LABORATORIO BIOTECNOLOGIA

INFORME N 01-RMV-LB-2016-EAPIA-UNAMBA
PARA: Ing. Victor H. Sarmiento Casavilca
DE:

Roger moina Villegas

PRACTICA N 01 CONCERVACION DE CEPAS Y PREPARACION DE

INOCULOS
I.

INTRODUCCION

El punto de partida de cualquier fermentacin es un recipiente limpio

que ha sido esterilizado y rellenado con el medio de cultivo estril.
Posteriormente, el fermentador se inocula con el microorganismo
adecuado. El tamao del inculo generalmente es del orden del 1-10%
del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporcin puede
existir un excesivamente prolongado perodo de latencia, lo que
prolongar el perodo de fermentacin.
II.
OBJETIVOS
Obtener copias fenotpicas idnticas de una cepa
Regenerar clulas
Obtener un inoculo a concentraciones conocidas

III.

MARCO TEORICO

Desde 1950, las enzimas lignocelulolticas han incrementado su

importancia en diferentes industrias como en la produccin de
alimentos, industria textil, industria papelera, agricultura e investigacin
(Bhat, 2000), principalmente debido a las ventajas que otorgan en la
optimizacin de procesos. Adems, por caractersticas como: su
especificidad de sustrato, el requerimiento de condiciones suaves de pH,
temperatura y presin para su actividad (comparando con procesos
qumicos), su contribucin al cuidado del medioambiente haciendo los
procesos ms limpios y su posibilidad de inmovilizacin, evitando la
presencia de stas en los productos finales (MacCabe et al., 2002).

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Las enzimas lignocelulolticas incluyen a celulasas y xilanasas. Las
celulasas constituyen un sistema enzimtico de cuatro enzimas: la endo
-glucanasa,
que
hidroliza
randomizadamente
celulosa
a
glucooligosacridos; la exo -glucanasa, que libera glucosa de la
celulosa; lacelobiohidrolasa, que libera celobiosa de la celulosa
cristalina; y la - glucosidasa (Szijrto et al., 2004). Asimismo, las
xilanasas constituyen tambin un complejo enzimtico responsable de la
hidrlisis de xilano, siendo las principales Cepas de niger enzimas
involucradas la endo-1,4- xilanasa, que rompe los enlaces glucosdicos
de la cadena principal de xilano produciendo oligmeros de -D
xilopiranosil,
y
la
-xilosidasa
que
hidrolizan
xilobiosa
y
xilanooligosacridos (Polizeli et al., 2005).
En respuesta a la demanda creciente de estas enzimas, se ha impulsado
la investigacin y el estudio de diferentes microorganismos
lignocelulolticos. Los hongos filamentosos son la fuente principal de
hidrolasas, incluyendo celulasas y xilanasas, debido a su fcil manejo y
costos reducidos. Los principales gneros incluyen a Aspergillus,
Trichoderma y Penicillium (MacCabe et al., 2002). Aspergillus niger es
uno de los microorganismos ms utilizados en la produccin de enzimas
industriales, principalmente por sus altos niveles de secrecin de
protena, y su estatus GRAS (generally regarded as safe) (Ward et al.,
2006; Schuster et al., 2002; De Vries y Visser, 2001).
De otro lado, el sistema de cultivo ms empleado en la produccin de
enzimas comerciales es la fermentacin sumergida (MacCabe et al.,
2002). En este aspecto, en la produccin de enzimas con hongos
filamentosos, la morfologa es de crucial importancia para lograr una
mayor produccin (Villena et al., 2010; Papagianni, 2004; Pazouki y
Panda, 2000). Los factores que afectan la morfologa incluyen el tipo y
concentracin de la fuente de carbono, la concentracin del inculo, los
niveles de hidrgeno, fsforo y otros minerales traza, el O2 y CO2
disueltos, el pH y la temperatura, y factores fsicos como geometra del
fermentador, tipo de agitacin, reologa y sistema de cultivo (Grimm et
al., 2005; Papagianni y Mattey, 2004).
Las principales morfologas desarrolladas en sistemas de fermentacin
sumergida corresponden al crecimiento miceliar o filamentoso y el
crecimiento tipo pellet, este ltimo caracterizado por ser una esfera de
micelio. Existen tres tipos principales de pellets, los de centro compacto

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y contorno laxo, los totalmente compactos, y los de interior vaco debido
a autolisis (Pazouki y Panda, 2000).
El objetivo del presente trabajo fue determinar, mediante cultivo
sumergido, la influencia de la concentracin del inculo en la morfologa
y produccin de celulasa y xilanasa de A. niger ATCC 10864.
5.- Preparacin de inculo elaborado. Conteo de esporas.
Esta es la parte en la que un vivero puede encontrar mayor dificultad.
Para solventarlo el Instituto del Corcho, la madera y el carbn Vegetal
ponen a disposicin de los viveros extremeos
un servicio para la preparacin del inculo a partir de la suspensin
elaborada previamente por el vivero.
En el caso de que el vivero disponga de los medios para la preparacin
de inculo, una vez preparada la suspensin esporal, siguiendo la
metodologa del apartado anterior, es necesario ajustar la concentracin
necesaria para la inoculacin de las plantas en esporas/ml.
Generalmente se utiliza una concentracin de entre 5x105 y 5x107
esporas/planta, dependiendo de la dosis de riego, esto es, del nmero
de ml a dispensar por planta. Esta cantidad de agua que va a ser
aadida a la planta depende de:
El volumen a aportar de la suspensin esporal debe estar ente 5 y 10
ml/planta por cada uno de los riegos que se realicen.
Para realizar el ajuste de la concentracin esporal, es necesario utilizar
una cmara cuentaglbulos o de recuento tipo Cmara Neubauer.
Esta cmara permite hacer un conteo de esporas en una suspensin
previa, por lo tanto podemos realizar el clculo del agua que es
necesario aadir para conseguir nuestra concentracin objetivo.
La cmara Neubauer dispone de una cuadrcula formada de recintos de
0,0025 mm2 y de 0,1 mm de profundidad, por tanto, de 0,00025 mm3
de volumen. El conteo se realiza en los 4 cuadrados de la diagonal de la
cmara, formados a su vez por 16 cuadrados de 0,00025 mm3
Por tanto, realizaremos el conteo en 16 x 4 cuadrados de ese volumen.
El procedimiento es el siguiente:

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- Limpiar bien la cmara con alcohol de 96.
- Colocar una gota de la suspensin esporal con la ayuda de una
micropipeta.
- Colocar el cubreobjetos de la cmara.
- Introducir la cmara Neubauer en la placa del microscopio y realizar el
conteo.
El conteo se realizar en los cuadrados amarillos del siguiente grfico.
La secuencia el conteo se har e acuerdo a las fechas indicas de rojo.

El nmero de esporas encontrado en esa diagonal se anotar, y se

repetir el proceso otras 2 veces (3 en total), agitando cada vez la
suspensin esporal antes de tomar la dosis del recipiente de inculo
bruto con la micropipeta.
Con los 3 datos de esporas contadas se calcular la media y se
proceder a realizar el clculo de esporas/ml.
El clculo es el siguiente:
El volumen de 1 cuadrado de la cmara Neubauer es de 0,00025 mm3.
Al hacer el conteo en la diagonal de la cmara, se cuenta el nmero de
esporas en un volumen de: 0,00025 mm3 x 4 x 16 = 0,016 mm Si
contamos X esporas en 0,016 mm3, podemos saber cuntas habr en 1
ml.
En resumen, el nmero de esporas por ml, nos lo dar la media de las
esporas contadas dividido entre 0,000016.
Esporas/ml= X/0,000016

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Como ejemplo, si la media de los 3 conteos nos da un valor de 20
esporas, la concentracin ser de 1,25x106 esporas/ml y queremos
aportar 2,5x106 esporas/planta.
Si hiciramos un riego esporal con esa concentracin (1,25x106
esporas/ml) aadiendo 10 ml por planta, estaramos aadiendo
1,25x107 esporas/planta, de forma que la dosis sera excesiva. Con esa
concentracin podramos hacer un riego esporal para 5 plantas, por lo
que podramos multiplicar por 5 el volumen de partida. Si este es de 1
litro, podramos aadir 4 litros ms de agua destilada de forma que
regando con 10 ml/planta aadiramos 2,5x106 esporas.

IV.

MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos
Cmara de new bawer
Microscopio

Materiales
Tubos de ensayo
Pipeta
Matraz
Mechero de bunsen
Alcohol
Asa de siembra
Agar agar 20 gr/1000ml
Glucosa 15 gr/1000ml

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Extracto
gr/1000ml

papa

20

V.
PROCEDIMIENTO
1. Agar PDA (agar papa dextrosa)

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2. Los tubos se autoclavaron inclinados a 20 c por 48 horas

3. Luego se utiliz la cama de new bawer

microscopio

y poder mirar al

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VI.

RESULTADOS
60
65
62
52

= 307 x

VII.

104

DISCUCIONES

La morfologa de Aspergillus est influenciada por varios factores que

incluyen las propiedades intrnsecas de cada cepa, la concentracin y el
tipo de inculo, la velocidad de agitacin, entre otros (El-Enshasy et al.,
2006).
Para A. niger se ha reportado la formacin de pellets cuando la
concentracin del inculo est por debajo de 108 esporas*mL-1
(Papagianni, 2004), sin embargo, en el caso de la cepa evaluada, la
morfologa de pellet se mantiene an a concentraciones de 108
esporas*mL-1.
Asimismo, se observ la formacin de los pellets a partir de las 24 horas,
los cuales fueron de tipo coagulativo, caracterizados por una agregacin
inicial de las esporas y micelio entrelazado, como ha sido reportado
anteriormente (Villena y Gutirrez-Correa, 2007; Znidarsic y Pavko,
2001; Pazouki y Panda, 2000; Ryoo y Choi, 1999). De otro lado, la
diferencia en la concentracin de esporas puede explicar el aspecto de
los pellets obtenidos en cada caso. El color oscuro de pellets formados a
la concentracin de 108 esporas*mL-1 pudo deberse a inhibidorespropios, que inhiben la germinacin de esporas cuando estn en altas

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concentraciones (Barrios-Gonzles et al., 1989). Tambin, el tamao de
los pellets, particularmente para A. niger, se explica por el equilibrio
termodinmico que existe entre la superficie del pellet y el medio; la alta
hidrofobicidad de las esporas rompe la tensin superficial del medio
dando lugar al crecimiento en forma de pellet, mientras mayor sea el
inculo, menor ser la tensin superficial del medio y ms pequeos los
pellets formados (Ryoo y Choi, 1999). Los tamaos de pellets obtenidos
en cada caso son coincidentes con este comportamiento. De otro lado, la
morfologa desarrollada por un microorganismo tiene una marcada
influencia en la productividad. Para la produccin de cada enzima o
metabolito se tiene una morfologa apropiada con la cual se alcanza una
productividad ptima; por ejemplo, para la produccin de cido ctrico
por
VIII. CONCLUSIONES
La concentracin inculo de esporas no muestra una marcada influencia
en la morfologa desarrollada por A. niger ATCC 10864 en matraz
agitados de cultivo sumergido, la cual fue del tipo pellet. Sin embargo,
esta influye considerablemente tanto en la velocidad de crecimiento
como en la produccin de celulasas y xilanasas, existiendo una relacin
lineal inversa entre el logaritmo de la concentracin de inculo y la tasa
especfica mxima de crecimiento max. Aunque no se evidencia una
diferencia significativa de la productividad volumtrica ( FPA) de
celulasa para las dos concentraciones de inculo probadas, en xilanasa
s se obtiene mayor productividad volumtrica para la concentracin 108
esporas*mL-1. En ambos casos las productividades especficas de
celulasas y xilanasa (UI*g-1*h-1) fueron superiores a las obtenidas en
estudios anteriores para otra concentracin de inculo.
IX. BIBLIOGRAFA
1. Barrios-Gonzles, J., Martnez, C., Aguilera, A., Raimbault, M. 1989.
Germination of concentrated suspensions of spores from
Aspergillus niger.Biotechnology Letters, 11: 551-554.
2. Bhat, M. K. 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology
review.Biotechnology Advances, 18: 355- 383.
3. Chipeta, Z., du Preez, J .C., Szakacs, G., Lew, C. 2005. Xylanase
production by fungal strains on spent sulphite liquor.Applied
Microbiology and Biotechnology, 69: 71-78.