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RESUMEN
ABSTRACT
Palabras clave: factor de crecimiento derivado de las plaquetas; sistema msculo-esqueltico, ratn, rata, cambios edad-dependientes.
Key words: platelet-derived growth factor; muscle-skeletal system; mouse, rat, age-dependent changes.
Correspondencia:
Prof. Miguel E. del Valle
Departamento de Morfologa y Biologa Celular
Facultad de Medicina
C/ Julin Clavera, s/n
33006 OVIEDO
Telfono: +34 985 10 37 17
E-mail: miva@uniovi.es
INTRODUCCIN
Las plaquetas son clulas hemticas que desempean un papel crucial en el mantenimiento
de la hemostasis por su contribucin a la formacin del cogulo en los lugares donde se ha producido una lesin vascular (1). Pero adems son
fuente de una serie de sustancias que favorecen la
reparacin tisular (2), modifican la reactividad de
las clulas vasculares y de otras clulas sanguneas en la angiognesis (3,4) y la inflamacin (5). La
mayora de tales sustancias son factores de crecimiento entre los que se incluyen el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) (6), el
factor de crecimiento transformante de tipo
(TGF-) (7), el factor de crecimiento insulina-like
(IGF-1) (8), el factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF) (9), o el factor de crecimiento epidrmico (EGF) (10). Tambin producen algunas citoquinas como el factor plaquetario 4 (PF4) (11),
la tromboglobulina (12), interleucina 8 (IL-8),
growth-regulating oncogene-alpha (GRO-), epithelial neutrophil-activating protein 78 (ENA-78),
macrophage inflammatory protein-1alpha (MIP1), monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3) y
CD40L (13,14).
El PDGF forma parte de una familia de factores de crecimiento constituida por cinco miembros codificados por cuatro genes diferentes
(15). Estas isoformas se denominan PDGF-AA,
PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC y PDGF-DD y
actun sobre las clulas sensibles a ellas por
medio de dos receptores tirosin-quinasa denominados (PDGFR) y (PDGFR) (16). Las
formas A y B se activan intracelularmente en el
proceso de exocitosis, mientras que las C y D se
liberan como factores latentes que requieren la
intervencin de proteasas (6). El PDGF y sus receptores desempean papeles clave en la proliferacin y diferenciacin del mesnquima, as
como el desarrollo del rin, sistema cardiovascular, cerebro, pulmn y tejido conectivo. En los
tejidos adultos, sin embargo, se asocian con los
procesos de regeneracin tisular, inflamacin y
angiognesis, as como con la gnesis de algunos tumores (17). Ello es debido a que estimula
la ostoegnesis (18) y aumenta la sntesis de la
matriz extracelular (19,20).
En los ltimos aos se han venido utilizando
estos conceptos biolgicos con fines teraputicos en los procesos en que se requiere una cu4
racin rpida o una regeneracin tisular acelerada (21-23). As, el implante autlogo de cogulos procedentes de plasma rico en plaquetas
se ha utilizado con notable xito en diferentes
especialidades mdicas como la odontologa
(24), ciruga ortopdica (25) y en cualquier caso
que requiera aceleracin en la curacin de heridas (26), as como en ingeniera tisular (27).
Sin embargo, existen algunos estudios que ponen en entredicho la bondad del procedimiento (28).
Para conocer cul o cuales de los factores de
crecimiento que son liberados por las plaquetas
ejercen sus acciones sobre los tejidos del aparato locomotor, el primer paso es conocer la distribucin de sus receptores, tanto en condiciones de normalidad como durante la reparacin
tisular. Con el fin de contribuir a ello, en el presente trabajo hemos analizados, mediante tcnicas de Western-blot e inmunohistoqumica
la distribucin de los receptores PDGFR y
PDGFR en los tejidos del sistema msculo-esqueltico de ratn y rata.
MATERIAL Y TCNICAS
Material y tratamiento de los tejidos
Para la realizacin del presente estudio se
han utilizado ratones y ratas. Los experimentos
en animales se realizaron siguiendo los Principles of Laboratory Animal Care.
Los ratones utilizados fueron de la cepa
C57B1/6 de edades comprendidas entre el da
16 del desarrollo embrionario (E15 n = 5; E18 n
= 6) y los 6 meses de vida postnatal (1 da n = 6;
7 das n = 5; 15 das n = 3; 1 mes n = 4; 3 meses n = 4; 6 meses n = 5). Las ratas utilizadas
fueron de la cepa Wistar-Kioto de edades comprendidas entre los E15 (E15 n = 6; E18 n = 4) y
los 6 meses de vida postnatal (1 da n = 3; 7 das n = 5; 15 das n = 4; 1 mes n = 4; 3 meses n
= 5; 6 meses n = 5). Los animales fueron sacrificados mediante una sobredosis de hidrato de
cloral. A continuacin se extrajeron las piezas
objeto de estudio, se trocearon y una parte fueron fijaron en lquido de Bouin o en formol al
10%, y el resto congelados inmediatamente en
nitrgeno lquido y almacenados a 80 C hasta
el momento de su utilizacin. Las piezas fijadas
fueron deshidratadas y procesadas para su inclusin en parafina de forma rutinaria. Los bloques se cortaron a 10 mm, y las secciones obtenidas montadas en portas gelatinizados. Las
piezas congeladas se utilizaron para la realizacin del Western-blot.
Westernblot
El estudio se realiz sobre muestras congeladas de recin nacidos (piezas que contienen
msculo, cartlago y hueso) y de animales de 15
das y 3 meses (msculo esqueltico). La muestras se homogenizaron de forma mecnica y a
continuacin se lisaron en hielo en un tampn
de lisis que contiene un 1% de digitonina (1%
digitonina, 50mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1
mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 8 mM yodoacetamida y 1mM fenilmetilsulfonil fluorado; pH
7.6). Los homogenizados se centrifugaron a
6000xg durante 10 min, a 4 C, se recogio el sobrenadante y se centrifug durante 10 min, a 4
C, a 14000xg para eliminar los restos celulares.
El pellet resultante se rediluy y se separ en
SDS-page (10%), transfieriendose las proteinas
por electroforesis a una hoja de nitrocelulosa.
sta se boqueo con TBS (1M, pH 7.4) que contiene 1% de leche desnatada y 1% de Tween-20,
y se incub durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpos anti-PDGFR- y antiPDGFR-, a una dilucin de 1:500. Los anticuerpos primarios fueron obtenidos en Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA
(PDGFR-, C-20, sc-338; PDGFR-, P-20, sc339) y reconocen un eptope del dominio carboxilo terminal de los receptores de origen
humano. El transblot se lav en TBS y 1%
tween-20 y se incub con IgG-anti conejo ligada a peroxidasa (Amersham) diluida a 1:1000
durante 1 hora. Finalmente, se lav y se analizo
mediante el sistema de deteccin ECL Western
(Amersham, Gran Bretaa).
Immunohistoqumica
Los cortes, una vez desparafinados y rehidratados, se lavaron en tampn HCl-Tris (0.05M,
pH = 7.5) que contena suero bovino fetal al
1%, albmina al 0.1% y Triton X-100 al 0.1%. A
continuacin se bloque la actividad peroxida-
PDGFR PDGFR
180 kDa
170 kDa
1
2 1
2 PDGFR
PDGFR
PDGFR
PDGFR
t
*
*
t
r E15 b
PDGFR
r E15 c
PDGFR
r E18 d
PDGFR
r 1s
PDGFR
ca
r 1d f
r 1d g
R 1m h
*
R 1m
Fig. 2. Distribucin de la inmunorreaccin para los receptores del PDGFR en secciones de hueso y cartlago
de animales de diferentes edades. r: ratn; R: rata; *: cavidad articular; ca: cartlago articular; f: fmur; t: tibia.
10
4 PDGFR
PDGFR
R E15 b
PDGFR
R E18 c
R 1s
Embriones
E15
E18
Postnatal
1d
7d
15 d
1m
3m
6m
Cartlago
crecimiento
Cartlago
articular
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
++
+
+
+++
++
++
++
+
+
+++
+++
+++
++
+
+
+++
+++
+++
++
+
+
++
++
++
++
+
+
Msculo
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
++
+
+
+
++
++
+
+
+
+
++
++
+
+
+
+
Las cruces representas densidades estimadas de clulas inmunorreactivas para cada uno de los receptores:
+++: ms del 50%; ++: entre el 50% y el 10%; +: menos del 10%; -: ausencia de inmunorreaccin.
11
PDGFR PDGFR
H E12 b
H E12
R 1s c
R 1s
DISCUSIN
En los ltimos aos se ha comenzado a utilizar con xito en clnica humana, de forma emprica, el plasma rico en plaquetas para el tratamiento de algunas patologas del sistema
msculo-esqueltico (2,29), pero se desconoce
cuales son los mecanismos por los que se producen los efectos beneficiosos clnicos observados. Se supone que la base racional de los mismo sea la liberacin de factores de crecimiento,
entre ellos el PDGF, por parte de las plaquetas
(30). Estos factores actan sobre las clulas que
responden a ellos unindose a receptores de
membrana. En el presente trabajo hemos analizado la expresin proteca de los receptores para el PDGF en el cartlago (articular y de crecimiento), hueso y msculo, durante el desarrollo
pre y postnatal y en la vida adulta. Los trabajos
disponibles sobre el tema son escasos. En condiciones de normalidad se ha detectado la presencia de PDGFR en diferentes tipos celulares
durante la formacin del hueso y el cartlago
(31,32); en el msculo se localiza en las uniones
neuromusculares (33) y miotendinosas (34).
Adems, el PDGF y sus receptores han sido implicados en la patogenia de diferentes enfermedades del sistema msculo-esqueltico como la
distrofia muscular humana (35), la progresin de
los osteosarcomas y condrosarcomas (36,37), o
de la artritis reumatoide (38).
8
12
en el tratamiento de algunas patologas osteocondrales (29). No obstante, el suero plaquetario, que supuestamente contiene elevadas cantidades de PDGF, es capaz de inducir proliferacin
de los condrocitos humanos en cultivo, pero bloquea su diferenciacin ya que reduce los niveles
de colgeno II y otros componentes de la matriz
extracelular (46).
En nuestro trabajo hemos encontrado clulas
inmunorreactivas para el PDGFR y PDGFR
en el msculo esqueltico, tanto en el desarrollo como en la vida adulta. Sobre la base de criterios topogrficos y morfolgicos hemos identificado tales clulas como clulas satlites y/o
clulas troncales (47). Dichas clulas responden
al PDGF (48) y son las responsables de la regeneracin del msculo esqueltico. Por tanto, en
base a nuestros hallazgos, existen bases racionales para el empleo del PDGF en las patologas que requieran regeneracin muscular.
En conjunto, los resultados obtenidos en los
animales de experimentacin sugieren que el
PDGF, por medio de sus receptores, podra participar en la diferenciacin y maduracin de los
condrocitos tanto hacia tejido seo como hacia
cartlago articular; otro tanto puede afirmarse
del msculo esqueltico. Adems, la persistencia en los tejidos adultos de poblaciones celulares que potencialmente pueden responder al
PDGF hacen de este factor de crecimiento un
potencial factor terapeutico para las procesos
regenerativos del sistema msculo-esqueltico.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por una beca
de la FUNDACIN MAPFRE MEDICINA (2004).
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