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INDICE:
1. INTRODUCCIN.
2. PREPARACIN DE DNA
3. PREPARACIN DE RNA
1. INTRODUCCIN.
El DNA, RNA y protenas son la materia prima del trabajo en biotecnologa. Estas Biomoleculas
tienen diferentes propiedades que facilita su separacin.
-
Es mas complicado trabajar con RNA que con DNA, por la inestabilidad y por la abundancia de
enzimas RNAasas que la degradan, por lo que se debe trabajar en condiciones de asepsia y tratar
reactivos y materiales de trabajo con agua libre de RNAasas (tratamiento con DEPC).
Es importante extraer y purificar adecuadamente DNA para su aplicacin en diferentes tcnicas de
biologa molecular para analizar genomas complejos.
2. PREPARACIN DE DNA
El objetivo principal es obtener un conjunto de elevado peso molecular de DNA que contenga la
clula, virus o muestra de tejido.
Los objetivos de la extraccin son:
Caracterizacin de muestras: huellas dactilares
Clonacin de genes.
Diagnostico para evaluar la presencia de un gen integrado en el genoma de un organismo
transgnico.
Estudiar los efectos del genoma en la regulacin y expresin de genes. Ejemplo regiones
que definen una expresin en ciertos tejidos y rganos.
El procedimiento general se resumen en:
1)
2) Mtodos qumicos o enzimticos para eliminar contaminantes como protenas, RNA y otras
biomoleculas.
3) Protocolos adaptados a las caractersticas de cada muestra.
2.1 LSIS CELULAR.
El objetivo es liberar las clulas de una muestra de un tejido, rompiendo este en partes muy
pequeas (mediante un mazo o mortero).
NOTA: el tejido congelado con Nitrgeno liquido antes de triturarlo para evitar la degradacin
enzimtica del DNA.
El procedimiento consiste en la:
Ruptura de la membrana celular y liberacin del contenido citoplasmatico mediante una solucin
que contiene:
Tampn de Tris-pH=6-8
EDTA: secuestra cationes divalentes del funcionamiento de las enzimas nucleadas.
NaCl: estabiliza las biomoleculas.
SDS-detergente inico: desnaturaliza las membranas celulares.
Protena K: ayuda a la lisis que digiere las protenas y libera el DNA de estructuras
eucromaticas e histonas.
El fenol debe estar saturado con Buffer o agua, ya que el pH es importante para el
procedimiento (el pH del final debe ser neutro, si es acido el DNA tiende a solubilizarse en la
fase fenlica). Aparecen dos fases: superior de Buffer e inferior de fenol (desnaturaliza a las
protenas).
El cloroformo es similar al fenol como disolvente, sirve para estabilizar el limite entre fase
acuosa y orgnica que se forme.
b)
Figura 2. a) Extraccin de la muestra de DNA de la saliva b) Introducir el hisopo en el tubo Eppendorf para
su procesado
Figura 3. a) Aadir la solucin de lisis en el tubo Eppendorf b) introduccin el tubo Eppendorf con el
contenido de la lisis celular en el bao termosttico.
Figura 4. a) Adicin de solucin de sal concentrada para separar el DNA de las protenas en la muestra
recogida b) esquema del proceso de separacin de las cadenas de DNA de las protenas y otras sustancias.
Figura 5.a) Introduccin en la centrifuga para decantar las protenas y poderlas separar de nuestra
sustancia de inters, DNA b) Esquema grfico de distribucin de las sustancias de inters en la separacin y
purificacin del DNA.
Figura 8. a) Introduccin de la disolucin problema en la centrifuga para separa por decantacin el DNA,
que quedara fijado en el pellet b) Extraemos el tubo Eppendorf con la sustancia de inters en pellet, slido y
el sobrenadante lo eliminaremos.
Figura 9. a) Extraccin del sobrenadante que no interesa b) La sustancia en el pellet, DNA, permite un
proceso de secado para reservarla a otros anlisis posteriores para conservarla..