TINCION DE LAS BACTERIAS:

Las clulas bacterianas, para poder ser vistas con un microscopio de luz, normalmente se
fijan y se tien. La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como cristal
violeta, azul de metileno y fucsina bsica, pero tien probablemente con colorantes cidos, como
eosina.
En las clulas viejas se observa a menudo una tincin irregular, con diferenciacin de una
pocas clases de bacterias se tien uniformemente sin diferenciacin de la estructura interna, la cual
puede demostrase a menudo en clulas procedentes de tejidos de mamferos.
La marcada afinidad por colorantes bsicos indica que el protoplasma es acido y contiene
cantidades inusualmente grandes de cidos nucleicos distribuidos mas o menos uniformemente; los
cidos y acido desoxiribonucleico constituyen de 5 a un 30 % del peso seco de la clula
microbiana.
TECNICA DE TINCION
Teir es una reaccin de intercambio de iones de colorante a lugares activos de la superficie
o interior de las estructuras de la clula.
Para llevar a cabo una tincin se requiere lo siguiente:
-

Realizacin de un frotis
Coloracin
Decoloracin
Lavado
Coloracin de contraste (es al final)
Observacin al microscopio
TINCION DE GRAM:

Por medio de este mtodo es posible dividir las bacterias en 2 grupos: Gram (+) y Gram (-).
Esta coloracin tiene la capacidad de retencin de algunas bacterias del colorante primario
o de secundario.
Al colocar los grmenes con cristal o violeta de genciana y aadirles una solucin dbil de
yodo (lugol), se combinan con algunos componentes de la clula bacteriana que son retenidas por
la membrana citoplsmica cuando se trata con alcohol, otros en cambio liberan rpidamente el
colorante por lo que no aparecern a la visin microscpica o no ser que contra tieran con algn
otro tinte biolgico como la safranina o la fucsina. Por lo tanto, los microorganismos que
conservan el cristal o la violeta de genciana se observan de azul (grampositivas). Las
gramnegativas muestran un color que corresponde al utilizado en el contraste, que en este caso
seria rojo para la fucsina.
* Para teir paredes se utiliza 2 colorantes:
1.
-

Colorante primario.
Cristal violeta (azul)[colorante bsico, que al sumar sus cargas es positivo]
Fijador del colorante (mordente) [ se utiliza el lugol]
Alcohol - Acetona

2. Colorante Secundario.
- Safranina (rojo)
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

 Si la bacteria se tie de color azul es Gram ( + ).

Si la bacteria se tie de color rojo es Gram ( - ).
TECNICA:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)

Preparar el frotis y fijarlo al calor

Colocar la preparacin fijada con la solucin de cristal violeta durante 1 min.
Lavar con solucin yodada (lugol)
Cubrir el frotis con lugol durante 1 min.
Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre mas cristal violeta.
Lavar con agua
Contrastar con la solucin de safranina por 1min.
Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersin.
METODO DE ZIEHL NEELSEN

Para la tensin del bacilo tuberculoso, lepra y micobacterias

* Colorantes:
- Fucsina fenicada
- Azul de metileno (colorante de contraste)
* Decolorantes
- Alcohol-cido
- Agua corriente
TECNICA
a) Cubrir la lamina previa fijacin de la preparacin por calor con la Fucsina Fenicada de
Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva, durante tres a cinco
minutos ( 7 min.), respondiendo constantemente el colorante para evitar la desecacin.
b) Lavar con agua corriente.
c) Decolorar con el alcohol-acido hasta que no haya mas salida de color (2 min.).
d) Lavar con agua corriente.
e) Contrateir con la solucin de azul de metileno por un minuto.
f) Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersin.
Los microorganismos pertenecientes al genero Mycobacterium son designados acidorresistentes a
causa de que una vez teidos por un mtodo conveniente retienen al colorante y no son
decolorados por accin de los cidos. Los grmenes acidorresistentes y de la lepra) aparecen de
color rojo y los no acidorresistentes de azul, al igual que las clulas, leucocitos, etc. Del material
en estudio.

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

BIOQUIMICAS
SLIDOS INCLINADOS:
- Citrato de Simons: Esta prueba sirve para
determinar si un organismo es capaz de utilizar
citrato como nica fuente de carbono y compuestos
amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su
metabolismo, provocando una alcalinizacin del
medio. Entre las enterobacterias caractersticas se
dan los gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con
esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de
Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y
fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de
bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato
podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la
eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser
aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
- Kligler- TSI (Agar de Hierro y
Triple Azcar): Color Naranja.
Contiene glucosa y lactosa,
determina fermentacin de lactosa
y glucosa produciendo gas y H2S.
-

Fermentacin de la glucosa:
Fondo amarillo.
Fermentacin de la lactosa:
Superficie amarilla.
Produccin de gas: Burbuja de
gas en el medio.

Produccin de cido sulfhdrico (H2S): Precipitado de color negro.

- Urea de Christensen: Determina la capacidad

de un organismo de desdoblar la urea formando
dos molculas de amoniaco por accin del
enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es
caracterstica de todas las especies de Proteus y
se usa sobre todo para diferenciar este gnero
de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.
- Positivo: Cambia de amarillo a rosa mexicano.
Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen
actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

- LIA (Agar de Hierro y Lisina): Determina

la descarboxilacin de la lisina y la
desaminacin de la lisina.
pH cido: amarillo
pH alcalino: prpura
- Descarboxilacin de la lisina:
Positiva: Fondo del tubo
(alcalinizacin)

prpura

Negativo: Fondo del tubo amarillo

- Desaminacin de la lisina:
Positiva: Superficie del tubo rojo-vino (Si no hay cambio en el medio, es negativa)
- Determinacin de gas a partir de glucosa y produccin de de H 2S.
LQUIDOS:
- Prueba del Indol: Mediante esta prueba se
detecta la liberacin de indol en un cultivo
bacteriano. Dicha liberacin se debe a la
degradacin del aminocido triptfano mediante
el enzima triptofanasa. Se hace en MIO o en El
caldo Peptonado.
Las ms convenientes son Escherichia coli
(indol+) y todas las especies de Klebsiella
(indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al
aadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs,
se producir un anillo de color rojo en la
superficie del caldo y la prueba ser considerada
positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es
negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.
- Malonato de Ewing: Es un medio lquido de color verde brillante-negrusco.
- Positivo: El medio cambia de verde a Azul-negrusco.
SEMI-SLIDOS:
- MIO (Movilidad, Indol, Ornitina): Determina la movilidad de la bacteria, su capacidad
de descarboxilar la ornitina y la produccin de indol (por picadura): cido: Amarillo,
Alcalino: Prpura o morado.
-Movilidad:
Positiva:
Medio
turbio,
crecimiento
Negativa: Crecimiento a lo largo de la picadura.

en

todo

el

medio.

- Ornitina: Positiva: Se presenta en el fondo color alcalino. Negativa: Fondo amarillo.

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

PRUEBA

PRUEBAS BIOQUIMICAS:
RESULTADO POSITIVO

Catalasa
Citrato
Fenilalanina desaminasa
Indol
Lactosa
Manitol

Aparicin de burbujas de O2
Medio de color azul
Aparicin de color verde oscuro
Aparicin de un anillo rojo
Colonias de color violeta
Aparicin de color amarillo

Movilidad

Difusin a partir de la lnea del inculo

Nitratos
Oxidasa
Rojo de Metilo
Ureasa
Voges-Proskauer

Cambio de color (rojo oscuro)

Aparicin de color azul
Aparicin de color rojo
Aparicin de color rojo
Aparicin de color rojo

Coagulosa: Inhibe notablemente la actividad bactericida del suero normal para los
Estafilococos, pero el mecanismo del efecto es incierto, al parecer no guarda relacin
con el metabolismo respiratorio de las bacterias.
Vogues Proskaver: Es una prueba cualitativa de la presencia de acetilmetil corbinol
entre los productos finales de la fermentacin de la celulosa.
Al quedar en presencia del lcali, el acetilmetil corbinol se oxida a diacetil que a su vez
reacciona con algn constituyente de la peptona dando color rosado.
Cuando se produce acetilmetil carbinol, la cepa bacteriana es V P Positiva y cuando
no, es V- P negativa
Prueba R M (Rojo Metilo): Es una determinacin de pH de caldo de cultivo de
glucosa, despus de incubacin por 2 a 4 das.
Se aade el indicador al cultivo incubado y se dice que la prueba es positiva cuando la
acidez acumulada es suficiente para vivir el indicador al rojo, y negativo cuando el
indicador permanece amarillo; un color rojo indica que el pH ha disminuido a 4,5 o
menor.
Prueba "Catalasa": La enzima descompone el perxido de hidrgeno H 2O2
Mtodo: Aadir una gota de H2O2 a un cultivo denso y buscar burbujas (O2)
Utilizacin ms frecuente: Bacillus (+) de Clostridium (-) estreptococcus (-) de
micrococcus (-) staphilococcus (+)

Prueba de la B Galactosidasa (ONPG): El Ortomitrofenil B galactsido (UNPG) es

un sustrato artificial para la enzima. Cuando se hidroliza, si forma nitrofenol (amarilla)
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

Mtodo: Incuba, una suspensin pesada de un cultivo lisado en ONPG buscar en color
amarillo
Utilizacin Mas Frecuente: Litrobacter y Arizona (+) de Salmonella (-). Identificacin de
algunas especies de Shigella y Pseudomonas.
Prueba: Licuefaccin de la gelatina: Muchas hidrolasas hidrolizan la gelatina y
destruyen el gel.
Mtodo: Incubar un caldo de 12% de gelatina. Enfriar para comprobar la formacin de
gel. Si se hidroliza la gelatina, el tubo permanece lquido cuando se enfra.
Utilizacin mas frecuente: Ayuda a la identificacin de serratia, pseudomonas,
flavobacterium, clostridium.
Prueba: Oxidasa: El citocromo xido al aceptar de electrones artificial: tetrametil (o
dimetil) p fenilendiamina
Mtodo: Caldo o agar. Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse
sumergiendo la placa en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones.
Utilizacin mas frecuente: Separa Neisseria y Moraxella (+) de Acinetobacter (-). Separa
enterobacterias (todas -) de pseudomonas (+) ayudar a la identificacin de aeromonas
(+).
Prueba: "Ureasa: La urea (H2N CO NH2) se escinde en 2NH3 + CO2
Mtodo: Medio con un 2% de urea y rojo fenol como indicador. La liberacin de amonio
eleva el pH, intenso color rojo rosado.
Utilizacin mas frecuente: Distinguir Klebsiella (+) de Escherichia (-) Distinguir Proteus
(+) de Providencia (-).
Prueba: "Salmonella": Se hace en un pre-enriquecimiento de caldo nutritivo durante 24
horas, y esto se recomienda para alimentos desecados liofilizados. Se toma la muestra y
se aaden 225 ml de caldo tetrationato en uno de los fraseo y en el otro la misma
cantidad de caldo selenito cistena. Si los alimentos presentan un alto contenido en
grasas se aade adems 6 ml de la solucin al 10% de tergitol nro 7 (sulfato heptadecilo
sdico). Despus de la incubacin se siembra por estras, a partir de cada uno de los
cultivos de enriquecimiento, una placa de agar salmonella shiguella.
La salomnella sobre agar 55 suelen ser incolora o transparente o marrn claro, la
salmonella sobre agar verde brillante pueden ser verdes y transparentes.
Fundamentos de la produccin de H2S: Algunos microorganismos tienen enzimas que
desprenden el tomo de azufre de los aminocidos sulfurados, el cual es luego reducido
con hidrgeno (de los substratos), para formar cido sulfhdrico, en este proceso los
microorganismos cumplen con la actividad que puede catalogarse como fermentacin
proteica, que es la produccin de cido sulfhdrico.

EXUDADO CERVICO-VAGINAL
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

FASE PRE-ANALTICA
Instrucciones para la toma de muestras:
1.- No haber tenido relaciones sexuales 3 das antes del estudio.
2.- Con aseo vaginal externo (baada), sin duchas o irrigaciones vaginales.
3.- No estar menstruando.
4.- Presentarse con falda o vestido, sin pantimedias.
5.- Sin haber aplicado ningn medicamento por va vaginal por lo menos en los tres ltimos das y
sin tratamiento con antibiticos tomados o aplicados en los ltimos diez das antes de su cita.
Toma de muestra:
1.- Se coloca la paciente en posicin ginecolgica.
2. Se identifican los tubos sol. Salina y sol. Stuart y un frotis.
3.- La muestra se toma introduciendo el espejo vaginal en la vagina y con dos hisopos se toma del
cuello y del cerviz uterino, uno de ellos se introduce en el medio de Stuar y con el otro se hace un
frotis para despus introducirlo en la sol. Salina.

TUBO GERMINATIVO: Se utiliza para identificar Candida albicans y Candida sp. En el Agar
Biggy se observan las colonias de color caf (Candida albicans) y de color blanco (Candida sp.).
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

Mtodo:
1.- Se le agrega a un tubo de ensaye 1ml de suero.
2.- Del agar Biggy se toma con un aplicador ( hisopo) una colonia de
posible Candida y se hace una suspensin en el tubo de suero.
3.- Se incuba durante 3 horas en la estufa bacteriolgica a 37 C.
4. Con la suspensin se hace una preparacin en fresco y se observa a
10X y 40X.
NOTA: Candida albicans se ve como con un flagelo.

UROCULTIVOS
FASE PRE-ANALTICA
La muestra de orina deber ser la primera de la maana. Antes de orinar lavarse
perfectamente los genitales externos con abundante agua y jabn. Desechar la primera arte de la
orina en la taza del bao, el chorro medio recolectarlo en un frasco estril (proporcionado por el
laboratorio) y taparlo inmediatamente. En los bebes se coloca una bolsa recolectora
(proporcionado por el laboratorio) con previo aseo de los genitales. Presentar se al laboratorio lo
ms pronto posible. En caso de estar menstruando no recolectar la muestra.
NOTA: Para la toma bacteriolgica el paciente debe presentarse sin tomar ni aplicarse antibiticos
diez das antes de su cita.
Toma de muestra:
- Despus de que el paciente llega al laboratorio con las instrucciones adecuadas para la
toma del urocultvo se le proporciona un paquete de 3 gasas estriles adicionadas, una con
isodine, una con agua y la otra permanece seca.
- Se le pide que se haga un aseo con las gasas: primero que se limpie su aparato genital con
la de isodine, despus con la que contiene agua y por ltimo con la gasa seca; se la pide que
deposite el chorro medio en el frasco estril, que es el que va a entregar a la persona
encargada de la toma de muestra.
FASE ANALTICA:

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

Proceso de la muestra: Se usa el mtodo del asa calibrada en el cual se utilizan asas calibradas de
1:1000.
- Con el asa calibrada se toma una muestra de orina y se comienza a sembrar en los medios
de Agar Sangre y Mac Conkey.
- Los medios se incuban 24 horas a 37C.
- Si hay crecimiento de de bacterias se procede a identificarlas mediante las pruebas antes
indicadas para determinar el tipo de bacterias.
- Contar el nmero de colonias.

FASE POST-ANALTICA:
Se cuentan las colonias UFC/ml del microorganismo identificado.
- Ejemplo: 90000 UFC/ml de E. coli
Ms de 100000 UFC/ml de Proteus mirabilis.
Patologas:
- Infeccin de vas urinarias.
- Insuficiencia renal.
- Sepsis (invasin de bacterias en todo el organismo).
- Diabetes Mellitus

CULTIVOS
Se incuban durante 24 horas a 37 C en la estufa bacteriolgica, para su posible observacin.
Los cultivos duran de 5-6 das para dar un posible resultado.
Faringeos: Se siembra solo en Agar Sangre de Carnero para identificar las hemlisis (alfa
y beta).

HEMOCULTIVO
-

Es un examen que permite determinar si microorganismos como bacterias, hongos y

micobacterias estn presentes en la sangre.
Se realiza cuando hay sospecha de infeccin en la sangre (bacteriemia o septicemias),
debido a sntomas tales como fiebre, escalofros o presin sangunea.
El cultivo de sangre ayuda a identificar el origen de la infeccin.
Los resultados positivos generalmente significan que los microorganismos estn presentes
en el torrente sanguneo.

FLORA NORMAL
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

La composicin de la flora normal vara de un individuo a otro. Algunos miembros de la

flora normal pueden transformarse en patgenos si se alteran las condiciones fisiolgicas del
individuo, se altera la virulencia del organismo o se introducen en vas estriles.
La flora normal es beneficiosa ya que impide la localizacin por otros microorganismos patgenos
y producen algunos nutrientes esenciales para el organismo (por ejemplo: Vitamina K, producida
por la flora del intestino).
Flora Normal de la Vagina:
En mujeres adultas:
- Lactobacilos
- Difteroides
- Anaerobios
Flora Normal en la Piel:
- Staphilococus epidermis coagulasa (-).
- Staphilococus aureus.
- Difteroides
- Coynebacterium sp.
- Propionibacterium
Flora Normal de la Boca y la Garganta:
- Streptococus mitis y salivarius.
- Difteroides.
- Anaerobios.
- Staphilococus epidermis coagulasa (-).
- Espiroquetas.
Flora Normal de Nasofaringe:
- Staphilococus epidermis coagulasa (-).
- Staphilococus aureus.
- Steptococus pneumoniae y pyogenes
- Hemophylus.
- Neisseriae.
Flora Normal del Estoma:
Usualmente estril, pero se puede encontrar:
- Campylobacter jejuni
- Helycobacter pylori
Flora Normal del I. Delgado:
- Lactobacilus
- Anaerobios Gram. (-).
- Enterobacterias.
- Mycobacterias
Flora Normal del I. Grueso:
- Anaerobios estrictos: Bacteroides, sp: cocos
- Gram. (-) Anaerobios, Clostridium
- Enterobacterias (E. coli), y Enterococos.
Sensibilidad antimicrobiana: MUELLER HINTON
T.L.C. Andrade Garcs Pablo

10

BHI: Infusin Hgado Cerebro, es una bioqumica para la identificacin de bacterias.

SAL Y MANITOL
Estafilococos: Grupos semejantes a racimos de uvas. Medios slidos, Gram. positivos.
1) Estafilococos Aureus (Patgenos)
2) Estafilococos Epidermidis (Raramente patgenos)

AGAR SANGRE
ESTREPTOCOCOS: Se presentan en cadenas largar o cortas. Gram. Positivos.
- Tipo alfa hemoltico: Produce un halo verdoso alrededor de la colonia.
- Tipo beta hemoltico: Donde las colonias se rodean de una zona clara y bien definida de
hemlisis.
- Tipo alfa primaria: En la cual las colonias se rodean de una zona de hemlisis facial.
- Tipo no hemolticas o tipo Gama: Colonias que ofrecen sin mostrar alteracin al medio.

NEUMOCOCOS: Se presentan en parejas y en algunas veces en cadenas cortas, son cocos de

forma oval o lanceolada, Gram. Positivos.

CLULAS CLAVE: Las clulas clave en un exudado vaginal son Gardnerella vaginalis,
cuando se sospecha de clulas clave en una colonia, se hace una prueba: en un tubo con sol. Salina
se la agregan las colonias que se desean identificar y una gota de KOH (Hidrxido de Potasio al
10%), esta suspensin presentar un olor a aminas (como a pescado).

COPROCULTIVO: Para los cultivos de heces se inocula la muestra en caldo de Tetrationate,

despus se la agrega Yodo para tetrationate para matar la flora normal (adems tiene los nutrientes
necesarios para Salmonella), Se incuba durante 24 horas a 37 C y despus de eso se resiembra en
Verde Brillante, donde se va a desarrollar la Salmonella que se vern como colonias de color rojo.

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

11

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

12

CALIBRACIN DE KHLLER
Parte importante de la observacin de un frotis es la iluminacin adecuada del microscopio, que
nos permitir un mayor visibilidad de los microorganismos de importancia a observar, para dar
resultados ptimos y confiables. Adems de esta iluminacin nos garantiza que la luz este en el
centro de nuestro condensador y no nos dae la vista.
PROCEDIMIENTO:
1. Subir la platina con el tornillo macromtrico y afinar la imagen con el tornillo
micromtrico, enfocar con el objetivo de 10X.
2. Cerrar los diafragmas de iris que se encuentran en la parte baja del condensador.
3. Cerrar el diafragma de campo que se encuentra en el pie del microscopio.
4. La imagen que se observar es una figura geomtrica de 8 lados iguales (octgono),
la cual se debe encontrar en el centro del campo, al cerrar y abrir el diafragma de
campo sus lados se deben ir abriendo y cerrando uniformemente, de no ser as se
tiene que centrar el octgono con los tormillos del condensador que estn en los
extremos de ste, con los cuales lograremos enfocar la figura geomtrica en el
centro del campo.
5. Terminada la calibracin, abrir los diafragmas de campo e iris.
6. Para obtener una lectura de laminillas ptima en iluminacin, se recomienda
realizar esta calibracin cada semana.

ANTIBIOGRAMA
Gram. Negativos (-):
CF- Cefalotina
30mcg
CRO- Ceftriaxona 30mcg
AMP- Ampicilina 10mcg
SXT- Sulfametoxazol 25mcg
CTX- Cefotaxima 30mcg
NET- Netilmicina 30mcg
PEF- Pefloxacina
5mcg
NF- Nitrofurantoina 300mcg
CL- Cloranfenicol 30mcg
AK- Amikacina 30mcg
GE- Gentamicina 10mcg
CB- Carbenicilina 100mcg
Gram. Positivos (+):
CF- Cefalotina
30mcg
E- Eritromicina 15mcg
AMP- Ampicilina 100mcg
SXT- Sulfametoxazol 25mcg
CTX- Cefotaxima 30mcg
CXM- Cefuraxima 30mcg
PEF- Pefloxacina
5mcg
PE- Penicilina 10 u
CAZ- Ceftazidima 30mcg
TE- Tetraciclina 30mcg
GE- Gentamicina 10mcg
DC- Dicloxacilina 1mcg

T.L.C. Andrade Garcs Pablo

13