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PILARES HISTRICOS
16/04/2016
azcar ribosa.
ARN monocatenario (ARNm,
ARNt, ARNr).
cido Desoxirribonucleico
circular).
Bases nitrogenadas: Adenina,
FACTORES INFLUYENTES:
Calidad de muestra.
Remover inhibidores.
Remover o inhibir nucleasas.
Priorizar el AN de inters
(ADN, ARN?)
anlisis.
Pureza requerida para
anlisis.
Tiempo disponible.
Presupuesto disponible.
Equipamiento adecuado.
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https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc
16/04/2016
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U
HOMOGENEIZACIN:
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U
HOMOGENEIZACIN:
16/04/2016
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U
HOMOGENEIZACIN:
Se requiere provocar lisis celular,
inactivar nucleasas intracelulares y
separar cidos nucleicos.
DIGESTIN ENZIMTICA:
Proteinasa K, lisozima
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2.
REMOCIN DE
PROTENAS:
Permite la eliminacin
progresiva de protenas y otros
contaminantes celulares.
Extraccin; fenol cloroformo
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ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE
PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Centrifugacin; ultra
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE
PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Cromatografa;
penetrabilidad, intercambio
inico, adsorcin selectiva.
16/04/2016
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE
PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Separacin por afinidad; unin
de cidos nucleicos a bolas
paramagnticas en presencia de
sales caotrpicas.
ETAPAS DE LA EXTRACCIN
3. PURIFICACIN:
16/04/2016
https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4
CUANTIFICACIN DE ANs
ANs y oligonucletidos
pueden cuantificarse en
soluciones acuosas midiendo
la absorbancia A (DO) de luz
UV.
Utilizar una muestra blanco
o patrn.
ANs absorben a 260 nm.
Protenas absorben a 280 nm.
Contaminantes
(carbohidratos, pptidos,
fenoles, compuestos
aromticos, otros.) absorben
a 230 nm.
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CUANTIFICACIN DE ANs
A 260 nm, A = 1, corresponden:
MEDICIN DE PUREZA
Cociente de pureza: A260/A280. (ADN puro 1.8; ARN
puro 2.0).
A 260 / A 280 < 1,7 Contaminacin con protenas
A 260 / A 280 > 1,7 < 2 Buena calidad
A 260 / A 280 > 2 Contaminacin con fenoles, cloroformo, etc,
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la muestra
Buena calidad: migracin
28S
18S
100 50 25 ng
Genomic DNA
markers
Degraded RNA
5S rRNA, tRNA,
and other small
RNA molecules
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