INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LA ADN

POLIMERASA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y SU USO
COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLGICA

INFORME TCNICO DE LA OPCIN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIN
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO BIOTECNLOGO
PRESENTA

RAYMUNDO MONDRAGN MARTNEZ

DIRECTOR EXTERNO: DR. LUIS G. BRIEBA DE CASTRO

Mxico D.F., Mayo de 2007

Lugar de Realizacin del Proyecto:

Laboratorio de Bioqumica Estructural; Departamento de Bioqumica del Centro de

Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional

Asesor Externo
(Director del proyecto)

Dr. Luis G. Brieba de Castro

Asesor Interno
M.C. Gloria Lpez Jimnez

Sinodal
M.C. Patricia Vzquez Lozano

Alumno sustentante
Raymundo Mondragn Martnez

ii

AGRADECIMIENTOS

A mis padres Rafael y Beatriz por ser los padres que han sido, por
creer siempre en mi y por haberme dado la educacin ms slida junto con los
mejores fundamentos para no flaquear y as poder mantenerme siempre a la altura de mis sueos
A cada una de mis tas, -Vicky, Shofi y Luz- por haber sido cada
una como una madre ms en toda mi vida, ya que sin
ustedes es un hecho que no lo hubiera logrado
A los que ya no estn a mi lado
A mis abuelitos Benja y Elena, simplemente porque al
recordarlos, el nico sentimiento que me
embriaga, es el amor

A mi to Quique porque estoy seguro que le

hubiera encantado ver como terminaba
con xito

A la que parece que siempre estar conmigo, Mi Beatricita

A mis hermanos Rafa y Rochy, por ser los hermanos que han sido
ya lo logramos los 3!!
A mis amigos
A Mario, simplemente mi hermano para siempre, por abrirme las puertas
de su casa, as como a sus padres, por tratarme como
a un hijo ms, es algo que jams olvidar
A Cuau, por hacer parecer que la escuela era tan sencilla
y de igual forma, por abrirme las puertas de su
casa y tambin a sus padres
A mi muy querido hermano Leo, por ensearme esa leve actitud
de omnipotencia jaja y por siempre animarme y ensearme
lo que necesitaba sin necesidad de hablar
A Paquito, por ensearme lo verdadero Merol
Al buen Alex Fernndez por ser un hermanito
y por demostrarme la verdadera
nobleza en alguien
A mi ltimo amigo adquirido, Dany Olgun el chavito,
por demostrarme su sincera amistad
tan rpido
A mis dudes de la infancia Pablo, Robert y Jorge
Y a todos los que me faltan disclpenme pero solo dej est hoja

Al Dr. Luis G. Brieba, ya que a pesar de ser una persona

muy exitosa, me hizo sentir bien y me ayud siempre
en lo que necesit

A la que se rob mi corazn y me dijo que siempre lo querr para ella, la que
me enamor con una ida a comer y de quien me enamor como
siempre dese enamorarme de alguien, en un concierto
de U2 Para ti, mi preciosa Virginia D. Osorio A.
Gracias por todo tu amor y apoyo

iii

NDICE
1. RESUMEN
2. INTRODUCCIN
3. ANTECEDENTES
3.1. Replicacin de cidos nucleicos
3.2. Replicacin mitocondrial
3.2.1. Mecanismos de replicacin del ADN mitocondrial
3.3. ADN polimerasas
3.4. Expresin recombinante de ADN polimerasas mitocondriales
3.4.1. Caractersticas de las ADN polimerasas mitocondriales
3.5. Investigaciones previas en la elaboracin de quimeras
4. JUSTIFICACIN
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
5.2 Objetivos Especficos
6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
7. MATERIALES Y MTODOS
7.1. Obtencin del ADN genmico de S. cerevisiae
7.2. Diseo in silico de las construcciones a realizar del ADN polimerasa
7.3. Diseo de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la

1
2
4
4
5
6
7
8
9
10
12
13
13
13
14
15
15
15

ADN polimerasa
7.4. Amplificacin por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del

16

gen completo y las dos deleciones de la ADN polimerasa

7.5 Obtencin de los cassettes
7.6 Obtencin del vector

16
18
18

7.7. Subclonacin de la ADN polimerasa de Saccharomyces cerevisiae

en el plsmido pET28a(+)
7.8. Obtencin de clones positivos conteniendo el gen de la ADN

19

polimerasa de S. cerevisiae en vectores de expresin de procariontes

7.9 Corte con enzimas de restriccin
7.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa

19
20
20

7.11 Expresin recombinante de la ADN polimerasa de S. cerevisiae

en Echerichia coli
8. RESULTADOS Y DISCUSIN
8.1. Diseo de construcciones
8.2. Diseo de oligonucletidos
8.3. Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de

21
22
22
23

la ADN polimerasa de S. cerevisiae por medio de la PCR

8.4. Reaccin de ligacin del gen completo y de las mutantes de delecin

24

de la ADN polimerasa de S. cerevisiae en el vector pET28a(+)

8.5. Identificacin de clones positivos

25
26

iv

8.6. Expresin recombinante de la ADN polimerasa en E. coli

9. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO
10. CONCLUSIONES
11. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
ANEXOS

27
28
31
32

NDICE DE CUADROS Y FIGURAS

Cuadro 1. Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la
replicacin

Cuadro 2. Reactivos y concentraciones finales para la amplificacin del gen

completo y las dos deleciones de la ADNpol
Cuadro 3. Programa para el termociclador

5
5

Cuadro 4. Proporcin inserto:vector en la subclonacin de la ADNpol en el

plsmido pET28a(+)

25

Figura 1. Similitudes estructurales entre la ADN polimerasa y la T7 ADN

polimerasa

13

Figura 2. Dominio de sitio de unin de la tioredoxina en el bacterifago T7 y

la ausencia de ste en la ADN polimerasa I de E.coli

17

Figura 3. Superposicin del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa

(azul) con la T7 ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de insercin
de la T3 TBD (amarillo). La secuencia primaria de aminocidos de la Taq ADN
polimerasa desde el residuo 470 507 se indica debajo (azul) con la secuencia
de la T3 TBD (amarillo) y la regin deletada en rojo.

18

Figura 4. Metodologa para la subclonacin y expresin de la ADNpol de

Saccharomyces cerevisiae

14

Figura 5. Diseo de construcciones a partir de la secuencia de aminocidos

de la ADNpol y el fragmento Klenow

22

Figura 6. Diseo de oligonucletidos para amplificar el gen de la ADNpol y

deleciones en el N-terminal

23

Figura 7. Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de

la ADNpol de S. cerevisiae. Lnea 1) gen completo de 3762 nucletidos,
2) Delecin 102 de 3 456 nucletidos, 3) Delecin 124 de 3390 nucletidos.
El marcador de peso molecular de 1 kb (New England Biolabs) muestra que los
productos de amplificacin corresponden al tamao esperado

vi

24

Figura 8. Reaccin de ligacin de dos mutantes de delecin y el gen completo

de la ADNpol. Lnea 1) plsmido pET28a cortado con NheI y SacI, 2) plsmido
pET28a superenrrollado, 3) marcador de peso molecular de 1 kb NEB, 4) producto
digerido de la delecin II, 5) producto digerido de la delecin I, 6) producto digerido
del gen completo de la ADNpol de S. cerevisiae

25

Figura 9. Doble digestin con NheI y SacI de la mutante de delecin II

de la ADNpol de S. cerevisiae. Lneas 1 a la 6 representan 6 colonias
(en este caso todas positivas), se observan dos bandas, una inferior y
otra superior que corresponde al plsmido pET28a de 5 369 nucletidos
digerido. La banda ms intensa del marcador de peso molecular corresponde
a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb

26

Figura 10. Gel SDS-PAGE que muestra la expresin recombinante de la

ADNpol de S. cerevisiae. Lneas 1 y 2 muestran la construccin completa,
lneas 3 y 4 construccin Nterm124. Lneas 2 y 4 despus de la induccin.
La expresin de la protena se muestra con dos asteriscos
Figura 11. Metodologa para la construccin de la quimera Taq ADN pol /

27
29

Figura 12. Esquematizacin ms detallada para la construccin de la

quimera Taq ADN pol /

30

vii

1. RESUMEN
Desde que Arthur Kornberg obtuvo de forma sinttica y describi por primera vez a la ADN
polimerasa de Escherichia coli, a la fecha se han descrito cinco tipos ms. Estas
polimerasas, aunque muy semejantes llevan a cabo diferentes funciones en lo que a la
sntesis del ADN respecta, ya que mientras unas sirven de iniciadores de este proceso (),
otras la llevan a cabo (), as como unas ms lo reparan (, ). Sin embargo se encontr
que ciertos organelos que llevan a cabo una funcin importante en la clula como la
respiracin celular y el metabolismo energtico en general, poseen su propio material
gentico. Uno de estos organelos es la mitocondria, que a su vez cuenta con la ADN
polimerasa como la encargada de la sntesis total de su material gentico en eucariontes.
Esta polimerasa se encuentra nicamente en humanos y levaduras, adems es una
enzima sumamente fiel. A diferencia de S. cerevisiae, la de humano necesita un factor de
procesividad para que funcione eficientemente, sin embargo esta polimerasa guarda una
gran similitud con la polimerasa del bacterifago T7, por lo cual es de gran inters nuestro
su comparacin para el anlisis funcional y estructural de nuestra polimerasa.
De lo anterior parte el inters acerca del estudio de esta polimerasa, ya que el modelo
tomado como estudio, el de Saccharomyces cerevisiae, es altamente procesivo y no
necesita de ningn factor extra para llevar a cabo la replicacin total. De esta forma es
importante comprender el funcionamiento de esta unidad enzimtica para as vislumbrar
las interacciones en el ncleo del resto de las polimerasas. Adems de que se tiene un
especial inters en la mitocondria ya que a ella se le atribuyen mltiples enfermedades en
humanos, como la diabetes tipo II, disfunciones cardiacas, as como el envejecimiento
mismo.
De esta forma el inters fue expresarla de forma recombinante en E. coli en la cepa
BL21/DE3 Rosseta II para as producirla en grandes cantidades y facilitar su estudio futuro.

2. INTRODUCCIN
En los organismos eucariticos la mayor parte de la extensa informacin gentica reside
en el ncleo, sin embargo poseen organelos con su propio material gentico, mismos que
cumplen el papel primordial de principales proveedores de energa para la clula, ya que
llevan a cabo reacciones de fosforilacin oxidativa en mitocondria o fotosntesis en
cloroplastos. El plan es contribuir en el entendimiento de cmo el metabolismo del ADN es
llevado a cabo en los organelos. Se tiene un especial inters en las transacciones llevadas
a cabo por el ADN mitocondrial (mtADN), usando como modelo a Saccharomyces
cerevisiae. La mitocondria es especialmente interesante ya que guarda una relacin con el
envejecimiento en humanos.
A pesar del tamao relativamente pequeo del material gentico en la mitocondria, debido
a la transferencia mitocondrial al ncleo, el mtADN est asociado a una multitud de
enfermedades, incluyendo diabetes tipo II, anormalidades musculares y cardiacas y
envejecimiento. Las transacciones del mtADN son realizadas por una sola subunidad
enzimtica la cual desplaza a las subunidades mltiples enzimticas bacterianas ms
complejas presentes en el endosimbionte original, levaduras y en humanos. Todas las
enzimas implicadas en las transacciones del ADN son codificadas en el ncleo

importadas por la mitocondria. Entendiendo como trabaja una sola subunidad de las
polimerasas es importante para comprender estas transacciones del ADN que ocurren en
la mitocondria, pero tambin para entender el rol de las polimerasas en el ncleo, como
nuevos miembros de esta familia, como la ADN polimerasa Q y la ARN polimerasa IV que
se localizan en ste [1,2].
En el presente trabajo escogimos estudiar las funciones del mtADN usando como modelo
a la levadura S. cerevisiae por sus obvias ventajas, ya que puede crecer de forma
anaerobia adems de la enorme cantidad de herramientas genticas en levaduras. Pero
para el sistema bioqumico es un sistema particularmente atractivo ya que las enzimas
envueltas en estas funciones del ADN son similares a los sistemas clsicos que posee el
bacterifago T7. Para el caso, la transcripcin mitocondrial es realizada por una ARN
polimerasa similar a la ARN polimerasa del bacterifago T7, as como tambin posee
similitudes respecto a la replicacin. Este bacterifago tiene el replisoma ms simple
conocido a la fecha, con solo cuatro protenas implicadas para llevar a cabo la sntesis
2

coordinada de ADN, por lo que supondremos varias similitudes entre ste y nuestra
levadura. En el cuadro 1 mostramos la similitud replicativa mitocondrial entre S. cerevisiae
y la humana, as como las del bacterifago.
Cuadro 1. Similitudes entre las ADN polimerasas que intervienen en la replicacin

Partiendo de lo anterior, se pretende estudiar las interacciones existentes en el mtADN as

como a la ADN polimerasa (ADNpol) de S. cerevisiae, la cual ser el centro de atencin
en el presente trabajo ya que es la encargada de llevar a cabo la replicacin del mtADN y
se ha estudiado que le confiere alta procesividad a este fenmeno.

3. ANTECEDENTES
3.1 Replicacin de cidos nucleicos
Una vez que Watson y Crick elucidaron la estructura del ADN fue ms sencillo comprender
su funcionamiento. Una de las ideas que surgi inmediatamente debido a la
complementariedad de ambas hlices fue que si por medio de estas hebras se transmita
la informacin gentica, entonces cada una de las bases en su orden tan preciso y estricto
deban de funcionar como un cdigo, mismo que a mediados de los 50s ya se saba que
su informacin llevaba hacia las protenas.
Con el conocimiento de que las protenas se sintetizaban fuera del ncleo, fue entonces
que Crick hizo la interrogante de Cmo era posible eso? As es que propuso a un posible
intermediario llamado ARN que se encuentra en el citoplasma, el cual posea ciertas
caractersticas que cada vez lo llevaban a asegurar sus hiptesis, entre las cuales estaban
que posea un esqueleto de azcares y fosfato tomando en cuenta que en vez de ribosa
tena desoxirribosa, que usaban las mismas bases nitrogenadas solo que tena uracilo en
vez de timina, sin embargo ste se poda unir a la adenina como lo haca la timina y que
era de cadena sencilla. A toda esta idea condensada Crick le llam dogma central de la
biologa, especificando que el ADN se traduca a ARN y a partir de ste se producan las
protenas. Lo que hoy en da conocemos perfectamente como la replicacin, transcripcin
y traduccin respectivamente.
El objeto de inters principal en este trabajo es la replicacin, por lo que es importante
sealar que sta no es un proceso espontneo y pasivo ya que se requiere que la doble
hlice se abra y se sinteticen las nuevas cadenas de ADN, as que es un proceso llevado a
cabo por un conjunto de enzimas especializadas.
En el inicio de la replicacin, las topoisomerasas son las enzimas encargadas de evitar el
superenrollamiento de las cadenas mientras las helicasas logran desenrollar la cadena
original doble rompiendo los enlaces de Hidrgeno, por lo que necesita de ATP para este
fin. Las protenas de unin de cadena sencilla (SSB) se unen a las cadenas sencillas
evitando que se unan de nuevo, mientras que la ADN polimerasa lleva a cabo la
elongacin de la cadena nueva mediante la unin de los dNTPs libres y colocndolos con

sus complementarios formando un enlace fosfodiester. Existen varias ADN polimerasas,

donde la responsable de la procesividad en la sntesis de la cadena nueva es la ADN
polimerasa III. Tambin interviene la primasa que es parte de un agregado de protenas
llamado primosoma que fija un pequeo iniciador de ARN a la cadena sencilla de ADN
como sustituto de 3 OH para que inicie la sntesis la ADN polimerasa adems de la ligasa
que cataliza la formacin de los enlaces fosfodiester.
Por supuesto que la explicacin anterior es muy vaga, sin embargo es suficiente ya que lo
que nos interesa aqu es el estudio de las polimerasas, en especial la ADN polimerasa
encargada de replicar el mtADN de S. cerevisiae que se explicar a continuacin.
3.2 Replicacin mitocondrial
La ADN polimerasa es la nica ADN polimerasa mitocondrial en humanos y levaduras
[3,4], esta caracterstica es conservada en la mayora de las clulas eucariontes, con la
excepcin de la mitocondria de Tripanosoma la cual contiene al menos 5 ADN polimerasas
[5]. En S. cerevisiae el gen MIP1 expresa un polipptido de 1255 aminocidos compuesto
de dos subdominios: el dominio exonucleasa 3 5 y el dominio arquetipo (pulgar, palma y
dedos), en contraste con la ADN polimerasa en humanos que no necesita una protena
accesoria (subunidad p55) para realizar la procesiva sntesis de ADN.
A la fecha, la nica familia ADN polimerasa A trabaja como el replisoma T7 ADN
polimerasa. Sin embargo la delecin de seis aminocidos en su dominio exonucleasa de la
T7 ADN polimerasa produce un mejor cristal, que ser utilizado en experimentos
posteriores ajenos al presente. La reciente estructura del cristal de la doble mutacin
puntual (D5A, E7A) muestra una conservacin en la exonucleasa y confirma nocin de que
la tioredoxina le confiere procesividad (Brieba and Ellenberger, manuscrito en
preparacin).
En comparacin con la T7 ADN polimerasa, la polimerasa de S. cerevisiae contiene una
extensin de alrededor de 170 aminocidos en su dominio amino terminal y una secuencia
de alrededor de 40 aminocidos en el subdominio del pulgar, que es anlogo al lazo de
unin de tioredoxina del T7 (Figura 1).

3.2.1 Mecanismos de la replicacin del ADN mitocondrial

Las ADN polimerasas necesitan un iniciador (primer o cebador) para comenzar la
replicacin. Est bien documentado que en los bacterifagos, bacterias y humanos la
actividad enzimtica de la primasa es la que comienza el iniciador para la sntesis de la
hebra discontinua, mientras que existe un mecanismo mltiple para la sntesis de la hebra
lder. Tambin est bien documentado que en la mitocondria de S. cerevisiae la ARN
polimerasa mitocondrial (mtARNP) transcribe un hbrido ARN:ADN en la secuencia ori/rep
que es usada como cebador inicial para la ADN polimerasa [6].

Figura 1. Similitudes estructurales entre la ADN polimerasa y la T7 ADN

polimerasa

La ADN polimerasa humana es una transcriptasa reversa eficiente, as es capaz de usar

este hbrido ARN:ADN para iniciar la replicacin. La regin 5 rica en G:C en contraste con
la secuencia rica en A:T de levaduras mutantes sin secuencias transcripcionales ori/rep en
un origen secundario, conducen a la replicacin [7]. El sitio ori es aproximadamente de 270
pares de bases y se divide en 3 partes (A, B y C). Un modelo propuso que la subunidad
6

est implicada en ambos iniciadores recombinantes de la polimerasa completa, que tiene

poca expresin y es insoluble. Sin embargo el fragmento

Nterm124

es soluble y puede

ser purificado con cromatografa de afinidad, y es activa en la extensin del iniciador.

Calculamos que se pueda obtener aproximadamente 1 mg de protena purificada por litro
de cultivo bacteriano.
3.3 ADN polimerasas
Las ADN polimerasas de la familia A conservan un mismo plegado y mecanismo, donde su
estructura se puede comprender mejor si lo comparamos con nuestra mano derecha, ya
que stas poseen esta forma, como ya se mostr en la figura 1, de esta forma conocemos
diversas ADN polimerasas entre las ms comunes tenemos a la ADN pol I (Klenow) y Taq
ADN polimerasa (TaqADNpol) que se encargan de los fragmentos de Okasaki, a la
ADNpol y la T7 ADN polimerasa (T7ADNpol) quienes se encargan de la replicacin total
de un genoma, as como la ADN polimerasa Q (ADNpolQ) que se encarga de reparar al
ADN.
Cuando nos referimos a polimerasas, la procesividad se refiere al nmero de nucletidos
que son adicionados a la cadena naciente durante un ciclo de unin/disociacin del
iniciador/templado o molde. La procesividad de las ADN polimerasas est ntimamente
ligado a su rol biolgico. Enzimas que copian genomas completos presentan una mayor
procesividad, la reparacin de largos huecos debe proceder con una menor procesividad
mientras que un modo distributivo de catlisis parece el adecuado para los huecos
pequeos [8].
El deslizamiento ocurre durante la sntesis de secuencias microsatlites repetidas y se
caracteriza por la expansin o delecin en el nmero de unidades repetidas. Un
mecanismo propuesto para este deslizamiento envuelve la disociacin de la cadena en
crecimiento y la formacin del lazo (loop) consistiendo de una o ms unidades repetidas en
cualquiera del templado como de la cadena naciente, la cual es estabilizada por puentes
de Hidrgeno con elementos adyacentes repetidos [9,10]. Ha sido previamente establecido
que la procesividad de la T7ADNpol se relaciona con la reduccin en el deslizamiento
durante la repetitiva copia de las secuencias de ADN, esto presumiblemente ya que sus

resultados son de alta procesividad y baja probabilidad de la disociacin de la enzima

durante la replicacin de las secuencias nucleotdicas repetidas.
Ya que empezamos a hablar acerca de la procesividad de las ADN polimerasas, y
partiendo de que esta procesividad est en funcin de su rol biolgico como ya se
mencion, nos podramos preguntar el qu es lo que le confiere la procesividad a las
polimerasas as como el por qu varan estas si es que pertenecen a una misma familia de
polimerasas. La respuesta an para cada polimerasa es incierta, sin embargo nosotros
pensamos que lo que le confiere procesividad a la ADNpol es el subdominio que
pertenece al pulgar, permitiendo anclarse firmemente a la cadena de ADN, ya que no se
sabe otro motivo por el cual esta polimerasa sea tan fiel.
3.4 Expresin recombinante de ADN polimerasas mitocondriales
Uno de los problemas con los que se enfrenta un bioqumico es el poder contar con
grandes cantidades de enzima relativamente pura para realizar los ensayos. La primera
ADN polimerasa se obtuvo a partir de cientos de litros de cultivo para obtener microgramos
de polimerasa [16,17]. Esta era la forma clsica en la cual se obtena una protena, es
decir a partir de un cultivo (ya sea de clulas animales, vegetales, de levadura, de E. coli o
de un tejido) se lograba fraccionar la protena por medio de cromatografa y precipitacin
en sales como sulfato de amonio.
Todo este tipo de trabajo cambio en 1977 (hace 30 aos) con la produccin recombinante
de la hormona somatostatina en E. coli. [18]. A lo largo de 30 aos la tcnica del ADN
recombinante ha cambiado muy poco, todo parte de la idea de poder contar con la versin
sinttica del gen a expresar y un vector de expresin. La primera polimerasa de cidos
nucleicos de la cual se obtuvo su secuencia completa de nucletidos y aminocidos
adems de su sobreexpresin de forma recombinante fue el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I de E. coli. Hasta la fecha se ha reportado la expresin recombinante de las
ADN polimerasas mitocondriales de Homo sapiens, Drosophila melanogaster y Xenopus
laevis, sin embargo esta expresin se basa en el sistema de baculovirus el cual es
sumamente costoso y difcil de manipular. Tambin se ha expresado a la ADN polimerasa
mitocrondrial de Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe sin embargo el

sistema ha sido en levadura, siendo tambin un sistema costoso y no tan sencillo de

manipular como el sistema de expresin en E. coli.
3.4.1 Caractersticas de las ADN polimerasas mitocondriales
Las ADN polimerasas mitocondriales, como todas las polimerasas de la familia A,
presentan alta fidelidad. Sin embargo hay dos caractersticas que las hacen nicas, su alta
procesividad y la capacidad de desplazar hebras de ADN.
Respecto a la procesividad se sabe que las ADN polimerasas de S. cerevisiae y S. pombe
no necesitan de la unin de una protena accesoria para aumentar su afinidad al templado.
Lo anterior es en marcado contraste con las ADN polimerasas mitocondriales de H.
sapiens, Drosophila o Xenopus, las cuales necesitan de una protena accesoria para unirse
al ADN con alta afinidad. Las ADN polimerasas mitocondriales de S. cerevisiae y S. pombe
tienen alrededor de 120 aminocidos extra en el subdominio del pulgar cuando se le
compara con polimerasas como el fragmento Klenow a la Taq DNA polimerasa. Nosotros
especulamos que debido a la localizacin de estos 120 aminocidos en el subdominio del
pulgar su funcin puede ser la de abrazar al ADN durante la replicacin.
Es til remarcar que lo que hace nica a esta secuencia es que no necesita de protenas
accesorias como es el caso del Thioredoxin Binding loop o lazo de unin a tioredoxina
que estabiliza la unin de la T7ADNpol con el ADN, pero solamente si el factor de
procesividad accesorio es decir la tioredoxina se encuentra presente, as como en el caso
de las ADN polimerasas de mitocondria de H. sapiens, Xenopus o Drosophila que tambin
cuentan con una protena accesoria para estabilizar su unin al ADN.
Las ADN polimerasas de mitocondria en S. cerevisiae tambin tienen la capacidad de ir
desdoblando al ADN de cadena doble, esta caracterstica es sumamente deseada en el
mbito biotecnolgico, para lograr la meta de secuenciar un genoma completo con una
sola enzima.

3.5 Investigaciones previas en la elaboracin de quimeras

Investigaciones previas realizadas sobre lo que le confiere alta procesividad a la T7ADNpol
es que posee en su estructura un sitio de unin a la tioredoxina o TBD, de sus siglas en
ingls Thioredoxin Binding Domain, La unin de la tioredoxina a la T7ADNpol incrementa
su afinidad por el iniciador/templado adems de conferir la habilidad de extender el
iniciador en la cadena sencilla de ADN por miles de nucletidos sin disociarse [10].
La estructura tridimensional del fragmento de E. coli ADN polimerasa I (Fragmento Klenow)
es conocido. El sitio activo de la polimerasa y el dominio de unin al ADN se encuentran en
el carboxilo terminal (C-terminal), a la mitad de la molcula y la exonucleasa 3-5 con
actividad de correccin se localiza a la mitad del amino terminal (N-terminal). Comparando
ambas secuencias, la T7ADNpol y la E.coli ADN polimerasa I revela un segmento de
alrededor de 76 aminocidos en la T7ADNpol (residuos 258 - 333) que no se encuentran
en la E.coli ADN polimerasa I. En la estructura de la E.coli ADN polimerasa I, esta regin
corresponde a un inserto que se encuentre entre las hlices H y H1 (Figura 2). Estas dos
hlices se localizan en la regin referida como el pulgar que se piensa es importante para
la interaccin del ADN de doble cadena [11].

Figura 2. Dominio de sitio de unin de la tioredoxina en el bacterifago T7 y la

ausencia de ste en la ADN polimerasa I de E.coli

A partir del conocimiento anterior, fue construida una quimera de E.coli ADN polimerasa I
con el subdominio de la T7ADNpol, lo cual result positivo, ya que aument la procesividad
de esta ltima de forma excepcional [12].

10

Otro trabajo que se ha realizado respecto al aumento de procesividad ha sido la insercin

de este mismo dominio de unin a la tioredoxina (TBD) de igual manera perteneciente al
subdominio del pulgar, pero en este caso del bacterifago T3, de la T3 ADN polimerasa
TBD a la Taq ADN polimerasa en un sitio anlogo, aumentando su procesividad (Figura 3).
Este sitio de unin convierte la procesividad de la enzima de un valor <15 nucletidos
hasta

una

procesividad

>2

000

nucletidos,

incrementando

la

afinidad

iniciador/templado y aumentando el grado de elongacin [13,14].

Figura 3. Superposicin del dominio del pulgar de la Taq ADN polimerasa (azul) con la T7
ADN polimerasa (rosa). Las flechas indican el sitio de insercin de la T3 TBD (amarillo). La
secuencia primaria de aminocidos de la Taq ADN polimerasa desde el residuo 470 507 se
indica debajo (azul) con la secuencia de la T3 TBD (amarillo) y la regin deletada en rojo.

11

del

4. JUSTIFICACIN
La ADNpol es una enzima altamente procesiva, sin embargo la obtencin de ADN
polimerasas se obtiene solamente a partir de cultivos celulares de levadura o en forma
recombinante utilizando baculovirus. Como un punto de partida inicial deseamos construir
un vector de expresin en donde clulas de E. coli sinteticen a la ADNpol de S.
cerevisiae. Hasta la fecha no se ha reportado la expresin en bacteria de esta enzima ya
sea de levadura o de humano. Adems, debido a que en el diseo y construccin de
quimeras existe un proceso bastante establecido en protenas expresadas en bacteria,
deseamos ser los primeros en expresar a la ADNpol para tener un modelo de estudio que
nos permita su modificacin.
A partir de ese modelo se tiene planeado a futuro la construccin de una quimera de la Taq
ADN polimerasa con los subdominios funcionales de la ADNpol. Partiendo del
conocimiento de que la ADNpol es altamente procesiva y que el factor que le confiere
esta procesividad es el subdominio del pulgar, pensamos que se pudiera construir una
quimera de la Taq polimerasa en la cual su subdominio del pulgar sea cambiado por el
subdominio del pulgar de la ADNpol, brindndonos una enorme ventaja sobre las
quimeras Klenow y Taq ADNpol/TBD, ya que stas necesitan forzosamente a la
tioredoxina para ser funcionales, al contrario de lo estudiado en la ADNpol, ya que se
sabe que sta es altamente procesiva y no utiliza tioredoxina u otro factor accesorio para
tener esa alta procesividad.
Respecto a la obtencin de un dominio mnimo de la ADNpol, as como la medicin de
sus parmetros cinticos podr brindar informacin muy til, ya que la delecin de
alrededor de 124 aminocidos en el extremo N-terminal posiblemente pertenezcan a una
regin aparentemente no conservada y posiblemente innecesaria para su funcin. Adems
se sabe que este dominio es indispensable para la actividad de la polimerizacin y se
especula que al truncarlo se aumentar la expresin de las protenas recombinantes,
siendo importante para futuros experimentos de cristalografa que nos permitirn conocer
la longitud mnima del polipptido que le confiere procesividad a la ADNpol de S.
cerevisiae.

12

5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General:
Obtencin de la ADN polimerasa de S. cerevisiae de forma recombinante en E. coli
5.2 Objetivos Especficos:
5.2.1 Diseo in silico de dos construcciones recombinantes de la ADNpol

5.2.2 Amplificacin por PCR del gen completo y de las dos deleciones de la
ADNpol
5.2.3 Subclonacin de la ADNpol y de las dos construcciones recombinantes de
Saccharomyces cerevisiae en el plsmido pET28a(+)
5.2.4 Expresin recombinante de la ADNpol de S. cerevisiae en E. coli

13

6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Obtencin del ADN genmico de

S. cerevisiae

Diseo de oligonucletidos

Amplificar gen de la
ADNpol de S. cerevisiae

Amplificar construccin
124
Subclonar en vector de expresin
pET28a(+) (colita de histidinas)
Sitios de restriccin: NheI y SacI

Identificacin de clones
positivos

Identificar un sistema de
expresin

Analizar el sistema
BL21/DE3

Analizar el sistema
BL21/DE3/RossetaII

Comparar,
analizar y concluir

Figura 4. Metodologa para la subclonacin y expresin de la ADNpol de

Saccharomyces cerevisiae

14

7. MATERIALES Y MTODOS
7.1 Obtencin de ADN genmico de S. cerevisiae
EL ADN genmico se obtuvo a partir de 1 L de cultivo de S. cerevisiae cepa S288c (cepa
secuenciada originalmente) [15], usada como punto de referencia para trabajar con
levadura. El cultivo de levadura se realiz en medio lquido y se incub a 30 C. La pared y
membrana celular fue rota utilizando perlas de vidrio. En breve se crecieron en 5 mL de
medio de cultivo para levadura (medio YPD) y a partir de una sola colonia se crecieron a
30 C. Se transfiri el cultivo a un tubo de vidrio de 13 x100 mm. Las clulas se
centrifugaron durante 2 min en una centrifuga de mesa, desechndose posteriormente el
sobrenadante. Las clulas se lavaron con 5 mL de H2O, se centrifugaron durante 2 min
ms y se volvi a desechar el sobrenadante. stas se resuspendieron en 500 L de buffer
de lisis (0.1 M Tris pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS), a esta pastilla se le agreg perlas de
vidrio (400 - 500 m) hasta antes del menisco y se mezclaron en vortex por 30 s mientras
se aadan 25 L de una solucin 5 M de NaCl. Se centrifug por 2 min para disminuir la
espuma. El lisado fue removido con una pipeta de 1000 L y se transfiri a un tubo de
microcentrfuga de 1.5 mL. A este lisado se le aadi 400 L de buffer TE con fenol
saturado y se centrifug por 4 min. La fase superior se transfiri a un tubo de
microcentrfuga nuevo (400 L aprox.) y se aadieron 400 L de fenol:cloroformo (4:1), se
mezcl en vortex, se centrifug y se transfiri la fase superior a un tubo nuevo. Se aadi 1
mL de etanol al 95% y se mezcl. Se centrifug por 6 min y se decant el etanol. Se dej
secar al ambiente y se resuspendi en 50 L de buffer TE. La concentracin de cido
nucleico total fue determinada al medir la absorbancia a 260 nm.
7.2 Diseo in silico de las construcciones a realizar de ADN polimerasa
Con base a una alineamiento entre la secuencia de aminocidos de la ADN polimerasa
de S. cerevisiae y la secuencia del fragmento Klenow se determin que las dos deleciones
a realizar eran de 102 y 124 aminocidos respectivamente. En el ANEXO I se observa una
superposicin de las secuencias de aminocidos del Fragmento Klenow y la ADN
polimerasa de S. cerevisiae. En esta superposicin es evidente que el Fragmento Klenow
tiene por los menos 120 aminocidos extras en el domino N-terminal en comparacin con

15

el Fragmento Klenow. Nosotros suponemos que estos aminocidos no juegan un papel en

la catlisis adems de que no son importantes para interacciones protena - protena que
ocurren en el replisoma mitocondrial y por lo tanto son un buen punto de partida a eliminar.
7.3 Diseo de los iniciadores para amplificar las tres construcciones de la ADN
polimerasa
Los oligonucletidos tuvieron como base la secuencia del ADN genmico de S. cerevisiae.
Un anlisis in silico indic la ausencia de intrones en el gen de la ADN polimerasa de S.
cerevisiae, por lo que la amplificacin directa del gen puede llevarse a cabo. Para disear
los oligonucletidos se utiliz una longitud de entre 18 y 26 nucletidos para as llegar a
una Tm superior a los 55 C. En el extremo 5 de los oligos se aadi el sitio Nhe I (5
gtcgac 3) dado que deseamos introducir los segmentos amplificados en el vector
pET28a(+) (el mapa del vector se encuentra en el ANEXO IV) y el sitio Nhe I esta cercano
al 5 del sitio de clonacin mltiple. Lamentablemente no podemos utilizar el sitio de
restriccin Nde I porque nuestros segmentos a amplificar pueden ser digeridos por esta
enzima, principalmente hablando de nuestra delecin dos (ANEXO III). El oligo C-terminal,
el cual es un oligo consenso se dise para amplificar hasta el aminocido 1254 y se
incluy un codn de paro, adems del sitio de restriccin Sac I (5 aagctt 3). Los cuatro
oligonucletidos a utilizar se disearon con 5 nucletidos extra para asegura el corte con
las enzimas de restriccin (ANEXO II-B)
7.4 Amplificacin por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del gen completo
y las dos deleciones de la ADN polimerasa
Para llevar a cabo la PCR se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de 600 L en
el orden y proporciones marcadas en el cuadro 2.

16

Cuadro 2. Reactivos y concentraciones finales para la amplificacin del

gen completo y las dos deleciones de la ADN pol
Cantidad

Reactivo

(L)

Concentracin final

Agua MiliQ

33

-------

Amortiguador 10X

1X

0,2 mM

Iniciador N-terminal (12,5 pmol L )

0,5 M

Iniciador C-terminal (12,5 pmol L-1)

0,5 M

ADN genmico ~45 ng L-1

~90 ng

Polimerasa Pfu

2,5 unidades

dNTPs 2,5 mM
-1

Los tubos se centrifugaron por 5 s y se colocaron en un termociclador MyCycler Biorad.

Para llevar a cabo la reaccin se utiliz el programa estipulado en el cuadro 3.
Cuadro 3. Programa para el termociclador
Paso

Temperatura (C)

Tiempo

95

3 min

55

1 min

72

1,5 min

94

45 s

Regresar al paso 2 y repetir por 28 veces

5

72

5 min

Posteriormente se tomaron 5 L de las PCRs y se corrieron en un gel de agarosa al 1%

con marcadores de 1 kb de New England Biolabs (NEB).

17

7.5 Obtencin de los cassettes

Los productos de PCR presentaron una banda nica, por lo que solamente se limpiaron
con el PCR Cleanup Kit de Qiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la
obtencin de las construcciones se realizaron reacciones de corte de los productos de
PCR de las 2 construcciones. Esta reaccin consisti en colocar en un tubo Eppendorf lo
siguiente:
44 L de la PCR
5 L de Buffer de Reaccin # 2 NEB
0,5 L (5 unidades) de enzima NheI
0,5 L (5 unidades) de enzima SacI
Dejndolo incubar toda la noche a 37 C.
Una vez realizado el corte, se eliminaron las enzimas de restriccin con el PCR Cleanup
Kit de Qiagen y se determin la concentracin de ADN por medio de la lectura a 260 nm en
un espectrofotmetro.
7.6 Obtencin del vector
El plsmido pET28a(+) se transform en la cepa de Escherichia coli DH5 y las bacterias
se crecieron en un medio de LB/agar con Kanamicina. De esta transformacin se tom una
colonia de la placa y se creci un cultivo bacteriano de 10 mL en LB/kanamicina. El ADN
plasmdico del plsmido pET28a(+) necesita ser de alta calidad por lo cual se realiz su
extraccin utilizando el DNA Miniprep Kit de la compaa Qiagen de acuerdo a las
instrucciones del proveedor. A partir de 10 mL de cultivo celular obtuvimos
aproximadamente 5 g de ADN. Este ADN plasmdico fue linearizado de acuerdo al
siguiente protocolo:
85 L del miniprep
10 L de Buffer de Reaccin # 2 NEB
2,5 L (5 unidades) de enzima NheI
2,5 L (5 unidades) de enzima SacI

18

Y se dej incubar toda la noche. Para separar las poblaciones digeridas versus las no
digeridas se procedi a preparar un gel preparativo de agarosa al 1%.
7.7 Subclonacin de la ADNpol de Saccharomyces cerevisiae en el plsmido
pET28a(+)
Para lograr una subclonacin eficiente es importante la proporcin de inserto/vector. En el
presente trabajo se realizaron diversas relaciones molares y llevadas a volmenes finales
de 20 L, incubndose a 16 C por 12 h, de acuerdo al cuadro 4.

Cuadro 4. Proporcin inserto: vector en la subclonacin de la

ADNpol en el plsmido pet28a(+)
Relacin Molar

1:3

1:6

1:12

Vector

12 ng

12 ng

12 ng

Inserto

12 ng

24 ng

48 ng

Buffer

2 L

2 L

2 L

Ligasa NEB

10 unidades

10 unidades

10 unidades

Temperatura de la reaccin - 16 C -

Se realiz una transformacin con vector sin ligasa como testigo negativo y uno de vector
superenrrollado como testigo positivo.
7.8 Obtencin de clones positivos conteniendo el gen de la ADNpol de
Saccharomyces cerevisiae en vectores de expresin de procariontes
El proceso del aislamiento y purificacin de plsmidos o Miniprep consisti en transferir 1,5
mL del medio de cultivo bacteriano a un tubo Eppendorf estril y centrifugar a 12 000 rpm.
Se procedi a desechar el sobrenadante y se repiti la operacin hasta completar 3 mL de
medio de cultivo. La pastilla bacteriana se resuspendi en 100 L de solucin de lisado (50
mM de glucosa, 25 mM de Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA). Se incub por 5 min a
temperatura ambiente y se aadi 200 L de un solucin alcalina recientemente preparada
(0.2 N NaOH, 1% dodecil sulfato de sodio). El contenido del tubo se mezcl por inversin
de 5 a 6 veces hasta que la solucin se torn transparente y viscosa. Despus de 5 min se

19

agregaron 150 L de una solucin 7.5 M de acetato de amonio a pH 7.8 y se mezcl el

tubo por inversin. Se procedi a centrifugar el tubo por 10 min a 14 000 rpm a
temperatura ambiente. El sobrenadante que contena el plsmido de inters se transfiri a
un microtubo limpio y se aadi 0,6 volmenes (250 L aproximadamente) de isopropanol.
Esta solucin se incub a temperatura ambiente por 10 min y posteriormente se centrifug
a 14 000 rpm por 10 min. Al decantar el sobrenadante se obtuvo una pastilla que contena
el plsmido y el ARN, sta se lav con etanol al 70% y se dej secar al aire. Esta pastilla
se disolvi en 100 L de agua miliQ estril y se agreg 1 L de RNAsa A en una
concentracin de 10 mg mL-1 y se incub por media hora a 37 C. La RNAsa A fue
eliminada por medio de una extraccin fenol/cloroformo y se procedi a precipitar el
plsmido con etanol. La pastilla obtenida fue resuspendida en 50 L de agua miliQ estril.
7.9 Corte con enzimas de restriccin
Para liberar los insertos de las construcciones de la DNA polimerasa gamma. Se utiliz el
ADN plasmdico y se realiz un corte con las enzimas de restriccin NheI y SacI, el cual
consisti en colocar en un tubo Eppendorf de 600 l los siguientes reactivos:
7 L de H2O MiliQ
10 L del miniprep
2 L de Buffer de Reaccin # 2 NEB
0,5 L (5 unidades) de enzima Nhe I
0,5 L (5 unidades) de enzima Sac I
7.10 Electroforesis de ADN en gel de agarosa
Para efectuar una electroforesis de ADN se mont la cmara de electroforesis con un
peine de 8 pozos, dejando un espacio de aproximadamente 0,2 cm entre el final del peine
y la cmara. Se agregaron aproximadamente 35 mL de agarosa al 1% en buffer TAE a la
cmara. Al alcanzar una completa gelificacin se removi cuidadosamente el peine as
como los sujetadores y se mont el gel en el tanque de electroforesis con suficiente buffer
para cubrir el gel. Se mezclaron las muestras de ADN con el buffer de carga y se carg la
mezcla en el gel sumergido utilizando una micropipeta. Se coloc la tapa del gel de

20

electroforesis y se someti a un flujo elctrico de 90 V. Se corri el gel en relacin al

corrimiento del azul de bromofenol.
7.11 Expresin recombinante de la ADNpol de Saccharomyces cerevisiae en E. coli
En este mtodo pondremos a crecer en matraces de 1L en caldo LB las cepas de E. coli
BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II a 37 C, cuando la densidad ptica alcanza 600 se aade
IPTG a una concentracin final de 0,5 mM y se deja incubar en hielo durante toda la
noche, proceso conocido como induccin.
Previamente a la induccin se toma una alcuota del cultivo bacteriano sin IPTG (cultivo sin
inducir). Una vez finalizada la induccin (aproximadamente 15 h) se centrfuga el cultivo
bacteriano en una centrifuga Sorvall utilizando un rotor JA-10. Se decanta el sobrenadante
y se guarda la pastilla bacteriana a -20 C. La pastilla se resuspende en 25 mL de un buffer
de lisis conteniendo 25 mM Tris pH 8.0. 175 mM NaCl y 0.1 mM PMSF. Esta resuspensin
se somete a un proceso de sonicacin por 45 s y una pausa de 1 min. Este proceso se
repite 6 veces. Las clulas sonicadas se centrifugan por 30 min a 17 000 rpm en un rotor
Sorval JA-20. El sobrenadante se pasa a travs de un filtro de 0,2 m.
Previamente se estabiliza una columna de Hi-Trap con Nquel utilizando el mismo buffer de
lisis. Se hace pasar el sobrenadante a travs de la columna Hi-Trap y se lava con 15 mL
de buffer de lisis. El primer lavado se realiza con 15 mL de buffer de lisis pero con 20 mM
de Imidazol pH 8 y el segundo con buffer de lisis con 50 mM de imidazol pH 8. Finalmente
se eluye con 2 mL de buffer de lisis y 500mM de imidazol. La elusin se dializa en un litro
de 25 mM Tris pH 8.0, 175mM NaCl y 50% glicerol y se almacena a -20 C.

21

8. RESULTADOS Y DISCUSIN
8.1 Diseo de construcciones
El gen de la ADNpol de S. cerevisiae codifica para una protena de 1254 aminocidos. La
ANDpol tiene alta homologa con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli,
tanto en el dominio con actividad exonucleasa como en el dominio con actividad de
polimerasa. En comparacin con el fragmento Klenow de aproximadamente 600
aminocidos, la ADNpol tiene el doble de tamao, como responsables de lo anterior se
encuentran dos extensiones en la parte amino y carboxilo terminal de cerca de 150
aminocidos respectivamente, as como una ms en el subdominio del pulgar que es
anlogo al dominio de unin a tioredoxina de la T7ADNpol. Previos estudios en otras ADN
polimerasas han indicado que la presencia de extensiones en las regiones amino o
carboxilo terminal son importantes para interacciones protena-protena e indispensables
para la funcin de polimerizacin.

Figura 5. Diseo de construcciones a partir de la secuencia

de aminocidos de la ADNpol y el fragmento Klenow

Con base a este racional se disearon 2 deleciones en el N-terminal, la 102 y la 124. La

delecin 124 es similar al sitio proteoltico del Fragmento Klenow y al sitio de inicio del
dominio N-terminal de la T7ADNpol.

22

8.2 Diseo de los oligonucletidos

Los oligonucletidos se disearon para amplificar el gen completo y las dos deleciones de
102 y 124 aminocidos respectivamente. stos se disearon en base a la secuencia de
nucletidos de la ADNpol (ANEXO II)

Figura 6. Diseo de oligonucletidos para amplificar el gen

de la ADNpol y sus deleciones en el N-terminal

Dado que deseamos amplificar una zona especifica de ADN, los oligonucletidos son fijos,
es decir tienen un principio determinado. Lo nico con lo que podemos experimentar es
con la longitud de los mismos. El oligonucletido N-terminal completo y la delecin I tienen
una longitud de 20 nucletidos que se aparean a la secuencia de la ADNpol. El
oligonucletido N-terminal correspondiente a la delecin II tiene una longitud de 23
nucletidos. Fue necesario darle una extensin extra de 3 nucletidos debido a que la
secuencia de nucleotdica donde se ubica sta es muy poco heterognea. Los
oligonucletidos N-terminal fueron diseados para incorporar el sitio de restriccin NheI y
el C-terminal para incorporar el sitio de restriccin SacI (sitios subrayados) y una secuencia
extra de 5 nucletidos para hacer mas eficiente el corte con las enzimas de restriccin.

23

8.3 Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de delecin de la ADNpol de

S. cerevisiae por medio de la PCR
Para llevar a cabo nuestros experimentos se decidi amplificar el gen completo as como a
dos deleciones N-terminal de la ADNpol por medio de una PCR.

Figura 7. Amplificacin del gen completo y de dos mutantes de

delecin de la ADNpol de S. cerevisiae. Lnea 1) gen completo de
3762 nucletidos, 2) Delecin 102 de 3 456 nucletidos, 3) Delecin
124 de 3390 nucletidos. El marcador de peso molecular de 1 kb
(New England Biolabs) muestra que los productos de amplificacin
corresponden al tamao esperado

Entre las mltiples ADN polimerasas para llevar a cabo la amplificacin del gen se decidi
utilizar la enzima Pfu (Stratagene) ya que es superior a enzimas como la TaqADNpol,
primero porque tiene mayor fidelidad y segundo porque no tiene propiedad 3 terminal (es
decir no agrega poli-Adeninas de forma no especifica al final del templado). El producto de
la PCR se puede observar por medio de un gel de agarosa teido con bromuro de etidio.
En la lnea uno se observa una banda de 3762 nucletidos que corresponde al gen
completo de la ADNpol de S. cerevisiae, en la lnea 2 se observa una banda que
corresponde a un peso aproximado de 3456 nucletidos que corresponde a la Delecin I
( 102 aminocidos) y en la lnea 3 se observa una banda que corresponde a 3390
nucletidos que corresponde a la Delecin II ( 124 aminocidos). Los pesos relativos se
pueden deducir al comparar la migracin electrofortica en relacin a un marcador de peso
molecular de 1 kb (New England Biolabs).

24

8.4 Reaccin de ligacin del gen completo y las dos mutantes de delecin de la
ADNpol de S. cerevisiae en el vector pET28a(+)
Para llevar a cabo la ligacin de genes recombinantes en vectores de expresin es
necesario el obtener ADN plasmdico de forma pura (Figura 8, lnea 2), una vez obtenido el
plsmido de forma pura se procede a cortar con las dos enzimas NheI y SacI en las cuales
se desea subclonar, previamente se corri el ADN cortado en un gel de agarosa.

Figura 8. Reaccin de ligacin de dos mutantes de delecin y el gen

completo de la ADNpol. Lnea 1) plsmido pET28a cortado con
NheI y SacI, 2) plsmido pET28a superenrrollado, 3) marcador de
peso molcular de 1 kb NEB, 4) producto digerido de la delecin II,
5) producto digerido de la delecin I, 6) producto digerido del gen
completo de la ADNpol de S. cerevisiae

El peso molecular de un plsmido superenrrollado es relativamente menor a su peso real

(el cual corresponde al plsmido linear), esto se puede observar al comparar la migracin
electrofortica de las lneas 2 y 1. Los insertos a ser subclonados se cortan con las
enzimas de restriccin NheI y SacI y se eliminan las enzimas por medio de una
precipitacin en etanol. Una vez obtenidos tanto el inserto como el vector de forma pura
se procedi a mezclarlos en diversas concentraciones molares. Es importante el
mencionar que tpicamente se necesita un concentracin de aproximadamente 10 veces
mas inserto que vector para lograr una ligacin eficiente. La reaccin de ligacin se llev a
cabo a 16 C debido a que se aumenta la formacin y estabilidad de enlaces de puente de
Hidrgeno dbiles entre los extremos cohesivos del inserto y del vector, esto puede ser no
muy intuitivo porque la ADN ligasa tiene una actividad optima a 37 C, pero de qu
servira que fuera ptima si no tiene sustrato?

25

8.5 Identificacin de clones positivos

Una vez llevada a cabo la reaccin de ligacin se procedi a llevar a cabo

una

transformacin, es decir pasar este ADN a una bacteria. En nuestro caso se decidi utilizar
a la bacteria DH5 que ha sido transformada por medio de un protocolo con CaCl2. El
plsmido pET28 confiere resistencia a la kanamicina, por lo cual solamente las bacterias
que hayan atrapado el plsmido lograran sobrevivir en un medio ambiente con el
antibitico Kanamicina. Como es de esperarse obtuvimos un mayor nmero de colonias en
la ligacin que tuvo una proporcin de 1:12 de inserto versus vector.

Figura 9. Doble digestin con NheI y SacI de la mutante de delecin

II de la ADNpol de S. cerevisiae. Lneas 1 a la 6 representan 6
colonias (en este caso todas positivas), se observan dos bandas, una
inferior y otra superior que corresponde al plsmido pET28a de 5 369
nucletidos digerido. La banda ms intensa del marcador de peso
molecular corresponde a 3 kb y la inmediata superior a 4 kb

En las tres construcciones que obtuvimos procedimos a seleccionar colonias individuales y

crecerlas en 5 mL de medio LB suplementado con kanamicina. A partir de estos cultivos se
extrajo el ADN plasmdico y se digiri con las dos enzimas NheI y SacI, de esta doble
digestin se esperaba obtener fragmentos de entre aproximadamente 3 300 a 3 700 pares
de bases (lo anterior dependiendo de la clonacin de la enzima completa o las deleciones I
o II). Como se muestra en la figura 9, fuimos totalmente exitosos en lograr las
construcciones que buscamos. En esta figura presentamos un gel de agarosa
representativa de las 6 colonias que se ensayaron cuando buscamos clones positivos para
la Delecin II.

26

8.6 Expresin recombinante de la ADN polimerasa en E. coli

Nosotros nos enfocamos a estudiar la expresin recombnate de la ADNpol completa y la
delecin 124 (Nterm124) utilizando dos cepas de E. coli, la cepa BL21/DE3 y la cepa
BL21/DE3 Rosseta II. Ambas cepas expresan genes que estn bajo el control del promotor
de la T7 RNA polimerasa. La cepa BL21/DE3 Rosseta II contiene un juego extra de
codones que por lo general mejora la expresin de protenas de eucariontes en E. coli. En
experimentos preliminares observamos una mejor induccin en la cepa BL21/DE3 Rosseta
II en comparacin a la BL21/DE3.
Se llev a cabo la expresin de la protena truncada (Nterm124) en la cepa E. coli
BL21/DE3 Rosseta II en un plsmido pET28a. En la figura 10 se muestra el gel SDS-PAGE
al 10%, donde la M indica el marcador de peso molecular, en el carril 1 y 2 se muestra la
protena completa sin inducir e inducida respectivamente y de igual forma en el 3 y 4
mostramos la protena truncada sin inducir e inducida.

Figura 10. Gel SDS-PAGE que muestra la expresin recombinante de la

ADNpol de Saccharomyces cerevisiae. Lneas 1 y 2 muestran la construccin
completa, lneas 3 y 4 construccin Nterm124. Lneas 2 y 4 despus de la
induccin. La expresin de la protena se muestra con dos asteriscos

27

9. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO

Una de las metas de este trabajo es construir una quimera de la Taq DNA polimerasa
utilizando las propiedades de la ADN pol
Construccin de la quimera
Taq ADN pol /

Gen de la Taq
ADN polimerasa

Gen de la ADN
pol

Diseo de iniciadores para los

dominios flanqueantes con una colita
complementaria de el subdominio de la
ADN pol

Diseo del iniciador en

direccin 5 - 3 y 3 - 5
del subdominio del
pulgar

Amplificacin de los subdominios

flanqueantes de la Taq ADN pol
con colitas complementarias a la
pol

Amplificacin del
subdominio del pulgar

Reaccin de PCR con los amplificados

Quimera Taq ADN pol/

Figura 11. Metodologa para la construccin de la quimera

Taq ADN pol /

28

Figura 12. Esquematizacin ms detallada para la

construccin de la quimera Taq ADN pol /

29

Como perspectivas del trabajo se tiene que la ADN polimerasa es una enzima altamente
procesiva (se enlaza muy fuertemente al cido nucleico sin necesidad de un factor de
procesividad Tabla 1). Es del inters del laboratorio de bioqumica estructural el
entender como la ADN polimerasa es altamente procesiva y evaluar si se puede conferir
esta caracterstica a la ADN polimerasa de Thermus aquaticus o Taq polimerasa ya que es
una de las enzimas ms utilizadas en la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), interesndonos mucho ya que es una herramienta bsica en la investigacin
biotecnolgica debido a que es utilizada para amplificar de manera selectiva una regin de
ADN en la que tengamos especial inters.
Pese a que es una tcnica que revolucion en el mbito cientfico, como toda tcnica tiene
sus lmites, y uno de ellos es el tamao del fragmento que deseamos amplificar, por lo que
desearamos poder darle una posible solucin aplicando precisamente esta misma tcnica
y apoyndonos de estudios previos parecidos respecto a la procesividad de la ADN
polimerasa y mezclarlos con los de la Taq polimerasa para intentar construir una quimera
que satisfaga las necesidades de los pasos agigantados de la biologa molecular y por
ende los de la investigacin biotecnolgica.

30

10. CONCLUSIONES
El diseo in silico de los iniciadores fue clave, ya que tuvimos la fortuna que hubiera
ausencia de intrones en el gen de la ADNpol de S. cerevisiae por lo que la amplificacin
pudo ser directa.
La expresin se llev a cabo en las cepas BL21DE3 y BL21DE3 Rosseta II, sin embargo
se decidi que fuera en esta ltima posterior a la realizacin de un anlisis, del cual se
concluy que esta cepa al poseer un juego extra de codones mejorara la expresin de
nuestra enzima en un procarionte.
Nos enorgullece el logro de haber expresado por primera vez en forma recombinante en E.
coli una ADN polimerasa mitocondrial, ya que slo se tienen reportadas expresiones de
polimerasas en baculovirus y levaduras, siendo ms difcil y costoso su manejo, adems
no son de origen mitocondrial.
Este trabajo representa la primera vez en la cual una ADN polimerasa mitocondrial se ha
expresado de forma recombinante en E. coli. Los logros obtenidos en esta tesis son un
avance en nuestro entender de cmo funcionan las polimerasas de cidos nucleicos
mitocondriales y esperamos que en un futuro cercano podamos utilizar este aprendizaje en
el manipular las caractersticas de alta procesividad y desplazamiento de DNA de doble
cadena en la construccin de quimeras como herramientas biotecnolgicas.

31

11. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Seki, M; Masutani C; Yang, L. W; Schuffert A; Iwai S. and Bahar, I. and Wood, R. D.

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Issue 4, p: 1958-1964.

33

ANEXO I. SUPERPOSICIN DE LAS SECUENCIAS DE AMINOCIDOS DEL FRAGMENTO

KLENOW Y LA ADN POLIMERASA DE S. CEREVISIAE

ANEXO II. DISEO DE OLIGONUCLETIDOS DE LAS CONSTRUCCIONES N-TERMINAL

DE LA ADN POLIMERASA DE S. CEREVISIAE.

A) DISEO BASADO EN LA SECUENCIA DE NUCLETIDOS

Completa
atgacgaaattgatggttagatctgaatgcatgctgcgaatggtgcggcggcggccgctg
M T K L M V R S E C M L R M V R R R P L
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R V Q F C A R W F S T K K N T A E A P R
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I N P V G I Q Y L G E S L Q R Q V F G S
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C G G K D E V E Q S D K L M E L S K K S
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L K D H G L W G K K T L I T D P I S F P

Delecin I
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L P P L Q G R S L D E H F Q K I G R F N

Delecin II
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S E P Y K S F C E D K F T E M V A R P A
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A Y P D E E L V V F D V E T L Y N V S D
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K L G K P N L D I D S K V S Q Y A Y N Y
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R E P V F E E Y N K S Y T P E F L K Y F
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A K A V H S K K L P A R K S S T T N R N

Oligo C-terminal
taaagatctctcatgatc
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L V E L E R D I T I S R E Y -

B) LISTA DE OLIGOS
N-terminal
Completa
5 ggaag gctagc atgacgaaattgatggttag 3
Delecin I
5 ggaag gctagc ctacaaggcaggtcgctaga 3
Delecin II
5 ggaag gctagc cgaccggcggaatggctgcggaag 3

C-terminal
Constante
5 ggaag aagctt ctagtactctctagaaat 3

ANEXO III. SITIO DE CORTE DE LA ENZIMA DE RESTRICCIN NheI (catatg) EN

NUESTRA CONSTRUCCIN (DELECIN II - 124)

Completa
atgacgaaattgatggttagatctgaatgcatgctgcgaatggtgcggcggcggccgctg
cgtgtgcagttttgtgctcgatggttctccacaaagaagaataccgcagaagcacccagg
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Delecin I
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Delecin II
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Oligo C-terminal
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ttggttgagctggaaagggacattactatttctagagagtactag

ANEXO IV. MAPA DEL VECTOR pET28a(+)