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UT5. EXTRACCIN, PURIFICACIN Y DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS.

INDICE:
1. INTRODUCCIN.
2. PREPARACIN DE DNA
3. PREPARACIN DE RNA

1. INTRODUCCIN.
El DNA, RNA y protenas son la materia prima del trabajo en biotecnologa. Estas Biomoleculas
tienen diferentes propiedades que facilita su separacin.
-

DNA: es un biomolcula cargada negativamente. No se degrada fcilmente.


RNA: es una biomolcula cargada negativamente. Es flexible qumicamente y tiene un
tamao mas corto.

Es mas complicado trabajar con RNA que con DNA, por la inestabilidad y por la abundancia de
enzimas RNAasas que la degradan, por lo que se debe trabajar en condiciones de asepsia y tratar
reactivos y materiales de trabajo con agua libre de RNAasas (tratamiento con DEPC).
Es importante extraer y purificar adecuadamente DNA para su aplicacin en diferentes tcnicas de
biologa molecular para analizar genomas complejos.
2. PREPARACIN DE DNA
El objetivo principal es obtener un conjunto de elevado peso molecular de DNA que contenga la
clula, virus o muestra de tejido.
Los objetivos de la extraccin son:
Caracterizacin de muestras: huellas dactilares
Clonacin de genes.
Diagnostico para evaluar la presencia de un gen integrado en el genoma de un organismo
transgnico.
Estudiar los efectos del genoma en la regulacin y expresin de genes. Ejemplo regiones
que definen una expresin en ciertos tejidos y rganos.
El procedimiento general se resumen en:

1)

Lisis celular y solubilizacin del DNA.

2) Mtodos qumicos o enzimticos para eliminar contaminantes como protenas, RNA y otras
biomoleculas.
3) Protocolos adaptados a las caractersticas de cada muestra.
2.1 LSIS CELULAR.
El objetivo es liberar las clulas de una muestra de un tejido, rompiendo este en partes muy
pequeas (mediante un mazo o mortero).
NOTA: el tejido congelado con Nitrgeno liquido antes de triturarlo para evitar la degradacin
enzimtica del DNA.
El procedimiento consiste en la:
Ruptura de la membrana celular y liberacin del contenido citoplasmatico mediante una solucin
que contiene:

Tampn de Tris-pH=6-8
EDTA: secuestra cationes divalentes del funcionamiento de las enzimas nucleadas.
NaCl: estabiliza las biomoleculas.
SDS-detergente inico: desnaturaliza las membranas celulares.
Protena K: ayuda a la lisis que digiere las protenas y libera el DNA de estructuras
eucromaticas e histonas.

2.2 PURIFICACION DEL DNA.


El objetivo principal es la separacin principal de las protenas y los polisacridos del DNA en
solucin.
Procedimiento:
1) Al lisado se le aade un volumen de: Fenol/Cloroformo/alcohol isoamlico F:C:I en
proporciones 25:24:1.
2) Se agita la mezcla para provocar la emulsin.
3) Se centrifuga para diferenciar las fases
4) Se transfiere la fase superior o acuosa a un nuevo tubo.
5) Se repite el proceso 2 o mas veces hasta que se compruebe que la interfase esta limpia.
6) El ltimo lavado se realiza con cloroformo: alcohol isoamlico 24.1, para obtener una
solucin acuosa sin restos de fase orgnica.
Precauciones o problemas planteados:
-

El fenol debe estar saturado con Buffer o agua, ya que el pH es importante para el
procedimiento (el pH del final debe ser neutro, si es acido el DNA tiende a solubilizarse en la
fase fenlica). Aparecen dos fases: superior de Buffer e inferior de fenol (desnaturaliza a las
protenas).
El cloroformo es similar al fenol como disolvente, sirve para estabilizar el limite entre fase
acuosa y orgnica que se forme.

2.3 PRECIPITACIN DEL DNA.


Los reactivos empleados son:
Sal de acetato amnico o de cloruro sdico que ayuda a neutralizar la carga negativa del
DNA y quitar el agua de las cadenas de DNA, eliminando el poder solvente.
Alcohol 100% (etanol o isopropanol), en alcohol menor del 65% tiende a permanecer
precipitado el DNA (nos aseguramos), en isopropanol se produce una precipitacin
selectiva.
El procedimiento consiste en:
1) A la solucin de DNA purificado se le aaden 0,2 vol de acetato amonico 7,5 mM y 3 vol de
etanol 100%.
2) Se mezclan suavemente por inversion,
3) Se centrifuga.
4) La muestra se incuba a -20C durante 15-30 min.
5) Retirar el sobrenadante, el pellet ( solido) del DNA se lava con etanol 70%.
6) Finalmente se quita el etanol.
7) Se deja secar al aire durante 10-30 minutos.
8) Se resuspende en tampon tris-EDTA de pH =8.
2.4 PURIFICACIN COMPLETA DE DNA CON KITS.
Existen muchas posibilidades de Kits para extraccin y purificacin de DNA:
- columnas para retener el DNA por dilucin diferencial.

Microesferas magnticas para aislar el DNA en solucin.

Procedimiento consiste en:


1) El tratamiento de un tejido con solucin de sal caotropica (modifica la estructura de
biomolculas) es interactiva con agua reduciendo su poder, cambia carga del DNA mediante
la unin a esferas de silice.
2) Lavado con solucin de etanol y agua para eliminar contaminantes.
3) El paso final es la elucin del DNA mediante agua o Buffer TE.
2.5 PREPARACIN DE DNA DE PLASMIDOS.
El fundamento consiste en el aislamiento de DNA de plasmidos que se basa principalmente en la
diferencia de tamaos entre el DNA genomico y el plasmidico.
Motivo: El DNA plasmdico es pequeo y tiende a volver a su forma inicial mas rpido y queda en
solucin. El DNA genmico es mas grande y complicado, tarda en renaturalizarse y precipita.
Mediante la centrifugacin se asla el DNA plasmidico en solucin. Existen dos procedimientos par
aislar el DNA plasmidico, y se diferencian en la naturaleza del paso de desnaturalizacion.
a) Minipreps de lisis por calentamiento:
Se emplea un Buffer STET (0,1 M NaCl, 10 mM tris-HCl pH=8. 1mM EDTA y Triton X-100 5%) y
Lisozima.
Pasos:
1) Incubacin a 100C durante 40 s
2) Centrifugacin: separar restos celulares de la solucin de DNA plasmidico.
3) Precipitacin segn otros protocolos.

b)

Minipreps de lisis alcalina:

El procedimiento consiste en:


1) Ruptura de clulas con detergente SDS y NaOH, desnaturaliza todo ( rompe enlaces H en
DNA)
2) Adicin de sal acida para un proceso de precipitacin de DNA genmico; el DNA plasmidico
queda en solucin.
3. PREPARACIN DE RNA
El RNA es muy inestable por su susceptibilidad a ser degradado por las enzimas RNAasas.
El procedimiento consiste en:
1) Eliminacin de las enzimas RNAasas:
- DEPC: Inhibe la accin mediante transformacin covalente de las histidinas. Se realiza en
cmara de extraccin.
- Cloroformo
- SDS
- Productos comerciales.

2) Aislamiento del RNA total mediante fenol y tiocianato de guanidina.


Es un mtodo parecido al DNA genmico, F:C.I. el fundamento se basa en que el DNA se
requiere en la fase orgnica y el RNA permanece en la acuosa. El tiocianato es
desnaturalizante y favorece la precipitacin del DNA y protenas contaminantes.
3) Lavado con C:I en proporcin 24:1 y precipitacin del RNA con solucion de acetato de
amonio e isopropanol.
4) El pellet (slido) se seca al aire.
5) Resuspender en agua libre de RNAasas ( agua con DEPC).
6) Evaluar la calidad del RNA mediante Electroforesis en geles de agarosa (el Buffer sin tris). El
patrn de electroforesis de RNA total se observan 2-3 bandas predominantes del RNA
ribosomal ms abundante y bandas tenues de RNAmensajeros. El RNAm tiene inters de
separacin por cromatografa de afinidad.

LABORATORIO VIRTUAL DE EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS: DNA.

Figura 1. Descripcin de Equipos, materiales y reactivos de extraccin y purificacin de Acidos Nucleicos,


DNA.

Figura 2. a) Extraccin de la muestra de DNA de la saliva b) Introducir el hisopo en el tubo Eppendorf para
su procesado

Figura 3. a) Aadir la solucin de lisis en el tubo Eppendorf b) introduccin el tubo Eppendorf con el
contenido de la lisis celular en el bao termosttico.

Figura 4. a) Adicin de solucin de sal concentrada para separar el DNA de las protenas en la muestra
recogida b) esquema del proceso de separacin de las cadenas de DNA de las protenas y otras sustancias.

Figura 5.a) Introduccin en la centrifuga para decantar las protenas y poderlas separar de nuestra
sustancia de inters, DNA b) Esquema grfico de distribucin de las sustancias de inters en la separacin y
purificacin del DNA.

Figura 6. a) Extraemos el sobrenadante de inters para purificarlo y concentrarlo b) Adicin de alcohol


isoproplico para purificar y concentrar el DNA, sustancia de inters.

Figura 7. a) Agitacin de la disolucin con el reactivo de alcohol para homogeneizar la mezcla b)


insolubilizacion del DNA, en el alcohol y posterior decantacin con centrifuga.

Figura 8. a) Introduccin de la disolucin problema en la centrifuga para separa por decantacin el DNA,
que quedara fijado en el pellet b) Extraemos el tubo Eppendorf con la sustancia de inters en pellet, slido y
el sobrenadante lo eliminaremos.

Figura 9. a) Extraccin del sobrenadante que no interesa b) La sustancia en el pellet, DNA, permite un
proceso de secado para reservarla a otros anlisis posteriores para conservarla..

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