Exclusin Molecular

Fase estacionaria: es un slido o lquido colocado sobre un slido que sirva como soporte a la
prueba.
Fase mvil: es la fase que se mueve, o atraviesa a la columna en direccin definida.
Cromatograma: representacin grfica del resultado de la cromatografa. En el caso de obtener
una buena separacin lo diferentes picos del cromotograma corresponden a los componentes de
la mezcla separadas.
Cromatografa lquido-lquido: la fase estacionaria es un slido recubierto por un lquido que
generalmente es polar y una fase mvil constituida por otro lquido que generalmente no es polar.
Volumen muerto (Vo): volumen del lquido requerido para eluir una sustancia que sea excluida
complentamente del gel, es decir, que no penetra en las partculas del gel.
Volumen de elucin (Ve): volumen necesario para eluir el compuesto de la columna. El volumen
de elucin atraviesa la columna desde que se siembra la muestra, hasta que la elucin del soluto
de mayor masa molecular este fuera de la columna.
Volumen interno (Vi): es el volumen interno de las partculas porosas, que contienen la fase
mvil.
Kd: relacin entre la diferencia entre los volmenes de elucin y el volumen interno de los poros.
Este coeficiente osicla entre 0 y 1. Cuando su valor es nulo, es soluto es totalmente excluido, por
lo que el volumen de elucin coincide con el volumen muerto.
Lmite de exclusin de un gel: es el tamao mnimo para que el soluto sea excluido. Cuado Kd=1 el
soluto tiene la mxima penetrabilidad (movilidad) entre los poros, por lo que el volumen de
elucin coincidir con el volumen total de la fase mvil dentro de la columna.
Cul es el fundamento de la cromatografa de exclusin molecular? sta es una tcnica de
cromatografa lquido-lquido. El fundamento de esta tcnica se basa en el tamao de las
sustancias a separar.
La prueba consiste en dejar pasar las sustancias disueltas en un buffer adecuado por una columna
de grnulos de un material inerte, conocido.
Las sustancias de menor volumen penetraran en los grnulos, y las que no pueden penetrar irn
bajando por la columna a velocidades diferentes relacionadas con su tamao.
Formulas:
Vt = Vo+Vg+Vi Vi= a x Wr Ve= Vo+(Kd x Vi)
Prctica:

Kd= Ve+Vo/Vi V=pi r2h R= 2(Ve2-Ve1)/Wb1+Wb2

1) Calculamos el volumen del lecho de la columna V=pi r2h = 9,70mL=Vt

2) Medimos la absorbancia a 625 y 450 Graficamos.
3)Calculamos a.
promedio de a.

15mL --- 1g; 9,7mL---X=0,64; Lo mismo con 20mL, promedio. Calculo del

4) Calculamos Vi.
5) Clculo de Vo. 1,5 mL x 5fracciones=7,5mL
6) Vg. Calculo Vt = Vo+Vg+Vi
7) Vs. Vs=Ve-Vo (Acuerdate que es lo que indica la grafica)
8) Calculo de Kd. Si Kd es mayor a 1, esto nos indica que existen interacciones hidrofobicas con el
gel.
9) Clculo del volumen teorico Vx=Vg+Vi--- Vg=Vx-Viigual con 20mL; 15mL y el promedio. Sacar
promedio
10) La resolucin con la formula (Wb son el nmero de fracciones x los mililitros del los tubos,
1,5x6= 9 o 1,5x4=6. Mayor a 1 se obtiene una buena resolucin, es decir que los picos de elucin
estn separados.
Se ha comparado que existe una relacin lineal entre Ve y log del peso molecular de la protena,
por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elucin de una protena desconocida, para llevarlo
a una recta de calibracin y deducir aproximadamente el peso molecular.
Log 2x106=6,3 ; calcular Kd.
Intercambio Ionico.
Cul es el principio de la cromatografa de intercambio ionico? El principio de este mtodo es la
separacin sobre la base de las cargas que se presentan las molculas. Este mtodo emplea una
columna empacada con una resina insoluble. En la parte superior de la columna se carga con una
disolucin de mezcla de aminocidos o protenas, y se hacen pasar por una columna una serie de
disoluciones amortiguadoras de pH que aumenta progresivamente. Los aminocidos se separan
porque atraviesan la columna con una distinta rapidez.
Se debe mencionar que en este tipo de cromatografa se conserva los analitos basndose en las
interacciones de la columna cromatogrfica de intercambio catinico que retiene cationes
cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargados
negativamente, por lo tanto, la cromatografa de intercambio inico retiene aniones usando grupo
funcionales cargados positivamente. FM: disolucin acuosa; FE: Intercambiador inico.

Qu es un intercambiador catinico? Un intercambiador es un polmero que tiene grupos

cargados unidos. Si este grupo est cargado negativamente podr intercambiar cargas positivas y
ser un intercambiador cationico.
Prctica.
Primero eluyo el A.Glutamico ya que su pI es de 3,22 a un buffer 6,8 presentar una carga
negativa y como el intercambiador cationico est cargado negativamente estos se repelan y eluye
primero, mientras que la histidina a este pH sus cargas son positivas, por lo que son retenidas.
La nihidrina permite cuantificar la cantidad de aa ya que esta reconoce los grupos aminos libres,
como los aa presentan dichos grupos, la nihidrina podr reaccionar con ellos cuantificando as la
cantidad de aa presentes. A mayor coloracin, mayor concentracin.
Problemario:
Los aa polares cargados negativamente (Asp) o neutros (Thr y Ser) eluieran primero porque la
resina tiene grupos con cargas negativas unidos a anillos bencnicos no polares. Los aa con cargas
positivas (Lys, Arg, His) o que tengan en su cadena lateral anillos aromticos que interactan con
la resina (Phe y Tyr) quedarn ms retenidos en la columna. Se encontraran Ve intermediarios
para el Glu cargado negativamente y con una cadena ms larga que el Asp, la Pro un aa que tiene
una estructura en anillo no polar y los aa con grupos R, no polares de menor tamao (Gly y Ala) y
las cadenas alifticas grandes (Val, Met, Ile,Leu) que interactan con la resina, tambin de
naturaleza hidrofobica.
El punto isoelctrico es el pH al que un polianflito tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminocidos y
tambin en lasprotenas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.
Para calcularlo se deben utilizar los pKa.

Enzimas
Competitva: tanto el sustrato como el inhibidor se ajustan al sitio activo. El inhibidor
competitivo compite con el sustrato por el sitio activo.
No competitiva: El inhibidor se une a un lugar de la superficie enzimtica distinto del
lugar del sustrato.
Lpidos
Mayor que
Esfingomielina; Fosfotidilserina; Fosfotidilcolina; Fosfodiletanomina; Colestero; Esteres de
colesterol.
Ninhidrina: reacciona con los grupos amino primarios de los esfigonlpidos y los fosfolpidos.
Azul de Moliibdeno: Reacciona con los fosfolpidos
Molish: Reaccin con el furfural e hidroxil-furfural con alfa naftol dando lugar a derivados de calor
purpura. Esta prueba en general se usa para carbohidratos.

Mezcla de cido sulfrico-anhdrido actico: Reacciona con el colesterol.

TLC: Cromatografa de adsorcin, por lo tanto, una cromatografa lquido-slido, debido a que el
soluto a separar eluye con el solvente utilizado (FM) dependiendo de su afinidad con el
absorbente (FE) generadose una competencia entre FM y FE.
Problemario:
2gyema40mL cloroformo metanol; 25gyema X=500mL
500x2/3=333,33ml de cloroformo
0,05g lpidos 5mL clorofomico; 333,33mL X=3,33 g lpidos
25g tejido 3,33g lpido; 100g tejido X=13,32

Carbohidratos
Molish: Reaccin de furfural e hidroximetil-furfural con alfa-naftol dando lugar a
derivador de color prpura. Es una prueba general para carbohidratos. Positiva
coloracin violeta. Incoloro.
Iodo: Permite identificar a los polisacridos, ya que reacciona con cadenas
lineales de amilasa formando un complejo azul intenso Almidn (+); Marrn (-).
Benedict: permite identificar azcares reductores formando una coloracin azul (). En soluciones alcalinas pueden producir Cu+2 que tiene un color azul a Cu+;
que precipita de la solucin alcalina Cu2O de color naranja-rojo. Sacarosa (-).
Barford: permite identificar a los monosacridos. Se basa en la reduccin de
cobre (II) a cobre (I), el cual forma un precipitado color ladrillo. Los disacridos
reaccionan pero ms lento. Debido al grupo aldehdo del monosacarido que se
encuentra en forma de hemicetal se oxida su a.carboxilico.
Tauber: Identificacin de los azcares pentosa. Produce una coloracin cereza
cuando se calienta con una solucin de bencina en cido actico glacial. Xilosa
(+).
Seliiwanoff: reaccin del furfural e hidroximetil furfural con resorcinol, dando lugar
a derivados de color rosa-rojo. Es una prueba especfica de hexosas. Las cetosas
se deshidratan ms rpido que las aldosas, por lo que ambos grupos pueden
diferenciarse en funcin del tiempo que tarda en aparecer el producto coloreado
Ensayo de cido fosfrico: Identifica a los disacridos que una de sus molculas
es fructosa. Debido a que hidroliza al disacrido amarillo.