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Tema 14: Tecnicas

especiales de
investigacin y/o
diagnostico.

1. CUTIVO DE TEJIDOS:
Podemos decir que un cultivo de tejidos, es el conjunto de tcnicas que nos permiten
mantener clulas in vitro con una gran aproximacin a sus propiedades y funciones in
vivo. Dependiendo del grado de preservacin de la estructura del tejido u rgano de
origen y del tiempo de su duracin distinguimos diferentes tipos de cultivos: de rganos,
explantes, primarios, secundarios, etc. El trmino cultivo de tejidos suele ser usado
como un trmino genrico que incluye el de cultivo de rganos y el de cultivo de
clulas.
-----1.1 Equipamiento del laboratorio, instrumental y material:
En el rea de preparacin: refrigerador, balanzas, potencimetro, plancha
elctrica con agitador magntico, frascos Erlenmeyer, botellas y material de
vidrio o plstico.
En el rea de lavado y esterilizacin autoclave manual o automtica, destilador
de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plstico de varios
tamaos, recipientes de plsticos grandes, estufas para esterilizacin y secado.
En el rea de transferencia: gabinete de flujo laminar, microscopio de diseccin
con luz incidente e instrumentos de diseccin: cuchillas, mangos para cuchillas,
agujas de diseccin, pinzas, tijeras, navaja de afeitar. Tambin se necesitan
frascos con alcohol, mechero de alcohol, mascaras, guantes, marcadores a
prueba de agua, bandeja para desechos.
En el rea de incubacin: un cuarto con temperatura, iluminacin y humedad
relativa controlada, estanteras con iluminacin para los cultivos, bandejas,
termmetros de mxima y mnima y gradillas para tubos de varios tamaos.
En el rea de exanimacin: microscopio estereoscopio, microscopio compuesto,
lentes de aumento y elementos pticos complementarios
En el rea de crecimiento in vivo: macetas, suelo, bandejas, cmaras de alta
humedad.
Otros equipos tiles incluyen: microscopio invertido, microscopio compuesto
con objetivo de inmersin, agitador para cultivos en suspensin, centrifuga de
mesa, sistema de filtracin para producir agua tipo reactivo, filtros para la
esterilizacin de medios de cultivo, gabinete para secado por aire caliente,
lavadora de pipetas, desionizador de agua, pipetas Pasteur, horno de microondas,
cmaras de crecimiento controladas, etc.
1.2 Tcnica asptica:
Es una serie de medidas preventivas contra los microbios y va de infeccin objetivo
tomada. Para prevenir y evitar la infeccin postoperatoria, con el fin de garantizar el
xito de la ciruga
(WWW.JUSTDOCUMENT.COM)

A pesar de la utilizacin de antibiticos en los medios de cultivo, la contaminacin por


microorganismos contina siendo uno de los mayores problemas del cultivo de clulas.
Las bacterias, los mico plasmas, las levaduras y las esporas de los hongos, pueden ser
introducidas va el operador, la atmsfera, la superficie de trabajo, las soluciones, etc.
Una correcta y rigurosa tcnica asptica por parte del operador, conjuntamente con la
utilizacin de soluciones y materiales probadamente estriles son imprescindibles para
el mantenimiento de los cultivos libres de contaminantes biolgicos.
(WWW.MONOGRAFIAS.COM)
1.3 Esterilizacin del material:
La esterilizacin es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se
libera completamente de cualquier microorganismo vivo o espora. En la terminologa
mdica se utiliza generalmente la palabra asepsia para designar la condicin en la que
estn ausentes los microorganismos patgenos.
La desinfeccin se limita generalmente al proceso de destruccin de los
microorganismos mediante mtodos qumicos.
Procedimiento de esterilizacin:
El calor es uno de los agentes que se utiliza con ms frecuencia en la esterilizacin. Se
puede usar en forma de llama directa, de calor hmedo o de calor seco, cuando se utiliza
el calor hmedo puede ser en forma de vapor abierto o de vapor bajo presin.
El logro de esterilidad en cualquier preparacin depende de muchos factores, como son
la naturaleza de las sustancias que se esteriliza, el volumen contenido en cada unidad, el
tamao del recipiente y el nmero de unidades que se pueden manejar en una sola
operacin.
-

Calor seco: Los recipientes de vidrio seco que se utilizan para operaciones
estriles se pueden esterilizar por medio de aire caliente; para el efecto se coloca
en una estufa de aire caliente a una temperatura mnima de 170C,
preferiblemente durante dos horas.
Es obvio que todos los materiales esterilizados mediante calor seco debern de
estar limpios
Vapor bajo presin (autoclave): es muy eficiente para destruir todas las formas
de bacterias y hongos y sus esporas, y es el mtodo ms utilizado para esterilizar
diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo.
La autoclave ms utilizada actualmente en el laboratorio es la contraparte de
mayor tamao de la olla de presin comn. Es necesario extraer todo el aire
antes de empezar el proceso de esterilizacin, esto se logra automticamente al
permitir que el vapor expulse el aire el aparato , antes de cerrar la vlvula
correspondiente. La temperatura de la autoclave se regula mediante la presin y
es directamente proporcional a esta.

Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se


acostumbra a usar una presin de 15 LB durante 20 minutos. Sin embargo, Se
debe recalcar que le tiempo de exposicin requerido depender tanto del tipo del
material que se va a esterilizar como de su cantidad.
Calor hmedo a 100 C: Probablemente sea suficiente una sola exposicin de
15 minutos al calor vivo para matar todas las formas vegetativas microbianas.
Sin embargo, as o se mata necesariamente todas las formas de esporas y puede
ser prctico efectuar la esterilizacin intermitente. En este caso, la exposicin
puede ser de 3 a 60 minutos y se repite diariamente durante 3 das consecutivos.
Tericamente la primera exposicin destruye todas las formas microbianas. A
veces el procedimiento se modifica utilizando temperaturas inferiores al del agua
hirviendo y aumentando el nmero de las exposiciones asta cuando haya una
seguridad razonable de esterilidad.
Este mtodo del calor hmedo a 100 C, conocido como mtodo de Koch se
utiliza en la esterilizacin de medios que contienen componentes capaces de
soportar la exposicin a temperaturas de vapor vivo, pero no a las temperaturas
mayores que tiene el vapor bajo presin. Este mtodo no est exento de
problema, las esporas puede no desarrollarse en la soluciones no nutritivas, por
lo cual se recomienda reemplazarlo por el mtodo de filtracin.
Filtracin: a travs de filtros especiales a pruebas de hongos y bacterias. Es
claro que los filtros y otros aparatos se deben esterilizar antes de tratar de utilizar
para remover los contaminantes de un lquido.
El tamao del poro es el principal factor en la capacidad de retencin de
bacterias, otros factores son el pH, la carga elctrica del material filtrado, la
temperatura, la presin y la duracin del procedimiento, as como el efecto de la
absorcin de protenas y otras sustancias en el filtro.
En el mercado se encuentra una amplia gama de aparatos e filtracin entre los
cuales estn el Millipore.
Limpieza de los recipientes de vidrio:
Es de importancia vital en el trabajo de cultivos de tejidos vegetales. Nunca de
debe utilizar jabn, se deben adoptar detergentes que se laven y enjuaguen
fcilmente. Se debe de utilizar agua caliente con el detergente, enjuagar con
agua caliente sola, hacerlo despus con agua desionizada y finalmente con agua
destilada
Bajo circunstancias especiales puede ser necesario exponer los recipientes de
vidrio a soluciones limpiadoras de acido crnico, durante varias horas.
Adicionalmente, las soluciones limpiadoras son peligrosas y se deben utilizar
con cautela para evitar quemaduras y problemas de contaminacin ambiental.
Tambin existen soluciones inorgnicas para el lavado, las cuales son tan
efectivas como las soluciones de acido crnico y , a diferencias de ellas , se dice
que son inocuas par el medio ambiente.

1.4 Reactivos y medios de cultivo:

1. Medios de cultivo:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproduccin y la identificacin
de los microorganismos.

Contienen sustancias nutritivas

pH adecuado

Deben estar estriles.

Clasificacin de medios de cultivo:


1. Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos.
2. Segn su finalidad en microbiologa:

No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el


crecimiento de gran variedad de microorganismos.

Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de microorganismo.

Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser


sangre, suero, albmina, etc... Para microorganismos exigentes.

Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre


diferentes tipos microorganismos.

Los requerimientos de los medios de cultivo son especficos de:

La muestra que se analiza.

De los microorganismos a ser detectados.

Los medios de cultivo se preparan:

En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes.

A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o

Pueden adquirirse medios listos para su uso.

2. Incubacin:
Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.

La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico, anaerobio)

Tiempo.

Temperatura.

Manejo de los medios de cultivo:


1. El laboratorio debe registrar la fecha :
o de recepcin
o de apertura del envase.
o de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas.
o Envases: deben estar hermticamente cerrados. (especialmente medios
deshidratados)
o No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento
o un cambio de color.
Procedimiento para preparacin de medios de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse
de acuerdo con un procedimiento documentado.

En dicho procedimiento debe haber una descripcin del equipamiento necesario.

El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificacin y otros datos


en los medios de cultivo y reactivos.

Debe haber un registro de preparacin de medios de cultivo y reactivos.

Almacenamiento de los medios de cultivo y diluyentes preparados


Debe determinarse y verificarse el perodo de validez de los medios preparados en las
condiciones de conservacin especificadas.
En general los medios preparados se guardan:

En heladera no ms de tres meses

A temperatura ambiente no ms de un mes en condiciones que impidan que su


composicin sea modificada.

Reactivos:
El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada
para los ensayos realizados.
(http://www.scientificainc.com/)

1.5 Cultivo celular primario:


Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido original
recin extrado, recibe el nombre de Cultivo Primario. Cuando este cultivo primario es
sometido a procesos de transformacin que le confieren capacidad ilimitada de
multiplicacin, recibe el nombre de Lnea Celular.
Los cultivos de clulas animales tambin se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad
de adherencia o no a una superficie determinada, pudiendo crecer en forma de mono
capa o en suspensin.

1.6 Determinacin de la viabilidad celular:


La viabilidad mide la proporcin de clulas vivas luego de procedimiento, pruebas para
determinar rompimiento de la integridad de la membrana, mide la entrada de tinte que
normalmente es impermeable
Las clulas vivas son impermeables a Trypan Blue y Naphthalene Black, mientras que
las muertas permiten la entrada del tinte y microscpicamente se observan teidas.
La invencin comprende un mtodo para la determinacin de la viabilidad celular y un
aparato especialmente diseado para la aplicacin de este mtodo. El mtodo utiliza la
tcnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo con deteccin de
fluorescencia, y es adecuado para las cepas de levaduras comerciales. Funciona
adecuadamente como lo demuestra la comparacin de los resultados de viabilidad
celular obtenidos mediante el GrFFF con los obtenidos utilizando las tcnicas de
citometra de flujo y de contador Coulter. Proporciona una buena linealidad,
repetitibilidad, y un lmite de deteccin suficientemente bajo para detectar 2 x 104
clulas no viables. Adems, el GrFFF puede ser fcilmente implementado en un sistema
convencional de cromatografa de lquidos. As, la sencillez y bajo coste del aparato lo
hace ser una alternativa valiosa a los comerciales basados en tcnicas de citometra de
flujo y contador Coulter.
Se determin la concentracin y viabilidad de una suspensin celular. El azul tripn tie
a las clulas que presentan dao en la membrana plasmtica, fue utilizado para
diferenciar entre clulas viables y no viables / teidas con azul tripn. Se prepar una

disolucin 1:2 con 10 L del cultivo y azul de tripn. Se us la cmara de Neubauer


para contar e inferir el nmero de clulas viables, como concentracin celular,
expresadas en clulas por mililitro. El volumen celular en el cual se han contado las
clulas resulta de multiplicar la profundidad de la cmara por el factor de dilucin, la
superficie de los cuadrados y el nmero de cuadrados contados. Se encontr a partir de
las clulas (linfoma de clulas B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000
cel /mL de concentracin celular.
(http://reportesparaestudiantesdequimica.blogspot.com.es/)
(http://es.slideshare.net/)

2. CITOMETRIA DE FLUJO:
La citometra de flujo es una tecnologa biofsica basada en la utilizacin de luz lser,
empleada en el recuento y clasificacin de clulas segn sus caractersticas
morfolgicas, presencia de biomarcadores, y en la ingeniera de protenas. La citometra
de flujo es una tcnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el
diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades
Un rayo de luz monocromtico, usualmente de luz lser, es dirigido hacia un finsimo
chorro de lquido hidrodinmicamente enfocado. Se coloca una serie de detectores en el
punto en el que el chorro de lquido atraviesa el rayo de luz. Cada una de las partculas
suspendidas que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias qumicas
fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partculas son excitadas hasta
emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinacin de
de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores, y por medio de un
anlisis en la fluctuacin de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es
posible derivar varios tipos de informacin acerca de la estructura fsica y qumica de
cada partcula individual.
El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen de la partcula,
mientras que los detectores laterales o SSC brindan informacin acerca de la

complejidad interna de la misma. Esto es debido a que los componentes internos de las
clulas dispersan la luz.
Los citmetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partculas por
segundo, y pueden separar y aislar activamente partculas de acuerdo a propiedades
especficas. Los citmetros de flujo ofrecen una cuantificacin automtica de una serie
de parmetros con altsima calidad.
Un citmetro de flujo tiene cinco componentes principales:

La celda de flujo laminar

Un sistema de medicin

Un sistema de iluminacin formado ya sea por lmparas de alta luminosidad


lseres de alta potencia refrigerados por agua, lseres de baja potencia refrigerados
por aire, lser rojo de helio-nen ( 633 nm), verde de helio-nen, ultravioleta de
helio-cadmio; lseres de diodo de baja potencia.

Un detector y un conversor de seales ADC

Un sistema de amplificacin, lineal o logartmico.

Un ordenador para el anlisis de las seales.

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A ANATOMIA PATOLOGICA:


El desarrollo reciente de tcnicas de biologa molecular y la expansin acelerada del
conocimiento de las bases genticas y moleculares de las enfermedades humanas,
han tenido un impacto significativo en Anatoma Patolgica
En la medida que los patlogos han participado en el estudio de las bases genticas
y moleculares de las enfermedades humanas se ha permitido el desarrollo de nuevas
herramientas diagnsticas en Anatoma Patolgica y la creacin de una subespecialidad en esta disciplina, la Patologa Molecular. La Patologa Molecular se
define por las tcnicas que se utilizan en ella y por los elementos que se analizan,
bsicamente cidos ribonucleico (ARN) y desoxirribonucleico (ADN), a partir de
muestras de tejidos (especmenes de biopsias o autopsias) o clulas
En cada anlisis de diagnstico molecular existen varias tcnicas de biologa
molecular disponibles. La eleccin de la tcnica ms apropiada para un determinado
examen de diagnstico debe ser muy cuidadosa y basarse en el conocimiento
acabado de las ventajas y desventajas de cada tcnica, en el equipamiento del
laboratorio y en la experiencia de sus integrantes. En la actualidad, los exmenes de
diagnstico molecular disponibles en Patologa Molecular estn referidos
principalmente a la deteccin de microorganismos, al diagnstico de enfermedades
hereditarias y al diagnstico auxiliar de neoplasias, especialmente en lo referente a
estudios de predisposicin gentica, estudio de poblacin de riesgo, diagnstico de
determinados cnceres, estudio de micrometstasis, seleccin de terapias y
evaluacin del pronstico de la enfermedad.
I.

Patologa molecular en el diagnstico de enfermedades infecciosas.


El diagnstico utilizando mtodos de biologa molecular ha tenido un
gran impacto en el diagnstico y manejo de las enfermedades
infecciosas5. Estos mtodos han sido desarrollados con el objeto de
mejorar la sensibilidad y especificidad de los mtodos tradicionales
de diagnstico microbiolgico, como asimismo acelerar el
diagnstico en casos de microorganismos de difcil cultivo o lento
crecimiento. Este desarrollo se ha extendido al diagnstico en
Patologa Molecular, en la cual se han implementado tcnicas de
diagnstico de virus, bacterias, hongos y protozoos en muestras de
tejidos y clulas aisladas.

II.

Patologa molecular en el diagnstico de enfermedades hereditarias.


El anlisis de la secuencia del genoma humano sin duda incrementar
la lista de enfermedades en las cuales se identifiquen las alteraciones
genticas responsables y los exmenes que permitan su deteccin.
Aunque casi la totalidad de estos exmenes se realizan en muestras
de sangre de los individuos afectados o con sospecha de poseer la
enfermedad y an no corresponden estrictamente al campo de la
Patologa Molecular, sin duda en el futuro stos tambin se aplicarn
a muestras de tejidos o clulas aisladas de los mismos.

III.

Patologa molecular en el diagnstico de neoplasias. Este campo es


sin duda una de las reas de la Patologa Molecular que ha

experimentado el desarrollo ms acelerado en los ltimos aos,


ayudando al estudio y aplicacin de los principios y las tcnicas de
biologa molecular.
-

Determinacin de predisposicin gentica para el desarrollo de neoplasias.

Deteccin precoz de cncer con mtodos moleculares

Diagnstico de tipos especficos de neoplasias.


o Traslocacin de cromosomas en sarcomas y neoplasias hematolgicas.
o Anlisis de clonalidad en proliferaciones linfoides.
o Distincin de doble tumor primario o metstasis.
o Estudio de metstasis
o Seleccin de terapias.
o Determinacin del pronstico.

En resumen, el desarrollo de las tcnicas de biologa molecular y la expansin acelerada


del conocimiento de las bases genticas y moleculares de las enfermedades humanas
han tenido un impacto significativo en Anatoma Patolgica. Este desarrollo, que debe
acompaarse de la capacitacin de los antomo-patlogos en los principios y tcnicas de
la biologa molecular, debiera incidir significativamente en el desarrollo del diagnstico
antomo-patolgico y en el incremento de la investigacin cientfica en nuestra
especialidad.
(http://www.scielo.cl/)
3. TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR:
Se denomina as a todas las tcnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, amplificar una regin, cortarlo y
pegarlo, etc.
Todas estas tcnicas tienen diversa aplicaciones generalmente en le diagnostico de
enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos ms o menos frecuentes asociados a una
caracterstica que nos interesa seleccionas, diagnstico de contaminacin bacteriana de
alimentos, diagnostico vital, etc.

4.1Tcnica de obtencin de ADN:


Para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a
partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de
proteinasas que eliminan las protenas del medio, detergente para eliminar las

membranas plasmticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN, protenas


y restos celulares
4.2 PCR:
Es la ampliacin de ADN in vitro por medio de la polimerizacin de cadena de ADN
utilizando un termociclador. Su propsito es hacer muchas copias de un fragmento de
ADN, se realiza la amplificacin de un segmento especfico de ADN teniendo poco
material disponible.
Fue diseada por el Dr. Kary Mullis. Este proceso incluye 3 pasos bsicos que se repiten
25 veces o ms:
1. Desnaturalizacin: consiste en separar la doble hebra de ADN y
convertirla en hebra sencilla
2. Apareamiento o Anneling: Los cebadores primers
previamente diseados, reacciona con la hebra sencilla del ADN
y se pega a lugares especficos por complementariedad de base.
Por eso se deja bajar la temperatura.
3. Polimerizacin o extensin: una polimerasa de ADN extiende los
primers en el espacio comprendido entre ambos primers, y
coloca dinucleotidos trifosfatados de 5 a 3 leyendo el ADN de 3
a 5. Se sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de
ADN molde.
Ventajas del PCR:
-

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad


considerable para su estudio

Puede utilizarse para clonar , secuencial y anlisis

Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto

Sus aplicaciones son mltiples.

Desventajas del PCR:


-

Se puede reproducir solo parte del genoma en donde se conoce por lo menos una
mnima secuencia.

Se necesita primers que sean complementarios al fragmento que se desea


sintetizar

La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con el ADN.

4.3 Tcnicas de hibridacin:


La hibridacin entre secuencias se basa en la especificidad de la interaccin entre las
bases nitrogenadas de distintas cadenas, de manera que se favorezca su asociacin y se
disminuya la posibilidad de reasociaciones intracatenarias as como las hibridaciones
inespecficas. Para empezar, hay que contar con una secuencia diana dentro de un
fragmento de DNA y con una sonda, que no es ms que un fragmento pequeo de DNA
de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana. Cuando la sonda y la
diana se encuentran, el dplex se identifica con radiactividad, fluorescencia o colorante,
segn de la manera en que la sonda se haya marcado.
El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restriccin
para dar lugar a una serie de fragmentos individualizados que se pueden resolver en
una electroforesis en un gel de agarosa. Este gel de agarosa se replica sobre un filtro
de nitrocelulosa o niln mediante la transferencia del DNA desde el gel hasta el filtro.
Esta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. Tambin se han
desarrollado mtodos rpidos por transferencia al vaco. Para que el DNA se transfiera
es necesario sumergir el gel en una solucin alcalina, de manera que ste de
desnaturaliza al romperse los puentes de hidrgeno. La desnaturalizacin del DNA es
esencial para que, posteriormente, la sonda pueda encontrar su secuencia
complementaria. Si el DNA a transferir es de gran tamao, entonces conviene dar antes
un tratamiento con rayos UV o una solucin cida para introducir mellas que permitan
que los fragmentos difundan a travs de la agarosa. A continuacin, el gel
se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas
sencillas a la membrana.
Una vez inmovilizado el DNA sobre el filtro, se rastrea (screening) el fragmento con la
sonda especfica. Se forman as una serie de DNA hbridos bicatenarios cuya estabilidad
va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto ms larga es la sonda y ms
bases se aparean y ms estable es el hbrido. En general, a mayor grado de hibridacin,
mayor conexin evolutiva entre especies, y viceversa.
Los tipos de hibridacin son:
-

transferencia Southern

transferencia Northern

La transferencia en ranura

transferencia puntiforme

hibridaciones Grunstein

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