algas es muy bajo en comparacin
con las plantas superiores (Wong et al. 2007).
Los EST fueron originalmente diseados como una va
para identificar genes transcriptos, pero desde entonces se han
convertido en una poderosa herramienta en el descubrimiento
66
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - de genes, la obtencin de datos sobre la expresin y la

regulacin
gnica,
la
determinacin
de
secuencias y el
desarrollo de marcadores de gran valor, tales como EST

basado en RFLP, SSR, SNP y CAPS (Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence) . Los EST tambin han sido utilizados

en el diseo de sondas para ADN de microarrays, que luego se
utilizaron en la determinacin de expresin del gen (ver tabla
1.2) .
En
algas
marcadores,
por
se
han
ejemplo,
realizado
en
estudios
especies
con
como
estos
Porphyra
yezoensis (Asamizu et al. 2003), Laminara digitata (Roeder et

al. 2005), Ulva Iinza (Stanley et al. 2005), Chondrus crispus
(Callen et al. 2006) y Sargassum binderi (Wong et al. 2007). El
incremento en los estudios realizados en las algas con esta
tcnica permite a su vez un aumento de la libreras de cONA de
algas, con lo cual proporciona a su vez un medio alternativo
eficaz para el descubrimiento de genes, relacionados con
importantes funciones, la biosntesis de polisacridos (Callen et
al. 2006) o la proteccin de la clula contra los radicales libres
(Roeder et al. 2005).
Otro
tipo
de
marcadores
son
los
STS
o STMS
(Sequence Tagged Sites o Sequence Tagged Microsatellite

Sites-STMS),
definidos
como
sitios
etiquetados
por
la
secuencia, se obtienen a partir de los marcadores RFLPs,

67
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - RAPOs y AFLPs, en donde se asla el fragmento de AON

polimrfico del gel, se clona, se secuencia y se disean
oligonucletidos especficos de alrededor de 20pb, para ser
utilizados como primers (Picca et al. 2004) . Los STS siguen los
mismos principios que el procedimiento de los SSRs, pero se
diferencian nicamente porque utilizan secuencias de primers
alrededor de 20 pares de bases.
Los CAPS o secuencia polimrfica amplificada y cortada
se describen como la combinacin de PCR y RFLP Y fue
originalmente llamado PCR-RFLP (Semagn et al. 2006). La
tcnica consiste en la amplificacin de fragmentos de AON,
seguido de una digestin por enzimas de restriccin. Las
variaciones se detectan por presencia o ausencia de los sitios
de restriccin , en geles de agarosa .
La regin amplificada caracterizada y secuenciada o
SCAR
"Sequence
Characterized
Amplified
Region" , son
fragmentos de AON amplificados mediante la utilizacin de

primers especficos de 15 a 30 pares de bases, diseados de
acuerdo con la secuencia obtenida de PCR que se desea hacer
an ms especificas (Picca et al. 2004). La especificidad de
estos primers los hace adecuados para su utilizacin en la
amplificacin especfica de marcadores.
La amplificacin de polimorfismo sensible o susceptible
a
metilacin,
MSAP
"methylation-sensitive
amplification
polymorphism", se basa en una doble digestin, primero con

68
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - una enzima sensible a la presencia de sitios de metilacin

(Hpall o Mspl) y luego una enzima no sensible a metilacin
(EcoRI).
Despus,
los
fragmentos
son
ligados
los
adaptadores en la doble banda y se amplifica la secuencia con

primers complementarios a estos. (Snchez-Chiang & Jimnez
2009).
La tcnica de AFLP ha sido ampliamente empleada en la

caracterizacin de cultivares.
El AFLP "Amplified Fragment Length Polymorphism" es una

tcnica desarrollada por Vos y colaboradores (1995) en la cual
primero involucra la digestin del ADN con dos enzimas de
restriccin, segundo, se realiza ligacin de adaptadores en
ambos
extremos,
segmentos
de
ADN
por ltimo,
con
ocurre
amplificacin
primers especificas
de
diseados,
tomando en consideracin las secuencias de los sitios de

restriccin de las enzimas y de los adaptadores empleados
(Vos et al. 1995; Picca et al. 2004; Sanchez-Chiang & Jimnez
2009). Una vez que los fragmentos han sido amplificados, se
visualizan
en
geles
de
poliacrilamida
software
como
GeneMarker, GeneMapper, etc.

Los AFLPs presentan un alto poder de deteccin de
variabilidad gentica debido a que exploran
simu~neamente
la
presencia o ausencia de sitios de restriccin, como los RFLPs,

69
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - y la ocurrencia o no de amplificacin, como en los RAPOs. Este

marcador es una herramienta mucho ms poderosa que los
RAPOs porque permite amplificar secuencias de mayor nmero
de
nucletidos
(lo
que
incrementa
significativamente
la
especificidad), no requiere informacin previa de la secuencia

del genoma y es altamente reproducible.
La tcnica de AFLP analiza las distintas zonas o loci del
genoma, sin necesidad de conocer previamente el genoma, y
es capaz de detectar los cambios de tamao en las distintas
regiones. Esto es de indudable importancia en los procesos de
seleccin artificial de especies. Como se sabe, los organismos
pueden sufrir mutaciones como resultado de la interaccin de
las funciones normales de la clula con su medio ambiente. La
mayora de estas mutaciones se producen en las partes no
funcionales del genoma y consecuentemente no pueden ser
reveladas por la secuenciacin de la protena. La aplicacin de
la
tcnica
ha
servido
tambin
para
el
diagnstico
de
enfermedades, monitoreo de poblaciones, identificacin de

familias y estudios de variabilidad gentica dentro y entre
poblaciones.
Aunque la tcnica de AFLP es altamente reproducible ,
las tasas de error, por lo general, estn entre un rango de 2-5
%. Esta variacin puede deberse a varias causas. Las ms
comunes son la contaminacin de la muestra, los artefactos

bioqumicos, el error humano, o la baja calidad de AON (Bonin
70
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - et
al.
2004).
Otros
desaciertos
que
pueden
prevalecer
principalmente en el anlisis, son la homoplasia de alelos y los

errores de puntuacin o de anotacin. Adems de presentar
fallos en el genotipado durante el anlisis molecular, y que se
podra corresponder con un genotipo alterado, de los individuos
bajo consideracin, con respecto al real. Bonin y colaboradores
(2007), recomiendan para evitar este tipo de errores: (i) se
debe dirigir el anlisis a nivel intraespecfico, y evitar transferir
marcadores entre especies; (ii) favorecer las combinaciones de
primers,
que
generan
perfiles
claramente
legibles
reproducibles (con un nmero de bandas menor de 100 Y que

estas, estn distribuidas homogneamente a lo largo del
genoma); (iii) dar preferencias a las bandas mas grandes en
intensidad como marcadores , y por ltimo (iv) si es posible,
valorar el grado de homoplasia del fragmento
mediante
secuenciacin, en anlisis in slico, o mediante otros protocolos

propuestos por Hansen et al. (1999) y O'Hanlon & Peakall
(2000).
El estudio de la variabilidad gentica, mediante AFLP, en

cultivares de Vitis vinifera ha tenido mucho xito. Se ha
encontrado una alta variabilidad gentica entre clones y una
tendencia a mutaciones espontneas en el genoma de las
vides, sugiriendo que los clones propagados asexualmente no
son estables y su informacin gentica era variable (Anhalt et
71
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - al. 2011). En este sentido, estudios realizados en clones de
Vitis vinifera por Upadhyay y sus colaboradores (2011),

mediante tres combinaciones de primers de AFLP, pudieron
detectar marcadores nicos para tres clones, sealando por
tanto que fue un procedimiento muy til para el anlisis de
variabilidad gentica en cultivares de reproduccin vegetativa
(Scott et al. 2000; Cervera et al. 2000; Sensi et al. 1996).
Adems de la aplicacin de esta tcnica en las vides, se
ha aplicado en cultivos de arroz (Aguirre et al. 2005; Arnao et
al. 2008), maz (Hartings et al. 2008), y tambin ha sido muy
til en la identificacin de variedades de cebada y sus
relaciones genticas que establece este cereal entre los
diferentes cultivares en North Shewa Etiopia (Assefa et al.
2007). En este sentido, AFLP se ha utilizado con xito en el
estudio de plantas clona les, revelando diversidad clonal y la
distribucin espacial de los clones (Escaravage et al. 1998).
Esta
polimorfismos
tcnica
y
se
ha
variacin
utilizado
para
somaclonal,
determinar
en
plantas
micro propagadas in vitro y a travs de embriognesis somtica

(Mehta et al. 2011; Sharma et al. 2011; Medero et al. 2002; Hsu
et al. 2008). Tambin se ha utilizado en la caracterizacin
gentica de cultivares de ctrico (Fang et al. 2009), ciruelas
(lIgin et al. 2009) y albaricoque (Geuna et al. 2003).
Los estudios realizados con AFLP en algas son muy
escasos; solo se han reportado algunos estudios en algas
72
- - - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - verdes, tales como Caulerpa taxifolia (Murphy & Schaffelke
2003) y Chlamydomonas reinhardtii (Werner et al. 2001). En la
primera, se llevaron a cabo estudios de relaciones genticas
entre localidades del Mediterrneo y de Australia. En la
segunda, se generaron marcadores de AFLP del locus mating
type de Chamydomonas.
En algas pardas, en el gnero Laminaria se han
realizado estudios con AFLP, para principalmente, estudios de
mapeo gentico (Yan et al. 2009, Liu et al. 2009, 2010). Otros
estudios realizados con AFLP en Laminara japonica (Yi et al.
2010) Saccharina japonica (Shan et al. 2011) Y Po/ste/sia
palmaeformis
(Kusumo
et
al.
2004)
se
realizaron
para
determinar diversidad y diferenciacin gentica dentro y entre

las poblaciones.
En algas rojas, se ha reportado la aplicacin de AFLP en
el gnero Porphyra para la identificacin de cepas puras (Niwa
et al. 2004) y en la determinacin de perfiles moleculares de 27
lneas de Porphyra (Sun et al. 2005). Otro estudio fue
realizado, en poblaciones perifricas de Grateloupia lanceolala,
para analizar la estructura de la poblacin y su variacin
gentica (Maneiro et al. 2011). En la especie Chondrus crispus,
Donaldson y colaboradores (1998; 2000) realizaron estudios de
caracterizacin de la poblacin y variacin gentica. En el
gnero Kappaphycus no se han realizado estudios con esta
73
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - tcnica, por lo que sera el primer reporte de AFLP en la

caracterizacin gentica de los cultivares de Panam.
A continuacin se describe en detalle los tres pasos bsicos en
que consiste la tcnica:
1. Restriccin-Ligacin
2. Pre-amplificacin
3. Amplificacin selectiva .
Restriccin-Ligacin
El
ADN
genmico
endonucleasas
es
incubado
enzimas
de
en
presencia
restriccin
que
de
dos
producen
fragmentos de diferente tamao. Normalmente se usan EcoRI,

preferentemente, Asel, Hind 111, Apal y Pstl. Estas enzimas
requieren la presencia de 6-8 bases en una secuencia
especfica para poder actuar. Este grupo de enzimas de
fragmentos de alto nmero de pares de bases y, considerando
la especificidad de la secuencia sobre la que acta, el nmero
de fragmentos es reducido (rare-cuffer) .
Por esta razn, se utiliza una segunda endonucleasa,
generalmente Msel, que acta sobre una secuencia especfica
de 4 bases y consecuentemente el nmero de fragmentos que
se obtienen es mayor (frequent-cuffef. Ambas enzimas EcoRI
y
Msel
son
altamente
especficas
aseguran
la
reproducibilidad del patrn de corte . La Msel o frequent-cuffer
74
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - generar pequeos fragmentos que amplificarn bien y podrn

separarse en los geles. El uso de dos enzimas de restriccin
favorece que una de las hebras del ADN quede etiquetada por
la zona de corte de la enzima y por consiguiente se puede
identificar los productos de la PCR.
Los adaptadores son secuencias de doble cadena,
especficos
de
la
enzima
utilizada
pa ra
la
digestin,
constituidos por 10-30 pares de bases. Estos adaptadores se

unen por la accin de la T4 ADN ligasa solamente a una de las
hebras del ADN.
Estos fragmentos,
por tanto,
no son
amplificados si el ADN problema est desnaturalizado antes de

la PCR: esta es la razn por la que algunos de los protocolos
establecen un paso inicial a 72C para favorecer la elongacin
antes de comenzar la desnaturalizacin y la pre-amplificacin.
Previo a la ligacin , los adaptadores deben ser alineados en

una reaccin individual en la cual el adaptador diseado en
forward y re verse se ponen en contacto. Los adaptadores para
la enzima EcoRI son:

5' CTC GTA GAC TGC GTA CC 3'
3' CAT CTG ACG CAT GGT TAA 5'
Los correspondientes a Msel son:
5' GAC CAT GAG TCC TGA G 3'
3' TAC TCA GGA CTC TA 5'
75
- - - - - - - - Introduccin Captulo I - - - - - - - -
Los adaptadores estn diseiiados de tal manera que no

pueden ligarse entre s y cuando se unen a los sitios de
restriccin, se pierde la secuencia especfica del sitio de
restriccin.
Existen protocolos donde la reaccin del corte del ADN
genmico y la de la ligacin de los adaptadores se realizan en
un solo paso "one step" o la restriccin y la ligacin se hacen
separadamente
"two
steps".
El
protocolo
de
Applied
Biosystems one step, el la restriccin y ligacin se llevada a

cabo en un solo paso como se presenta en la siguiente figura
1.3.
A. El ADN
genm~o
es cortado en fragmentos por las enzimas de
fo fcoRI
re~tri(cin
B. ligacin de los adaptadores
EwRI
c. Modificacin de 105 fragmentos de ADN genmico

Mse l
MsloI
::coRI
EcoRl
Fig. 1.3 La reaccin de restriccin-ligacin, donde primero el

ADN genmico es cortado por las enzimas de restriccin.
Luego se ligan los adaptadores correspondientes para cada
enzima y por ultimo se forman los fragmentos de ADN .
76
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Los primers de la AFLP consisten de tres partes: i) una

secuencia core en el extremo 5'; ii) una secuencia especifica
de la enzima de restriccin (enz) y iii) una extensin selectiva
(ext) en el extremo 3', Otra de las caractersticas de los primers
es que comienzan en el extremo 5'con una guanina (G).
Los primers para la EcoRI:
5' GAe TGe GTAAee AAT Te NNN3'
ca re
enz
ext
y para Msel:
5'GATGAGTeeTGAG TAA NNN3'
core
enz ext
La extensin
NNN
es sustituida por 1 o 3 nucletidos
selectivos.
Pre-amplificacin o PCR-Selectiva
En la pre-amplificacin , la extensin NNN es sustituida por una

nica base extra (AFLP+1) que se corresponde con una
adenina (A) para la EcoRI y una citosina (e) para Msel. La
presencia
de
esta
base favorece
un
cierto
nmero
de
fragmentos de amplificacin que deben contener el nucletido

extra.
Las secuencias de los adaptadores y de los sitios de
restriccin sirven como sitios de unin del cebador para una
posterior seleccin de bajo nivelo amplificacin "preselectiva"
77
---------Introduccin Captulo I - - - - - - - -
de los fragmentos de restriccin. El primer complementario de

Msel contiene un 3 'C. El primer complementario de EcoR l
contiene un 3 'A (En kit de genoma regular de plantas) o sin
adicin de base (en kit de genoma pequeo de plantas). Solo
los 1i"agmentos genmicos que tienen un adaptador en cada
extremo amplifican exponencialmente durante la amplificacin
por PCR( Fig. 1.4). Este paso efectivamente purifica el blanco
(el objetivo), lejos de las secuencias de que amplifican solo
linealmente, es decir aquellas con una modificacin en su
extremo.
Fragm entos d e AON genmico modificados con los adapt adores

P,fmers selecti',lOs
Ad~p!.dorH
Coro Mili
Pr~-.ml>h~<UI'"
4: &dAPUdOltUl RI . !lM ~~ letMQ('(f\~M.ll' f..
o M.pl~do, f rD!U \'''0 ~ e ,~< .. ,,,,d .. let>to
Sele<trv. "'~ PCR
Fig . 1.4. La pre-amplificaci6n de los fragmentos de ADN se da

como segundo paso, para aumentar en volumen dichos
fragmentos y purificarlos.
78
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - Amplificacin Selectiva
Las amplificaciones adicionales de PCR se ejecutan para

reducir aun ms la complejidad de la muestra y asf pueda ser
resuelto en un gel de poliacrilamida.
El producto de pre-amplificacin se utiliza para la reaccin de
amplificacin,
usando
ahora
primers
con
nucletidos
selectivos (AFLP+3). Algunos nucletidos del primer de EcoRI

suelen marcarse con fluorescencia
para ser identificados
posteriormente en el secuenciador.
El producto de pre-amplificacin puede diluirse entre 10
Y 100 veces para evaluar la mejor dilucin en AFLP+3, esta
estrategia permite la reduccin considerable del smear y
obtener amplificaciones discretas de bandas . En definitiva, lo
que se consigue al amplificar solo aquellos fragmentos con la
secuencia extra definida (condiciones astringentes) es la
selectividad y reproducibilidad al mtodo.
Los productos amplificados son separados en
gel y el
polimorfismo se detecta por la presencia o ausencia de bandas

determinadas.
Para la eleccin correcta de las bases extras, se
recomienda probar con las combinaciones probables que
genera la EcoRI+3 y la Msel+3 e identificar cual trabaja mejor,
es decir, aquellos que son fcilmente legible y que generan
numerosas bandas polimrficas. (Fig. 1.5).
79
--------Introduccin Captulo
1-------
A. Seleccin de Primers selectivos de AFLP
A"':-Uno d~ 1<>\ 16 dil .. ""tlo' tinte' uiqueta<lo< d~ p r"" .... , EtoR I

De a mpli~Lac6<1 ,el"'lv. d e AFlP,
e .. utoO de lo< B dlf. , ent~1 p,ome" M,el de amplificadn .,Iectiva

<le AflP
B. Seguimiento de amplificacin selectiva
Le /1.6
.
r61C
1
TGT '
"c.tI.-
Fig. 1.5. La amplificacin selectiva se realiza utilizando las

diferentes combinaciones de primers selectivos de EcoRl y
Msel, y utilizando como marcador de dicho fragmento, una
molcula nuorfora en los primers selectivos de EcoRI.
80
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - OBJETIVOS
Este trabajo se centra en la validacin de los marcadores

moleculares
cloroplsticos
mitocondriales
para
la
identificacin de la especie cultivada en Panam, as como, la

aplicabilidad de la tcnica del AFLP para la obtencin de un
perfil molecular o "huella dactilar" de dicha especie. Creemos
que se podran utilizar para caracterizar la especie y el cultivar
respectivamente.
La caracterizacin del perfil gentico de los cultivares de
K. alvarezii de Panam, mediante AFLP, se ha descrito como

efectiva para el anlisis de variabilidad gentica tanto en
cultivares
de
reproduccin
vegetativa,
de
clones
de
reproduccin sexual. Adems su uso no requiere conocimiento

previo del genoma, caractersticas que rene la especie de
Panam. En el gnero Kappaphycus no se han realizado
estudios con esta tcnica, por lo que sera el primer reporte de
AFLP en la caracterizacin gentica de los cultivares de
Panam. Adems, algunos marcadores aislados a partir del
uso de AFLP se han mostrado efectivos en la mejora gentica
(Aguirre et al. 2005; Arnao et al. 2008) .
81
- - - - - - - - - Introduccin Cap1tulo I - - - - - - - OBJETIVOS
1. Caracterizar molecularmente la especie que se cultiva en

Panam mediante el uso de un marcador gnico de secuencia
y la tcnica de PCR.
2. Explorar la posibilidad del uso de la tcnica del AFLP para

detectar fuentes de variacin y el aislamiento de algn
marcadores gnico de inters que pudiera usarse en la mejora .
82
- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez
------~
MATERIAL y MTODOS
--------~~--------CAPTULO I
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Material Vegetal
Se recolectaron 9 muestras vegetales procedentes de las

granjas de cultivo ubicadas en Cativ, Bahia Las Minas, (09
23'22.05"N 7952'11.83"0) Provincia de Coln, en la Repblica
de Panam. Para su traslado a Espaa con el fin de ser
procesadas y analizadas en el laboratorio de Fisiologia y
Biotecnologia Vegetal Marina del Departamento de Biologia de
la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, se les retir el
exceso de agua y se empaquetaron entre lminas de papel de
filtro, conservndose en fria hasta su transporte.
Una vez en el destino, las algas fueron removidas de su
envoltorio inicial, clasificadas segn la posicin en las granjas y
conservadas a -20C hasta su uso. Son las llamadas muestras
frescas.
Por otro lado, 9 muestras secas procedentes de los secadores
naturales
situados in situ en Cativ, como describi Batista
(2009), fueron embolsadas y almacenadas a temperatura

ambiente hasta su empleo.
83
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Identificacin
molecular
de
la
especie
mediante
marcadores gnicos
Extraccin del AON
La identificacin molecular de la especie se realiz a partir de

fragmentos
apicales
de
las
muestras
aproximadamente 100 mg de alga .
frescas
con
Estos trozos fueron
homogeneizados en morteros en presencia
de nitrgeno
liquido, y el polvo resultante se incub en 800 ..iL de tampn

CTAS en microtubos de 2 mI.
El
tampn
CTAS
es
el
procedimiento
del
Hexadeciltrimetil amonio bromuro establecido por Murray &

Thompson 1980. La composicin de este buffer consta de
100mM TRIS pH 8, 2M NaCI, 20mM EDTA pH: 8, 2% CTAS,
0.1 % PVPP, 0.1 % SOS, 2%
i3
mercaptoetanol como se detalla
en la siguiente tabla 1.3.
84
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.3. Reactivos para la preparacin del bufferCTAS.
Soluciones
Contenido
CTAS
100mM TRIS (pH 8)

20mM EDTA (pH 8)
2% CTAS
0.1 PVPP
0.1 SDS
2%
13 mercaptoetanol
Cada una de las soluciones stock descritas fueron

previamente esterilizadas 20 min cada una en autoclave a 1
atmosfera de presin . La solucin de trabajo se prepar con los
correspondientes alcuotas, se esteriliz de nuevo en autoclave
y previo a su uso se aadi la concentracin correspondiente a
l3-merca ptoetanol.
La incubacin del material vegetal en presencia de la solucin
CTAS se realiz a 65 oC durante 1 h, con inversiones suaves a
intervalos de 20 min o
continuacin,
se
aadi
el
mismo
volumen
de
cloroformo: alcohol isoamlico (CIA, 24:1, v/v), se mezcl

nuevamente por inversin y , se centrifug en una centrfuga
Seckman Coulter Aliegra X-22R durante 20 minutos a 800 g a
4 C. Se generaron tres fases, tomndose el sobrenadante con
cuidado, y disponindose en otro microtubo, y al que se aadi
85
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - otro volumen de CIA; se mezcl por inversin y se centrifug
bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. Este
proceso se repiti
1-2 veces ms hasta clarificar dicho
sobrenadante. Sobre el ltimo sobrenadante clarificado,
se
aadi 2/3 de volumen de n-propanol a temperatura ambiente y

se mezcl suavemente. Se centrifug a 13 000 g durante 30
minutos hasta obtener un sedimento o pe//et. Retirado el
sobrenadante por inclinacin del microtubos, este pe//et fue
lavado con 1 mL de etanol (80% v/v, grado molecular), se
centrifug de nuevo a mxima velocidad, se retir el etanol por
inversin de los tubos, mantenindose en esta posicin para
favorecer la evaporacin total de etanol.
Finalmente,
el
sedimento se resuspendi en 40- 50 microL de tampn TE (ver

preparacin tabla lA), se dispuso en un microtubo limpio y se
conserv durante toda la noche a 4C.
Tabla lA. Preparacin del Tampn TE

Soluciones
Contenido
Tampn TE
10 mM Tris HCL
0.1 mM EDTA
(pH 8)
La
concentracin
de
ADN
fue
valorada
en
un
espectrofotmetro Beckman Coulter DU 530 con microceldillas

para volmenes pequeos a las longitudes de onda de 230,
86
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - 260 Y 280 que permita, al tiempo, valorar la pureza del cido
nucleico. La integridad de la molcula fue tambin observada
en gel de agarosa (1 %) en tampn TAE 1 % Y 65 V. Las
muestras de ADN se almacenaron en el frigorfico a 4 C hasta
su posterior utilizacin.
El tampn TAE se prepara a una concentracin 50 X con

los siguientes reactivos, para un litro de solucin, 242 g de
TRIS, 57.1 mL de cido actico glacial, 100 mL EDTA pH 8 (0.5
M) yagua Milli Q (enrazar hasta 1 L), como se detalla en la
tabla 1.5, esterilizndose en autoclave durante 20 mino A partir
de esta solucin se obtuvo otra al 4X de la cual se preparaba
todas las soluciones de trabajo al 1X. Estas dos soluciones (4X
y 1X) se prepararon con agua doblemente esterilizada a
intervalos de 1 h cada uno.
Tabla 1.5. Reactivos de preparacin del Tampn TAE (50X)

Soluciones
Contenido
Tampn TAE (50X)
242g TRIS
57.1 mL AcOH glacial
100 mL EDTA pH 8 (0.5 M)
Agua Milli Q (enrazar hasta 1 L)
87
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Diseo de los primers para la amplificacin selectiva del
marcador molecular.
Se seleccionaron varios juegos de primers que correspondieron

al gen que codifica la sintesis de la subunidad grande (rbcL) y
pequea (rbcS) cloroplstica respectivamente (tabla 1.6) y
aquellos que hacen lo propio con el gen citocromo oxidasa
(cox) de la mitocondria (tabla 1.6). En la tabla 1.6 se indica el
tipo de marcador, el nombre originario del aligo y su secuencia

tanto en sentido delante o forward (F), como atrs o reverse
(R).
Dado
que
los
cebadores
reportados
concernian
mayoritariamente a la subunidad grande de Rubisco para

Rhodophyta, pero no especificas de las especies en estudio, se
realiz un alineamiento para chequear con mayor precisin los
aligas que mejor hibridaban con la secuencia problema.
Para ello, se tomaron 12 secuencias del gen rbcL
depositados en la base de datos del NCBI (National Center For
Biotechnology Information) (htlp://\NWW.ncbi.nlm.nih.gov), de las
cuales 5 se
identificaban
como
K.
a/varezi (AF481498,
AF489871, AF099694, AF489870, AF489872), otras 2 como K.

coffoni
(AF099695,
AF481499),
otra
como
K.
saco/
(AF481500), y K. striatum (AF099696) y otras 3 correspondian

al
gnero
Eucheuma , E.
arno/di (AF099690),
E.
serra
(AF099692) y E. uncinatum (AF099693) (tabla 1.7).

88
- - - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.6, Cebadores o primers utilizados para la especie
cultivada en Panam ,
Marcador
Primer
Secuencia
Referencia
5'tatacttctacagacacagctga 3'
Kam ya et al .
molecular
Rubisco
rbcF1 '
rbc4*
R 5' rtcaaawaawggwarwcccca 3'
1998
Subunidad
grande
Kamiya et al.
1998
(modificado)
MaggsF1 '
5' tgtggacctctacaaacagc 3'
Maggs
~t
al.
~t
al.
1992
Maggs
MaggsR1' R 5'ccccatagttcccaat 3'
1992
F2
5'ccacaaccaggtgttgatcc 3'
Iyer
et
al.
2005
R753
R 5'gctctttcatacatatcttcc 3'
Freshwater &
Rueness 1994
F7
pequea
RrbcS
R 5'gttctttgtgttaatctcac 3'
Freshwater &
Mitocondrial
cox2
5'gtaccwtctttdrgrrkdaaatgtgatgc
Zuccarello
3'
al. 1999b
Rubisco
5'aactctgtagaacgnacaag 3'
Gavio
&
Fredn cq 2 002
Subunidad '
Rueness 1994
cox3
R 5'ggatctacwagatgraaawggatgtc
3'
Zuccarello
et
et
al. 1999b)
F= sentido forward, R= sentido reverse
89
------~
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - Tabla 1.7. Secuencias tomadas de la base de datos del NCBI
para obtener la secuencia consenso.
Nmero de Acceso
GenBank
Especie
AF099690
AF099692
AF099693
Eucheuma arnoldiWeber-van Bosse

Eucheuma serra (J. Agardh) J. Agardh
Eucheuma
uncinatum
Setchell
&
Gardner
Kappaphycus sp. Sacol
Kappaphycus striatum (F. Schmilz)
Doty ex P.C. Silva
(Weber-van
Kappaphycus
coffoni
Bosse) Doty ex PC Silva
(Weber-van
Kappaphycus
coffoni
Bosse) Doty ex PC Silva
Kappaphycus alvarezi (Doty) Doty ex
PC Silva
PC Silva
PC Silva
PC Silva
PC Silva
AF481500
AF099696
AF099695
AF481499
AF481498
AF489871
AF099694
AF489870
AF489872
90
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Todas estas secuencias fueron alineadas en formato

FASTA mediante Jalview (Waterhouse et al. 2009)
y Geneious
v5.4 (Drummond et al. 2011) Y la secuencia consenso derivada

fue enfrentada a cada uno de los cebadores reportados en la
bibliografa
para este gen y se valor el porcentaje de
coincidencia en esos alineamientos. De los 6 oligos, solo 2

eran coincidentes en un 99% con la secuencia consenso y
fueron los descritos como F2 y R753. El resto de los primers no
super el 50% de coincidencia.
91
Material y Mtodos Captulo I

1
"
"
JO
., . ...... , ,: " un, " ' TATo.
,..,
''''
..,
<T . . . . "' .,,"
' ''''
'"
!lO
'!lO
,ro
lOO
,1" , <T <>:!.u n" ,,1 "'<0", Ti = . <>,,;n'TTTT IT'~
"
00
'"
IDO
' 10
no
' 20
'AYn', """ u TCu , rrl.... ATO< ".TATA"' 'm.'"'." ...T< "<;.,, ,= ........"-".:rn! ... 'T'I"!T. 1"
~
",
,,. , . t'.'nU'TA -............,.."' ...... "'", "..:u."..
<"T. n
Tt . ... . nTTT1. ""n."ilT"
~
"0
m
~
~
~
~
m
~
m
~
~,
1, ....... , ..h .,,,,,,,,.'''u,,,,, d,,,, u"u. '. TU " TAm", :m,.... ,,,,n"" "TTU ' ITT........" "' u '" , 'u. ,nu "'' .... ,:n-r<,
" OTa"" "
<TT'I'T
fl
~ID
" ' ''' '''-'' '''''. T<'/' TlTU ,.... """"' ''' '''''''' ' '''''' TTTTT'' ' '''''''TTTA.. " '... "';."',.,...T""..... IT.:TO '~". TLTTTAT .... ," ...
~
"0
,l. ~ nr m 'TT<..........,.... J.u,",.."",!,,&< <TTT< . T< r, = ,..........n-h-r, .. Tf n'"

~
",
, .." .... " , ,.h.,.u" ,!.-" ..

~
m
T. .
rn
"0
<T,,,
I.." .. '''''A'''TT'' .....:''' ,,.,., T.ITUUTUtT' ''' TT'' :/'TT''''TATT.n" , 1..

~
rn
" " , ~. T..n ......I.""; '"
'"
T< . .. .
To . . , :I-r"~," T "n" TT
"uoe.n ' n+<' , " !O,,...
u .u"'.==.,..,. ..,,,,, 1", ,.,=:I" .nTT',.,......'un" 'u'!... ,." ,. "'n.:r=u"' r,, .TO. "1 ...,,, ..... ,in n,n" ">T" .,:I' ''', n, n
- - - - - ,- - '.
,', " ..,., ....." '- <T' ,h.,.",.,.,.
'a
,~
,.
'. '. '. '. '.
" .'TTIT.' ''Ut"lIT.''''''T>''''uTTn.huTTT' ''''''''''''''+'''=

,.... ,.,,,. ,TlTTT1< , .... TT. IT,I ..... ,
'"
'm
,~
I~
,~
1)1 '
1m
'.
IH
I~
I~
1m
T> .., I..r;oTTrrI,n"'........ r"".:lTaT,,,,,....... ,,. I...,.,TT.,.:..,u,, .. ,' ..... ,.,. ,,!" " TI,,' .......'rrr. " TT>''''''''''''TT.lrrn''TT' +
Fig. .6. Secuencia Consenso, generada mediante Geneious

v5.4, perteneciente a las 12 secuencias de Kappaphycus y
Eucheuma del gen rbcL, obtenidas de la base de datos del
NCB. Sealadas las secuencias correspondientes a

cebadores chequeados.
92
los
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Purificacin del fragmento o amplicn.
El fragmento de rbcL, obtenido con los cebadores F2 y R753

fue de 560 pb, el cual se purific, utilizando el kit de purificacin
de Pro mega (\l\lizard SV gel and PCR Clean up System) que
consisti en:
1. Se aadi el mismo volumen de Membrane Binding
Solution al volumen del producto amplificado. Este
volumen
total
se
dispuso
en
las
microcolumnas
suministradas con el kit y se incub durante 1 mino a

temperatura ambiente para favorecer que el ADN se
enlace a la membrana.
2 . Se centrifug a 16 000 g durante 1 min., reserv la
columna y desech el lquido presente en el tubo.
3. Se aadi
previamente
700
j..IL de Membrane
diluido
con
etanol
Wash
al
95%
Solution,
(segn
recomendaciones del fabricante), y centrifug durante 1

min a 16000 g.
4.
Se desech el lquido y, nuevamente se repiti
el
lavado y centrifugado con 500 j..IL de Membrane Wash

Solution durante 5 mino Se retir el lquido sobrante y se
centrifug durante 1 mino
5 . A continuacin se transfiri cuidadosamente la columna
a un tubo de eppendorf de 1.5 mL y aadi 50 j..IL de
94
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - agua Ubre de nucleasas. Se incub a temperatura

ambiente durante 1 min y centrifugar a 16000 g 1 min o
El AON purificado resultante fue chequeado en gel de

agarosa 2% en tampn TAE 1%. Tras su verificacin, fue
preparado
para
su
secuencia ci n
automtico ABI 310 ONA
en
un
secuenciador
(Applied Biosystems, Fostier City,
CA, USA) Y Big Oye Terminator v3.1 Chemistry) por los

Servicios de Gentica Molecular de la ULPGC.
La lectura de la secuencia se hizo con el programa
BioEdit version 5.0.6 (Tom Hall Copyright) y con el software
Genious v5.4 que permita la observacin del cromatograma y
la disposicin de la secuencia en cdigo fasta.
Anlisis de identificacin molecular mediante software de

anlisis filogentico
La secuencia de rbcL de las muestras de Panam obtenida fue

"lanzada" en BLASTx "Basic Local Alignment Search Toof' .
Este ejercicio nos devolvi que la secuencia en cuestin tenia
un 100% de coincidencia con el gen rbcL de K. alvarezi y un Evalue de 1e-130.
A continuacin se procedi al an lisis de identificacin
de la especie mediante el software de anlisis filogentico,
PAU P*
4.0b.10 (Phylogenetic Analysis
Using Parsimony;
95
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Swofford 2002), comparando las secuencias del gen rbcL
tomadas de la base de datos NCBI con nuestra secuencia
obtenida.
PAUP es un programa para anlisis filogentico que
implementa mtodos de parsimonia, mxima verosimilitud y
distancias, comparando secuencias, enraizndolas y evaluando
hiptesis. Para ello es necesario introducir secuencias similares
a la problema y secuencias externas o outgroups que permiten
comparar los taxones y enraizar lo rboles. Las secuencias
seleccionadas fueron Kappaphycus coffoni (Weber-van Bosse)
Doty ex P.C. Silva (AF099695, AF481499), Kappaphycus
alvarezi
var.
tambalang
(Doty)
(AF099694,
AF489872,
AF489870, AF481498) Kappaphycus sp. Sacol (AF481500),

Eucheuma
uncinatum
Setchell
&
Gardner
(AF099693)
Eucheuma
serra
Agardh)
J.
Agardh
(AF099692,
(J.
ESU21693), Como especie fuera de grupo se eligi a Solieria

pacifica (Yamada) Yoshida (AF09971 O), que es una especie
perteneciente a la familia Solieriaceae y orden Gigartinales al
igual que Kappaphycus.
Todas las secuencias se organizan en formato Nexus que
se caracteriza por organizar los datos en dos grande bloques a
efectos de comparar y analizar los datos. Un primer bloque se
corresponde con el taxa y donde hay que incluir el nmero de
taxa (ntax)
y los nombres de cada especie (labels). Un
segundo bloque se corresponde a los caracteres (ADN o

96
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - protena), y sus dimensiones (nchar) Fig. 1.8).

Se utilizaron los dos tipos de anlisis ms aceptados en la
bibliografas para este tipo de anlisis (Garca-Jimnez et al.
2008).
Para el anlisis de MP "Maximum parsimony" , se realiza
la mejor estimacin con bsquedas heursticas de 1 000
rplicas, utilizando la adicin aleatoria de taxa, manteniendo
solamente el mejor rbol, y manejando 10 rboles en cada
paso.
97
- - - - - - - - liI3!erial y lit todos Caprtuil I
-- . ... -
.
......
_._
..
,,- ..
..-.
.....
....
. .
~ -~
_ .
I'\I~
.. _ ... _ . " 0_''' ..-''' '

,.,,-,
__
.
._.
,
taxas
, ~
'''-
..
_.,. ",
0_ ... ...
-"
Listado de taxas
.. .
-.,.,-
E
~
"
._.
f lg I 8 MlXlelO de forrn ll Nexus paralrtrodlXlr los IlllOS en el
programa PAUP
""
Cllmdia Al aMif}! Pr6Z GonZ'IeZ _ _ _ _ _ __
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - El anlisis de ML "Maximun likelihood" se realiz a partir

del rbol resultante del anlisis de mxima parsimonia, luego,
se utiliz un mtodo de aproximacin sucesiva (Sullivan et al.
2005). Para estimar el parmetro de modelo de evolucin, se
us el modelo de tiempo general reversible (GTR) con 4 clases
de distribucin gamma para un rango de heterogeneidad (G) y
proporcin de sitio invariable (1). Los rboles de probabilidad
fueron estimados mediante bsqueda heurstica con
100
rplicas de secuencias adicionales aleatorias. Para analizar la

estabilidad de los nudos, se llev a cabo un anlisis con 1000
iteraciones (bootstraping) con 500 rplicas.
Caracterizacin molecular mediante AFLP
La tcnica de AFLP est basada en la bsqueda de una huella

digital de los organismos, detectando polimorfismos en distintas
regiones genmicas simultneas con cierta reproducibilidad y
sensibilidad .
Esta tcnica, corno hemos descrito previamente, se basa

en tres pasos bsicos el primero, la utilizacin de enzimas de
restriccin para cortar el ADN genmico, seguido de la ligacin
de adaptadores de doble cadena
a los fragmentos de
restriccin. Estos fragmentos ligados se amplifican usando un

juego de primers preselectivos complementarios al adaptador y
99
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - por ltimo, la amplificacin del producto preamplificado con los
primers selectivos. Finalmente
se analizan los fragmentos
amplificados mediante secuenciacin (ver en introduccin

detalle de la tcnica) .
El desarrollo de la tcnica de AFLP se ha llevado a cabo

con el kit de un solo paso de Applied Biosystems, siguiendo las
instrucciones del fabricante con algunas modificaciones y
ajustes de acuerdo al material de trabajo. Este sistema utiliza
enzimas de restriccin como la EcoRI
(Promega, WI USA) y
Msel (New England Biolabs Inc.) a una concentracin en el

volumen de reaccin de 500 y 100 U respectivamente. En la
tabla 1.8 se muestran las zonas de corte de ambas enzimas.
Tabla 1.8. Tipo y sitios de corte de enzimas de restriccin en

AFLP.
Enzima
Sitio de corte
EcoRI
G' AATT
Tipo
C Corte poco frecuente
C TTAA .. G
Msel
T"TA A
Corte frecuente
A AT .. T
100
Material y Mtodos Captulo I - - - - - - -
Comprobacin de la idoneidad del A.DN
Previo a la utilizacin de esta tcnica, se cheque que las

muestras de DNA extra idas de los especmenes de Panam
eran susceptibles de ser cortadas por las enzimas requeridas
en el kit. Para ello, se trabaj con muestras secas y frescas. Se
hicieron
digestiones
individuales
con
sus
tampones
correspondientes y mezclas de ambas enzimas con el tampn

de cada una de ellas respectivamente. En la tabla 1.9 se
muestra los reactivos,
sus concentraciones y volmenes
requeridos en la mezcla de cada reaccin.
Tabla 1.9. Preparacin de reactivos para comprobar efectividad

de las enzimas, tanto juntas y por separado, con sus
respectivos buffer, en muestras secas y frescas
Reactivos
~L
Msel
EcoRI
MsellEcoRI
MsellEco
(Buffer Eco RI
reaccin
(Buffer
RI)
Msel)
Msel
0.5
EcoRl
0.5
ADN
Buffer
BSA
0.2
H20DD
14.8-
16.3
Vol. Final
20
101
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - El
resultado
de
las
reacciones
de
digestin
se
comprobaron con la formacin de un smear o degradado en

una electroforesis en el gel de agarosa (1 %) en tampn TAE.
Estos resultados preliminares indicaron que ambos tipos de
material son viables para utilizar esta tcnica.
Restriccin-Ligacin
Se
hizo
necesario
el
acondicionamiento
previo
de
los
adaptadores previo a su uso. Los adaptadores para los cortes

con EcoRI
y Msel tenan
las siguientes secuencias de
nucietidos, suministradas por el fabricante :

EcoRI:
F: 5' CTCGTACACTGCGTACC 3'
R: 5' AATTGGTACGCAGTCTAC 3'
Msel :
F: 5' GACGATGAGTCCTGAG 3'
R: 5' TACTCAGGACTCAT 3'
Los adaptadores debieron ser pre-tratados como se relata:

./ Se calentaron los tubos a 95 oC durante 5 minutos en
bao mara .
./ Se dejaron enfriar a temperatura ambiente por 10 mino
./ Se centrifugaron 10 seg. a una velocidad mxima de
1400g .
102
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - El ADN fue digerido en presencia de las dos enzimas de
restriccin (EcoRI y Msel) y ligado con la enzima T4 ligasa
atendiendo a las indicaciones del fabricante con la adicin extra
de ATP a una concentracin final de 1mM .
Para soslayar los problemas de pipeteo , se prepar un cctel
previo o mastermixpor muestra a tratar (tabla 1.10) .
Tabla 1.10. Componentes de Mezcla de reaccin de las

enzimas de restriccin con sus respectivas concentraciones.
AFLP
mezcla de
reaccin
enzimas
Solucin
volumen de reaccin (IlL)
T41igase buffer (10x)

ATP (5mM)
NaCI (0.5 M)
BSA (1 mgmL")
Msel (100 U)
EcoRI (500 U)
T 4 ligase (500 U)
Agua estril
Volumen total
0.1
0.2
0.1
0.05
0.2
0.1
0.2
0.05
1
A continuacin los adaptadores de reconocimiento de los

extremos cortados por las enzimas de restriccin, preparados
como se indic anteriormente, se aadieron a los extremos
digeridos y cortados, siguiendo el orden indicado en la
siguiente tabla 1.11.
103
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla
1.11 . Componentes de la mezcla de reaccin de
adaptadores con sus respectivas concentraciones.

Solucin
Volumen de reaccin
AFLP
(Il L)
Mezcla de
T4 ONA ligase buffer 1
Reaccin de
(10x)
adaptadores
NaCI (0.5M)
BSA (1 m9mL-1)
0.5
Msel adaptador
EcoRI adaptador
dATP (5mM)
2.2
Mezcla
de
reaccin
enzimas
ADN en H2 0
3.3
Volumen Total
11
Se probaron dos cantidades de ADN 0.05 1-19 (recomendada

por el fabricante) y 0.5 1-19. Esta reaccin se mantuvo en
microtubos de 500 I-IL a temperatura ambiente durante toda la
noche.
104
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - -
Pre-amplificacin
La pre-amplificacin permite eliminar fragmentos y con ellos el

ruido o background de aquellos que no se
han ligado
correctamente, y por tanto no amplificaran.

La reaccin de pre-amplificacin consta de la dilucin del
producto de reaccin ligacin-restriccin a una ratio de 1 :18,
recomendada por el fabricante,
y otra 1: 8. La dilucin se
realiz con tampn TE (0.1 M). El resto de la solucin de preamplificacin puede ser almacenada a -20 oC si no se utiliza .
Se mezclaron cuatro
ligacin-restriccin con
~L
~L
de esta solucin diluida de

de una mezcla de primers
selectivos de pre-amplficacin (AFLP preselective primer pair,

y 15
~L
del cctel de pre-amplificacin (AFLP core mix) que
contiene el buffer y cofactores para la reaccin apropiados y

suministrados tambin en el kit.
La reaccin de pre-amplificacin se 'lIev a cabo en un
termociclador Perkin Elmer Gene Amp 2400 a 72C durante 2
minutos para la desnaturalizacin, seguido de 20 ciclos de 20
segundos a 94C, 30 seg. a 56C y 2 minutos a 72C, y un ciclo
final de 30 minutos a 60C . (Fig. 1.9).
La pre-amplificacin se verific, con 1O ~L del producto
de la pre-amplificacin en un gel de agarosa al 1.5 % en TAE y
tuvo como resultado la presencia de un smearvisible .
105
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.12.Combinaciones de primer utilizados en el anlisis de

AFLP en muestras de Kappaphycus alvarezii de Panam.
N de juego EcoRI-FAMI
de
Primer
Msel-3 bases
TG/CAA
TG/CTA
TG/CTC
ACT/CAA
ACT/CTA
ACT/CTC
TG/CAG
ACT/CAG
ACT/CAT
10
ACA/CAC
11
TG/CAT
12
TG/CAC
13
TG/Cn
14
ACT/CAC
15
ACT/CTT
16
ACA/CAA
17
ACA/CTA
18
ACA/CTC
19
ACA/CAG
20
ACA/CAT
21
ACA/Cn
107
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - La amplificacin propiamente se realiz a partir de la

dilucin de los 1O
restantes con 190
~L
~L
del producto de pre-amplificacin
de TE (0.1 M). Esta nueva mezcla fue
centrifugada durante 10 seg.

tomaron 3
~L
a 1200 g. A continuacin se
Y se mezclaron con 1~L de primer EcoRI FAM,
1~ L de primer Msel XXX, y 15 ~ L de AFLP Gore Mix. La

amplificacin se realiz estableciendo el siguiente programa de
desnaturalizacin,
hibridacin
elongacin.
La
desnaturalizacin previa se realiz a 94 C durante 2 min ..
A continuacin se establecieron 11 ciclos de 94C a 20

segundos, 66C disminuyendo un grado en cada ciclo hasta los
5rC por 30 segundos, y 72 oC por 2 minutos; seguido de 20
ciclos de 94C por 20 segundos, 56C a 30 segundos y 72C
por 2 minutos, un ciclo a 60C por 30 minutos (Fig. 1.10).
108
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Este ADN fue cortado y ligado, pre-amplificado a una ratio 1/18
y amplificado en las condiciones ya descritas.
La ta bla 1.13 indica las muestras empleadas con su
acrnimo, su almacenaje y las combinaciones de primer
empleadas.
Tabla 1.13. Muestras de ADN de especimenes de Panam (con

su acrnimo), tipo de almacenamiento y el nmero de juego de
primer empleado.
Muestras de Panam
Tipo(*)
N de juego de Primer
B1
1,2,3,4,5,6
G1
7,8,9,10
G2
11,12,13,14,15,16
B2
17,18,19,20,21
F1
1,2,3,4,5,6
F2
7,8,9,10
F3
11 ,12,13,14,15,16
F4
17,18,19,20,21
Acrnimo
(*) S- secas; F- frescas
Teniendo en cuenta las recomendaciones realizadas por

Bonin et al. (2006) (previamente descritas en la introduccin), a
las 21
combinaciones de primers, se realiz el test de
reproducibilidad, que consisti en determinar el nmero de

110
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - veces que se repite las mismas bandas en una misma muestra.
Consideramos fragmentos para nuestro anlisis a partir de 120
pb,
Y con
intensidad
de
banda
>
100
RFU
(Relative
Fluorescence Units).
Caracterizacin de Kappaphycus
y Eucheuma de otros
cultivares.
Se analizaron muestras secas de hipotticos especimenes de

Kappaphycus procedentes de Tanzania, Filipinas e Indonesia
cedidos por el Dr. Zuccarello (Nueva Zelanda); y de Mxico
gracias a Dr. Robledo (CINVESTAV). Otros especimenes
asignados como Eucheurna fueron donados por Dr. GmezPinchetli (ULPGC). (Tabla 1.14).
De cada espcimen se extrajo ADN por triplicado y se
hicieron de 2-3 rplicas por cada combinacin de primer. En
estos casos, se seleccionaron 9 combinaciones de primers de
aquellos 16 considerados con una alta reproducibilidad. Este
ADN fue procesado hasta su amplificacin como previamente
se ha descrito.
111
1.14.
Muestras
de
posibles
especmenes
de
Kappaphycus y Eucheuma de otros cultivares.

Juego de Primer
Muestras
Tanzania
K. alvarezi
1,3,4,5,6
Filipinas
K. alvarezi
11 ,14,15,16
Indonesia
K. alvarezi
11 ,14,15,16
Filipinas
E. espinosum
11 ,14,15,16
Filipinas
E. cottoni
1,3,4,5,6
Mxico
K. alvarezi (Verde)
1,3,4,5,6
Mxico
K. alvarezi (Parda)
1,3,4,5,6
Anlisis in slco
El anlisis de las muestras resultantes de AFLP se realiz con

el software GeneMarker de Softgenetics, LLC (Sta te College,
PA, USA); los datos fueron introducidos en formato .fsa,
siguiendo las recomendaciones del software para anlisis de
AFLP, las cuales se detallan en Manual de guia de rpida
GeneMarker (ver Anexo). Con estas premisas se generaron
electroferogramas con fragmentos de un amplio rango de pares
de bases, pero se asumi que por debajo de 120 pb era zona
de ruido.
112
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - La lectura de las bandas se hizo manualmente y se

codific su presencia con "1 ", Y la ausencia con valor "O",
formando una matriz binaria en formato de Excel. Esta matriz
fue
posteriormente
analizada
mediante
coordenadas
principales, utilizando el software GenAIEx (Peakall & Smouse

2006). (ver Anexo).
El anlisis de coordenadas principales nos revelar la
posible existencia de un patrn dominante en el conjunto de
datos . Es una tcnica que permite encontrar y trazar patrones
dominantes en un conjunto de datos multivariantes; estos datos
pueden ser, por ejemplo , mltiples loci y mltiples muestras
(Flanagan 2005). En gentica de poblaciones se utiliza para
calcular una matriz de distancia y producir una configuracin
grfica en un espacio Euclidiano de pocas dimensiones (dos o
tres) de manera tal que, con la menor prdida de informacin
posible, puedan determinarse las relaciones genticas entre los
individuos, las poblaciones y/o las especies estudiadas.
113
- - - - - - - Material y Mtodos Capitulo I - - - - - - -
Clonacin y secuenciacin de fragmentos de AFLP.

Bsqueda de un marcador gnico de inters.
A partir del cctel de fragmentos obtenidos en la amplificacin

por AFLP , se procedi a la clonacin de dichos amplicones.
La insercin del amplicn en el vector pGem-T Easy

(Promega
Corporati on,
Madison
WI
USA), se
optimiz
chequeando 4 ratios de amplicn: vector 2: 1; 1:1; 0.5:1 y
0.25: 1. Las cantidades de amplic6n respecto al vector usado

eran dependientes del tamao del fragmento o inserto y se
calculan atendiendo a la siguiente expresin:
ng de vector x Tamalio del inserto IKb)
Ratio inserto: vector'" ng del inserto
------------ '
Tamao de l vector (Kb)
El protocolo de clonacin propiamente consta de la

adicin de nucletidos de adenina (tailing) , ligacin del
amplicn al vector y transformacin de la bacteria E. cofi JM
109. A continuacin se describe cada uno de estas etapas de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Promega
Corporation
Madison
1M
USA)
pero
con
algunas
modificaciones.
114
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonz/ez - - - - - -
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - -
Tailing
El cctel de amplificacin procedente de la AFLP se
precipit
con acetato de amonio 7.5 M Y 2.5 volmenes de
etanol absoluto. El pellet obtenido fue re-suspendido en 2 I-IL de

agua Milli Q esterilizada en dos tiempos .
El acetato de amonio se prepar, pesando 28 g de
CH 3C0 2 NH 4 en 50 mL de agua y filtrado con membranas de
poro de 0.45 micras, y distribuidos en microtubos de 2 mL para
su esterilizado en autoclave.
La reaccin de tailing transcurri a una temperatura de
70 oC durante
30 minutos. Los componentes de la reaccin,
sus concentraciones y volmenes requeridos para cada uno de

ellos se muestran en la tabla 1.15.
Tabla
1.15.
Componentes
de
la
reaccin
de
tailing,
concentraciones y volmenes requeridos

Solucin
volumen de reaccin (.tL)
Fragmentos precipitados
Taq ONA Polymerase reaction buffer (1 Ox)
MgCI, (25 mM)

dATP (2mM)
Taq ONA polymerase (5U)
0.5
Agua
4.5
Volumen Final
10
115
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Ligacin
Como se indic, la ligacin se realiz con distintas ratios de

amplicn: vector dada los distintos tamaos de fragmentos
obtenidos en el producto de reaccin. Especficamente se
utilizaron aquellos amplicones obtenidos de la amplificacin
selectiva
ACT/CTA,
de los siguientes juegos de primers: TG/CAA,

TG/CAT,
ACT/CTT,
debido
que
eran
las
combinaciones con mayor reproducibilidad.
La reaccin de ligacin se llev a cabo con un volumen

variable de la solucin de tailing, a la que se le aadi 2 iJL de
buffer de ligacin y 1 iJL de la enzima T4 ONA ligasa y 1 iJL del
vector pGem-T Easy previamente centrifugado (tabla 1.16).
Este cctel se mezcl por pipete y se incub durante 1 hora a
temperatura ambiente, dejndose reposar toda la noche a 4C .
116
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.16. Componentes soluciones de la ligacin
(~L)
Soluciones
Volumen
Reactivos
mezcla de
en
reaccin
2x Rapid ligation buffer 5
pGem-TEasy
Amplicn (tailing)
T 4 ONA ligase
H20 DD
Volumen final
10
X variable dependiendo de la ratio empleada en cada caso .

Transformacin
La transformacin se llev a cabo aadiendo suavemente 50

~L
a 2
de una solucin JM1 09, suministrada en el kit de Promega,

~L
de solucin de ligacin, dispuestas en tubos de 15 mL
(Sarstedt AG & Ca, Nmbrecht, Alemania). Se dej reposar en

hielo durante 20 minutos, para a continuacin introducir los
tubos en un bao de agua Raypa BAD-4 durante 50 segundos
a 42 oC y por ltimo,
periodo se aadi 950
2 minutos en hielo.
~L
Finalizado este
de medio SOC, dejndose en
agitacin suave, 150 rpm, durante 90 min a 3rC en un horno

117
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - de hibridacin. El cultivo bacteriano resultante se centrifug a

1000 9 durante 10 mino El sedimento obtenido (c.a. 2 mL) se
emple en la siembra en placas de Petri conteniendo medios
SOC como se describe ms adelante.
El medio SOC "Super Optimal Broth with catabolic
repressol" se prepar con
2.0g Bacto-Tryptone, 0.5 9 Bacto-
Extracto de levadura, 1 mL 1M NaCI, 0.25 mL 1 M KCI, 1 mL de

un stock de 2M Mg 2+ Y 1 mL de glucosa 2M en 100 mL.
La tabla 1.17
presenta los reactivos de la solucin SOC y
aquellos que corresponde a la solucin de Mg 2+.
Tabla 1.17. Preparacin del medio de cultivo SOC (100 mL) .

Soluciones
Contenido
Medio Soc
2.0 g Bacto-Tryptone
0.5 g de Bacto- Extracto de Levadura
1 mL 1M NaCI
0.25 mL 1M KCI
1 mL Soln. Mg'+
1 mL Soln. Glucosa
Solucin Mg'+ 20.33 g MgCI,. 6H,O

24.65 g MgSO. 7H,O
100 mL Agua Milli Q
El medio SOC, sin la solucin de Mg 2+ y glucosa, se
mantuvo a 4 oC durante 1 mes tras ser esterilizados en
118
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - autoclave durante
20 min a una atmsfera de presin. Las
soluciones de Mg
y glucosa 2M fueron
preparadas y
esterilizadas por autoclave de manera separadas, aadindose

a una concentracin final de 20 mM respectivamente. Previo a
su uso, el medio completo fue filtrado por membranas de 0.45
micras y se dej atemperar previo a su uso.
La siembra se realiz en medios Luria Bertoni (LB), el

cual
se
prepar
con
Bacto-Tryptona
(Sigma),
Bacto-
Extracto(Sigma) de Levadura y NaCI (Sigma) en un litro de

solucin ajustando el pH con NaOH 1 M (Sigma) a pH 7.0,
como se detalla en la tabla 1.18. Para placas con medio LB
slido, se le aade 15g. de agar por litro.
Tabla 1.18. Preparacin del medio LB lquido y slido para un

litro de solucin.
Soluciones
Contenido
Medio LB lquido
10 g. Bacto-Tryptona (Sigma)
5 g. Bacto-Extracto de Levadura
5 g. NaCI
pH 7 (ajustado con NaOH)
Agua Milli Q (enrazar 1 litro)
Medio LB slido
15g. agar
119
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Estos medios se esterilizaron en autoclave durante 20

min oa presin de 1 atmsfera y una vez enfriados a 37-40 oC, y
antes de la solidificacin de los medios, se aadi ampicilina
(Fluka Biochemika) a una concentracin final de 100 I-Ig mL,1 .
La ampicilina fue preparada en un stock de 0.02 9 mL,1 con
agua Milii Q esterilizada en 2 tiempos.
Previo a la siembra, se dispuso sobre la superficie del
medio 100l-lL de isopropilo-[3-D-tiogalactopiransido (IPTG 0.1
M) Y 20 I-IL 5-bromo-4-cloro-3-indolil-[3-D-galactopiransido (XGal 50 mgmL,1) (Promega Corporation Madison WI USA) y se
extendi con una asa de Digralski.
Finalmente, el sedimento del cultivo bacteriano (800 I-IL
por placa)
se
dispuso sobre estas placas,
se extendi
repetidamente con las asas de siembra y se incub a 37
en posicin invertida, en estufa durante toda la noche.
Seleccin de Transformantes
Tras 24 h. se obtuvieron colonias blancas (con inserto) y

co'lonias azules (sin inserto). La presencia de IPTG, un inductor
de la sntesis de la [3-galactosidasa, y el substrato cromognico
X-gal, generar colonias azules por la hidrlisis del X-gal. Si se
incorpor ADN exgeno en el sitio de clonaje mltiple del
vector, las colonias aparecern blancas, puesto que el inserto
120
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - interrumpe
el
gen
JacZ
plasmdico
impide
la
complementacin .
La amplificacin del fragmento contenido en el vector se realiz

atendiendo a dos procedimientos:
a) Amplificacin del fragmento a partir de la colonia
b) Replicacin de la colonia, purificacin y amplificacin.
a) Para la amplificacin del fragmento a partir de la colonia, se

prepar una mezcla de reaccin conteniendo 0.125 U de
GoTaq Hot Start Polymerase (Promega), 1.5 mM MgCI 2 y 0.5
mM
del
cctel
de
nucletidos.
Los
primers
utilizados
correspondieron a M13 forward (5' GTTTTCCCAGTCACGAC

3') y M13 Reverse
(5' CAGGAAACAGCTATGAC 3') de
Promega. Ambos primers flanquean en ambos sentidos la zona.

de insercin del plsmido.
En la tabla 1.19 se presentan los reactivos, soluciones
madres y volmenes empleados para la reaccin en cadena de
la polimerasa.
Preparado el cctel, se replic, con un asa bacteriolgica en
pico, la colonia en una placa madre (con referencia de su
procedencia) y se introdujo el resto en el microtubo de
amplificacin. (Fig. 1.11)
121
- - - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - -
Fig.1.11. A) Seleccin de colonias blancas (tienen el inserto). B)

Placa madre.
La reaccin en cadena de la polimerasa se realiz en un

termociclador Perkin Elmer Gene Amp 2400 a 94
e durante 3
minutos para la desnaturalizacin, seguido de 23 ciclos de 1

min a 94 C; 1 min a 52 e y 2 min a 72C y un ciclo final de 7
minutos a 72C. El producto de amplificacin obtenido se

cheque en un gel de agarosa al 2 % .
122
1.19.
Reactivos,
soluciones
madres
volmenes
empleados para la reaccin en cadena de la polimerasa .

Reactivos
Solucin
volumen
Stock
en mezcla
reaccin(.JL)
Buffer
5x
5.0
MgCI 2
25mM
1.5
Cctel de nucletidos
10 mM c/u
0.5
M13 F
10.JgmL,1
0.25
M13 R
10.JgmL,1
0.25
Go taq Hot Start Po/ymerase
100 U
0.125
Agua doblemente destilada
17.0
Volumen final
24
b) Las colonias que revelaron insertos, se picaron y fueron

igualmente sembradas en una placa madre y el resto se
dispuso
en tubos conteniendo 5 mL de LB y 25 .JL de

Ampicilina (0.02 gmL 1) a 37 oC toda la noche. A continuacin
se purificaron con un QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Hilden

Gernnany) siguiendo las instrucciones del fabricante.
En resumen,
durante
se centrifugaron los tubos a 1000 9
10 minutos, se descart el sobrenadante y se
resuspendi el pellet en 250 .JL de buffer P1, transfirindose a

un tubo de microcentrfuga de
2 mL. A continuacin
se
123
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - aadi 250 iJL de buffer P2 y se mezcl cuidadosamente

invirtiendo los tubos de 4 a 6 veces. Se aadi 350 iJL de buffer
N3 y se mezcl inmediata- y cuidadosamente, tambin por
inversin 4 a 6 veces, y se centrifugaron los tubos durante 10

minutos a 15500 g en una Beckman Coulter Aliegra X-22R. El
sobrenadante se dispuso en una columna QIAprep spin column
y se centrifug durante un minuto. Se descart el eluato y se
aadi a la columna 500 iJL de Buffer PB. Los microtubos se
centrifugaron de nuevo, descartndose el eluato y aadiendo a
la columna 650 iJL de Buffer PE para su centrifugacin durante
un minuto a 15 500 g. Los restos de buffer se eliminaron
centrifugando una segunda vez en las mismas condiciones.
Finalmente la columna se dispuso en un microtubo nuevo de
1.5 mL a la que se le aadi 50 iJL de agua
destilada y estril.
Se dej reposar durante un minuto y se eluy el plsmido

transformado por centrifugacin a 15 500 g durante 1 mino Se
realiz un segundo control de la presencia de inserto por
digestin de este plsmido transformado, con la enzima de
restriccin EcoRI durante 3 h a 37 oC,
La reaccin de
restriccin se realiz como indica la tabla 1.20.
124
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Tabla 1.20. Reaccin de restriccin con la enzima EcoRI para el
plsmido transformado. Mezcla de soluciones para la digestin
del plsmido purificado con la EcoR 1.
Soluciones
IJL por reaccin
Agua MiliiQ estril
14.3
Buffer EcoRI (10 X)
2.0
BSA 10 mgmL- 1
0.2
Plsmido transformado
3.0
EcoRI (12 U IJL- 1)
0.5
Volumen final
20
La verificacin de la presencia del inserto se realiz en una

electroforesis al 2% de aga rosa .
Ambos tipos de muestras (colonia y replicacin del
cultivo) fueron preparadas atendiendo a las recomendaciones
del servicio de secuenciacin con un primer especifico propio
del vector pGem T easy, y enviadas a Sistemas Genmicos
S.L. (Valencia, Espaa). La mezcla de secuenciacin consisti
en un cctel de ADN clonado (100 ng mr1, 3,5 mi de 1 mM del
primer seleccionado
yagua doblemente esterilizada hasta
completar 19m1 de volumen final. Los primers seleccionados

fueron SP6, M13 y T7 Y sus secuencis se indican en la tabla
1.21 . La figura 1.12, resume los pasos bsicos del protocolo de
clonacin utilizados para la obtencin del gen o en nuestro
caso, los posibles fragmentos relacionados con el mismo.
125
- - - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - -
Tabla 1.21. Secuencias de primers seleccionados del vector

pGem T easy.
Primer Secuencia
Sp6
5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'
T7
5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'
M13F
5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'
Fragmentos
de AFLP
'V'-"
Insercin (Llgarion)
Tailfng
-~
I GEN
Transformacin bacteria
BACTERIA
E, coli
BACTERIA
E. co/ ..
PLSMIDO
- O
PLSMIDO
Crecimiento bacteria
+ GEN
Lisis Bacteria
OO ~
~
Separadon plasmido - gen
Fig. 1.12. Resumen grfico de los pasos bsicos de clonacin

realizados para obtener el fragmento deseado.
126
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - Alternativamente,
aquellos
fragmentos
de
tamao
esperado, tanto por amplificacin directa de la colonia o tras la

digestin del plsmido, fueron purificados para su posterior
secuenciacin.
Estos
fragmentos
amplicones
fueron
extrados del gel de agarosa mediante diseccin con bistur y

purificados utilizando el kit de Promega, Wizard SV Gel y PCR
Clean-up Systems. Este consisti en el pesado de la banda de
gel conteniendo el amplicn a la cual se le adicion igual
volumen de la solucin MBS (Membrane Binding Solution).
Esta mezcla se introdujo en un bao de agua a 65 oC
durante10 minutos, dando vrtex al inicio y cada pocos minutos
hasta la disolucin completa de la agarosa. A continuacin, se
centrifug a temperatura ambiente durante 1 minuto a 16 000
g. Se transfiri el volumen a minicolumnas suministradas en el
kit y dispuestas en microtubos de 2 mL y se dej reposar 1
minuto a temperatura ambiente, se centrifug un minuto, y se
descart el lquido eluido. A la columna, se le agreg 700 I-IL
de Membrane Wash Solution (MWS) previamente diluida en
etanol al 95% y se centrifug por un minuto a 16 000 g. Se
repiti el lavado, aadiendo ahora 500 I-IL de MWS y
se
centrifug nuevamente durante 5 minutos a 16000 g, se repiti

la centrifugacin durante 1 minuto para eliminar los restos de
etanol. Cuidadosamente se transfiri la columna a un nuevo
microtubo de 1.5 mL y se le aadi 30 I-IL de agua libre de
nucleasas; se dej reposar 1 minuto y finalmente se centrfug
127
- - - - - - - Material y Mtodos Captulo I - - - - - - a 16 00 9 durante 1 minuto. La presencia de la banda

purificada se cheque en un gel de agarosa al 2% y se envi
al servicio de secuenciacin como se describi anteriormente.
El anlisis de cada una de las secuencias obtenidas se

realiz con los programas incluidos en la pgina web del NCBI
(BLASTx,
tBLASTn)
(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast. cgi) .
Para la bsqueda en
secuencias de aminocidos, se utiliz
EMBOOS Transeq (http://www.ebi .ac.uk/Tools/emboss/transeg .
Bsqueda de un marcador gnico de inters
A partir de los fragmentos secuenciados y los
resu~ados
obtenidos en BLAST, se disearon primers relacionados con

actividad sulfatasa que permitieran la posible localizacin de
este marcador en el ADN genmico de Kappaphycus a/varezi.
Para ello, una vez obtenida la secuencia (Fig. 1.13) se procedi
a disear los primers, mediante el programa Primer3 (Rozen &
Skaletsky 2000) http://frodo .wi.mit.edu/ . una vez obtenido los
primers
sus
respectivas
secuencias
(tabla
1.22),
se
establecieron las condiciones de PCR para su amplificacin a

partir del ADN genmico (Fig.1.14).
128
Material y Mtodos Captulo I - - - - - - "
A CCCC AAA CAA CTT A T TTTTCTCCTC CT

~
"
A TA C AAA CAA ATA A CA '

, ~
A TC
,~
1 ~
C TAT TC AT
""
'le
CT C TTA CTT C CAA CTCCTT AAAAAA

~'O
l~
A CCTA ATT CATA .... TT
Jm
""
,m
,~
TT A TCC
m
TAAA ccc ' c
J~
A A TTTT
T C CT A '
~,
AAACTT ' TAT A
"0
""
,~
T TCAAATT
CC CACTTTCCC TTCC
TCCACCATAC A
T A TTCC A TACT
,~
TTCCT
A CATAA A TT
CA CT AA C'I'
,~
AT CTT ATTTTTA
TCATA CT
J~
C '1'
CA CC T CA TTTTT AAATA
I~
,.,
,~
C TT
"0
,~
T TATT AAA CC AA CCTC A
I~
' A A CTT ~ C A T
TAACTTAA A TTTTTT '
TTCCCTCTTT AA C C ATTATAAA A AA TTCCCCCTTTCT
,~
TCCTTC A TA T
TTCT A
~o~'
TTT A AAT C A C CACT C
Fig.1.13. Localizacin de los primers localizados sobre una

secuencia usada como posible marcados gnico .
Tabla 1.22. Primers utilizados para la obtencin de la banda.

Juego de Primer Primer Secuencia
P1
P2
P3
P4
F4
5'ccctttctgatcgtccttca 3'
R1
5' 9 ggaa agtg ggcagttagt g3'
F1
5'tttctcctcgactgttctaggg 3'
R2
5' cg cgggcttta caa tttatg 3'
F2
5'tgaaaccaacctcgaatacaaa 3'
R3
5' a gtgcg ctcgattct caaa c3 '
F3
5' ca agat aga ca ggttccct cttt3'
R4
5' 9 caggt ggctat a caagtttcc3'
129
Claudia Massiel Prez Gonz/ez
RESULTADOS
--------~~--------CAPTULO I
_ _ _ _ _ _ _ __ Resullaoos CaphJO I - - - - - - - -
La ampllficadOn , con la pareja de
g,ande
clo,opl\s~n
loa BSIIedmSMIi.
ollgol de la IlUbunidad
f2-R753 , a partir del ADN gen6mico de
,~v el
un fragmento de aproXImadamente
5aJ pb (F g 115) Esta parej a da p",n.r~ fue la que ton

nu est ra a prox imadn n i".I, obtuv o el mayo ' po roe nt . je
co ,n cid enCla
c ~ . nd o
se alin eaba con las sec usnC'aS consenso
de Ka ppaph)'Cu s ~ Eucne uma de ~s basu de datos
(N CB ~
rbcL Escalera
F'9 I 15 EI&drofo,esis en gel de "garosa al 1% en TI<E (band a

amplificlda con F2 y R753 y escaler a)
_______
'"
CS'daM~IAlrvlG"'lalll -------
- - - - - - - - - Resultados CapItulo I - - - - - - - Las otras parejas de primers pertenecientes tanto de la

subunidad
grande
citocromo
oxidasa
y
de
pequea
la
c1oroplstica
regin
como
mitocondrial
de
(cox)
la
no
amplificaron.
El fragmento rbcL purificado y secuenciado revel un tamao

real de 600 pb. Esta secuencia
secuencias depositadas en la
se compar con otras
bases de datos para
su
comparacin y caracterizacin mediante el programa BLAST

(http ://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast. cgi) ,
prediciendo
que
efectivamente se corresponda con una parte del gen que

codifica a la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa .
La relacin evolutiva de este fragmento de gen, perteneciente a

la especie de Panam, con el mismo gen de otras especies, de
una probable ascendencia comn (Eucheuma y Kappaphycus),
revel que la especie originaria de Panam formaba un c1ade
(100) con aquellas depositadas en las bases de datos (NCBI)
como Kappaphycus a/varezii y que corresponda a los nmeros
de accesin, AF099694, AF481498, AF489870 Y AF489872.
Otro c1ade enraiz con otro (99) que corresponda a especies
de Kappaphycus como K.coffonii (AF099695, AF481499) y K.
Sp saco/ (AF481500) y finalmente un tercero (99) con especies
de Eucheuma serra (AF099692, ESU21693) (Fig. 1.16).
132
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - -
La secuencia de Panam fue depositada en la base de datos
del
NCBI
como
Ribulosa
1,5
bifosfato
descarboxilasa
perteneciente a Kappaphycus alvarezii y nmero de acceso

HQ612184 (Fig. 1.17).
Fig. 1.16. rbol filogentico de Kappaphycus alvarezii de

Panam creado por el PAUP'
4.0b.10 (Swofford 2002). Los
valores de sus ramas representan el Maximun Likelihood

calculado utilizando la matriz del tiempo general reversible
133
- - - - - - - Claudia Ma ssiel Prez Gonz lez - - - - - - -
- - - - - - - - Resultados Capitulo I - - - - - - - -
(GTR) + G + I modelo de evolucin (-lnL= 6808.6188; tasa de

substitucin de la matriz RAC=0.531, RAG = 4.730, RAT =
0.776, RCG = 1.189, RCT = 10.207, RGT = 1; base de
frecuencias pA = 0.318, pC = 0.146, pG = 0.212, pT = 0.323;
parmetro de forma (a) :;: 0.2870; proporcin de sitio invariable
(1) :;: 0.2143. El valor de cada clade representa el porcentaje de
rboles en los que se da esta solucin.
r AIct p\rT .:NL.ll.I.U
~A n
~8.1QtL
BN.
t A3;1"
J;.."t* -...:a1'TTbTAIA
,~
r:
'.
El CM!'.!; CAIBIAAA ' TI; !U...&T
E&%
AAB A'T .B'! .:bhA~M AA ~AC;'T..T~.cf.
Wi_
OJO
I,A! C1A,!
...
...
. .,
a.L.:.:; IbMIA..;b.K..rM
Fig.1.17. Secuencia cloroplastica del rbcL de Kappaphycus

alvarezi de Panam , tamao de 557 pb , nmero de acceso en
GenBank HQ6121 84.
134
- - - - - - - Claudia Massief Prez Gonzlez - - - - - - -
'"
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - Caracterizacin molecular de Kappapahycus alvarezii de

Panam mediante la tcnica de AFLP .
Como resultado de la aplicacin de la tcnica de AFLP en

muestras secas de Kappaphycus alvarezi de Panam , se
obtuvo que de las 21 combinaciones de primers usados , 16
combinaciones presentaron una reproducibilidad mayor del 85
%. Este test est en base al nmero de veces que se repite el
mismo alelo, en el total de las muestras amplificadas con ese

juego de primer.
Los
restantes
parejas
de
primers
presentaron
una
reproducibilidad muy baja y fueron descartados para el anlisis

del perfil de la poblacin de K. alvarezii.
En la Tabla 1.23 se muestra las combinaciones de aligas

utilizadas para los extremos cortados con EcoRI y Msel
repectivamente, el nmero de alelas determinados para cada
juego, asi como, el nivel de polimorfismo y el nmero de
ocasiones (N) en la que se valid la amplificacin. La columna
de rango de pb indica la posicin inicial y final de la lectura del
electroferog ra ma.
Analizando el
electroferograma
generado
por cada
pareja de primers de las 16, tomadas como reproducibles, se

135
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - obtuvo un rango entre 16 y 22 bandas; el estudio conjunto de

todas ellas determin que Kappaphyccus alvarezi procedente
de Panam se caracterizaba por 129 bandas o alelas. En la
tabla 1. 24 se indican el nmero de pares de bases que
corresponde a cada alelo, as como, las bandas generadas
atendiendo a estas 16 parejas de aligas empleadas.
Respecto a la presencia de alelas polimrficos, y atendiendo a
los datos derivados del GenAIEx, se presentaron en un rango
entre 11-23 %.
136
Resultados Captulo I
Tabla 1.23. Test reproducibilidad de las 21 combinaciones de
primers de AFLP en Kappaphycus alvarezi de Panam.
Primer Combinacin N' de %
EcoRl/Msel
Alelas
Re~roducibilidad
TG/CAA
19
100
TG/CTA
31
50
TG/CTC
21
88
ACT/CAA
19
100
ACT/CTA
19
100
ACTlCTC
20
100
TG/CAG
16
100
ACT/CAG
17
97
ACT/CAT
17
100
10
ACAtCAC
20
100
11
TG/CAT
22
86
12
TG/CAC
30
50
13
TG/CAC
31
50
14
ACT/CAC
19
100
15
ACTlCn
19
100
16
ACAtCAA
19
100
17
ACAtCTA
31
49
18
ACAtCTC
25
65
19
ACAtCAG
20
85
20
ACAtCAT
19
89
21
ACAtCn
17
100
Rango
de ~b
%
Polimorfismo
119565
119568
119568
120568
120568
119568
120546
120552
119562
119562
120571
119573
120573
120570
120570
121565
120566
119560
119560
119562
119560
13.7
9..8
11.7
6.3
15.3
18.3
13.9
12.3
17.5
18.3
13.7
15.0
12.0
12.6
10.9
22.7
16.4
13.4
18.0
13.1
17.2
137
Tabla 1.24. Alelas generados a partir de las 16 combinaciones de primers.
f'li me'
Combina C1 n
EcaRIMsel
t-f'deAleos
Ale los o bandas (pb)
IG/CM
19
119" 121 , 124 , 127 , lJ9, 162 , 12.5 , n i, 2'1J, 239, 277, 323 ,375 , 4i3., el, A/4, 520, 558, 5')5.
TGrCTC
"
119, 122, 125, 12E, 139, t&3, 185,221, 23J, 240 ,- 278 , 324,370, 414, 425 , 475, 521,523,593,566,588
""<:AA
18
120, 122 ,124,127,139,163,185,221,231, 240,278,324 ,370,415,425, 476 , 522, 560, 568.
ACT.cTA
'9
119 , 122,125,128,1 39 , 163, 185 , 222, 231,240 , 271l , 324, 377 ,414 , 425 , 47'6 , 522,559, 5ffi
ACTKTC
'"
119,121 , 124 , 126,128, lE, 163, 185, 222, 231 , 240 ,278,325,377,41&, 426,477,523, 56, 56B
TG/CAG
'fr
, j) , 131,153,175,21 0 ,219,228,335,31O,::ll1, 300 , 407,457,502,539,546
ACT,\)AG
-1,
1:J] , 122, 134 , 157 , 178 ,214,223,231, 269 ,3 14, 3>5,, 402 , 4 12,462, 507 , 544,552 .
ACliCAT
"
119,122,134,157,1 Ta, 223, 232, 270, 315, R, 403 , 4 14, 454, W , 540 , 553, 552..
f9
ACMe N:;
'"
119,121,123,134,157,1 78 ,214,223,232,269" 314, :E5, 402 , 41 0 , 413, 463, al, 545, 553, 552
"
TGiCAT
"
1:IJ , 121,124 , 127 , 139,162,185, m
"
ACTrI':AC
19
1::!J , 122, 125, 128, 139, 102, H)4, n1 , 23] ,D3, 278 , 324, 377,415,428 , 478,524, 562, 571J
ACTKTT
f9
~ 1 n'3,~m'R,.m ro rumllim.mmm~_
"
ACA/CM
f8
121,125 , 128 ,140,153.. 185 ,221,225,231,239,27'8,325,378 , 401 , 415 , 428 , 478, 525, 563
18
ACMCM:;
"
119,122,1 34 ,155,179,214 , 223,233,271, 3 16,3'.'l, 4(J), 410, 468, 512 , 514 , 550, 552 , 557 ,.559
'"
ACNCAT
1,<
119,122,134,157,179,214,223 ,232,271,310,339,41)7,417, 468, 514, 552, 554, 560, 562-
"
ACAiCTT
"
119,122,134,157,178 ,214, 223, 233,271,317 ,::69,407 ,41 7 ,469 , 514 , 552, 5130
,n l ,240, 27'8, 325, 37'8 , 417 , 427,479, 523.,528,561,554,569,571
138
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - Comparacin del perfil de AFLP de la especie de Panam

cOn las de otros sitios.
Como adelantamos en material y mtodos, el anlisis de los

electroferogramas para otras especies de
Kappahycus y
Eucheuma se realiz con las 9 de las 16 parejas de primers de

mayor reproducibilidad, como se detall en la tabla 1.14. Estos
aligas generaron bandas definidas con valores de fluorescencia
en unidades de RFU "Relative Fluorescence Units" superiores
a 100 y nmero de pares de bases superior a120.
Las bandas generadas en las otras especies de Kappaphycus
y Eucheuma se detalla en la siguiente tabla 1.25. Las especies
de Kappaphycus se corresponden con la denominacin por
pais, con los morfotipos verde y parda para la procedente de
Mxico. En cualesquiera de los casos, la acepcin de estas
especies , como Kapapphycus o Eucheuma, no ha sido
chequeada por nosotros con marcadores moleculares tipo rbcL.
139
Resultados Captulo I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __
Tabla 1.25 Alelas o bandas generados en las distintas muestras de Kappaphycus y Eucheuma.
N de
primer
Poblacin
N de
Bandas o Alelas (pb)
Alelas
Mxico
Parda
18
119.121.124.134.157.178.214.222.231.269.313.365. 402. 412. 462. 507. 545. 552.
Mxico
verde
17
119.121.124.134.157.178.214.222.230.269.314.364. 402. 412. 461. 506. 543.
Tanzania
19
123. 126. 131. 135. 147. 171. 193.230.239.249.288.333.387.425.436.488.536.576.

582.
E. cottonii
20
120.122.124.127.130.141.165.187.223.232.241.279. 324. 376. 414. 425. 476. 522.

560.568.
Mxico
Parda
17
120.123.133.157.178.213.222.230.268.313.364.401. 411. 461. 506. 542. 550.
Mxico
verde
17
120.123.133.156.177. 213. 221. 230. 267. 312. 362. 399. 409. 458. 503. 539. 546.
Tanzania
20
122.125.129.132.135.146.171.193.229.238.248.286.332. 385. 423. 434. 486. 533.

572.579.
E. cottonii
20
119.121.123.126.129.140.163.185.221.230.239.276. 321. 373. 411. 421. 471. 517.

555.562.
140
- - - - - - - - - - - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - - - - - - - - - - -
Resultados Captulo I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __
N de
Primer
Poblacin
Mxico
Parda
120, 124, 135, 158, 179,215,224,233,270,315,367,404,414,465,510,547,555.
Mxico
verde
17
121,124,135,158,179,214,224,232,270,315,366,403, 413, 463, 509, 545, 553.
Tanzania
21
123,126,128,130,133,136,147,172, 194,232,241,250,289,335,390,428,440,493,
540, 580, 588.
E. cottonii
19
121,123,128,131,142,166,188,224,233,242,281,326, 379, 417, 428, 480, 526, 565,

573.
Mxico
parda
17
121,124,134,157,179,214,223,232,269,314,366,402, 413, 463, 508, 545, 552.
Mxico
verde
17
121,124,134,157,178,214,223,231,269,313,364,401, 412, 461, 506, 543, 550.
Tanzania
20
122, 125, 129, 132, 135, 146, 171, 193,229,238,248,286,332,385,423,434,486,533,

572, 579.
E. cottonii
19
120,122,124,127,130,140,164,187,222,231,240,279, 324, 376, 414, 425, 476, 524,

558,
N de
Alelas o bandas (pb)
Alelas
141
Nde
Primer
Poblacin
Nde
Alelas
Bandas o AI~os (pb)
Mxico
parda
19
120,123,134,156,177, 213, 222, 230, 268, 312, 364, 401, 411, 465, 505, 542, 549, 550,
555.
Mxico
17
120,123,133,156,177, 213, 221, 230, 267, 312, 363, 400, 410, 460, 505, 541, 549.
Tanzania
21
122,125,128,130,132,136,147,171,193,230,239,249, 287, 332, 386, 425, 436, 488,

535, 574, 582.
E. cottonii
19
119,121,126,130,140,164,186,222,231,239,277, 322, 375, 412, 423, 474, 520, 558,

565.
E. spinosum
21
119,121,123,126,129,140,164,186,222,230,239,277, 322, 375, 412, 423, 474, 519,

558, 563, 566.
Indonesia
21
120, 122, 124, 128, 131, 141, 166, 188, 223, 232, 242, 280, 325, 378, 416, 426, 477, 524,
562, 568, 570.
Filipinas
21
119,122,125,126,129,132,142,167,189,225,234,243, 281, 327, 379, 417, 428, 480,

526, 565, 572.
E. spinosum
20
120, 122, 124, 127, 130, 141, 165, 187, 223, 232, 241, 280, 325, 378, 416, 426, 478, 524,
563,570.
Verde
11
14
142
N de
Primer
15
16
Poblacin
N de
Bandas o Alelas (pb)
Alelas
Indonesia
20
119,121,124,129,132,142,167,189,225,234,243,282, 327, 381, 419, 430, 482, 529,

567,575.
Filipinas
21
120,123,125,127,130,133,144,168,190,226,235,245, 283, 329, 382, 420, 431, 484,

531,569,577.
E. spinosum
20
120,123,126,129,140,164,185,121,230,239,278,322, 375, 413, 424, 474, 520, 559,

564,568.
Indonesia
22
120,122,124,127,130,141,165,187,223,232,240,279, 324, 376, 415, 426, 476, 523,

560, 566, 570, 573.
Filipinas
22
119,121,124,125,129,131,142,166,188,225,233,242, 281, 326, 378, 381, 416, 427,

479, 526, 564, 572.
E. spinosum
19
120,122,125,128,139,163,185,221,229,238,277. 322, 374, 411, 422, 472, 518, 556,

563.
Indonesia
20
119, 122, 124, 127, 130, 140, 164, 186, 222, 231, 240, 278, 323, 376, 413, 423, 475, 521,
559,567.
Filipinas
20
121, 123, 125, 128, 131, 141, 166, 188, 223, 232, 242, 280, 325, 377, 415, 426, 477. 523,
562,569.
143
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - Para analizar el perfil de alelas generados por las

muestras de Panam y el resto de Kappphycus y Eucheuma,
se llev a cabo un anlisis de coordenadas principales (PCoA).
El grfico generado por PCoA, en la figura 1.18, representa el
anlisis
de
las
muestras de
Kappaphycus
de
Panam,
Tanzania, y Mxico frente a E. coffoni, realizado con las

combinaciones de primers 1,3,4,5,6 (ver tabla 1.14). De este
anlisis se obtiene una correlacin entre los alelas de las
distintas
especies
muestras,
determinndose
que
la
distribucin espacial de los alelas de Panam (cuadrante

inferior izquierdo) se separa del resto de los alelas de las otras
Kapaphycus
Eucheuma
de
otras
procedencias.
Los
morfotipos, tanto verdes como pardos, de Kappaphycus de

Mxico
tambin
se
clasifican
en
dos
agrupaciones,
compartiendo su perfil de alelas entre ellos mismos y el resto

de los alelas de las muestras analizadas.
Algo similar ocurre con las muestras asumidas como
Kappaphycus de Tanzania que se asocian en un cluster propio
(cuadrante superior derecho) y otro compartido con el resto de
los alelas.
144
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - alvarezi de Panam que parece formar un cluster compartido
con el resto de alelas. Por otro lado, otra agrupacin parcial

de ciertos alelas de las muestras de Kappaphycus de Indonesia
y Filipinas parecen tambin evidenciarse en la figura pero
siempre compartiendo su perfil allico con el de las restantes
muestras.
Apa rentemente de los resultados graficados (Fig . 1.19)
se puede deducir que
el anlisis de los perfiles allicos de
muestras de Kapaphycus y Eucheuma , generado con los estos

primers no permite distinguir perfiles allicos de estas especies .
146
------~
- - - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - relacin
0.5:
(inserto :
vector) .
Entre
los
hndicaps
encontrados con otras ratio s se menciona la asociacin de

insertos entre si , o la baja probabilidad de la presencia del
vector.
De las mltiples secuencias obtenidas (44) el anlisis,

mediante BLAST de las mismas, comparadas con
aquellas
otras depositadas en las bases de datos , muestra que solo una

de estas (Fig . 1.13 material y mtodos) revela aproximaciones a
los genes que codifican las enzimas N- acetylgalactosamine-6sulfatase , sulfatasa y arylsulfatasa, pero con E-value elevados
(tabla 1.26). Estos E- value elevados son coincidentes con la
escasez de secuencias procedentes de las enzimas de esta
naturaleza en las macroalgas .
148
- - - - - - - - Resultados Captulo I - - - - - - - Tabla 1.26. Genes propuestos por el BLAST por su similitud a la
secuencia introducida. Dicha secuencia es el
resu~ado
del
cctel de amplificacin con los primers de AFLP, TG/CAA,

clonados y secuenciados con el primer M13F del vector pGemTeasy.
Secuencia Proteica (Frame -3 R) 3'-5'
VRSILKQN LLVVWVTI*KCRWLYKFPEGKVGS*CHAIMN*VYP*A
PRALQFMSFFKELEVRADN NLTQEQL *H*I RQKI*VTVWNTKN K
IQRI ESSPI*RTI RKGEFSL *SR*RGN LSI LFVFEVGFNTP*NSRG
ENISCLGX
Genes relacionados (tBLASTn)
ZP_01875382.1 N-acetyl-galactosamine-6-sulfatase
(GALNS)
ZP_07710689.1 sulfatase
YP_342257.1Ary/sulfatase A and related
Enzymes
149
- - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - -
DISCUSiN
--------~~--------CAPTULO I
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - Identificacin molecular. La especie cultivada en Panam

es Kappaphycus alvarezii.
Algunos autores desde la dcada de los 80, planteaban que

algas ,
muchas
se
conocian
por
su
notable
variacin
morfolgica dentro y entre poblaciones . Sin embargo, la

etiologia de esta plasticidad en las poblaciones naturales, los
beneficios
el
costo
de
asumir
las
diversas
formas
permanecian inexploradas, por el campo de experimentacin

(Taylor & Hay 1984). En particular en el campo de la
taxonomia,
esta
plasticidad
unida
las
tcnicas
de
identificacin clsicas basadas en la estructura celular de los

talos y la morfologia, han asignado y asignan de manera
incorrecta a numerosas especies.
Mathieson y colaboradores (1981) planteaban que no
todo en la taxonomia de algas estaba correcto , detallaron las
variaciones de la morfologia de las algas y las dificultades en la
clasificacin taxonmica basndose en esa morfologia. Estos
autores propusieron , en su estudio, algunas aproximaciones
para evaluar las relaciones genticas como complemento al
anlisis
morfolgico,
entre
ellas tcnicas tales
como
la
electroforesis.
151
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - A partir de la dcada de los 90 los mtodos moleculares

han sido muy tiles en la biologa, no solo para el estudio de la
evolucin, y la gentica de poblaciones, sino tambin en el
estudio taxonmico.
La
aplicacin
de
estudios
moleculares
en
la
investigacin de las algas, basados en ADN , ha sido enfocada

mayormente en la utilizacin de secuencias de ADN para
aclarar los problemas sistemticos y taxonmicos debido a la
alta plasticidad de estos organismos (Zuccarello et al. 1999a,b).
Los marcadores intraespecificos han sido empleados en
estudios filogenticos y de diversidad gentica, en algas, tales
como el gen cox1, subunidad mitocondrial 3 de la citocromo
oxidasa (cox 3), codificador del espaciador mitocondrial (cox 23), codificador del espaciador nuclear del transcrito interno de
los cistrones ribo soma les (IT81 Y IT82), el gen espaciador de
la Rubisco y rbcL (Yow et al. 2011) .
Estos marcadores son especificos para cada gnero,
puesto que, estos genes no evolucionan o cambian, de igual
manera en todas las especies . As, Bailey & Freswater (1997),
notaron que el gen rbcL estaba cambiando considerablemente
ms rpido en Gelidiales que en Gracilariales tanto a nivel de
gnero y de especie.
En contraste, el gen 88U (la subunidad ribosomal
pequea) parece evolucionar ms rpido en Gracilariales que

en Gelidiales. Asumiendo
los conceptos taxonmicos de

152
------~
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - gnero y especie son aproximadamente equivalente en los dos

rdenes, estos datos sugieren que las tasas de substitucin de
los genes rbcL y SSU son dependientes del linaje .
En esa lnea, autores como Tan et al. (2012, 2013)

trabajando con Kappaphycus y Eucheuma; Wiriyadamrikul et
al. (2010) que lo hicieron con Gelidiella, y Yow et al. (2011) con
Gracilaria, utilizaron tanto el marcador mitocondrial (cox 1),
como el espaciador cox2-3, dando resultados tiles, altamente
divergentes y aplicables para estudios de identificacin de
estas especies y de la evaluacin de su diversidad gentica .
Otros, autores como Robba et al. (2006), van ms all y
sugieren que el gen mitocondrial (cox 1), es un marcador
adecuado para el barcoding de las algas roja debido a que es
sensible para revelar la estructura de una poblacin y la
diversidad oculta de las especies de algas rojas.
Muchos autores recomiendan la utilizacin de mas de un

marcador.
As ,
Pareek
sus
colaboradores
(2010)
recomiendan la utilizacin de los marcadores mitocondriales y

cloroplsticos (cox y espaciador de la Rubisco) ya que los
consideran
ms
apropiados,
debido
que
ambos
son
conservados en menor grado que los marcadores nucleares

(18S rRNA) . Este ltimo, por ejemplo, presenta algunas
desventajas en reconstrucciones filogenticas , debido a su alto
153
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - grado
de
conservacin,
la
resolucin
de
los
arboles
filo genticos es algunas veces baja.

En este sentido , Zuccarello et al. (2006) trabajaron en la
identificacin de las variedades comerciales de Eucheuma y
Kappaphycus cultivadas alrededor del mundo, y encontraron
diferencias de variacin entre los dos marcadores utilizados, el
cox2-3 (mitocondrial) y espaciador de la Rubisco, siendo este
ltimo, ms conservado que el mitocondrial. Tambin, Conklin
y colaboradores (2009), utilizaron tres marcadores moleculares,
los mitocondriales de la regin COI subunidad I del gen la
citocromo oxidasa y espaciador cox2-3, una porcin plastdico
(238 rRNA o Universal Plastid Amplicon o UPA) y nucleares
(288 rRNA), con los gneros de Eucheuma y Kappaphycus de
Hawaii. Estos autores obtuvieron tres ciad es que se resumieron
en i) una separacin clara y congruente del clade de Eucheuma
y ii) dos clades de Kappaphycus revelando diferencias entre la
distribucin de las especies Kappaphycus de Hawaii frente a
las restantes analizadas.
Otros
autores
consideran
la
regin
espaciadora
transcrita interna (IT8 1) Y el espaciador de la Rubisco, como

partes ideales del genoma para determinar la identidad, de los
especmenes de algas rojas. Debido a que son suficientemente
variables y cortos, y permiten que los productos de PCR sean
fcilmente obtenibles (Maggs et al. 1992; Hughey et al. 2001) .
154
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - En este sentido, Kurihara y colaboradores (2010) han

considerado a la regin ITS con potencial til para aclarar las
variaciones entre el parsito y husped, en anlisis del ADN de
algas frente a sus epifitos. Sin embargo otros como Pareek y
colaboradores (2010) han considerado que el marcador de la
regin ITS como regiones de rpida evolucin y algunas veces
son inconsistentes en los alineamiento debido a las inserciones
y delecciones.
Las secuencias nucleotidicas codificadoras del gen

nuclear SSU rRNA (especialmente 18S rRNA) han sido muy
utilizados en filogentica por ms de una dcada y su uso se
est incrementando particularmente para determinar la posicin
de las algas rojas en los amplios esquemas filo genticos
(Pareek et al. 2010).
Luisma & Ragan (1995) utilizaron como marcador el gen
que codifica la subunidad ribosomal pequea (SSU-rRNA)
demostrando cuantitativamente que estas secuencias son
tiles para resolver problemas taxonmicos, filogenticos y
biogeogrficos entre las especies de la tribu Eucheumatoideae.
Sin embargo, indican que en muchos casos estas secuencias
nucleares, pueden ser poco variables, para ser utilizadas en
estudios de diferenciacin de especies a una escala ms fina,
por ejemplo, a nivel de cepas, haplotipos o variedades .
En
este
sentido,
Kurihara
colaboradores
(2010)
155
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - utilizaron secuencias del gen SSU y LSU rRNA en un estudio
de evolucin de las algas rojas parsitas (Ceramiales), y
encontraron una baja tasa de evolucin en ambas secuencias ,
por lo que concluyeron, lo difcil que es distinguir especies
cercanamente relacionadas, con este marcador.
Respecto al marcador del espaciador de la Rubisco, ha

sido til en la determinacin a nivel de haplotipos (variantes
plastdicos), en una poblacin de Caloglossa leprieurii, un alga
roja del orden Ceramiales (Zuccarello et al. 1999a). No
obstante, Fredericq y colaboradores (1999) mostraron datos ,
basados
en
el
anlisis
del
rbcL
gen
para
la
familia
Solierieaceae, los cuales no mostraron claramente la relacin

entre los gneros de algas rojas como Bethaphycus con
respecto a Eucheuma y Kappaphycus. En este sentido, autores
como Pareek y colaboradores (2010) sostienen que los genes
codificantes de protenas plastdicas tales como rbcL -a
menudo genes que evolucionan despacio-
ofrecen una baja
resolucin de la poblacin dentro de especies .
En especies cultivadas de Kappaphycus en Filipinas ,

Aguilan y
colaboradores
(2003),
utilizando
el
gen
rbcL ,
determinaron que la variedad Kappaphycus sp. "saco/" y K.
cottonii,
eran
caractersticas
idnticas
morfolgicas
pesar
de
hbitat
que
presentan
completamente
156
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - diferentes.
Otros
autores
como
Baamonde-Lpez
colaboradores (2007) recomiendan la utilizacin del marcador

rbcL junto a otro marcador, para obtener datos de mayor
resolucin.
Ellos utilizaron el marcador del gen rbcL y el IT8-
rnDNA "Nuclear Ribosomallnternal Transcribed Spacer ONA" ,

para discriminar e identificar las especies, de un grupo
notoriamente dificil, como las especies de Ulva.
En este estudio identificamos molecularmente la especie

cultivada en Panam, con el marcador de la subunidad grande
de la Rubisco (rbcL) como K. alvarezii. Y qued depositada
como tal, con el nO de acceso en GenBank HQ612184.
La identificacin filogentica de las especie de K. alvarezii de
Panam con el gen rbcL fue suficiente para obtener un rbol
filogentico altamente soportado (Fig. 1.20).
En Panam las primeras muestras fueron reportadas

como Eucheuma y datan desde 1978 y 1984, aos en los que
se realiz un programa de estudios de algas marinas en el rea
del Caribe, especficamente en Punta Galeta, Provincia de
Coln,
Repblica de Panam, las cuales se encuentran
depositadas en el Departamento de Botnica del Museo

Nacional de Historia Natural de Instituto 8mithsonian (Batista
2009). Desde entonces, cuando iniciaton los
cu~ivos
de algas
157
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - en Panam en el ao 2000 (Batista 2009), se denominaron

como Eucheuma coffoni.
Los primeros estudios filogenticos realizados a las

muestras comerciales (denominadas como "Eucheuma tips" y
"E. cottonii") de Panam fueron realizadas por Zuccarello et al.
(2006) , junto a otras muestras de diferentes partes del mundo.
Este estudio revel que la fuente de las muestras de Panam
es Kappaphycus alvarezi y que stas forman un grupo
diferente al grupo de las Eucheuma y de aquellas muestras de
Kappaphycus procedentes de Hawaii y de frica, formando
parte del grupo de las K. alvarezi determinado por Zuccarello
como cultivadas alrededor del mundo.
Esta
identificacin
molecular de
los
cultivares
de
Panam era necesaria por varias razones la primera de ellas,

como se mencion antes se le denominaba por su nombre
comercial como Eucheuma coffoni porque no se sabia si
perteneca a Eucheuma o Kappaphycus, y en segundo lugar,
debido a la alta plasticidad de las algas, especficamente de las
Eucheumatoides se hacia necesario confirmar a travs de los
marcadores moleculares su filogenia.
158
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - Caracterizacin molecular de los cultivares de Panam

mediante AFLP, nos permite distinguir diferencias sutiles.
En nuestro estudio hemos utilizado la tcnica de AFLP, porque

presenta patrones informativos sobre la diversidad gentica, en
organismos con reproduccin fundamentalmente vegetativa,
como es nuestro caso y porque permite establecer patrones
entre especies geogrficamente muy distantes. Es una tcnica
estratgica para la generacin de marcadores moleculares
relativamente sencilla, rpida y confiable.
Una vez aplicada la tcnica son muchos los factores a
discutir de la tcnica, entre las cuales, su utilidad en los
organismos no modelos, como en nuestro caso debido a que
no requiere informacin previa del genoma, y adems, requiere
de tanto solo 0.5
~g
de ADN genmico 0Ios et al. 1995). En
estudios de AFLP en algas se han reportado cantidades de

ADN de partida, similares a nuestro trabajo, entre 50 y 100 ng
(Shan et al. 2011; Murphy & Schaffelke 2003; Sun et al. 2005;
Donaldson et al. 1998,2000; Yi et al. 2010; Nivva et al. 2004).
Sin embargo ms que la cantidad, es importante una buena
calidad del ADN dado el papel a desempear de las enzimas
de restriccin, las cuales entre otros factores no deberian verse
inhibidas por la presencia de sales y/o polisacridos y que ms
adelante afectaria a la disponibilidad de los adaptadores 0Ios
et al. 1995 ). Adems de otros factores como el ADN degrado y
159
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - la utilizacin de mucha o poca cantidad ADN pueden afectar la

efectividad de la tcnica (Bonin et al. 2005).
Es importante hacer nfasis en este punto, y aclarar las
razones por las cuales nuestros perfiles gnicos se realizaron
con muestras secas tanto de K. alvarezii de Panam como de
las especies procedentes de otros lugares.
i)
El
anlisis se
realizaria
fundamentalmente
disponibilidad
sobre
muestras secas
la
considerando
accesibilidad
al
mayor
material
seco
obtenido de "quines realizan la gestin de los

cultivares" y, en este trabajo, por la manera ms
idnea
de
trasladar este
material
al
lugar de
realizacin de esta tesis.

ii)
Adems, el material seco era el estado en el cual

fueron recibidas las muestras de procedencia de las
especies de los otros sitios .
Siguiendo con la importancia de la calidad del ADN , los

mtodos para la extraccin de ADN en algas son variados, con
casos de estudio donde se ha llevado a cabo con kit de
extraccin, como en Laminara japonica (Liu et al. 2009, 2010),
yen especies del gnero Porphyra (Niwa et al. 2004; Sun et al.
2005) y aquellos otros con preparaciones ms robustas y
econmicas pero igualmente con buenos resultados . Ejemplos
de ellos tenemos los trabajos con Laminara japnica (Yi et al.
160
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - 2010) donde realizaron diferentes mtodos para extraer ADN
de calidad de material seco. En nuestro caso, con el mtodo de
CTAS obtuvimos un buen ADN, al igual que Kusumo et al.
(2004); Yang et al. (2009) en Laminariales, y Murphy &
Schaffelke (2003) en algas verdes.
Si bien es cierto, la mayoria de los autores que han
utilizado AFLP en algas, han partido de material fresco. Sin
embargo, en estudios de AFLP en plantas superiores, utilizan
muestras
de
material
seco
(hojas)
en
especies
como
Rhododendron ferrugineum , un arbusto de los Alpes Europeos

(Escaravage et al. 1998), y en un arbusto de la estepa de
Mongolia, Caragana microphyla (Chen et al 2009), obteniendo
ADN de calidad y por ende perfiles de AFLP fiables y
reproducibles.
El
material
seco
puede
estar
asociado
ADN
fragmentado, sin embargo un estudio realizado por Hughey y

colaboradores (2001), con 28 muestras secas procedentes de
muestras colectadas en el
herbario, de algas del orden
Gigartinaceae, para la identificacin gel marcador ITS1 y el

espaciador de la Rubisco, en el cual a pesar del estado del
material
obtuvieron
buenos
identificacin filogentica
resultados
en
de esas especies.
la
correcta
Por lo que
podemos decir, de nuestro material seco se ha obtenido de

buena calidad y no es uno de los factores que hayan podido
alterar los perfiles generados por AFLP.
161
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - Las enzimas de restriccin tambin juegan un papel

importante
en
los
perfiles
de
AFLP.
Por
ejemplo,
la
combinacin de la enzima EcoRI/Msel se recomienda para la

digestin de genomas vegetales, puesto que en animales, se
produce un excesivo nmero de fragmentos que complican la
interpretacin de fragmentos (Gonzalez-Fortes 2008).
En algas, se ha reportado con xito la combinacin de
EcoRI/Msel para algas rojas como Porphyra (Niwa et al. 2004;
Sun et al. 2005) y Chondrus (Donaldson et al. 1998,2000); para
algas pardas, como Laminara japonica (Yan et al. 2009; Liu et
al. 2009, 2010; Yi et al. 2010), Poste/sia pa/maeformis (Kusumo
et al. 2004), Saccharina japonica (Shan et al. 2011) y tambin
en algas verdes (Murphy & Schaffelke 2003).
Otras combinaciones reportadas han sido
EcoRllTrul
(isoesquisomera de Msel) en el alga roja Grate/oupia /anceo/a

(Maneiro et al. 2011) y la combinacin PsMMsel en algas
verdes (Werner et al. 2001).
Para
diferenciar
los
perfiles
generados
por
una
combinacin u otra, se consideran dos factores importantes : i)

la secuencia de reconocimiento de las enzimas de corte
frecuente
(Msel),
ii)
las
caracteristicas
genmicas
del
organismo en estudio.
El genoma de los vertebrados es rico en secuencias no
codificadoras compuestas mayoritariamente por nucletidos A
162
------~ .
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - y T. Muchos puntos sern susceptibles de corte por parte de la

enzima Msel, generando abundantes fragmentos de pequeo
tamao. Sin embargo, con la enzima de corte frecuente Taql, la
cual tiene una diana de corte de composicin equilibrada entre
bases pricas y pirimidnicas, cortar estos genomas con una
frecuencia
algo
menor, generando
fragmentos
con
una
distribucin de tamaos ms amplia (Gonzlez-Fortes 2008) .
Otro punto importante de la tcnica de AFLP es la

composicin de los primers selectivos. La tcnica
permite
obtener un nmero de fragmentos variables por combinacin

de primer, en funcin de la seleccin del nmero de nucletidos
selectivos (0-3) en la terminacin 3' (Donaldson et al. 1998).
As, primers selectivos con dos nucletidos en la terminacin 3'
pueden amplificar mas fragmentos que esos mismos primers
con tres nucletidos en la terminacin 3', a pesar de que solo
hay un nucletido de diferencia . Bsicamente se debe a que
primers cortos
requieren
sitios
de
alineamientos
menos
especficos, que los primers con mas nucletidos. A su vez, los

primers cortos se alinean mejor y por ende, amplifican ms
fragmentos.
En
nuestro
caso,
utilizamos
primers selectivos
de
tres
nucletidos en el extremo 3', por lo que, no es uno de los

parmetros que influyen en la obtencin de un mayor nmero
de fragmentos por combinacin de primer.
163
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - Aparte de estas cuestiones tcnicas, el anlisis de AFLP

revela la necesidad de tener un cierto nmero de individuos
para
llevar
cabo
el
estudio.
Si
bien
no
existen
recomendaciones especificas al respecto, si que depende del

tipo de estudio a realizar. En general se recomienda un
esfuerzo a la hora del muestreo, en comparacin con otros
marcadores.
Por ejemplo
se
expresa
para
estudios
de
diversidad gentica y estructura de poblaciones, la necesidad

de al menos obtener 30 individuos por poblacin, y si no es
factible este nmero de muestra, sugiere mtodos de anlisis
basndose
solo
en
individuos
(Bonin
et
al.
2007).
En
Saccharina japonica se utilizaron 33 individuos con los que

obtienen datos de AFLP verdaderamente fiables (Yi et al.
2010). Sin embargo,
Donaldson et al. (2000); Kusumo et al.
(2004); Murphy & Schaffelke (2003) y Niwa et al. (2004),

utilizan muestras menores de 30 individuos.
Algunos otros como Maneiro et al. (2011) para investigar
tambin la diversidad gentica y la estructura de esa poblacin
utilizaron
225
especies
Saccharina japnica
de
para
Grateloupia
determinar
solo
lanceola.
la
Con
diversidad
gentica a nivel de cultivo y de poblacin se emplearon 120

individuos (Shan et al. 2011) .
Para la realizacin de mapas genticos y QTL, el rango
oscila entre 92 y 230 individuos para Laminaria japonica (Liu et
al. 2009, 2010kOtro estudio similar fue realizado por Yang et
164
- - - - - - - - - - Discusi n Capitulo I - - - - - - - - al. (2009), en la misma especie, utilizando 40 individuos.
Otro factor importante a considerar en la tcnica de

AFLP es el nmero de bandas, que al igual que el nmero de
individuos, depende del objetivo del estudio . Cuando se busca
un loci bajo seleccin o asociado a un fenotipo, no hay
tericamente un limite superior, donde el esfuerzo en un
muestreo adicional sera intil ya que es preferible ana lizar el
mayor nmero de loci como sea posible. En la prctica, es
difcil evaluar el verdadero grado o nivel de cobertura del
genoma sin la previa informacin del tamao del genoma y la
ubicacin o posicin de
los marcadores . Las revisiones
bibliogrficas revelan que las exploraciones del genoma en

busca de seleccin de caractersticas en AFLP se basan
generalmente en ms de 300-400 marcadores . Por el contrario
en estudios clsicos de la diversidad gentica, la estructura de
la poblacin , las relaciones genticas o las pruebas de
asignacin,
por lo general,
hay una amplio
nmero de
marcadores por debajo del nmero de muestras de la varianza

que es muy alto, por lo tanto las estimaciones no son fiables .
Los estudios de simulacin realizados indican que entre 150 o
250 loci, se requieren para un correcto anlisis de cluster.
En nuestro caso se han generado se ha generado
aproximadamente entre 120 y 150 alelas, con rango de 16 a 22
alelas por combinacin de primer, informacin que concuerda
165
- - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - con los reportados en la bibliografa como aceptables para

anlisis como diversidad gentica , estructura de la poblacin y
relaciones genticas.
Otro punto importante son el rango de bandas, en

nuestro caso utilizamos las bandas a partir de 119 hasta 580
pb, para eliminar la zona de ruido, por contaminacin de PCR,
y evitar la homoplasia. Bonin et al. (2007) describen que los
fragmentos menores de 150 pb, Y perfiles con mucha densidad
de bandas, estn particularmente sujetos a la homoplasia. Sin
embargo autores como Donaldson et al. (2000) realiza su
anlisis en base a bandas generadas entre 35 y 500 pb en
Chondrus crispus, al igual que el trabajo realizado por Yi et al.
(2010) en Laminaria japonica. Otro estudio similar realizado en
Saccharina japnica, por Shan et al. (2011) utilizaron rangos de
bandas entre 100 Y 750 pb.
Como hemos visto segn la bibliografa, los perfiles
generados por la tcnica de AFLP en los especmenes de
Panam, presentan un nmero de alelas o bandas, aceptables
entre un rango de 119 a 580 pb. Lo que los hace perfiles
gnicos fiables para diferentes anlisis genticos.
166
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - Identificacin de los especmenes cultivados en Panam y

de otros sitios.
El nmero de primers utilizados y su reproducibilidad es otro

de los importantes factores a tomar en consideracin, a la hora
de diferenciar los perfiles genticos entre especies. Por
ejemplo, autores como Sharma et al. 2011, en su anlisis de
AFLP utilizaron 64 combinaciones o juegos de primers, de los
cuales solo 15 fueron reproducibles. Otros autores como
Geuna et al. 2003, solo utilizaron cinco primers para diferenciar
118 accesiones o variedades de albaricoque de Asia, Europa,
Amrica y Nueva Zelanda, sin determinar la reproducibilidad de

dichos combinaciones . En este sentido, Bonin et al. 2006 ,
recomienda probar entre una veintena y treintena de primers,
de los cua les elegir entre 5 y 6 juegos de primer, como tiles
para caracterizar el perfil molecular de la especie en estudio.
Lo que se confirma en nuestro caso , puesto que probamos 21
juegos de primers, de los cuales solo 16 eran reproducibles, de
estos se seleccionaron 9 para identificar los diferentes perfiles
de Panam y otros sitios, de los cuales, aparentemente solo 5
(Fig. 1.22) son capaces de diferenciar los perfiles de Panam
del resto, mediante el anlisis de peoA. Por lo que podramos
deducir que si bien es importante encontrar primers que sean
reproducibles , vemos que no todos los primers reproducibles
son tiles para diferenciar el perfil gentico de las especies en
167
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - estudio.
Bsqueda del marcador gnico a partir de los fragmentos

de AFLP para futura mejora.
Una vez establecida la huella o perfil molecular de K. alvarezi,

que riamos conocer si esos alelas caracteristicos, podrian verse
relacionados con un gen o marcador, como podria ser "el gen
relacionado con la sintesis de los carragenanos" lo que seria
de mucha importancia para el cultivo.
Hemos podido adaptar la tcnica de clonacin e insertar

fragmentos de AFLP . Sin embargo, en nuestro caso, la
aproximacin a la bsqueda de un marcador revel que si bien
los diferentes acercamientos eran buenos (tabla 1.26), la
proximidad de las secuencias obtenidas con
respecto a
aquellas presentes en las bases de datos no eran permisibles

dado los valores del parmetro E. A saber, E-value es un dato
probabilistico que indica la probabilidad que la secuencia target
se "parezca" a las depositadas. Por tanto, no significa que a
valores
E elevados, no sea lo que buscamos sino que
simplemente no se encuentra en bases de datos. Otro factor

que tambin afecta este valor, es la longitud de la secuencia,
ya que secuencias de mayor longitud estn compuestas de
mltiples sitios diferentes de dominios, por lo tanto tendrn un
168
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - valor E menor en comparacin con una secuencia corta. En
este sentido, la escasez de secuencias de genes procedentes

de algas multicelulares es elevada, lo que hace difcil su
bsqueda en las bases de datos, en comparacin con las
plantas
superiores .
secuenciacin
masiva
Las
se
nuevas
espera
tecnologas
que
ofrezca
como
mejores
oportunidades para el estudio de los geno mas de algas

multicelulares.
169
- - - - - - - - - - Discusin Capitulo I - - - - - - - - CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos no permiten concluir que :

1. Se ha amplificado selectivamente el gen rbcL de las
muestras frescas de Panam y depositado en las bases
de datos del NCBI con N de acceso HQ612184.
2.
La secuenciacin del fragmento amplificado ha permitido

establecer
la
especie
cultivada
como
Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty ex PC Silva .
3.
Es posible aplicar las bases de la tcnica de AFLP a

muestras frescas y secas. Lo segundo puede tener mayor
relevancia en la jndustria.
4. El
anlisis
gnico
mediante
GenAlex
revela
sutiles
diferencias genticas entre Panam y la de otros sitios.

5.
Hemos podido clonar fragmentos AFLP lo que abre una

puerta a su uso en mejora gentica .
170

0001

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

0001

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TESIS DOCTORAL

Recursos Vivos Marinos

Claudia Massiel Prez Gonzlez

Palmas de Gran Canaria - 2013

UNIVERS IDAD DE LAS PAUMS O[ GRAN CANAR IA

AD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

y para que as conste , y a efectos de lo previsto en el

Fdo. Jos Manuel Vergara Martn

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS

Ca racterizacin biolgica y qumica de Kappaphycus alvarezii

Tesis Doctoral presentada por Oa. Claudia Massiel Prez

Las Palmas de Gran Cana ria, 8 de abril del 2013.

~ UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS

CARACTERIZACiN BIOLGICA Y QUMICA DE

CLAUDIA MASSIEL PREZ GONZLEZ

LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

Cn memora de mi abuela Florentina Gonzlez

La libertad slo existe cuando existe el amor. Guien se

entrega totalmente, 9uien se sIente libre, ama al mxmo.

uno de nosotros es r<",..sponsable por lo 9ue siente,.tJ no

admiracin. De ambos he aprendido mucho, a nivel profesional

Tambin te doy gracias Seor, por concederme algo que no

Agradezco tambin a la Agencia Espaola de Cooperacin

A la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y al

Al Dr. Jess Prez Pea y Dr. Javier Araa, del Centro

Investigacin Aplicada (CIDIA). Por la formacin y acceso al

A la Dra. Gloria Batista por facilitarme las muestras de

Al Laboratorio Marino de Punta Galeta por las facilidades

A todos los compaeros que forman y han formado parte del

- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -

mi gente linda de Canarias,

hospitalidad, y por hacerme sentir como en casa . Que Dios

A mi amiga majorera Eva y a toda su familia, gracias a todos

desinteresada durante estos aos.

A mis compaeros de clases de canto Toms, Mari Carmen y

A mis amigas Malu, Arge y Gio gracias por su amistad a pesar

- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -

y por ltimo pero no menos importante, a mi madre a quien

y para finalizar este trocito de la cancin del trio Los Panchos

Islas Canarias las recuerdo con valor

Que Viva Canarias!!!

La doctoranda Claudia Massiel Prez Gonzlez curs estudios

A lo largo del periodo de formacin , del programa

doctorado: Ecologa y gestin de los recursos vivos marinos,

siguientes cursos, congreso y en la preparacin de trabajos por

Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P,

Panameo y caracterizacin de la carragena . Congreso

Curso PCR cuantitativa a tiempo real. Universidad de

Curso de Postgrado, Filogenias y Genealogas del DNA:

Barcelona, Barcelona 5-15 de julio de 2011.

- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -

Phycomorph net kick-off meeting. Universidad de Las

Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P, Robaina RR.

Kappaphycus alvarezi from Panama using rbcL gene

Prez-Gonzlez CM, Garca-Jimnez P, Robaina RR.

Kappaphycus alvarezifrom Panama. (en preparacin) .

- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -

Captulo 1: Caracterizacin molecular de Kappaphycus

Bsqueda de un marcador gnico a partir de fragmentos

Captulo 11: Caracterizacin qumica de Kappaphycus

... ...................................................................... 200

... ....................................................................... 200

- - - - - - - Claudia Massiel Prez Gonzlez - - - - - - -