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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA FORESTAL

PROPAGACIN CLONAL DE LA TECA (Tectona grandis L.)


MEDIANTE CULTIVO IN VITRO

Alumnos

AQUINO HERRERA, John


CARLOS JANAMPA, Rogelio
MEZA SANABRIA, Mara

Docente

Dr. POCOMUCHA POMA, Vicente

Curso

BIOTECNOLOGA FORESTAL

TINGO MARA-PER
2015

I.

INTRODUCCIN

La teca (Tectona grandis L.) est considerada entre las cinco


primeras especies maderables de mayor importancia a nivel mundial y en Cuba
se encuentra dentro de las 21 especies forestales priorizadas por el sector
estatal forestal para el fomento de plantaciones comerciales por lo que existe la
necesidad de incrementar el nmero de posturas para en corto perodo de
tiempo garantizar la demanda de la industria agroforestal.
Debido a la baja eficiencia de los mtodos tradicionales de
propagacin el cultivo in vitro se ha convertido en el mtodo ms promisorio
para la propagacin clonal de plantas de teca a gran escala con alta
uniformidad y en un corto perodo de tiempo (Tiwari et al., 2002). Sin embargo,
aunque se han desarrollado diversos trabajos para la propagacin in vitro de la
teca a partir de semillas germinadas in vitro y cultivo de pices procedentes de
brotes de rboles adultos (Tiwari et al.,2002; Castro et al., 2003;
Gangopadhyay et al., 2003; Yasodha et al., 2005), an persisten dificultades
con el coeficiente de multiplicacin, la susceptibilidad de los brotes a la
hiperhidricidad y la fenolizacin, as como el bajo porcentaje de enraizamiento
in vitro, por lo que se hace necesario realizar estudios que permitan mejorar la
propagacin a escala comercial de esta especie (MENDOZA et al., 2007).
Por otro lado, los pases donde se cultiva la teca (India, Myanmar,
Tailandia, Laos, Costa rica, entre otros) han desarrollado sus propios
protocolos de propagacin in vitro a partir de materiales seleccionados. En
Cuba tambin se han descrito dos protocolos a escala experimental, tanto a
partir de material juvenil (Ramrez et al.,2003) como material adulto (Daquinta
et al., 2001).

Sin embargo, todos estos protocolos se basan en el empleo de los


medios de cultivos semislidos, por lo que tienen como desventajas que los
coeficientes de multiplicacin son limitados, los altos costos por mano de obra y
el uso de agentes gelificantes que limita la posibilidad de automatizacin.
Por otro lado, en el caso de las plantas leosas las condiciones
estticas en las cuales se desarrolla el cultivo in vitro convencional no permiten
emplear medios de cultivo lquidos, debido a la alta susceptibilidad de estas
especies a desarrollar la hiperhidricidad. Con el empleo de los sistemas de
inmersin temporal (SIT) durante la etapa final del cultivo in vitro se podra,
siempre y cuando se controle la hiperhidricidad, aprovechar las ventajas de los
medios de cultivos lquidos y al mismo obtener plantas de mejor calidad.
El presente trabajo tuvo como objetivos:
Obtener un protocolo propagacin clonal de rboles adultos de Tectona
grandis en medios de cultivo semislidos.
Determinar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en la
multiplicacin, la morfo-anatoma y la fisiologa y la supervivencia ex
vitro de brotes de teca cultivados en Sistemas Inmersin Temporal.
Determinar el efecto del 6-BAP en la induccin de cambios morfoanatmicos, fisiolgicos y la respuesta hiperhdrica de los brotes.
Identificar

protenas

expresadas

diferencialmente

en

los

brotes

cultivados en los SIT, durante la induccin de la respuesta hiperhdrica.

II.
2.1.

REVISIN DE LITERATURA

Descripcin de la especie (Tectona grandis L.f)


2.1.1. Nomenclatura
Reino

: Plantae

Subreino

: Embryobionta

Divisin

: Magnoliophyta

Clase

: Magnoliopsida

Subclase

: Asteridae

Orden

: Lamiales

Familia

: Verbenaceae

Gnero

: Tectona

Especie

: grandis

2.1.2. Nombres Comunes


La especie es conocida ampliamente como Teca en la mayora de
los pases donde se ha introducido. En la India, se le conoce como sagun,
sagon, saguan, skhu, toak, Indian oak. Como Teck (Francia, Inglaterra y
Holanda); jati, deleg y kulidawa (Indonesia); kyun (Birmania); sak y mai-sak
(Laos y Tailandia), teca de Rangn, rasawa. (FONSECA, 2004).

2.1.3. Distribucin Natural


Tectona consta de 3 especies, con una distribucin natural del
gnero discontinua, muchos autores citan que la especie es originaria del
sureste asitico (Birmania, ahora Myanmar, Tailandia y de la India, Malasia,
Java, Indochina, La Repblica Democrtica Popular Laos), entre los 12 y 25
latitud norte y de 73 a 104 longitud este.
Tambin se ha encontrado al sur del Ecuador en Java y en algunas
pequeas islas del Archipilago Indonesio. Se menciona que la especie fue
introducida en Java hace 400 o 600 aos, donde se naturaliz.
En la zona de distribucin natural, los bosques son de tipo
monznico, abarcando bosque seco tropical y bosque hmedo tropical. En la
India se encuentra asociada con 76 especies, dentro de las que se citan: Xylia
dolabriformis, X. kerrii, Largeostremia caluculata, L. balasoe, Bombax insigne,
cinco especies de Terminalia, tres especies de Stereospermum, Acacia,
Cassia, Dipterocarpus, Cederia, Eugenia, Gmelina arborea, Vitex peduncularis,
Dalbergia sp, Crotn oblongifolius, entre otras. (FONSECA, 2004)
2.1.4. Distribucin Artificial
Por la calidad de la madera, Tectona ha sido introducida en una
gran cantidad de lugares que tienen clima tropical, entre los 18 y 28 latitud
norte. En el sureste de Asia, en Indonesia, Sri Lanka, Vietnam, Malasia, Islas
Solaman, en algunos pases africanos como Costa de Marfil, Nigeria y Togo.
En Amrica Tropical fue introducida primero en Trinidad entre 1913
y 1916, con semillas procedentes de Tenasserim en Burma (Myanmar). Esta
procedencia ha sido ampliamente distribuida, exportndose semilla de Trinidad
a Belice, Republica Dominicana, Jamaica, Costa Rica, Cuba, Colombia ,
Venezuela, Hait, Puerto Rico, Ecuador, Guayana Francesa y Mxico.
La especie se introdujo en Amrica Central, en Panam en 1926
con semilla procedente de Sri Lanka, de esta procedencia se enviaron semillas

a la mayora de pases de Amrica Central y el Caribe. Otros pases en donde


se han establecido plantaciones son Brasil, Per, Salvador, Honduras, Bolivia,
Ecuador y Jamaica. (FONSECA, 2004).
La especie se introdujo en Amrica Central, en Panam en 1926
con semilla procedente de Sri Lanka, de esta procedencia se enviaron semillas
a la mayora de pases de Amrica Central y el Caribe. Otros pases en donde
se han establecido plantaciones son Brasil, Per, Salvador, Honduras, Bolivia,
Ecuador y Jamaica. (FONSECA, 2004)
2.1.1. Descripcin Botnica
Tectona grandis L. f, es una especie latifoliada que pertenece a la
familia Verbenaceae. Es un rbol grande, deciduo, que puede alcanzar ms de
50 m de altura y 2 m de dimetro en su lugar de origen.
Es un rbol de fuste recto, con corteza spera y fisurada de 1,2 mm
de espesor, de color caf claro que desfolia en placas grandes y delgadas. Los
rboles generalmente presentan dominancia apical, que se pierde con la
madurez o cuando florece a temprana edad, originando una copa ms amplia
con ramas numerosas.
Las hojas son simples, opuestas, de 11 a 85 cm de largo y de 6 a
50 cm de ancho, con pecolos gruesos. Inflorescencia en panculas terminales
de 40 cm hasta 1,0 m de largo. Flores de cliz campanulado, color amarillo
verdoso, de borde dentado, los ptalos se juntan formando un tubo corto, 5 o 6
estambres insertados debajo del tubo de la corola, anteras amarillas, ovadas y
oblongas. Estilo blanco amarillento, ms o menos pubescente con pelos
ramificados, estigma blanco amarillento bfido, ovario ovado o cnico,
densamente pubescente, con cuatro celdas. El fruto es subgloboso, ms o
menos tetrgono, aplanado; exocarpo delgado, algo carnoso cuando fresco y
tomentoso; endocorpo grueso, seo, corrugado con cuatro celdas que
encierran generalmente 1 o 2 semillas de 5 mm. de largo.

La produccin de semillas frtiles se presenta entre los 15 y los 20


aos, sin embargo, en algunos casos se da una floracin temprana entre 5 y 8
aos.
Presenta una raz pivotante gruesa y larga que puede persistir o
desaparecer, pero forma numerosa y fuerte races laterales. Las races son
sensibles a la deficiencia de oxgeno, de ah que se encuentran a poca
profundidad (primeros 30 cm) creciendo en suelos bien drenados. En los
primeros 30 cm de suelo se encuentra el 65 a 80% de la biomasa radical fina,
mientras que la produccin anual de biomasa radical fina es de 5420 kg/ha.
(FONSECA, 2004)

Figura 1.

Caractersticas morfolgicas de la Teca


2.1.2. Sitios ptimos
Demuestra que los mayores crecimientos se dan en sitios con

altitudes menores a 500 msnm, con una estacin seca marcada de 4 a 6


meses, entre 23 y 27 C de temperatura y una precipitacin de 1300 y 2500
mm/ao.

Los mejores sitios son aquellos con una pendiente media (menor
al 25 %), al pie de monte o en el fondo de valles, con suelos de textura liviana,
bien drenados, frtiles, neutros, con una profundidad efectiva mayor a 80 cm,
con alto contenido de calcio (Ca), fsforo (P) y magnesio (Mg).
Los sitios buenos deben tener entre 150 y 160 ppm de P total , al
menos 15 ppm de Mn), hasta 2 ppm de zinc (Zn) y ms de 10 c mol/l de Ca
+Mg + K/100 gr de suelo, en los primeros 10 cm profundidad del suelo; una
relacin Ca/CIC pH 7 mayor al 50% entre 20 y 30 cm de profundidad y una
relacin Mg/CICE superior al 15-20% en los primeros 10 cm profundidad del
suelo. Bajo estas caractersticas, los sitios buenos son aquellos que tienen un
porcentaje de saturacin de acidez menor a 5,8% y un porcentaje de saturacin
de calcio mayor a 67%. (FONSECA, 2004).
2.1.3. Requerimientos Ambientales y Rango de Distribucin
2.1.3.1. Temperatura
En el rea de distribucin natural, en la India, crece en lugares con
temperaturas entre 13 C y 40 C, con una media de 24 C. Sin embargo, para
un ptimo desarrollo se considera una temperatura media de 25 C, con un
rango 24-30.
2.1.3.2. Precipitacin
Se reporta un amplio rango de precipitacin que va desde 1000 a
3750 mm/ao, con una poca seca bien definida de 3 a 5 meses, con extremos
de 500 a 5000 mm/ao.
Condiciones muy hmedas pueden conducir a mayor crecimiento y
a la produccin de madera de menor calidad, debido a un mayor porcentaje de
albura, color menos atractivo, textura ms pobre, prdida de fuerza y menor
densidad.

2.1.3.3. Suelos
Se adapta a gran variedad de suelos, pero prefiere suelos planos,
aluviales, de texturas franco-arenosas o arcillosas, profundas, frtiles, bien
drenados y con pH neutro o cidos. Es exigente de elementos como calcio,
fsforo y magnesio.
Las plantaciones de teca mejoran la calidad de los sitios, en
Tailandia se ha determinado incrementos de materia orgnica en plantaciones
de cuatro aos, y al ao 15 haba aumentado el pH, la capacidad de
intercambio catinico (CIC), el fsforo (P), potasio (K), calcio (Ca) y el
magnesio (Mg).
2.1.3.4. Altitud
Tectona crece desde 0 a 1000 msnm. En Centro Amrica se ha
ensayado desde 16 m hasta 600 m, mientras en Costa Rica las plantaciones
ms grandes en altura se encuentran a pocos metros sobre el nivel del mar.
(FONSECA, 2004).
2.1.4. Caractersticas y Propiedades de la Madera
La teca ha ganado gran reputacin a nivel mundial debido a la alta
calidad por su atractivo y durabilidad, a que posee gran resistencia al ataque de
hongos e insectos y, por sus excelentes caractersticas, se considera como una
de las ms valiosas del mundo.
La albura es amarillenta blancuzca o plida, el duramen es de color
verde oliva, moreno o dorado, con vetas ms oscuras, al cortarse se torna caf
oscuro. La madera es moderadamente dura, pesada, con mucha resistencia y
presenta anillos de crecimiento. La madera adulta tiene un aceite natural
antisptico que la hace muy resistente y la protege del ataque de insectos y
hongos. Su grano es recto, algunas veces ondulado, de textura gruesa,
accidentada o irregular y anillo poroso.

La teca es una madera fina, a pesar de que contiene slice es fcil


de trabajar, no presenta problemas de secado, posee buena durabilidad natural
y estabilidad dimensional, su carcter no corrosivo se debe a que posee
aceites naturales, estos aceites la hacen resistente a termitas y a hongos.
La Teca presenta buenas caractersticas de cepillado, moldurado,
perforacin, atornillado, clavado y lijado. Posee buenas condiciones de
trabajabilidad y de fcil aplicacin de acabados, fcil de encolar y recibe bien el
barniz, pinturas, tintes, selladores.
La teca presenta una proporcin de duramen de 55% a los 30
aos,

aumentando

logartmicamente

conforme

avanza

edad

consecuentemente conforme aumenta el dimetro.


La densidad bsica de la madera aumenta con la edad y a mayor
densidad de la plantacin. Tambin aumenta el porcentaje de duramen, las
propiedades mecnicas y la razn de contraccin.
Existen controversias sobre la calidad de la madera segn la altura
y el grosor del rbol; algunos investigadores no han encontrado diferencias en
las caractersticas de la madera del duramen conforme aumenta la altura del
rbol y hacia el exterior de la madera, mientras otros, determinaron diferencias
marcadas en el peso especfico de la mdula hacia la corteza, lo cual puede
traducirse en menor resistencia de la madera cerca de la mdula. Tambin se
menciona que crecimientos muy acelerados al inicio pueden afectar
negativamente la durabilidad.
Tambin se ha originado discrepancias sobre la calidad de la
madera de plantaciones y la de bosque natural. Se afirma que las propiedades
de la madera de plantaciones son menores a las mostradas en bosque natural,
posiblemente debido a que se cortan los rboles a menor edad. Su durabilidad
natural se ve reducida, es de un color ms apagado, ms clara y ms uniforme,
menos aceitosa a la vista y menos agradable al tacto.

Contrariamente, estudios recientes demuestran que la disminucin


del ciclo de corta no afecta las propiedades fsicas, encontrndose
caractersticas similares en densidad y resistencia en rboles de 13 a 21 aos y
de 55 y 65 aos. (FONSECA, 2004).
2.2.

Micropropagacin

La micropropagacin consiste en:


a) desinfectar el explante en una solucin de hipoclorito de sodio o de
calcio, cloruro de mercurio o etanol
b) sembrarlo en un medio de cultivo in vitro hasta que se produzcan
nuevos brotes y
c) enraizair los brotes hasta obtener plantas completas.
La propagacin en campo e invernaderos es sencilla pero requiere
tiempo y espacio y no garantiza que las plantas obtenidas sean sanas y
genticamente idnticas a las originales.
La propagacin in vitro resuelve estos problemas y permite
propagar muchas especies, incluso las que se reproducen por semilla,
resultando ms conveniente.
2.2.1. Ventajas de la propagacin In Vitro
Dentro de las especies leosas, las ms extensivamente
estudiadas en los ltimos aos han sido las forestales, especialmente los
maderables por su gran valor comercial (ROCA Y MROGINSKI, 1991; Muoz,
2003; Prez et al., 2004).
Los programas de mejoramiento gentico tradicionales en especies
forestales no han tenido repercusiones trascendentales en la urgente
necesidad de reforestacin o de acortar el tiempo de obtener rentabilidad en las
producciones comerciales, debido principalmente al largo ciclo de estas
especies desde la siembra de la semilla hasta la floracin.

Las tcnicas de micropropagacin han demostrado ser una


importante alternativa para la solucin de algunos de los problemas
anteriormente referidos.
El mtodo de diferenciacin de brotes adventicios es ms comn
que la embriognesis somtica, y tiene mayor potencialidad para una
propagacin masiva que el estmulo de las yemas axilares. Actualmente son
pocos los antecedentes que muestren un xito de la embriognesis somtica
en especies forestales (ROCA Y MROGINSKI, 1991).
Para fines de propagacin, se prefiere producir brotes directamente
del explante, ya que a partir de callos su formacin ha sido muy difcil y
frecuentemente genera anormalidades. En la diferenciacin de brotes
adventicios existe una interrelacin entre el explante, el medio y las
condiciones ambientales de cultivo.
Segn varios autores (VILLALOBOS et al, 1984; BONGA, 1982), la
edad del explante en el desarrollo In Vitro es importante y crtico para las
especies maderables; se dice que en general, la micropropagacin es
relativamente fcil empleando tejidos juveniles, y es progresivamente ms
difcil con tejidos adolescentes y maduros; sin embargo, es necesario
determinar esta situacin a nivel experimental segn cada especie; por ejemplo
los explantes ms comunes en conferas, han sido los embriones, partes de
plntulas, los cotiledones, y los hipoctilos provenientes de semillas
germinadas aspticamente. La misma situacin se ha empleado en otras
especies leosas como Quercus acutissima (Shoyama et al, 1992), Pinus
contorta (Flygh et al, 1993), etc.
2.2.2. Medios de Cultivo In Vitro para la micropropagacin
Los componentes de los medios de cultivo tambin han sido objeto
de diversos estudios. Generalmente se agrupan en cinco clases de
compuestos: a) macro y microelementos; b) fuentes de carbono, generalmente
sacarosa; c) vitaminas; d) nitrgeno reducido, y e) reguladores de crecimiento.

El regulador de crecimiento clave en la formacin de brotes es la


Kinetina; sin embargo, las auxinas en bajas concentraciones han tenido
respuesta en algunas especies (ROCA Y MROGINSKI, 1991).
Segn THORPE (1991), los medios de cultivo ms frecuentemente
usados para la produccin de brotes en angiospermas son WP y MS
suplementados con BAP. Al cambiar los nutrientes del medio de cultivo se
puede alterar el porcentaje de explantes que formen brotes adventicios o
vstagos (MUOS, 2003).
2.2.3. Sustancias reguladoras del crecimiento de las plantas
El crecimiento y desarrollo de las plantas, est regulado por cierto
nmero de sustancias qumicas que en conjunto, ejercen una compleja
interaccin para cubrir las necesidades de la planta. Se han establecido cinco
grupos de hormonas vegetales: auxinas, giberelinas, Citoquininas, cido
abscsico y sus derivados y etileno. Estas sustancias estn ampliamente
distribudas y pueden, en efecto, hallarse en todas las plantas superiores. Son
especficas en cuanto a su accin, ejercen su acctividad a muy bajas
concentraciones, y regulan el crecimiento de las clulas, la divisin y la
diferenciacin celular, as como la organognesis, la senescencia y el estado
de latencia. Su accin es probablemente secuencil.
Los efectos de estas sustancias, smamente activas sobre la
produccin de metablitos secundarios, especialmente desde el punto de vista
de la consecucin de plantas con elevada proporcin de su contenido en
principios activos, es interesante para los farmacognostas. Para la valoracin
final de la droga, lo mejor es el tanto por ciento referido al peso seco.
2.2.3.1. Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos
Auxinas (activador)
Citoquininas (divisin)
Giberelinas (expansin)
Etileno (regulador)

cido abcsico (terminador)


2.2.3.2. Las vitaminas como reguladores de crecimiento en las
plantas
Estudios en las universidades y centros de investigacin, como la
Universidad de Exeter y el estado de California, muestran que algunos aaden
vitaminas ayudan a las plantas mejoran su crecimiento. Tambin ha sido
mostrar que las plantas crean sus propias vitaminas. Ms investigacin est en
curso, pero se prueban algunas vitaminas necesarias o tiles.
La vitamina C
La vitamina C es necesaria para el crecimiento vegetal. Una
enzima en plantas produce vitamina C. Un estudio reciente realizado por
cientficos de la Universidad de Exeter y Universidad de Shimane ha
demostrado que las plantas no pueden crecer en todos sin vitamina C. plantas
uso vitamina C para combatir el estrs de condiciones climticas incontrolable
como la sequa y la radiacin UV.
La vitamina B
Segn los investigadores de alimentos avanzados y maestros
jardineros, vitamina B se sabe que ayudan a las plantas a crecer ms fuerte y
ms grande que su tamao normal y la fuerza. B5 es necesaria para el
crecimiento global, y sin ella, las plantas crecen lentamente o en absoluto. B1
ayuda a crear energa, que a su vez aumenta la produccin de flor y
crecimiento. B1 tambin ayuda a la fuerza de la raz y evita que la planta que
sorprendi por daos o transplante (REYES, 2002).
La vitamina D
La adicin de vitamina D se ha demostrado para mejorar el
crecimiento de las plantas, pero no es necesario para las plantas sanas. Esto
fue demostrado por un estudio de estudiante en la Universidad Estatal de
California. La vitamina D puede obtenerse a travs de la simple luz del sol, que
las plantas normalmente sobre una base regular. Adicin de vitamina D

aumenta los niveles de estos. Por qu mejora el crecimiento no es s, pero los


experimentos han demostrado que no.
El ph del suelo como factor de crecimiento en las plantas
El pH del suelo es considerado como una de las principales
variables en los suelos, ya que controla muchos procesos qumicos que en este
tienen lugar. Afecta especficamente la disponibilidad de los nutrientes de las
plantas, mediante el control de las formas qumicas de los nutrientes. El rango
de pH ptimo para la mayora de las plantas oscila entre 5,5 y 7,0, sin embargo
muchas plantas se han adaptado para crecer a valores de pH fuera de este
rango.
2.3.

Pasos para generar plantas a partir de explantos aislados


En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro, se pueden

distinguir las siguientes etapas.


Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantos.
Establecimiento: desinfeccin de los explantos (generalmente con
hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial de modo
de inducir callo, brote, raz o embrin somtico, segn se desee.
Multiplicacin: generar una masa vegetal suficiente para la regeneracin
del nmero de plantas necesarias.
Enraizamiento: formacin de races con el fin de convertir los brotes o
embriones somticos en plntulas completas.
Rusticacin: aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las
condiciones medioambientales ex vitro (suelo o algn sustrato inerte)

III.
3.1.

MATERIALES Y MTODOS

Lugar de ejecucin
La investigacin se realiz en el Instituto de Biotecnologa de las

Plantas (IBP), Universidad Central Marta Abreu de Las Villas (UCLV).


Carretera a Camajuan km 5.5, Santa Clara, Cuba. CP (QUIALA, 2014).
3.2.

Materiales
3.2.1.

3.2.2.

2.3.

Material biolgico y orgnico


-

Brotes epicrmicos y axilares de rboles adultos

Brotes de teca en los SIT

Equipos y herramientas
-

Envases de vidrio

Pinzas

Placas petri

Bistur

Mechero bunsen

Dispensador

Mascarilla

Guardapolvo

Algodn, algodn

Guantes

Metodologa
2.3.1. CAPTULO I: Propagacin clonal de rboles adultos de T.
grandis en medios de cultivo semislidos
En este trabajo se describe el desarrollo de un mtodo eficiente

para la propagacin clonal va organognesis de rboles de teca de ms de 30


aos de edad. Se estableci un banco de plantas donantes de T. grandis en
casa de cultivo a partir de brotes epicrmicos de rboles adultos. Con brotes

epicrmicos colectados una semana despus del rebrote se obtuvo el mayor


porcentaje de enraizamiento (47,5%), esto coincidi con el menor grado de
metilacin del ADN(7%), (QUIALA, 2014).
Una vez establecido el banco de plantas donantes se tomaron
brotes axilares a partir de estas las plantas para el establecimiento in vitro.
Durante el establecimiento in vitro se caracteriz la microbiota de las plantas
donadoras, as como los contaminantes fngicos ms frecuentes en los
explantes (Revista Biotecnologa Vegetal. 9: 99-103, 2009). A partir de esta
caracterizacin se aplic un tratamiento fitosanitario a las plantas quince das
antes del establecimiento in vitro . Con el empleo de NaOCl al 2% durante 10
minutos y la transferencia de los explantes a medio de cultivo fresco 48 horas
despus de realizado el establecimiento, se redujo el porcentaje de explantes
fenolizados (30%) y se increment a un 85% el porciento de explantes
establecidos in vitro.
2.3.2. CAPTULO II: Cultivo de brotes de T. grandis en SIT: Efecto
de la concentracin de 6-BAP en la multiplicacin, la
morfo-anatoma y la fisiologa de los brotes
La investigacin realizada durante el cultivo de brotes de teca en
los SIT tuvo como objetivo determinar el efecto de la concentracin de 6-BAP
en la multiplicacin in vitro, la morfo -anatoma, la fisiologa y la supervivencia
ex vitro de brotes de teca cultivados en estos sistemas semi-automatizados. Se
estudi el efecto de tres concentraciones de 6-BAP (2,22; 4,44 y 6,66 M) y un
tratamiento control sin 6-BAP en la multiplicacin de los brotes de teca y
mediante la evaluacin de indicadores morfolgicos, anatmicos y fisiolgicos
se defini la concentracin ms adecuada (QUIALA, 2014).
Se observ la anatoma foliar mediante microscopa electrnica de
barrido y se realizaron fotomicrografas para el anlisis morfomtrico del
complejo estomtico. Las imgenes fueron analizadas y procesadas con ayuda
de un software informtico (Image Pro Plus).

Se detect la presencia de ligninas en secciones transversales del


tallo mediante tcnica histoqumica (Tincin de Wiesner, con fluoroglucinolHCL). Para la caracterizacin fisiolgica del material vegetal, se determin el
contenido de agua a partir de la masa fresca y seca y mediante
espectrofotometra se cuantific el contenido de fenoles totales y de pigmentos
fotosintticos (clorofila a, b y carotenoides); mientras que la cuantificacin del
contenido endgeno de reguladores del crecimiento se realiz mediante HPLC
y espectrometra de Masas (QUIALA, 2014).
Las plantas obtenidas fueron transferidas a condiciones de casa de
cultivo para evaluar el efecto de la concentracin de 6-BAP en la supervivencia
ex vitro de las plantas.
2.3.3. CAPTULO III: Cultivo de brotes de T. grandis en SIT:
Efecto del 6-BAP en la induccin de cambios morfoanatmicos, fisiolgicos y la respuesta hiperhdrica
Se

compar

mediante

la

evaluacin

de

los

indicadores

morfolgicos y fisiolgicos descritos anteriormente la morfo-anatoma y la


fisiologa de tres tipos de brotes cultivados en los SIT con 4,44 M de 6-BAP,
los cuales presentaban cambios morfolgicos (Tipo 1, Tipo 2 y Tipo 3). Se
estudiaron los cambios de expresin diferencial de protenas en estos tipos de
brotes cultivados con 6-BAP mediante la comparacin de su perfil protemico
con el de brotes cultivados sin reguladores del crecimiento (control).
Al no existir en la literatura internacional antecedentes de estudios
de protemica en teca fue necesario establecer el perfil protemico de la hoja
teca como paso previo a los estudios de expresin diferencial. Se obtuvo el
perfil protemico de la hoja de teca a partir de 100 protenas identificadas
mediante espectrometra de masas y el anlisis de la huella peptdica recogida
en bases de datos (sistema MALDI-TOF-TOF) y se identificaron 7 protenas
probablemente especficas de la especie (Proteomics, 12:112 (2012)).

III.

RESULTADOS

3.1. CAPTULO I: Propagacin clonal de rboles adultos de T. grandis en


medios de cultivo semislidos
Los resultados demostraron que la capacidad para formar races de
los brotes epicrmicos de teca disminuye a medida que aumenta el tiempo de
permanencia del rebrote en el tocn y que esta pudo estar influenciada por
eventos epigenticos como la metilacin del ADN (Revista Biotecnologa
Vegetal, 8 (1): 51 - 56, 2008).Los mejores resultados durante la multiplicacin
de los brotes se lograron con la concentracin de 4,44 M de 6- BAP, con 3,0
g.l-1 de Gelrite y con un tiempo de cultivo de 42 das; con lo cual se alcanzaron
coeficientes de multiplicacin de 5,02 brotes/explante; con solo 0,35 brotes
hiperhdricos por planta. Se logr un enraizamiento in vitro del 72.5% con la
adicin de 0,75 mg.l-1 de AIB y 40 g.l-1 de sacarosa al medio de cultivo.
Durante la aclimatizacin a las 4 semanas de cultivo, las plantas
propagadas in vitro alcanzaron un 70% de supervivencia en un sustrato con
80% de materia orgnica y 20% de zeolita. El 100% de las plantas sobrevivi al
trasplante y 10 semanas despus de la transferencia ex vitro se encontraban
listas para la plantacin en campo (QUIALA, 2014).
3.2. CAPTULO II: Cultivo de brotes de T. grandis en SIT: Efecto de la
concentracin de 6-BAP en la multiplicacin, la morfo-anatoma y la
fisiologa de los brotes
Se determin que el 6-BAP en concentraciones de 4,44 y 6,66 M
disminuy la calidad de los brotes al provocar un incremento del contenido de
agua en los mismos, desrdenes en el aparato estomtico, el desarrollo de un
sistema vascular hipolignificado, disminucin del contenido de sustancias
antioxidantes y una sobreacumulacin de citoquininas en formas activas; esto
se correspondi con un menor porcentaje de supervivencia ex vitro.

El mejor resultado se logr con el tratamiento de 2,22 M de 6BAP, las plantas obtenidas desarrollaron desde la fase in vitro caractersticas
estomticas similares a las plantas in vivo, con un sistema vascular bien
lignificado, sin efecto residual de CK activas, un alto contenido de sustancias
antioxidantes de naturaleza fenlica y de reguladores del crecimiento de
respuesta a estrs bitico y abitico; estas caractersticas determinaron una
mayor supervivencia durante la fase de aclimatizacin (91,7%).
Los resultados demostraron que en los SIT con una concentracin
de 2,22 M de 6-BAP se logran condiciones de cultivo que permiten mantener
los coeficientes de multiplicacin alcanzados en medios de cultivos semislidos
(4,1brote/explante) y al mismo tiempo la activacin temprana en dichas plantas
de mecanismos de respuestas a los cambios ambientales que son esenciales
para su adaptacin a las condiciones ex vitro. (Plant Cell Tissue and Organ
Culture, 109:223234, 2012).

3.3. CAPTULO III: Cultivo de brotes de T. grandis en SIT: Efecto del 6BAP en la induccin de cambios morfo-anatmicos, fisiolgicos y la
respuesta hiperhdrica
Mediante

la

identificacin

de

protenas

expresadas

diferencialmente, se pudo determinar que la respuesta hiperhdrica inducida por


el 6-BAP en los brotes, estuvo asociada a una sobreacumulacin de
citoquininas endgenas en formas activas, que disminuy la expresin de
varias enzimas implicadas en diferentes rutas metablicas principalmente de
tipo Peroxidasa. Esto afect la capacidad antioxidante de los brotes, la
xilognesis, la biosntesis de la pared celular y la lignificacin; lo que constituy
la causa principal de la hiperhidricidad y de la baja capacidad adaptativa de
estos brotes (QUIALA, 2014).

IV.

DISCUSIN

La dificultad para propagar vegetativamente especies leriosas esta


directamente relacionada con la edad de los materiales seleccionados. La
maduracin o transicin de la fase juvenil a la fase adulta puede ser definida
como la etapa de desarrollo que induce cambios en las caractersticas
morfolgicas y fisiolgicas, dirigidas a la adquisicin de competencia
reproductiva del arbol (Pierik, 1990).
Los resultados obtenidos han servido de base para la elaboracin
de un instructivo tcnico para la propagacin comercial en biofbricas de esta
especie (Instructivo Tcnico para la Propagacin in vitro de la Teca, 2010), este
instructivo forma parte del paquete tecnolgico de la Biofbrica del IBP. En
dicha rea con la aplicacin de este protocolo se han producido un total de
3500 plantas las cuales han sido entregadas a la empresa Forestal de Villa
Clara y a la Empresa de Desmonte y Construccin de esta provincia.

V.

CONCLUSIN

El empleo de los medios de cultivos lquidos para la propagacin


de especies forestales, descritas en la literatura internacional se reduce a solo
4 especies, entre otros factores, la principal limitante ha sido la hiperhidricidad.
La metodologa descrita en este trabajo con el empleo combinado de medios
de cultivos semislidos y sistemas de inmersin temporal, estos ltimos en la
etapa final del cultivo in vitro, permiten aprovechar por primera vez las ventajas
de los medios de cultivos lquidos para la propagacin de la teca (ver Anexo 1).
Por otro lado, la evaluacin y el anlisis de indicadores morfoanatmicos y fisiolgicos asociados al 6 -BAP y los estudios de protemica
contribuyeron a un mejor entendimiento de los cambios bioqumicos y
moleculares asociados al efecto inductor de las citoquininas en la respuesta
hiperhdrica de los brotes propagados. Se estableci un diseo experimental
que sienta las bases metodolgicas para el estudio de la fisiologa de las
plantas forestales cuando son cultivadas en los SIT y se logr establecer a
nivel internacional las bases y procedimientos para los estudios de protemica
en la especie T. grandis. Por otro lado, tomando como referencia los estudios
realizados en la teca, los resultados y conocimientos obtenidos sirven de base
para el empleo de los SIT en la propagacin de otras especies agroforestales y
leosas.

VI.

RECOMENDACIONES

VII.

REVISIN BIBLIOGRFICA

ARCE, V; MOYA, R. 2001. Efecto del espaciamiento de plantacin sobre el


porcentaje de duramen en la madera de teca (Tectona grandis). Boletn
Kur. Instituto Tecnolgico de Costa Rica. 31: 3-6.
FONSECA, W. 2004. Manual para productores de teca (tectona grandis l. f) en
costa rica. P 174-2003
MONTEUUIS, O; Bon, M-C; Goh, DKS. 1998. Teak propagation by in vitro
culture. Bois et Forets des Tropiques. 256:1-11.
ROCA Y MROGINSKI, 1991. Establecimientos de cultivos de tejidos vegetales
in vitro. Facultad de ciencias agrarias, instituto de botnica del
nordeste. Unidad de investigacin en biotecnologa. 20-25 p.
THORPE, T, A. 1981. Influence of explant selection on the school forming of
juvenile tissue of radiate pine. Can. J. For. Res. 138 p.
QUIALA, E. 2014. Propagacin clonal de la teca (tectona grandis l.) Mediante
cultivo in vitro. Revista anales de la academia de ciencias de cuba. Vol.4,
no.2, ao 2014 5

ANEXOS

Figura 01. Brotacin de yemas de teca (Tectona grandis L.f ) en condiciones in


vitro.

Figura 02. Explante inicial (estaca) de teca (Tectona grandis L.f.) establecidoen
condiciones in vitro.

Figura 03. Plntula de teca (Tectona grandis L.f) desarrollada y lista para
transferir a condiciones de enraizamiento y aclimatacin.

Figura 04. Multiplicacin in vitro de brotes de teca (Tectona grandis L.f).

Figura 05. Plntulas de teca producidas in vitro (Tectona grandis L.f) en estadio
de aclimatacin.

Figura 06. Esquema para la propagacin in vitro de la teca empleando medios


de cultivos semislidos y sistemas de inmersin temporal (SIT).

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