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16/04/2016

TEMA 3: EXTRACCIN, PURIFICACIN Y


CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS

Genetista y Btlgo. Ruy Chacn Villanueva

PILARES HISTRICOS

1953: Modelo de ADN de Watson y Crick

16/04/2016

ESTRUCTURA Y COMPOSICIN DE LOS


CIDOS NUCLICOS (ANs)
cido Ribonucleico (ARN)

azcar ribosa.
ARN monocatenario (ARNm,

ARNt, ARNr).
cido Desoxirribonucleico

(ADN) azcar desoxirribosa.


ADN bicatenario (lineal o

circular).
Bases nitrogenadas: Adenina,

Timina, Guanina, Citosina,


Uracilo.

ASPECTOS ESENCIALES PARA UNA BUENA


EXTRACCIN DE AN
OBJETIVOS:

FACTORES INFLUYENTES:

Maximizar la cantidad de Ans.

Calidad de muestra.

Maximizar la calidad de ANs.

Cantidad requerida para

Remover inhibidores.
Remover o inhibir nucleasas.
Priorizar el AN de inters

(ADN, ARN?)

anlisis.
Pureza requerida para
anlisis.
Tiempo disponible.
Presupuesto disponible.
Equipamiento adecuado.

16/04/2016

INHIBIDORES DE PCR EN ANs

AISLAMIENTO DE ADN: Animacin

https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc

16/04/2016

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U

HOMOGENEIZACIN:

Se requiere provocar lisis celular,


inactivar nucleasas intracelulares
y separar cidos nucleicos.
MTODOS FSICOS:

trituracin, choque osmtico:


lisis hipotnica, choque
trmico, sonicacin.

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U

HOMOGENEIZACIN:

Se requiere provocar lisis celular,


inactivar nucleasas intracelulares
y separar cidos nucleicos.
MTODOS QUMICOS:

(detergentes: SDS, agentes


caotrpicos, reduccin con
tioles).

16/04/2016

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
1. LISIS CELULAR U

HOMOGENEIZACIN:
Se requiere provocar lisis celular,
inactivar nucleasas intracelulares y
separar cidos nucleicos.
DIGESTIN ENZIMTICA:

Proteinasa K, lisozima

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2.

REMOCIN DE
PROTENAS:

Permite la eliminacin
progresiva de protenas y otros
contaminantes celulares.
Extraccin; fenol cloroformo

para eliminacin de protenas,


salting out con acetato de
potasio, acetato de amonio.

16/04/2016

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE

PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Centrifugacin; ultra

centrifugacin con gradientes.

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE

PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Cromatografa;
penetrabilidad, intercambio
inico, adsorcin selectiva.

16/04/2016

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
2. REMOCIN DE

PROTENAS:
Permite la eliminacin progresiva
de protenas y otros
contaminantes celulares.
Separacin por afinidad; unin
de cidos nucleicos a bolas
paramagnticas en presencia de
sales caotrpicas.

ETAPAS DE LA EXTRACCIN
3. PURIFICACIN:

Separa los cidos nucleicos de


detergentes y sales.
Fase de precipitacin; con
etanol fro o isopropanol.
Lavado de pellet; alcohol fro y
centrifufado.
Recuperacin o resuspensin:
en agua o tampn.

16/04/2016

AISLAMIENTO DE ADN: Ejemplo en Plantas

https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4

CUANTIFICACIN DE ANs
ANs y oligonucletidos

pueden cuantificarse en
soluciones acuosas midiendo
la absorbancia A (DO) de luz
UV.
Utilizar una muestra blanco
o patrn.
ANs absorben a 260 nm.
Protenas absorben a 280 nm.
Contaminantes
(carbohidratos, pptidos,
fenoles, compuestos
aromticos, otros.) absorben
a 230 nm.

16/04/2016

CUANTIFICACIN DE ANs
A 260 nm, A = 1, corresponden:

50 g/ml de ADN bicatenario.


37 g/ml de ADN monocatenario.
40 g/ml de ARN.
20 g/ml de oligonucletidos.

MEDICIN DE PUREZA
Cociente de pureza: A260/A280. (ADN puro 1.8; ARN

puro 2.0).
A 260 / A 280 < 1,7 Contaminacin con protenas
A 260 / A 280 > 1,7 < 2 Buena calidad
A 260 / A 280 > 2 Contaminacin con fenoles, cloroformo, etc,

16/04/2016

MEDICIN DE CALIDAD - DEGRADACIN


Corrida de un gel de agarosa de

la muestra
Buena calidad: migracin

homognea a manera de banda.


Mala calidad: migracin

heterognea a manera de sombra.


Ausencia: sin bandas ni sombras.

CONTROL DE CALIDAD DE ANs


DNA

28S
18S

100 50 25 ng
Genomic DNA
markers

Degraded RNA

5S rRNA, tRNA,
and other small
RNA molecules

mRNA = background smear


high low MW

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Gracias por la atencin

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