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Ao de la consolidacin del Mar Grau

Microbiologa farmacutica I
UANCV - EAP:FYB

UNIVERSIDAD ANDINA NESTOR CACERES


VELASQUEZ

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD


ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y
BIOQUIMICA
MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA I (PRACTICA)

PRACTICA N 07
MEDIOS DE CULTIVO
DOCENTE: Q.F. Fredy Catacora Yucra

ALUMNO: Ever Nilson Choque Tiacacala

GRUPO DE PRACTICAS: 7.30 am 9:30 am

SEMESTRE: VII

Juliaca Puno Per

Microbiologa farmacutica I

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PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION

OBJETIVOS:
-

Conocer, diferenciar, clasificar y preparar (pesada, preparacin


esterilizacin y conservacin) los diferentes medios de cultivo
utilizados en el laboratorio de microbiologa.
Preparar un medio de cultivo completo aadiendo cada uno de sus
suplementos.
Conocer los medios de cultivo de uso general, diferencial y selectivo.

FUNDAMENTOS TERICOS

Medios de Cultivo

Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de cultivar y


mantener microorganismos en un laboratorio, y esto slo es posible si se
dispone de los medios de cultivo adecuados.

Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes, en los que


crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto
de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificacin y
llevar a cabo estudios complementarios.
Los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los
microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos, analizar agua y
alimentos, en microbiologa industrial y otras actividades.
Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energa,
carbono, nitrgeno, fsforo, azufre y varios minerales, la composicin
precisa de un medio adecuado depender de la especie que se quiere
cultivar, porque las necesidades nutricionales varan considerablemente. El
conocimiento del hbitat normal de un microorganismo es a menudo til
para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus necesidades de
nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza frecuentemente
para seleccionar y cultivar microorganismos especficos o para facilitar la
identificacin de una especie en particular. En estos casos, la funcin del
medio estar tambin determinada por su composicin.

Agentes gelificantes.

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El agar es un polmero sulfatado de azcares, obtenido de algas


Consistencia

Lquidos
Slidos
Semislido
Complejos

Composicin

Sintticos
Semisintticos

Enriquecimiento o Multiplicacin
Selectivos o Inhibidores
Enriquecidos
Utilizacin o funcin

Diferenciales
Identificacin
Transporte

marinas,
compuesto principalmente por D-galactosa, 3,6-anhidro-Lgalactosa y cido D-glucurnico. Es un buen agente solidificador porque,
una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una
temperatura de 40 a 42 c, sin endurecerse, y no fundir de nuevo hasta
que no se alcance una temperatura de 80 a 90C. Es tambin excelente
porque la mayora de los microorganismos no pueden degradarlo. Puede
utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar
comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares
purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente
la mitad de todo el agar que se produce se utiliza en trabajo microbiolgico,
por lo que es importante la ausencia de metales txicos.
La gelatina es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso
est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (licua a temperatura
ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es
la temperatura ptima de crecimiento para muchos microorganismos.

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Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios,


pero los ms importantes son aquellos que se basan en:

1 Segn su consistencia
Medios Lquidos.
Son los que se presentan en este estado, denominndose por ello
caldos. Contienen los nutrientes antes citados, con adicin de algn
tampn, capaz de mantener el pH adecuado. Se utiliza fundamentalmente
cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una
determinada concentracin.
Ejemplos: caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada, etc.

Medios Slidos.
Se prepara aadiendo un agente gelificante a un medio lquido
determinado. Los ms usados son gelatina y agar.
Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de
Petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones fsico-qumicas
son similares a las de los medios lquidos. Pero, a diferencia de ellos,
presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la
cantidad de inculo est suficientemente diluida. En este caso se puede
observar la existencia de colonias separadas unas de otras, y cada una
constituye un clon (conjunto de bacterias que provienen de una clula
madre, con el mismo patrimonio hereditario y las mismas caractersticas
fisiolgicas).

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Ej.: agar nutritivo, agar EMB, CLDE y todos los medios de aislamiento
primario y de identificacin.

Medios Semislidos.
Se preparan a partir de medios lquidos, agregando un agente
solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos.
Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias.
Ej.: agar cepa, SIM, medios base para utilizacin de aminocidos.

2 Segn su composicin.
Medios complejos.
Son aquellos que contienen ingredientes cuya composicin no es
exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante.
Adems, no se conoce exactamente la proporcin de cada uno de sus
componentes. Esto tiene ciertos inconvenientes en condiciones
experimentales, donde la reproducibilidad no podr ser exacta. En la
prctica estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.
Ejemplo: caldo nutritivo.
Medios Sintticos
Son aquellos que poseen exclusivamente componentes qumicos
definidos (se conocen todos los componentes) disueltos en agua destilada,
donde la proporcin de cada uno de sus componentes es conocida
exactamente. Entre ellos se encuentran los medios mnimos, pues en ellos
se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria determinada, con muy
pocos nutrientes. Los medios definidos son ampliamente usados en
investigacin, pues a menudo se quiere conocer qu est metabolizando el
microorganismo experimental.
Ejemplos: medio basal de sales y una fuente de carbono determinada.

Medios Semisintticos.
Cuando alguno de sus componentes no tiene composicin definida. En
estos casos, se aaden factores de crecimiento bajo la forma de un extracto
orgnico complejo, como por ejemplo, extracto de levaduras, peptona cono
fuente de nitrgeno, glucosa como fuente de carbono.

3 Segn su utilizacin o funcin.

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Medios de Enriquecimiento.
Se basan en la libre competencia por los sustratos. Son siempre
lquidos que favorecen o permiten la multiplicacin de unas bacterias,
inhibiendo parcialmente la de otras. Pueden ser: de enriquecimiento
propiamente dichos, que se basan en las propiedades metablicas del
microorganismo, o de enriquecimiento selectivo, en cuyo caso se agrega
un agente de seleccin que puede ser, un colorante, un antibitico, etc. Este
agente de seleccin no favorece el desarrollo del microorganismo a
enriquecer, sino que inhibe a la flora acompaante.
Ejemplos:

agua peptonada alcalina, se utiliza para V cholera (donde el pH


alcalino inhibe a todas las enterobacterias menos al Vibrio)
caldo selenito, acta inhibiendo el desarrollo de casi todas las
enterobacterias menos de Salmonella y Shigella.
caldo tioglicolato
caldo infusin cerebro corazn (BHI)

Medios Selectivos (o Inhibidores)


Pueden ser slidos o lquidos, a los que se les agrega uno o ms
agentes de seleccin. Favorecen el crecimiento de microorganismos
particulares, en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones fsicas del medio o aadiendo compuestos qumicos, que sean
nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Los medios
inhibidores pueden considerarse una variante ms restrictiva de los medios
selectivos. Las posibilidades de seleccin son infinitas y existen decenas de
medios selectivos especiales disponibles.
Ejemplos:
- Agar Endo, eosina azul de metileno (EMB o Levine), agar MacConkey. (Las
sales biliares o colorantes como la fucsina bsica y el cristal violeta,
componentes de estos medios, favorecen el crecimiento de bacterias
gramnegativas, al inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas).
- Agar salmonella-shigella (SS): medio selectivo para recuperar Salmonella
spp y Shigella spp. (Las sales biliares, el citrato de sodio y el verde brillante
son inhibidores de los grampositivos y de algunos gramnegativos. Las
posibles colonias de Shigella aparecen amarillas y las posibles de
Salmonella aparecen negras).
- Agar Tayer Martin: el medio base es agar chocolate con agregado de
antibiticos para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes:
- trimetroprima para inhibir Proteus spp y otros gramnegativos,
- vancomicina para inhibir grampositivos y
- nistatina para inhibir levaduras.
Medios Diferenciales.
Son siempre slidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son
medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso

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permiten una identificacin tentativa segn las caractersticas biolgicas del


microorganismo. A estos medios se les agrega, por ejemplo, un indicador de
pH que permite diferenciar a microorganismos que fermentan un
determinado hidrato de carbono.
Ejemplos:
-

Eosina azul de metileno (EMB- Levine): permite diferenciar bacilos


gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las
bacterias no fermentadoras dan colonias transparentes y las
fermentadoras rosa o rojas, y E coli da colonias con brillo verde
metlico. Estas coloraciones son producidas por la presencia del
indicador de pH eosina amarilla y del colorante azul de metileno (ste
inhibe el desarrollo de la mayora de los gram positivos y junto a la
eosina sirve como indicador de fermentacin ya que a pH cido los
colorantes precipitan).
El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo, contiene
lactosa y colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa
aparecen de color rosa a rojo y son fcilmente distinguibles de las no
fermentadoras.
Agar MacConkey-sorbitol. Es un medio diferencial que permite
sospechar en 24 hs la presencia de E coli O157 en materia fecal, dado
que esta especie no fermenta el sorbitol.
El agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) sirve para diferenciar
patgenos entricos. La mayora de los no patgenos fermentan
lactosa, sacarosa o xilosa y producen colonias amarillas. Shigella spp.
no fermenta estos azcares y da colonias rojas. Salmonella spp y
Edwarsiella spp fermentan xilosa pero producen lisina decarboxilasa
produciendo cadaverina que neutraliza los cidos de la fermentacin
y dan colonias rojas con centros oscuros porque producen cido
sulfrico.
Agar cistena lactosa deficiente en electrolitos (CLDE), contiene
lactosa y permite diferenciar las bacterias fermentadoras de lactosa
(colonias amarillas) de las no fermentadoras (colonias incoloras).

Medios Enriquecidos.
Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (adems de las
sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores
indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes). Pueden
ser lquidos o slidos. En estos medios no crece un determinado grupo de
bacterias sino todas. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u
otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, lquido
asctico, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir
suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del
mismo, por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc.
Ejemplos: agar sangre, agar chocolate, caldo infusin cerebrocorazn, caldo tristona-soya.

Medios de Identificacin.

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Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad especfica


que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo.
Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el
crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser
metabilozado y el indicador que nos muestre el resultado.
Ejemplos.: agar citrato de Simons, agar sulfhdrico-indol-movilidad
(SIM), agar manitol salado, agar DNAsa, agar triple azcar hierro (TSI), y en
general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial,
son medios utilizados para identificacin.
Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de
medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo
cual se consigue simultneamente identificar los grmenes a partir de la
placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos
especficos.

Medios de Transporte.
Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a
procesarse de inmediato o que deban ser trasladadas de un laboratorio a
otro, y que puedan contener microorganismos fastidiosos para su
desarrollo por lo que se debe impedir el sobrecrecimiento de bacterias que
colonizan con frecuencia piel y mucosas. Estos medios son generalmente
semislidos, tamponados y sin sustancias nutritivas.
Ejemplos: Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.

MATERIALES:

MATERIAL DE VIDRIO:
-

Balones
Palcas Petri
Probetas graduadas
Tubos de ensayo

OTROS MATERIALES:
-

Algodn
Esptula
Gasa
Gradilla
Mechero bunsen
Papel Kraft
Pabilo
Agua destilada

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EQUIPOS:
-

Autoclave
Balanza
Potencimetro PH-metro

MEDIOS DE CULTIVO:
Medios Solidos:
-

Agar
Agar
Agar
Agar
Agar
Agar

eosina azulde metilieno (EMB)


manitol salado
Mc Conkey
Muller Hinton
nutritivo.
salmonella shigella (ss)

Medios lquidos:
-

Agua peptonada
Caldo cerebro de corazn
Caldo lactosado
Caldo nutritivo

PARTE EXPERIMENTAL

La preparacin de un buen medio de cultivo es fundamental para un


buen diagnstico bacteriolgico. El xito de la preparacin est influenciado
por una serie de factores como:

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Exactitud de la pesada y perfecta medicin del volumen de agua


Control de pH
Correcta disolucin del medio de cultivo
Correcta esterilizacin
Correcta conservacin del medio de cultivo
Correcto fraccionamiento.

Para la preparacin de medios se parte de mezclas deshidratadas de los


compuestos que la integran. Habitualmente slo es necesario aadir agua y
esterilizar en autoclave, pero en algunas ocasiones es necesario aadir
despus de la esterilizacin algn componente termolbil que no hubiera
resistido el calor.

Los medios deshidratados presentan ventajas:


-

son muy estables,


su utilizacin es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes
de su utilizacin,
una pequea cantidad del producto permite la preparacin de una
importante cantidad de medio, no necesitando un gran volumen de
almacenamiento,
son econmicos.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO:

Determinar la cantidad que vamos a preparar, es decir el nmero de


medos de cultivo en cajas Petri y en los tubos de ensayo. Se
recomienda la siguiente cantidad.
Cajas Petri---------------------15-20ml
Tubos de ensayo--------------20 ml
Por tanto se desea preparar en 5 cahas Petri, se emplea l regla
de tres simple:
1 cajas de Petri----------------20 ml
5 cajas de Petri----------------Xml

X=5x20/1=100ml

Pesar la cantidad de gramos del medio de cultivo que se desea


preparar: ejemplo agar nutritivo. Para esto debemos fijarnos en las

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instrucciones de preparacin para determinar el


mediante una simple regla de tres debemos calcular.
Para nuestro agar que viene a ser el agar nutritivo

peso.

Luego

Clculos:
20gr de
1000ml

agar

nutritivo----------------

Xgr----------------------------------------40ml
X=20grx40ml/1000ml
X=0.8gr.
Y as pesamos 0.8 gr de muestra a preparar

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Luego se mezclan las cantidades de agua destilada y los gramos del


medio de cultivo. La mezcla preparada en el matraz de Erlenmeyer se
diluye realizando movimientos circulares de la preparacin con la
mano y calentando a la llama del mechero para acelerar el proceso.

Luego

se realiza la esterilizacin en el
autoclave a una presin de 1.5
atmosferas, 120C y por 15 minutos. Hay algunos medios de cultivo
que no deben esterilizarse al autoclave.

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Luego se realiza el vaciado a los recipientes estriles (cajas Petri y


tubos de ensayo) de forma rpida ya que el agar solidifica rpido a
40C en el caso de medios slidos. Siempre en el rea protegida por
llama del mechero que crea un ambiente estril.

Dejar enfriar los medios de cultivo con la tapa semiabierta en el caso


de las cajas de Petri.
Dejar enfriar los medos de cultivo con la tapa semiabierta en el caso
de las cajas de Petri, para evitar la formacin de gotas de
condensacin en su interior.

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Luego guardar en forma invertida, envolviendo previamente en papel


Kraft o papel madera, en la seccin de conservacin de un
refrigerador.

RESULTADOS y CONCLUSIONES:

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CONCLUSIONES:
-

Por medio de esta prctica al investigar la teora y realizar la


preparacin de un medio de cultivo, se logr la elaboracin adecuada
de los mismos, as como la seleccin apropiada para el uso que se les
dar posteriormente a los medios del mtodo de esterilizacin que
eliminara los restos microbianos que pudiesen haber quedado en el
medio de cultivo ya que si existe alguno de estos, ya no sera
adecuado para el uso que se le pudiera llegar a dar.
Por ltimo, se aprendi a envolver correctamente los medios de
cultivo y que estos cuando se almacenan en cajas de petri deben
colocarse inversamente para evitar su deshidratacin por
evaporacin y de esta manera no tener que desechar las muestras.

CUESTIONARIO:
1
-

Cules son los constituyentes de los medios de cultivo?


COMPONENTES DE UN MEDIO DE CULTIVO
Sales inorgnicas
Fuentes de carbohidratos
Reguladores de crecimiento
Vitaminas
Aminocidos
Complejos orgnicos
Reguladores de crecimiento vegetales
Antioxidantes
Material de soporte
Agua

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Mencione los medios de cultivo que no deben esterilizarse al


autoclave.

En el caso del medio TCBS, no se autoclava porque algunos de sus componentes se


degradan con la temperatura de autoclave, como la bilis de buey. Adems, el medio TCBS
es un medio altamente selectivo, es hipersalino y con pH muy alcalino. Solamente
sobreviven bacterias halo y alcalinotolerantes, como las bacterias del gnero Vibrio, as que
no se necesita esterilizar porque su riesgo de contaminacin es muy bajo.

El medio Agar SS en su composicin tiene productos que se degradan


con el calor. En estos casos se esteriliza por filtracin a travs de filtros
de 0.22 micrones.
Bibliografa.

Microbiologa Clnica. Mdulo 1. Taxonoma y Fisiologa


Microbiana. Recoleccin y transporte de muestras para el
diagnstico de infecciones. AAM- Colegio de Bioqumicos de la
Provincia de Entre Ros- Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas
Universidad Nacional del Litoral. 1997.

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Microbiologa Clnica. Mdulo 2. Procesamiento inicial de las


muestras para el diagnstico mocrobiolgico. AAM- Colegio de
Bioqumicos de la Provincia de Entre Ros- Facultad de Bioqumica y
Ciencias Biolgicas Universidad Nacional del Litoral. 1997
Daz Martn GA. Fundamentos
y
tcnicas
de
anlisis
microbiolgico. Medios de cultivo. Apuntes. Segundo curso:
Laboratorio de Diagnstico Clnico Unidad Temtica 14-1, Bloque
temtico III. 2004-2005.
Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual
de tcnicas de laboratorio para la enseanza de la
microbiologa bsica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 7, 47-50.

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