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QUMICO BILOGO
Informe de Tesis
Presentado por
QUMICO BILOGO
JUNTA DIRECTIVA
Decano
Secretario
Vocal I
Vocal II
Vocal III
Vocal IV
Vocal V
A mis paps, Marta Alicia Rojas y Oswaldo Efran Martnez, por su amor y apoyo. Son el todo
para m: mis decisiones las he tomado siempre con ustedes en mente.
A la Licda. Ana Margarita Paz de Ramrez, por su amor y presencia permanente. Los ngeles
existen: gracias por recibirme siempre con los brazos abiertos, por levantarme y guiarme.
A mis amores, las licenciadas Isabel Gaitn, Keila Guerrero y Dayrin Ortiz, por ser siempre luz.
A la Licda. Blanca Samayoa, por su apoyo y enseanzas diarias. Gracias por verme cuando me
senta invisible, por darme la mano cuando estaba perdido.
A mis maestras de vida, las licenciadas Karla Lange, Mara Eugenia Paredes, Ana Rodas, Irma
Jurez, Mara Teresa Meneses e Ingrid Tabarini, por creer en m y darme oportunidades.
A la Dra. Dalia Lau-Bonilla y las licenciadas Tamara Porta, Danicela Mercado, Anneliese
Moller, Mara Ins Herrarte, Luca Roesch, Luca Herrera y Aliz Prez, por compartir la vida.
AGRADECIMIENTOS
I.
NDICE
Pgina
II. Resumen
III. Introduccin
IV. Antecedentes
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A. Toxicidad celular
10
10
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a. Definicin
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i. Apoptosis y oncosis
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ii. Necrosis
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B. Inmunotoxicologa e inmunomodulacin
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1. Sistema inmunolgico
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4. Inflamacin
15
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18
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8. Inmunotoxicologa
20
9. Inmunomodulacin
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1. Definicin qumica
22
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3. Toxicidad
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V. Justificacin
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VI. Objetivos
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VII.Hiptesis
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A. Universo y muestra
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1. Universo de trabajo
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2. Muestra
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B. Recursos Humanos
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1. Investigador
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2. Asesora
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3. Revisoras
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C. Recursos Institucionales
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D. Materiales
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1. Equipo
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2. Reactivos
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3. Agentes biolgicos
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4. Materiales
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E. Metodologa
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6. Ensayo linfoproliferativo
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F. Diseo de la investigacin
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1. Tipo de estudio
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2. Variables
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3. Ensayos
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G. Diseo estadstico
1. Anlisis de resultados
IX. Resultados
44
44
47
6
X.
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47
48
49
49
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Discusin de resultados
51
XI. Conclusiones
55
XII. Recomendaciones
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XIV. Anexos
63
63
67
71
75
II. RESUMEN
Citotoxicidad es la propiedad de una sustancia que, bajo un conjunto especfico de
condiciones, causa efectos a nivel celular que pueden incluir lesiones reversibles hasta la muerte
por apoptosis o necrosis. Paralelamente, la inmunomodulacin es la propiedad de una sustancia
de intervenir en los procesos metablicos de regulacin, modificando ya sea por estimulacin o
inhibicin, el curso de la respuesta inmune. A nivel fisiolgico, algunas sustancias por accin
biocida, inducen la liberacin de endotoxinas microbianas, desencadenando la estimulacin de la
respuesta inmune de forma sostenida. Esta propiedad fue atribuida por Jim Humble a la solucin
de clorito de sodio (NaClO2) activado en medio cido que induce a la formacin de ion clorito
(ClO2-), popularmente conocida como Milagroso Suplemento Mineral (MSM) del cual se han
descrito efectos teraputicos en procesos patolgicos crnicos de tipo metablico, neoplsico y/o
infeccioso (Sachana, & Hargreaves, 2007; Ooi, & Liu, 2000; Humble, 2006).
La finalidad de este estudio fue establecer el efecto citotxico e inmunomodulador in vitro de
la solucin de ion ClO2- activado, contra nauplios de Artemia salina, linfocitos y eritrocitos
humanos, bacterias y levaduras. La actividad inmunomoduladora sera evaluada sobre la
actividad linfoproliferativa de linfocitos T y la capacidad hemoltica de protenas del sistema de
complemento.
La solucin de MSM se prepar a partir de una concentracin de 90% p/p de NaClO2, la cual
mostr ser hipertnica y fuertemente oxidativa (pH 2.6). Se determin una CIM de 6.25 mg/mL
y a partir de una regresin logartmica, que la concentracin de 4.48 mg/mL (IC95% 4.44 4.53
mg/mL) ocasion que 50% de la poblacin de clulas evaluadas murieran (DL50).
La
concentracin propuesta en el protocolo de Humble (400 mg/mL) fue 89 veces mayor que la
DL50 encontrada. El valor de p = 0.013 evidenci actividad citotxica significativa. No se
evidenci actividad antimicrobiana (bacterias y levaduras) y actividad inmunomoduladora
significativas (p > 0.05) (Humble, 2006; Merck Group, 2000).
La solucin de MSM demostr ser altamente txica, sin evidencia de actividad
antimicrobiana y efectos inmunomoduladores in vitro. Los resultados obtenidos y presentados en
este estudio no pretenden ms que establecer el comportamiento de la solucin como un
antecedente para la validacin de su uso seguro con conocimiento de sus potenciales riesgos.
III. INTRODUCCIN
La respuesta inmune basa su funcin en mecanismos celulares y humorales para discriminar
entre lo propio y lo extrao, diferencindose por la especificidad de los procesos y el desarrollo
de memoria. La inmunomodulacin ha sido descrita como el cambio en el sistema inmunitario
causado por sustancias que activan o debilitan su funcin, indistintamente clasificadas como
orgnicas o inorgnicas.
En el ao de 1997, Jim Humble report y patent el uso de clorito de sodio (NaClO 2)
activado en medio cido para el tratamiento de malaria en jornaleros de la jungla de Guayana.
Este producto lo denomin Oxgeno Estabilizado y popularmente se distribuye en Mxico
como el Milagroso Suplemento Mineral (MSM).
El MSM ha sido propuesto como tratamiento alternativo para el manejo de enfermedades
crnicas de tipo metablico, neoplsico y/o infeccioso. Con base en los principios homeopticos
de dosis mnima e individualidad medicamentosa, se describi el mecanismo de accin por
activacin del ion clorito que por capacidad biocida, induce la liberacin de endotoxinas
microbianas, desencadenando la estimulacin de la respuesta inmune de forma sostenida. En los
ltimos aos ha tenido auge popular como suplemento alternativo pero no cuenta con respaldo
cientfico basado en evidencia derivado de investigacin clnica que asegure su efectividad, libre
o con el mnimo de efectos adversos que afecten la integridad de los usuarios que lo consumen;
por ende, carece del registro avalado por entidades regulatorias.
El presente estudio se realiz para establecer el efecto citotxico e inmunomodulador in vitro
de la solucin de ion clorito activado de acuerdo con el protocolo de preparacin propuesto por
Humble. El efecto citotxico de la solucin se determin midiendo la viabilidad de nauplios de
Artemia salina, linfocitos, eritrocitos humanos, bacterias y levaduras; la actividad
inmunomoduladora se estableci a partir de la actividad linfoproliferativa de linfocitos T y la
capacidad hemoltica de protenas del sistema de complemento.
Los hallazgos de toxicidad y ausencia de actividad antimicrobiana e inmunomoduladora de
este estudio deben interpretarse en el contexto de las metodologas empleadas. No se pretendi
ms que establecer el comportamiento in vitro como un antecedente para la validacin de su uso
seguro con conocimiento de sus riesgos txicos potenciales.
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IV. ANTECEDENTES
A. TOXICIDAD CELULAR
1. Mecanismos de toxicidad celular por frmacos
Toxicidad es la propiedad de una sustancia que, bajo un conjunto especfico de
condiciones, causa efectos detrimentales. La toxicidad indica la potencia de una sustancia
venenosa y no la afeccin producida por sta (concepto que corresponde a intoxicacin o
envenenamiento). La toxicidad se expresa como la cantidad de la sustancia en mg/Kg de
peso vivo que origina efectos biolgicos determinados, en un tiempo dado y en una
especie establecida. Existen diversos indicadores de toxicidad, siendo uno de los ms
usados la dosis letal 50 (DL50); ste es un indicador estadstico de toxicidad aguda, el cual
seala la cantidad del txico que causa la muerte del 50% de los animales intoxicados en
ensayos de investigacin (Sachana, & Hargreaves, 2007).
La toxicidad depende de varios factores como el tiempo de exposicin a la sustancia en
cuestin, el nmero de exposiciones y la va de administracin. Se define como toxicidad
aguda cuando una nica exposicin puede causar un dao severo, mientras que la
toxicidad crnica es aquella que involucra exposiciones prolongadas en tiempo y/o dosis
para desencadenar inestabilidad metablica y dao severo (Dalmazzo, 2009).
La farmacocintica describe el marco temporal de la absorcin, distribucin,
metabolismo y eliminacin o excrecin de las sustancias qumicas.
Estas variables
La lesin puede
evaluarse en la totalidad del organismo, en los sistemas orgnicos, en las clulas o en las
10
molculas. Los sistemas orgnicos que pueden ser afectados incluyen al sistema nervioso,
cardiovascular, respiratorio, renal, gastrointestinal, muscular, sanguneo, endocrino e
inmunitario. Son rganos decisivos el hgado, el rin, el pulmn, el cerebro, el corazn,
la piel, los ojos y las gnadas (Oses, et al., 2003).
Entre los efectos adversos a nivel celular/bioqumico figuran la interferencia de la
funcin protenica normal y de la funcin de los receptores endocrinos, la inhibicin del
metabolismo energtico y la inhibicin o induccin de enzimas.
Las dianas
El retculo
Si el
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B. INMUNOTOXICOLOGA E INMUNOMODULACIN
1. Sistema inmunolgico
Conjunto de rganos, clulas y molculas encargados de la defensa del organismo
frente a infecciones, intoxicacin por partculas orgnicas e inorgnicas y la actividad
neoplsica. La respuesta inmune basa su funcin en la discriminacin de lo propio y lo
extrao, diferencindose por la especificidad de procesos y desarrollo de memoria
inmunolgica (Chaplin, 2010).
La respuesta inmunitaria est estructurada por una secuencia compleja de eventos; se
inicia con la presencia de un estmulo inmunognico y por lo general, culmina con la
eliminacin del agente que lo provoca. Esta respuesta depende principalmente de dos
14
15
fisiolgicamente sin importar que sus efectos protectores se requieran o no, sin perder o
modificar sus propiedades intrnsecas; su principal funcin es que son capaces de
reconocer blancos o sustratos identificables dentro de una amplia gama de
microorganismos pero que no se observan en el cuerpo humano en condiciones normales,
siendo denominadas como patrones moleculares especficos de patgenos. A travs del
reconocimiento de estos patrones comunes, las protenas del hospedero son capaces de
suministrar una proteccin relativamente inespecfica.
producir una C3-convertasa de la ruta clsica (Carroll, 2004; Fujita, et al., 2004; Strainic,
et al., 2008).
Por otro lado, el trmino de clulas inflamatorias se utiliza para designar a las clulas
que participan en las reacciones inflamatorias. Por su localizacin se clasifican en clulas
residentes de tejido (macrfagos y mastocitos) y las clulas circulantes que penetran a los
tejidos nicamente en el transcurso de una respuesta inflamatoria (neutrfilos, eosinfilos,
basfilos, plaquetas y linfocitos). Las propiedades de defensa son reguladas debido a la
expresin de receptores superficiales para componentes de fisin del complemento, para
la fraccin Fc de anticuerpos y para varias citocinas (Garca, 2008).
6. Mecanismos humorales y componentes celulares de la respuesta inmune adquirida
Los componentes humorales de la respuesta inmune adquirida incluyen a las
inmunoglobulinas y citocinas (interleucinas y quimiocinas). Las inmunoglobulinas
(anticuerpos) son glicoprotenas del tipo gamma globulina. Las funciones efectoras
mediadas incluyen la neutralizacin de microorganismos o de productos txicos
secretados por ellos, la activacin del sistema del complemento, la opsonizacin de
patgenos para facilitar la fagocitosis, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(CCDA) y la hipersensibilidad tipo I en la cual los anticuerpos inducen la activacin y
degranulacin de los mastocitos. Los isotipos de las inmunoglobulinas se denominan
IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM cada una con funciones y caractersticas determinantes
(Ahmed, Saha, Patwardhan, Shivprasad, & Nandi, 2009).
Se denominan interleucinas (IL) a protenas solubles de bajo peso molecular que
actan como mensajeros qumicos a corta distancia mediando procesos de proliferacin,
crecimiento celular, inflamacin, diferenciacin y reparacin. Son sintetizadas
principalmente por linfocitos y macrfagos, aunque tambin pueden intervenir clulas
endoteliales, del estroma del timo o de la mdula sea. Inician la respuesta inflamatoria,
y definen la magnitud y naturaleza de la respuesta inmunitaria especfica. Entre las
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principales se mencionan: Factor de necrosis tumoral (FNT) , FNT-, IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10, IL-12 e IL-17 (Feghali, & Wright, 1997).
Las quimiocinas son un grupo de molculas especializadas, que adems de la
quimiotaxis, cumplen funciones importantes en la proliferacin o apoptosis de diferentes
clulas, la morfognesis tisular, hematopoyesis, angiognesis y en el desarrollo de la
respuesta inmune especfica (induccin del trfico de clulas dendrticas y de linfocitos T
colaboradores [Th] de tipo 1, tipo 2 y linfocitos B en el tejido linfoide secundario). Las
clulas blanco de las quimiocinas son neutrfilos, fibroblastos, basfilos, eosinfilos,
condrocitos, linfocitos T y B, clulas del msculo liso, endotelio, clulas asesinas
naturales (NK, natural killer por sus siglas en ingls), monocitos, queratinocitos y
megacariocitos. Tienen un peso molecular aproximado de 8 a 15 kDa, y se dividen en
cuatro subfamilias: CXC, CC, C y CX3C (Moser, & Willimann, 2004).
Con respecto a los componentes celulares, los linfocitos se constituyen en las clulas
predominantes en una respuesta inmune especfica.
De acuerdo a la expresin de
influencian las funciones efectoras mediadas por otros leucocitos (Buckner, 2010).
19
La Ig es la
Su
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del sistema inmunitario o a una respuesta inmunolgica del hospedero al compuesto y/o
sus metabolitos o a sus propios antgenos modificados (Ladics, & Woolhiser, 2007).
Cuando el sistema inmunitario acta como diana pasiva de las agresiones qumicas, el
resultado puede ser una reduccin de la resistencia a las infecciones y a determinadas
formas de neoplasia, o una desregulacin/estimulacin inmunitaria que desencadenan
alergias o
autoinmunidad.
requiere cuando a pesar de funcionar con normalidad, la actividad natural del sistema
inmunitario no es suficiente para reducir la carga infectiva como en el caso de infecciones
recurrentes o cuando se considera como medida teraputica coadyuvante para restituir el
potencial del sistema inmunitario. Estos frmacos tienen como diana inmunolgica la
estimulacin de clulas que liberan citocinas, las cuales actuarn modificando el estado
basal potencializando la respuesta especializada a travs de los linfocitos.
Ha sido
3. Toxicidad
La base de datos de productos qumicos de Merck, versin 2000, describe al NaClO 2
como una sustancia nociva, irritante, corrosiva no combustible, con una DL50 oral en rata
de 1,136 mg/Kg (solucin al 25%). En contacto con cidos, libera gases de alta toxicidad
con potencial explosivo. Se debe evitar el contacto con cidos, sustancias inflamables,
cianuros, azufre, amonio, metales pulverizados, compuestos fosforados, cloro y agentes
reductores (Merck Group, 2000).
Por ingestin de solucin puede desencadenarse nusea, vmito, sangrado e irritacin
de las mucosas, especialmente de boca, esfago e intestino. Tras inhalacin de vapores
y/o aerosoles se presenta irritacin de mucosas, tos, edema pulmonar y espasmo
bronquial; la exposicin crnica a gases predispone al desarrollo de bronquitis.
El
contacto ocular puede desarrollar lesiones graves. Por la inestabilidad en medio cido, los
subproductos que se generan (cloruros y cloratos) pueden inducir shock heptico e
insuficiencia renal. No se ha definido con claridad el efecto teratgeno tras la exposicin
crnica a esta sustancia (Dietrich, et al., 1992; Merck Group, 2000).
4. Ion clorito activado: Milagroso Suplemento Mineral
En 1997, Jim Humble durante una expedicin en las Guyanas Francesas utiliz ClO2
en jugo de limn, al que nombr oxgeno estabilizado, para tratar a sus compaeros de
viaje que sufran de malaria reportando en ellos una evolucin positiva. A su retorno en
Estados Unidos, se dedic a identificar el mecanismo de accin que se centra en la
actividad del ion clorito activado (Humble, 2006).
Tras un seguimiento en frica de pacientes con malaria, expuso que el Oxgeno
Estabilizado induce una reaccin similar a la reaccin de Herxheimer que ocurre cuando
grandes cantidades de toxinas son liberadas en el cuerpo tras la muerte de bacterias por
terapia antibitica o una rpida desintoxicacin en donde el metabolismo no es lo
suficientemente rpido para la efectiva eliminacin a travs de hgado y riones. Esto
ocasiona un incremento en citocinas inflamatorias que se manifiesta en fiebre, escalofros,
cefaleas, mialgia, nuseas y exacerbacin de lesiones primarias en piel como reflejo de la
24
25
V. JUSTIFICACIN
El Milagroso Suplemento Mineral (MSM) ha sido propuesto y utilizado como
suplemento alternativo para la prevencin y tratamiento de enfermedades crnicas. Su accin ha
sido descrita como dependiente de su capacidad biocida y oxidante que estimula la respuesta
inmune luego de la liberacin de endotoxinas microbianas. El principio activo del producto es
NaClO2, compuesto altamente txico, potencialmente explosivo e inestable en medio acuoso, que
requiere manejo especializado para reducir riesgos de accidentes por inadecuada manipulacin.
Cualquier forma farmacutica, previa a su distribucin comercial, debe pasar por fases de
investigacin (fase preclnica con ensayos in vitro y en animales de laboratorio; fase I-IV de
investigacin clnica: farmacocintica, farmacodinamia, dosis y farmacovigilancia) que aseguren
la eficacia y seguridad a largo plazo. Esta informacin no est disponible para la solucin de
MSM, y nicamente se conoce por afirmacin de su creador e impulsor Jim Humble, que el
MSM ha tenido efectividad en pacientes con malaria tratados en frica, y algunos reportes de
testimonios aislados. Por lo anterior, se considera que no hay suficiente evidencia cientfica que
avale su efectividad, por lo que deben demostrarse las propiedades farmacolgicas y txicas in
vitro. La finalidad del presente estudio fue determinar el efecto citotxico e inmunomodulador de
la solucin, a partir del protocolo propuesto por Humble, utilizando metodologas previamente
estandarizadas.
Actualmente se encuentra disponible gran variedad de informacin acerca del MSM lo
que ha incrementado su auge popular. Sin embargo, no cuenta con respaldo cientfico, mdico ni
registros sanitarios avalados por entidades reguladoras internacionales. Este producto ha sido
difundido como teraputico en procesos autoinmunes, neoplasias e infecciones crnicas cuya
patognesis tiene un componente inmunolgico comprobado, no obstante, al establecer su
actividad y comportamiento in vitro se contribuye con datos objetivos en la informacin de
seguridad y toxicidad potencial.
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VI. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL
B. OBJETIVOS ESPECFICOS
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VII. HIPTESIS
La solucin de ion clorito activado no tiene actividad citotxica sobre Artemia salina,
linfocitos y eritrocitos humanos, afecta la viabilidad de bacterias y levaduras; muestra adems
efecto inmunomodulador in vitro.
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Agentes biolgicos
Cepa de Bacillus subtilis
ATCC 6633
ATCC 1023
ATCC 25922
ATCC 607
ATCC 27853
ATCC 14028
ATCC 25923
Materiales
Asa bacteriolgica no calibrada
Bata blanca, manga larga
Beakers de 250-1000 L
Bolsa roja para descarte de desechos
Bomba de oxgeno para pecera
Cajas de Petri simple
Cajas de Petri cudruple
Cmara de Neubauer
Estndar 4.0 de McFarland
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E. METODOLOGA
1.
a temperatura de 6-8 C.
Cultivo de Artemia salina
- Se colocaron en un beaker 200 mL del agua de mar y se airearon por 30 minutos
con bomba de oxgeno.
- La mitad de una pecera fue forrada con papel aluminio (rea cerrada).
- Se coloc el agua en la pecera y se agregaron aproximadamente 40 mg de
huevecillos en el rea cerrada.
- Se incub por 48 horas a temperatura ambiente y con luz artificial. Al eclosionar,
los nauplios (larvas) pasaron al rea abierta de la pecera (lado con luz).
- La pecera no se movi despus de agregados los huevos, con esto se evit que no
pasaran del rea cerrada y esto no permitiese el conteo de nauplios.
Determinacin de la citotoxicidad
- Se agregaron por quintuplicado en una microplaca: 100 L de MSM + 100 L de
agua de mar con 10-15 nauplios. Control negativo: 100 l de agua de mar + 100 l
de agua de mar con 10-15 nauplios.
- Se incub a temperatura ambiente con luz artificial por 24 horas.
- En el estereoscopio se contaron los nauplios muertos. Si se observaron nauplios
muertos en el control negativo la prueba se consider no vlida y se repiti.
33
Interpretacin
3. Actividad antimicrobiana: bacterias (Mitscher, Leu, Bathal, Wu, Beal, & White, 1972).
Ver diagrama de flujo resumido en anexo 2: Resultados grficos del ensayo de
actividad antimicrobiana.
Preparacin de Agar-MSM
- Se prepararon tubos con 9 mL de agar Meller-Hinton.
- Se esterilizaron a 121C durante 15 minutos, se dejaron enfriar hasta 50C.
- Se verti 1 mL de la solucin de MSM en cajas de Petri.
- El contenido de los tubos se verti en cajas de Petri; se agitaron suavemente
dejndolas solidificar. Los microorganismos se inocularon inmediatamente.
- Se realiz un control de esterilidad incubando una caja del lote preparado a 36C
por 24 horas.
Preparacin del inculo bacteriano
- Cada cepa de bacteria a ensayar (S.aureus, S. typhi, M. smegmatis, B. subtilis, P.
aeruginosa y E. coli) se purific tras inocular en un tubo con 8.0 mL de agar
Meller-Hinton. Se incub a 36C durante 24 horas.
- Una asada del cultivo puro bacteriano se inocul en un tubo con 5.0 mL de caldo
Tripticasa Soya. Se incub a 36C durante 24 horas.
- Se diluy 0.05 mL de cada suspensin en 4.95 mL de solucin salina isotnica
estril (dilucin 1:100).
34
35
- Una asada del cultivo puro de cada levadura se inocul en un tubo con 5.0 mL de
caldo Tripticasa Soya. Se incub a 36C durante 48 horas.
- Se diluy 0.5 mL de cada suspensin en 4.50 mL de solucin salina isotnica
estril (dilucin 1:10).
Demostracin de la actividad antilevadura
- Se inocul en las cajas con Agar-MMS una asada de cada una de las diluciones de
levaduras a ensayar (C. albicans, C. krusei, C. glabrata y C. tropicalis) siguiendo
el patrn de la plantilla. Se realizaron cinco repeticiones por microorganismo. Se
dejaron reposar durante 10 minutos y se incubaron a 36C durante 48 horas.
- Se utiliz como control negativo un sembrado en estras de la levadura en agar
Sabouraud.
Interpretacin:
Se
realizaron tres estras en cada uno de los cuadrantes de la caja. Se dej reposar
durante 10 minutos e incub a 36C durante 24 horas para bacterias y durante 48
horas para levaduras.
Interpretacin:
6. Ensayo linfoproliferativo (Gaines, Andersson, & Biberfeld, 1996; Ramayo, Soba, &
Mundo, 2005)
Ver diagrama de flujo resumido en anexo 3: Resultados grficos del ensayo de
viabilidad celular en linfocitos humanos.
Aislamiento y preparacin de linfocitos
- En campana de flujo laminar se agregaron 5 mL de sangre perifrica con
anticoagulante EDTA sobre 5 mL de Histopaque utilizando una pipeta automtica.
37
38
Reto linfoproliferativo
- Los linfocitos fueron resuspendidos en medio de cultivo suplementado.
- Se colocaron 80 L de la solucin de linfocitos en cinco pocillos de las filas A-E
de una placa de fondo plano estril.
- El primer pocillo de cada fila se dej como control de viabilidad, en l se
agregaron 20 L de RPMI. En los cuatro pocillos restantes se agreg 20 L de la
solucin de MMS. Se incub 37C y 5% de CO2 durante cuatro das.
- Se agreg 25 L de la solucin de XTT a cada uno de los pozos y se incub a
37C durante cuatro horas cubriendo la placa con papel aluminio para evitar
contacto directo con la luz.
- Se agregaron 25 L de SDS como solucin de parada.
- Se ley a 450 nm, comparando viabilidad celular con el aumento de absorbancia.
7.
Ensayo hemoltico para evaluar la actividad del complemento (Kuipers, Aerts, Sjholm,
Harmsen, & Dijk, 2002; Rose, Hamilton, & Detrick, 2002)
Ver diagrama de flujo resumido en anexo 4: Resultados grficos del ensayo de
hemlisis en eritrocitos humanos.
Determinacin de la capacidad hemoltica intrnseca de la solucin de MSM.
- Obtencin de sangre desfibrinada
39
- Preparacin de placa
La placa fue cubierta con papel aluminio y se incub a 37C por 30 minutos.
- Medicin de hemlisis
40
- Preparacin de placa
La placa fue cubierta con papel aluminio y se incub a 37C por 30 minutos.
- Medicin de hemlisis
- Preparacin de la placa
La placa fue cubierta con papel aluminio y se incub a 37C por 30 minutos.
- Medicin de hemlisis
Se colocaron 200 L de agua desmineralizada en los pozos de una placa de
fondo plano.
Se agregaron 50 L de los sobrenadantes de la placa anteriormente centrifugada
Clculos
- % de lisis (determinacin de actividad srica)
% = DO405promedio (H1,H2,H3) - DO405promedio(H4,H5,H6)
X 100
DO405promedio (H10,H11,H12) - DO405promedio (H7,H8,H9)
- Actividad inhibitoria de la muestra versus control
X 100
- Determinacin de CH50
La CH50 fue la concentracin menor de la solucin de MSM en la cual se obtuvo
50% de inhibicin o estimulacin del complemento.
F. DISEO DE LA INVESTIGACIN
1. Tipo de estudio: Cuasi-experimental.
2. Variables
a. Variable independiente: Concentracin de la solucin de ion clorito activado.
43
45
IX. RESULTADOS
A. Preparacin de la solucin de ion clorito activado: Milagroso Suplemento Mineral (MSM)
(Humble, 2006).
Las caractersticas observables de la solucin activa de MSM (0.4 g/mL) que se prepar,
previo a cada uno de los ensayos, fueron: incolora, exotrmica leve, de olor caracterstico a
la solucin de hipoclorito de sodio comercial y pH de 2.6. Se mantuvo fuera de contacto de
la luz y del ambiente externo. Estas caractersticas se mantuvieron por aproximadamente 4
horas. Posterior a este tiempo, se observ la formacin de una solucin amarilla con
sedimentacin de NaClO2. Ninguno de los ensayos utiliz solucin de MSM en este estado.
B. Actividad citotxica sobre Artemia salina (Sols, 1993).
Los nauplios de Artemia salina se enfrentaron a la solucin de MSM (0.4 g/mL)
obtenindose 100% de mortalidad en las cinco repeticiones realizadas. Para la determinacin
de concentracin inhibitoria mnima (CIM), se evidenci 5% de mortalidad a partir de la
dilucin 1:128. En el cuadro 1 se muestra los resultados del ensayo.
Cuadro 1. Actividad citotxica de MSM sobre Artemia salina.
Control
MSM
Ensayo negativo (0.4 g/mL)
A
B
C
D
E
+
+
+
+
+
MSM (diluciones)
1:2 1:4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
p = 0.013 indic que la actividad citotxica fue significativa. En el cuadro 2 se muestra los
resultados del anlisis en el sistema Statgraphics Centurion XVI (ver anexo 1: Resultados
grficos del ensayo de actividad citotxica sobre Artemia salina).
Cuadro 2. Determinacin de DL50 por modelo de regresin logartmica: porcentaje
mortalidad versus concentracin de MSM derivado de los resultados de CIM.
Modelo (regresin logartmica): Log(Concentracin)
Coeficientes
Error estndar
Intercepto
139.09
9.60
0.013
Pendiente
16.47
1.75
0.013
C. Actividad antimicrobiana: bacterias (Mitscher, Leu, Bathal, Wu, Beal, & White, 1972).
Bacterias Gram positivo (Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis y Bacillus
subtilis) y Gram negativo (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhi)
fueron enfrentadas a la solucin de MSM (0.4 g/mL). No se observ inhibicin en el
crecimiento microbiano en los inculos de todas las repeticiones, lo que se interpret como
no actividad antibacteriana significativa (p > 0.05). No se realiz determinacin de CIM. En
el cuadro 3 se muestra los resultados del ensayo (ver anexo 2: Resultados grficos de los
ensayos de actividad antimicrobiana).
Cuadro 3. Actividad antimicrobiana de MSM sobre bacterias.
Actividad antimicrobiana por ensayo
Microorganismo
Staphylococcus aureus
Mycobacterium smegmatis
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella typhi
48
Candida albicans
Candida tropicalis
Candida krusei
Candida glabrata
Control (-)
% viabilidad
100
100
100
100
100
49
F.
Ensayo hemoltico para evaluar la actividad del complemento (Kuipers, Aerts, Sjholm,
Harmsen, & Dijk, 2002; Rose, Hamilton, & Detrick, 2002).
Se determin el porcentaje de hemlisis en una solucin de eritrocitos humanos (5%)
expuesta a la solucin de MSM (0.4 g/mL). Se observ una hemlisis del 100% comparado
con el control positivo en todas las repeticiones del ensayo, lo cual se interpret como efecto
hemoltico intrnseco de la solucin. Por lo anterior, no se evidenci actividad hemoltica
por el sistema del complemento significativa (p > 0.05). En el cuadro 6 se muestra los
resultados del ensayo (ver anexo 4: Resultados grficos del ensayo de hemlisis en
eritrocitos humanos).
Cuadro 6. Capacidad hemoltica intrnseca de la solucin MSM.
Ensayo
A
B
C
D
E
Hemlisis por
Complemento
No determinada
No determinada
No determinada
No determinada
No determinada
50
X. DISCUSIN DE RESULTADOS
La solucin activa del Milagroso Suplemento Mineral (MSM) demostr en este estudio ser
altamente txica (CIM = 6.25 mg/mL; DL50 estimada en 4.48 mg/mL [IC95% 4.44 - 4.53
mg/mL]) segn la escala de toxicidad aproximada propuesta por Sweet (1997; ver anexo 1).
Paralelamente, no se evidenci actividad antimicrobiana e inmunomoduladora, dado que para
esto ltimo, las unidades y respuestas a medir fueron blanco de la misma toxicidad. Por lo
anterior, la hiptesis de este estudio fue rechazada.
Todos los ensayos se realizaron luego de activar una solucin de NaClO 2 (0.4 g/mL) en
medio cido para favorecer la formacin de ion ClO2-. Lo anterior a partir del protocolo de uso
El milagroso suplemento mineral del siglo 21, en donde se indica que en estas condiciones, la
solucin ha demostrado efectos teraputicos. La solucin de MSM preparada y lista para activar,
se encuentra disponible al pblico, en formato de venta libre en la ciudad de Mxico. Para este
estudio, la solucin fue preparada a partir de una concentracin de 90% p/p de NaClO 2, por lo
que el reactivo podra contener 10% de trazas de cloratos, fosfatos y/o sulfuros. La presencia de
estos residuos debe ser considerado en la estabilidad de la solucin y en los hallazgos obtenidos.
Sin embargo, tras la revisin de la hoja de seguridad del NaClO 2 de uno de los distribuidores ms
importantes de reactivos qumicos a nivel regional (Mxico, Centro y Sur Amrica), la pureza del
producto es la disponible actualmente en el mercado (Humble, 2006; Merck Group, 2000).
Para la activacin de la solucin se emple cido ctrico para emular in vitro la concentracin
y las caractersticas cidas del jugo de naranja, que es el excipiente recomendado, dejndose
fuera compuestos como cido ascrbico y vitamina D que tienen mayor variabilidad en productos
naturales y comerciales. Por lo anterior, el efecto de la solucin de MSM depende del medio en
que se activa. El protocolo permite el uso de jugo de limn, toronja y vinagre (cido actico)
(Humble, 2006; Kimball, 1991; Graumlich, Marcy, & Adams, 1986).
El ion ClO2- no es estable en un medio cido, manteniendo un intercambio electrnico que
induce a la produccin de ion ClO3- y radicales libres como el ion superxido (O2-). Este estado
de reaccin dinmico y reversible le confiere a la solucin caractersticas oxidativas y corrosivas.
Esto fue corroborado por las caractersticas fsicas macroscpicas reportadas y por los cambios
observados en aproximadamente cuatro horas posterior a la preparacin, que incluy cambio en
51
54
XI. CONCLUSIONES
55
XII. RECOMENDACIONES
56
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62
XIV. ANEXOS
A. Anexo 1: Grficos del ensayo de actividad citotxica sobre Artemia salina
1. Diagrama de flujo resumido del ensayo de citotoxicidad.
Preparacin de
la solucin de
agua de mar
Cultivo de
Artemia salina
Preparacin de
la solucin
ClO2- (MSM)
Ensayo de
citotoxicidad: 100 L
de MSM + 100 L de
agua de mar con 10-15
nauplios.
Interpretacin:
clculo de % de
nauplios muertos
% nauplios
muertos >
50%
% nauplios
muertos <
50%
Determinacin de CIM y
establecimiento de DL50
63
Parmetro
Intercepto
Pendiente
Estndar
Estadstico
Error
9.60
1.74
T
12.51
4.36
p
0.013
0.013
Frmula
La ecuacin del modelo ajustado para describir la relacin entre variables es:
%Mortalidad = 139.09 + 16.47 * ln (Concentracin) r2 = 0.53
Interpretacin
Puesto que el valor p en la tabla ANOVA es menor que 0.05, existe una asociacin
estadsticamente significativa entre las variables con un nivel de confianza del 95%. El
coeficiente de correlacin es igual a 0.53, indicando una relacin moderadamente
fuerte entre las variables.
140
y = 16.471ln(x) + 139.09
R = 0.5268
120
%Mortalidad
100
80
%Mortalidad
60
Predicted %Mortalidad
40
Logartmica
(%Mortalidad)
20
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentracin
64
3. Dossier fotogrfico
Fotografa A.2.1 Ensayo de citotoxicidad sobre Artemia salina.
65
Nombre
Extremadamente txico
Altamente txico
Moderadamente txico
Ligeramente txico
Prcticamente no-txico
Relativamente nocivo
< 1 mL
1 50
4 mL
50 500
30 mL
500 5,000
600 mL
5,000 - 15,000
1,000 mL
> 15,000
> 1,000 mL
Fuente: Sweet D. (1997). Registry of toxic effects of chemical substances. US. Department of health and
human services. Public Health Service.
Nombre
Sper txico
Extremadamente txico
Muy txico
Moderadamente txico
Ligeramente txico
No txico
DL50 (mg/Kg)
<1
< 1 mL
1 50
4 mL
50 500
30 mL
500 - 5,000
30 - 600 mL
5,000 - 15,000
600 - 1,200 mL
>15,000
> 1,200 mL
Fuente: Sweet D. (1997). Registry of toxic effects of chemical substances. US. Department of health and
human services. Public Health Service.
66
Preparacin de
Agar-MSM
Preparacin de
los inculos de
bacterias y/o
levaduras.
Ensayo de actividad
antimicrobiana: inculo
en agar-MSM
Interpretacin:
ausencia/presencia
de crecimiento
microbiano
Actividad
positiva (+)
Actividad
negativa (-)
Contaminacin
Determinacin de CIM
y reporte.
Reporte
Repetir procedimiento
67
2. Dossier fotogrfico
Fotografa B.2.1 Preparacin para el ensayo de actividad antimicrobiana.
68
69
70
Preparacin de
Agar-MSM
Aislamiento,
preparacin y conteo
de linfocitos.
Preparacin de
solucin 5x106
clulas/mL
Ensayo de viabilidad
celular sobre linfocitos.
Interpretacin:
clculo del % de
clulas acidfilas
% acidofilia
> 60%
% acidofilia
< 60%
Reporte de
inviabilidad celular.
Reto linfoproliferativo
71
2. Dossier fotogrfico
Fotografa C.2.1 Preparacin para la separacin de linfocitos humanos.
72
73
Fotografa C.2.5 Resultados del ensayo de viabilidad celular: linfocitos control (-).
74
D.
Preparacin de
solucin de
eritrocitos al 5%
Preparacin de
la solucin
ClO2- (MSM)
Ensayo de hemlisis
intrnseca de la
solucin de MSM.
Interpretacin:
clculo del % de
hemlisis
% hemlisis
> 50%
% hemlisis
< 50%
Reporte de capacidad
hemoltica intrnseca
de MSM.
Ensayo de hemlisis
del sistema de
complemento (va
clsica y va alterna)
75
2. Dossier fotogrfico
Fotografa D.2.1 Determinacin del pH de la solucin de MSM.
76
77
78