Manual de Inmunologia 2016

2,016
Manual de prcticas de
Laboratorio deInmunologa
Elaboracin
Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA)
Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA)
Adecuacin Campus Huehuetenango

Licda. Cynthia Olivia Rivas Batres (QB)
Universidad Mariano Glvez

Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano
REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE INMUNOLOGA

1. El alumno deber ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:
Bata blanca hasta la rodilla y de manga larga (con su respectivo nombre y el logo
de la universidad bordado).
Gafas de seguridad.
2. Para tener derecho a ingresar al laboratorio, el alumno debe entregar al inicio de
cada prctica:
- Cuaderno completo de laboratorio con los aspectos solicitados para la prctica.
- Reporte de la prctica anterior.
El laboratorio inicia puntualmente, no se permitir el ingreso tarde bajo ninguna
excusa. NO SE REPONDR LABORATORIO POR NINGN MOTIVO
3. El alumno no podr ingresar al laboratorio si:
-
Si tiene el cuaderno incompleto o hay evidencia de copia entre dos o ms

compaeros de laboratorio, de lo contrario tendr inasistencia aunque haya
firmado la lista de asistencia.
4. En el laboratorio est prohibido el ingreso de:

- Telfonos celulares, localizadores, reproductores de msica, cmaras o cualquier
otro artefacto electrnico (iPod, iPad, Laptops, tablets etc.) que pueda interferir
con la atencin del estudiante.
- Comida y bebidas.
- Gorras, suteres o chumpas que no sean del uniforme.
- Mochilas, bolsos u otro accesorio que no sea requerido por el docente. Todas las
pertenencias deber dejarlas en los casilleros asignados
5. No puede trabajar en el laboratorio si tiene uas acrlicas y joyera.
6. Las personas con cabello largo deben recogerlo con una cola o gancho (no fleco).
7. El alumno es responsable del material que recibe, mantenindolo limpio y en perfecto
estado a lo largo de cada prctica. Deber realizar una requisicin del material antes
de iniciar la prctica y al finalizar ser revisado por las licenciadas a cargo.
8. En caso de que el estudiante dae parcial o totalmente un material, deber firmar un
vale con su nombre, nmero de puesto, descripcin del material daado, fecha y
firma, comprometindose a reponer el material durante las dos prcticas siguientes,
de no hacerlo perder el derecho a ingresar al laboratorio. NOTA: El estudiante
deber estar solvente al momento de realizar los exmenes parciales y el final de
laboratorio.
2

9. Los alumnos sern responsables de dejar los reactivos cerrados y sin contaminar por
otros, las mesas limpias y en orden, lo mismo que el equipo que sea utilizado durante
la prctica.
10. Es necesario que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del
laboratorio se comporte de forma adecuada, cumpliendo con el reglamento y las
normas de seguridad requeridas (Prctica No. 1).

ASPECTOS A EVALUAR
1. PLANIFICACION
Generalidades para presentar el cuaderno El
cuaderno debe ser:
- De pasta dura, tamao media carta de 80 hojas con lneas (no
- Forrado con plstico y papel de color verde.
- Identificado en la primera hoja y al frente.
espiral).
El cuaderno de laboratorio contiene las siguientes secciones:

Seccin
Contenido
Indicar claramente el nmero, ttulo y la fecha en que se llevar a

cabo la prctica de laboratorio.
Deber de escribir los objetivos de cada prctica, para
Objetivos
familiarizarse con el contenido que se espera aprender en cada
una de ellas.
Realizar una representacin grfica del procedimiento que se
Diagrama de flujo llevar a cabo en el laboratorio en forma clara y resumida.
Encabezado
Para todos los reactivos utilizados en la prctica deber indicar en

una tabla:
Toxicidad por contacto en piel Toxicidad por
contacto en ojos:
Toxicidad por inhalacin:
Toxicidades/
Valores normales/ Toxicidad por ingestin:
Es de vital importancia incluir los efectos de exposicin, la forma
de aplicar primeros auxilios y la forma adecuada de desecho. Si
existen reactivos que se repitan en diferentes prcticas, deber
escribir esta informacin cada vez que ste se repita.
Principio de la
prueba
Prelaboratorio
Tablas
de
resultados
y
dibujo
de
observaciones
Se describir el principio inmunolgico en el que se basa la

reaccin realizada durante la prueba de laboratorio
deber incluir:
- Revisin Bibliogrfica acerca de la prctica (No ms de una
pgina)
- La importancia Clnica-medica que tiene la prctica
- Cuestionario (si se solicita)
- Referencias Bibliogrficas
Se realizarn las tablas que contengan la informacin generada
durante la prctica, as como los dibujos que se consideren
necesarios.Estos resultados servirn para realizar el informe de
laboratorio. Para poderse retirar el alumno deber presentarlos, y
sern sellados por el instructor
4
Valor (pts)
--10
10
10
10
20
10

Se calificar el orden, legibilidad de la escritura, limpieza y que el

cuaderno est al da.
Se evaluara que cada practica este firmada y sellada por la
Firma
catedrtica
Nota total del cuaderno de laboratorio
Presentacin
10
20
100 pts
NOTA: No puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultneos.
Debe escribir con lapicero azul o negro y con letra legible, los dibujos deben de pintarse y
describirse segn se indique en cada prctica.
El cuaderno se calificar al iniciar cada prctica de laboratorio.
2. DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO

Antes de poder realizar cualquier trabajo dentro del laboratorio, el estudiante
deber demostrar fehacientemente que tiene el conocimiento necesario para poder llevar
a cabo la prctica. Para ello se realizar un examen corto al inicio de cada prctica. El
examen corto ser sobre el contenido de la prctica.
Durante el desarrollo de la prctica el docente evaluar los siguientes aspectos:
Atencin, orden, limpieza y capacidad y disposicin para seguir instrucciones. Las faltas
graves, especialmente las que puedan poner en riesgo la salud y seguridad de los dems,
puede ameritar el retiro temporal o definitivo de un estudiante, teniendo cero en la prctica
completa.
Toda expulsin del laboratorio es contada como inasistencia, aunque el estudiante ya
haya firmado la lista de asistencia.
3. REPORTE DE LABORATORIO
La principal forma de evaluacin del trabajo hecho durante el laboratorio, as como
la comprensin obtenida despus de realizada la prctica, es el reporte de laboratorio. En
l se evidencia el nivel de comprensin y la calidad de trabajo realizado por el estudiante.
Es necesario que muestre tanto una buena redaccin como una buena ortografa.
Como futuros profesionales de las ciencias mdicas, es importante que los estudiantes
ejerciten y mejoren su habilidad de redaccin de informes, ya que es parte de la formacin
de todo profesional.
Generalidades para presentar el Reporte:
Formato virtual
Letra tipo Arial, tamao 12 a espacio cerrado (1,0)

El reporte de laboratorio incluye las siguientes secciones:

Seccin
Contenido
Valor (pts)
Debe mostrar toda la informacin de identificacin del

estudiante y de la prctica.
Encabezado
Resumen
Marco Terico
Resultados
Discusin de
Resultados
---
Debe expresar en forma clara y breve los objetivos, as como

los resultados y conclusiones ms importantes de la prctica,
deber redactarse en tiempo pasado e impersonal. Mximo 10
lneas.
Se deber buscar informacin relacionada al tema de la
prctica, el cual servir tambin para reforzar el conocimiento
adquirido durante la misma.
Deber de tener por lo menos dos pginas y no exceder de
tres.
Se solicita que esta seccin se presente en cuadros tabulados
de fcil lectura, a manera que la interpretacin sea de fcil
entendimiento para cualquier otra persona que no haya estado
en el desarrollo de la prctica. Cada cuadro debe tener
nmero, ttulo que lo describa y fuente de donde se obtuvo la
informacin. NO se aceptan datos, clculos y resultados
escritos a mano. De presentarlos as, se calificar con un cero
esa seccin.
En el caso de realizar dibujos estos deben de estar descritos,
pintados y sealados en caso de que en cada uno haya
distintas estructuras
Es un anlisis e interpretacin de los resultados obtenidos,

contrastando con lo descrito en la teora. El estudiante puede
poner en prctica el aprendizaje que haya obtenido. Debe
explicar su experimento en base al principio qumico
estudiado, utilizando un lenguaje tcnico-cientfico y redaccin
adecuada. Adems, debe discutir sobre las posibles fuentes
de error involucradas en la prctica y posibles formas de
mejorar la ejecucin y rendimiento de la misma.
10
10
20
20

Conclusiones
Responden a los objetivos y se derivan de los resultados

obtenidos, no deben ser muy extensas. Como regla, no se
puede concluir teora ni aspectos que no hayan sido incluidos
en la discusin. Debern colocar por lo menos 3 conclusiones
Responder las interrogantes planteadas al final de cada

prctica en el manual de laboratorio.
Referencias
Presentar segn los lineamientos del curso de Metodologa de
la Investigacin.
Nota total del reporte de laboratorio
Cuestionario
20
10
10
100
NOTA: Algunas secciones no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega

puntos, sin embargo su ausencia s resta puntos de la nota del reporte de laboratorio. Los
estudiantes que no lleguen al da de la lectura de los cultivos, NO podrn entregar reporte,
aunque hayan elaborado otras partes de la prctica.
OBSERVACIONES IMPORTANTES
El reporte de laboratorio debe ser entregado en el periodo de laboratorio de la
siguiente prctica.
No se calificarn reportes sin nombre.
No se recibirn reportes parcial o totalmente escritos A MANO.
Toda aquella persona que se haya ausentado o haya sido retirada por cualquier
motivo de una prctica, NO TIENE DERECHO a entregar el informe respectivo,
sin importar si la falta haya sido justificada. Sin embargo, esto no quiere decir que
el alumno se libere de la evaluacin del tema de la prctica durante las pruebas
parciales y final del laboratorio.
Si algn alumno tiene cualquier duda o reclamo sobre la forma en que se ha calificado su
reporte, debe hablar con su instructor DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA despus de
haberlo recibido corregido NO AL FINAL DEL SEMESTRE. No se aceptarn reclamos
posteriores.
IMPORTANTE:
Se tomar como falta grave (nota 0) cualquier indicio de plagio:
- Reproduccin no autorizada de una publicacin, palabra por palabra,
incluyendo internet),
- Copia total o parcial del contenido del reporte por parte de dos o ms alumnos
(la sancin aplica a todos los estudiantes involucrados). Todo caso quedar
documentado, y una reincidencia puede significar el retiro definitivo del
laboratorio.

DISTRIBUCIN DE LA ZONA DE LABORATORIO

Rubro a evaluar
Reportes
Cortos
Discusiones
Parcial de Laboratorio
Punteo
4
4
2
3
Final de Laboratorio
Cuaderno
Trabajo en grupo sobre inmunopatologa

y diagnstico de enfermedades inmunes
Texto paralelo
Total nota de Laboratorio
3
2
25

CALENDARIZACIN DE PRCTICAS
No.
Nombre
Fecha
0. Informacin general
21/07
1. Bioseguridad y buenas prcticas en el laboratorio
21/07
2. Venopuncin y manejo de especmenes hematolgicos
28/07
3. Clulas sanguneas. Observacin microscpica de la

sangre. Evaluacin hematolgica
4/08
4. Inmunodifusin
11/08
5. Reacciones de precipitacin
18/08
22-26/08
Primeros exmenes parciales Teora

6. Reacciones de aglutinacin
01/09
7. Reacciones de hemaglutinacin (grupo sanguneo y Rh)
08/09
22/09
Hoja de trabajo
8. Hemaglutinacin pasiva
29/09
9. Inmunocromatografa
29/09
06/10
Parcial de Laboratorio
10.
13/10
Ensayos inmunoenzimticos (ELISA)
17-21/10
Segundos exmenes parciales Teora

11.
Presentaciones: Inmunologa de enfermedad reumtica
27/10
12.
Presentacin: Inmunologa de lupus
27/10
13.
Presentaciones:
Inmunologa
neurolgicas autoinmunes
14.
Presentacin: Inmunologa del cncer
15.
Presentacin: Enfermedad tiroidea
03/11
16.
Presentaciones: Inmunodeficiencia (VIH/SIDA)
03/11
de
enfermedades
Examen final de laboratorio
27/10
03/11
05/11

INDICE
Pgina
Practica 1. Bioseguridad
11
Practica 2. Venipuncin y manejo de especmenes

hematolgicos
Practica 3. Clulas sanguneas
16
Practica 4. Inmunodifusin radial
35
Practica 5. Reacciones de Precipitacin
41
Practica 6. Reacciones de Aglutinacin
44
Practica 7. Reacciones de Hemaglutinacin directa e indirecta
48
Practica 8. Hemaglutinacin pasiva
53
Practica 9. Inmunocromatografa
57
Practica 10. Ensayo inmunoenzimticos (ELISA)
60
10
27

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Practica 1
1. Introduccin
Las siguientes son las prcticas generales requeridas para todo laboratorio que maneja
sustancias infecciosas.
a. Deber estar disponible un manual de procedimientos especficos (de seguridad) en
el laboratorio para todo el personal que trabaje en l. Todos sus requerimientos
debern ser seguidos, el mismo estar documentado y ser revisado y actualizado
con regularidad. Deber estar colocado en un lugar accesible para todos y ser
firmado por todo el personal.
b. El personal debe recibir entrenamiento sobre todos los potenciales peligros
asociados con el trabajo, as como sobre las precauciones necesarias para prevenir
la exposicin a agentes infecciosos y la disposicin y descarte de materiales. El
personal debe mostrar evidencia de que ha entendido las instrucciones dadas en el
entrenamiento, el cual deber ser documentado y firmado por el personal y por el
supervisor;
debern tambin implementarse programas continuos de
entrenamiento.
c. No est permitido comer, beber, fumar, guardar cualquier tipo de alimentos,
pertenencias personales o utensilios. Est prohibido maquillarse, colocarse o
removerse lentes de contacto. El uso de lentes de contacto est permitido
solamente cuando no hay otra opcin. El uso de joyas y accesorios no es
recomendado en el laboratorio.
d. Est prohibido pipetear con la boca cualquier sustancia.
e. El cabello largo debe estar atado atrs o arreglado de manera que no entre en
contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el equipo.
f. El acceso al laboratorio y reas de apoyo est limitado a personal autorizado. No
se admiten nios.
g. Las heridas abiertas, cortadas, rasguos y abrasiones deben estar cubiertos con
materiales a prueba de agua.
h. Los laboratorios deben mantenerse limpios. El almacenamiento de materiales que
no son pertinentes al trabajo y que no puedan ser fcilmente descontaminados (por
ejemplo revistas, libros, correspondencia), debe ser minimizado; el trabajo de
papelera y escritura de reportes debe estar aparte de las reas de trabajo con
material infeccioso.
i. Deber usarse ropa protectora, apropiadamente cerrada, por todo el personal,
incluyendo visitantes, estudiantes y todas las personas que entren o trabajen en el
laboratorio. Deber usarse zapato cerrado y con tacones adecuados en todas las
reas de laboratorio. La bata del laboratorio debe ser usada siempre.
j. Cuando se sabe de un riesgo potencial de exposicin a salpicaduras y otros objetos,
ya sea durante las operaciones de rutina o bajo circunstancias especiales (ej.
11

Accidentes), debe usarse proteccin de los ojos y la cara. Debe tenerse cuidadosa
consideracin para identificar los procedimientos que requieran proteccin de ojos y
cara.
k. Para todos los procedimientos que involucren contacto directo con la piel y material
biolgico o animales infectados, deben usarse guantes (de ltex, vinilo u otro copolmero). Estos debern ser removidos antes de abandonar el laboratorio y
descartados.
l. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las reas que no son de laboratorio
(pasillos, biblioteca, etc.).
m. Si existe sospecha o certeza de exposicin, la ropa contaminada debe ser
descontaminada antes de lavarla.
n. El uso de agujas, jeringas y otros objetos punzo-cortantes debe estar estrictamente
limitado; las agujas y jeringas deben ser usadas slo para la inyeccin parenteral y
aspiracin de fluidos de animales de laboratorio. Debe tenerse especial cuidado
cuando se usan agujas y jeringas para evitar autoinoculacin y generacin de
aerosoles durante su uso y descarte. Las agujas no deben ser dobladas, cortadas,
tapadas o removidas de las jeringas; deben ser colocadas rpidamente en un
contenedor resistente de punzo-cortantes para su descarte.
o. Las manos deben ser lavadas despus que se han quitado los guantes y antes de
dejar el laboratorio, as como en cualquier momento despus de manipular material
conocido o sospechoso de estar contaminado.
p. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y despus de cualquier
salpicadura de material potencialmente infeccioso. No usar cloro en las campanas,
excepto en caso de algn derrame. Es altamente corrosivo.
q. Si algn material o equipo debe salir del laboratorio para servicio de mantenimiento
o para descarte, debe ser apropiadamente descontaminado y etiquetado como tal.
Es responsabilidad del operador autoclavear y descartar todo desecho
potencialmente peligroso.
r. Debe realizarse regularmente un monitoreo de las autoclaves usadas para
descontaminar, usando indicadores biolgicos y todos los resultados deben ser
archivados.
s. Todo material contaminado, slido o lquido, debe ser descontaminado antes de
descartarlo o de reusarlo.
t. Todo el tiempo deben estar disponibles los desinfectantes efectivos dentro de las
reas en donde se manipula o se almacena material infectivo
u. Para el transporte de materiales infecciosos dentro de las instalaciones, debern
usarse contenedores a prueba de derrames.
v. Las salpicaduras, accidentes o exposiciones a materiales infecciosos, deben ser
reportados inmediatamente al supervisor del laboratorio. Deben mantenerse
registros escritos de tales incidentes dentro del Departamento, y los resultados de
las investigaciones de tales incidentes deben ser usados para educacin continua.
12

w. Debe mantenerse un programa efectivo de control de insectos y roedores.

2. Objetivo General
En esta prctica el estudiante aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio
de inmunologa.
3.
Objetivos Especficos
Que el estudiante:
-
Se familiarice las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunologa
Conozca la importancia de los riesgos biolgicos del manejo de material infeccioso
Aplique sus conocimientos en la resolucin de casos de accidente ocupacional con

material infeccioso
4.
Procedimiento
Revise literatura sobre bioseguridad en el laboratorio y esuelva los siguientes casos de

accidente ocupacional:
CASO No. 1
Edad: 34 aos
Sexo: femenino
Profesin: tcnico de laboratorio
Evento: Manipulacin de tubo de ensayo para procedimiento de valores sanguneos
Situacin: Ruptura de tubo de ensayo que provoc herida del dedo medio de la mano
derecha en contacto con sangre de paciente VIH positivo, se desconoce valores de CD4
y carga viral.
Cul es el riesgo para el tcnico de laboratorio al entrar en contacto con la sangre del
paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al tcnico de laboratorio?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el tcnico para disminuir el riesgo
de contacto con el material infeccioso?
CASO No. 2
Edad 27 aos
Sexo. Femenino
Profesin: Mdico
Evento: colocacin de sonda nasogstrica a con tuberculosis pulmonar, con franca
hemoptisis y hematemesis.
13

Situacin: hemoptisis y hematemesis activa durante el procedimiento de colocacin de la

sonda que contamina la conjuntiva del mdico.
Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al mdico?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el riesgo
CASO No. 3
Edad: 42 aos
Sexo: masculino
Profesin: mdico
Evento: puncin del ganglio cervical en paciente VIH positivo en fase de SIDA,
Situacin: realiza procedimiento de obtencin de muestra y al separar la aguja de la
jeringuilla el protector se separa y se introduce profundamente en el pulgar de la mano
derecha
Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben realizar al mdico?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el riesgo
CASO No. 4
Edad: 22 aos
Sexo: masculino
Profesin: estudiante de medicina
Evento: preparacin de pipetas de Westergreen para la evaluacin de velocidad de
sedimentacin
Situacin: realiza procedimiento de llenado de la pipeta, sin embargo el estudiante NO utiliza
un pipetor y lo hace con la boca. La sangre entra en contacto con su boca.
Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con los sangre del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir el
riesgo de contacto con el material infeccioso?
CASO No. 5
Edad: 19 aos
Sexo: femenino
14

Profesin: estudiante del curso de Inmunologa

Evento: preparacin de reactivos para la elaboracin de agua regia (cido clorhdrico y cido
ntrico, proporcin 3:1)
Situacin: al realizar la mezcla de suero y reactivo el estudiante deja caer sobre la mesa
de trabajo gotas de los mismos y no se da cuenta de ello. Posteriormente pone el
antebrazo sobre el lquido derramado.
Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con el suero y reactivos?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir el
riesgo de contacto con el material infeccioso?
CASO No. 6
Evale la bioseguridad en el laboratorio de inmunologa, haciendo nfasis en los cuidados
que se debe de tener para mantener un ambiente seguro para las personas que trabajen
en l, incluya:
-
Descarte de material bioinfeccioso

Limpieza del rea de trabajo
Lavado de cristalera
Lavado de manos
5. Referencia
Laboratory Biosafety Guidelines. 2004. 3rd edition. Published by the authority of the
Minister of Health Population and Public Health Branch, Centre for Emergency
Preparedness and Response, Government of Canada.Pp. 19-23.
VENIPUNCIN Y MANEJO DE ESPECMENES HEMATOLGICOS

Prctica 2
1. Introduccin
Las venas de un paciente constituyen la principal fuente de especmenes para anlisis de
laboratorio, como punto de entrada de medicamentos, as como el sitio ideal para
transfusiones sanguneas y/o procedimientos intravenosos. El proceso mediante el cual
la sangre es removida de la vena es conocido como venipuntura o flebotoma.
La importancia de la flebotoma reside en que es el primer contacto entre el laboratorio y
sus pacientes, mientras que desde el punto de vista de la muestra, un proceso cuidadoso
conlleva una muestra apropiadamente colectada, as como la garanta de la seguridad de
su origen y el correcto envasado y transporte, factores necesarios para la correcta
evaluacin e informe de los exmenes a realizar.
15

La toma de muestra de sangre para anlisis de laboratorio se puede realizar mediante las
siguientes tcnicas: venosa o perifrica y capilar. Para la mayora de los exmenes
clnicos, incluyendo hemogramas y dosificacin de hemoglobina, se recomienda utilizar
sangre venosa, mientras que para las frmulas leucocitarias o frotes perifricos puede
extraerse sangre en el lbulo de la oreja o de la yema de un dedo. En los casos de nios,
se recomienda utilizar la yema del dedo gordo del pie o del taln.
2. Objetivos
Que el estudiante:
-
Se familiarice con el equipo utilizado para la extraccin de sangre.
Realice la extraccin de sangre venosa utilizando jeringa o equipo vacutainer.
Conozca la importancia de realizar correctamente este procedimiento.
3. Alcance
En esta prctica el estudiante aprender el procedimiento correcto de extraccin de sangre
venosa.
4. Antecedentes
REQUERIMIENTOS PREVIOS A LA VENIPUNTURA
4.1 Orden mdica
Una solicitud mdica debe acompaar cada muestra admitida dentro del laboratorio. Dicho
documento debe contener la informacin apropiada para el correcto procesamiento de la
muestra. Los elementos esenciales de una orden mdica son:
-
Nombre del paciente

Nmero de identificacin del paciente y/o nmero de historia clnica
Gnero y edad del paciente
Nombre completo del mdico solicitante a) Anlisis requeridos
4.2 Equipo necesario para la venipuncin

El siguiente equipo es necesario para la venipuntura de rutina:
-
Equipo Vacutainer o Tubos de vaco: Estos dispositivos estn diseados para

llenarse con un volumen predeterminado de sangre por medio de vaco, esto
garantiza una adecuada relacin entre sangre y anticoagulante. Los tapones de
goma estn codificados por color de acuerdo con el aditivo que contienen as por
ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los ms utilizados para hematologa
rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas de coagulacin.
o
Agujas especiales para adaptador.

16

Adaptador para tubos de vaco.
Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
Agujas: Estn numeradas dependiendo de su calibre. Para coleccin de sangre

para hemogramas, se recomienda una
aguja de dimetro de 0.8mm (21G)
para evitar dao a las clulas. Las
agujas de 0.9-1.1mm de dimetro
(20G-19G) se utilizan normalmente
para puncin venosa en adultos.
Torniquete: Generalmente una liga

plana de ltex.
Alcohol: Etlico o isoproplico al 70%.
Algodn
Gasas y/o vendas adhesivas
Dispensador de agujas
4.3 Etiquetado de los tubos

Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los anlisis
concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el etiquetado para
garantizar la calidad de la muestra pre-analtica son:
-
Nombre o iniciales del paciente
Nmero de
paciente
Fecha y hora de la toma de

muestra
Iniciales del flebotomista
identificacin
del
PUNCIN VENOSA
Fundamento terico
La puncin venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas
necesarias en hematologa. Las venas de eleccin suelen ser las de la cara anterior del
antebrazo (vena cubital, vena ceflica y la vena baslica) porque resulta fcil acceder a
ellas. Las cifras hemticas permanecen constantes no obstante el sitio seleccionado para
obtener la puncin venosa.
Preparacin del paciente
-
Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra. Valore la existencia de

problemas hemorrgicos o de circulacin, o alergias en ltex.
Evite puncionar en un rea con hematoma, fstulas, quemaduras, escoriaciones de la

piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado mastectoma reciente.
17

Evite puncionar en el brazo donde hay venoclisis, inyeccin intramuscular previa o

administracin de medicamentos va intravenosa.
Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite ayuda
del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre.
Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con masajes. Se

debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de
realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o electrolitos, favorecer
el ejercicio leve del brazo.
Metodologa
Precauciones generales
-
Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene.

Practique las precauciones universales mnimas con todo paciente a ser atendido. Toda
muestra debe ser considerada potencialmente infecciosa y se deben tomar las
precauciones que garanticen la seguridad del flebotomista y de los pacientes.
El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez

manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se le considere nuevo.
o
Tome precauciones al manipular agujas y/o lancetas. o
No deje agujas y/o lancetas usadas en la mesa de trabajo. o

No coloque el protector a la aguja.
o
Evite que los nios toquen o jueguen con los equipos
de flebotoma.
-
Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados
en recipientes para ese fin.
Los recipientes que contienen algodn y los de desecho deben estar perfectamente
cerrados todo el tiempo y se abrirn solamente al momento de usar.
Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se
mantendrn puestos durante todo el procedimiento.
Si ocurre un pinchazo accidental, informar inmediatamente al jefe de laboratorio.

Mantenga la calma, y lvese inmediatamente con agua, jabn y alcohol. Favorezca la
salida de sangre por presin continua.
Procedimiento en adultos
-
Identifique correctamente al paciente. Preprelo correctamente para la extraccin.
Coloque un torniquete en la parte superior del brazo (aproximadamente 5 cm por encima

del pliegue) para producir congestin venosa. El torniquete prolongado causa estasis y
hemo-concentracin. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresin
del msculo no mayor a 1 mm.
18

Seleccione el sitio de la puncin: Pida al paciente que

abra y cierre el puo varias veces; escoja una vena
accesible.
Limpie el sitio de la puncin, previo a puncionar debe

estar seco. Debe tener presente que una vez
realizada la decontaminacin, no debe volver a tocar
el rea venosa.
Para realizar la puncin el paciente debe tener el

puo cerrado.
Coloque la punta de la aguja en un ngulo de 1530

sobre la superficie de la vena escogida y atraviese la
piel con un movimiento firme y seguro, hasta el lumen
de la vena.
Una vez que penetra en la vena, la sangre llena los

tubos aspiradores automticamente por la presin
negativa dentro del tubo en el caso de Vacutainer ,
mientras que con jeringas se debe jalar el mbolo con
movimiento continuo para extraer la sangre hasta el
volumen requerido. Evite presionar fuertemente la
aguja durante la extraccin.
Solicite al paciente que abra el puo y afloje el

torniquete para que la sangre fluya mejor y remueva
la aguja del brazo con movimiento suave al terminar
de colectar, sin apretar el rea de la puncin con el
algodn. Presione el algodn sobre el sitio de la
puncin aplicando una presin adecuada y no
excesiva para evitar la formacin de hematoma.
Descartar las agujas y/o jeringuillas en un contenedor

apropiado.
Procedimiento en nios
-
En nios mayores de 6 meses, se recomienda hacer

la extraccin del brazo como en adultos, pidindole a
un adulto que colabore en mantener inmvil al nio,
en particular el brazo.
En el caso de nios menores de 6 meses, se

proceder a extraer la muestra del taln con una
lanceta descartable. Antes de la extraccin conviene
calentar el taln frotndolo entre las manos para
favorecer la irrigacin de la zona.
Desinfectar con un trozo de algodn embebido en

alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta en la
zona lateral del taln.
19

Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en

el tubo con anticoagulante.
Secar la zona con un trozo de algodn seco y una

vez que no haya sangrado, colocar una curita o
apsito.
PUNCIN CAPILAR
Fundamento terico
Es utilizada para extraer pequeas cantidades de
sangre para determinaciones de hemoglobina,
hematocrito y frotes perifricos. Hay tres lugares de donde realizar esta puncin: el lbulo
de la oreja, la yema del dedo y el taln del pie.
Metodologa
-
Tome la muestra de las yemas de los dedos o lbulo de la oreja (adultos); del dedo pulgar
del pie o del tobillo (en lactantes o nios menores de 6 meses).
Desinfecte el sitio de la puncin, squelo y puncione la piel con una lanceta estril que
no debe penetrar ms de 2 mm.
Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un microtubo y

prepare las laminillas con esa muestra.
Recomendaciones:
No oprima el sitio de la puncin para obtener sangre porque se altera la composicin
hemtica o invalida los resultados.
Muchas veces se facilita la toma e muestra si se calienta la extremidad o se coloca en
postura colgante.
Cuidados del paciente despus de la puncin:

Aplique una pequea curacin o cinta adhesiva sobre el sitio de la puncin, si bien
hay que verificar presencia de hemorragia. De haberla, presione; en caso de que
persista el sangrado, busque en los antecedentes del paciente si ha sido sometido
a un tratamiento con anticoagulantes (aspirina) y/o antecedentes de alteraciones en
la circulacin o coagulacin.
CONSIDERACIONES ADICIONALES PARA LA BUENA CALIDAD DE LA
EXTRACCIN DE MUESTRA
Para prevenir la formacin de hematoma No
puncionar directamente sobre la pared de la vena.
Remover el torniquete antes de retirar la aguja.
20

Sostener las venas superficiales al momento de la puncin.

Asegurarse que la aguja penetre completamente hacia el lumen de la vena. La
penetracin parcial permite que la sangre escape hacia el tejido blando, rodeando la vena
va el bisel de la aguja.
Aplicar una presin adecuada en el sitio de la puncin.
Para prevenir la hemlisis (principal interferente en muchas pruebas) Mezclar
los tubos con anticoagulante gentilmente (en forma de 8) de 15-20 veces.
Evite la extraccin sangunea directamente de un hematoma.
Evite la extraccin forzada generada por el aspirado violento del mbolo, en el caso de
jeringas. Evite la formacin de espuma en la muestra.
Asegrese que el sitio de venipuncin est seco.
Evite la venipuncin traumtica.
En tubos no llenados al vaco, puede ocurrir hemlisis al llenarlos cuando se hace una fuerte
presin sobre el mbolo provocando un chorro de sangre violento.
La aplicacin prolongada del torniquete conlleva...
A la hemo-concentracin de elementos no filtrables (ej. protenas). La presin hidrosttica
ocasiona que el agua y algunos elementos filtrables abandonen el espacio extracelular y
se acumulen en la sangre. En algunos casos esto ocasiona serias interferencias en los
anlisis a efectuar.
Un aumento del volumen del paquete globular sanguneo.
Alteraciones dentro de los parmetros evaluados en la qumica sangunea.
GUA PARA LA RESOLUCIN DE PROBLEMAS DURANTE LA EXTRACCIN VENOSA

Si no se obtiene muestra sangunea o la misma es incompleta...
Cambie la posicin de la aguja. Un leve movimiento hacia delante (cuando hay menos de
2/3 de la aguja dentro de la piel), en el ngulo correcto ayuda. Es muy probable que no
se encuentre en el lumen.
En caso de una penetracin muy profunda (cuando hay ms de 2/3 de la aguja dentro de
la piel), un leve movimiento hacia atrs favorece la entrada al lumen venoso. Asegrese
que el ngulo sea el correcto.
En caso fallido, tome en cuenta lo siguiente:
o
Afloje el torniquete.
Este podra estar
obstruyendo el flujo sanguneo. o Pruebe otro
21

tubo. Es posible que no haya vaco en el que

se est utilizando.
Fije nuevamente la vena. Algunas veces las

venas se mueven del sitio de la puncin.
Si la sangre deja de fluir en el tubo...

Es probable que la aguja se haya salido de la vena durante el recambio de tubos. Con
movimientos gentiles, redireccinela. Para evitar los anterior, mantenga el equipo
firmemente sin ejercer una presin que cause molestias al paciente.
Es probable que la vena haya colapsado; afloje el torniquete para incrementar el flujo
venoso, remueva la aguja ligeramente y vuelva a redireccionarla. Si esto no es exitoso,
remueva la aguja, tenga los cuidados correspondientes en el sitio de la puncin. Puncione
nuevamente en un lugar diferente.
Otros problemas que deben considerarse

Si se forma un hematoma bajo la piel adyacente al sitio de la puncin, afloje el torniquete
y retire la aguja. Aplique presin firmemente sobre el hematoma. Aconseje el uso de
paos intermitentes de agua fra y caliente.
Pudiera suceder que se atraviese una arteria, en estos casos la sangre se observa de
color rojo brillante. Afloje el torniquete, retire suavemente la aguja y aplique una presin
uniforme y constante durante 5 minutos.
22

5. Materiales y equipo
-
Algodn
Etanol al 70%
Ligadura
Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA
Jeringas de 3 cc
Descartador de punzocortantes -
Bolsas roja
6. Procedimiento
-
Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra:

Coloque al paciente bien sentado con el brazo a puncionar extendido.
Busque la vena que va a puncionar visualmente, y luego con el dedo ndice tquela para
ver su trayectoria.
Figura 1. Venas del antebrazo
23

Coloque el torniquete haciendo un nudo moderadamente apretado en la parte superior

del brazo donde va a hacer la puncin
Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite ayuda
del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre.
Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con masajes. Se

debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de
realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o electrolitos, favorecer
el ejercicio leve del brazo.
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad

Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo
se est trabajando con muestras potencialmente infectivas.
8. Formato de presentacin de resultados

Entregue la hoja de trabajo del cuestionario escrita a mano, junto con su pareja de extraccin
9. Cuestionario
a. Describa brevemente el proceso de extraccin
b. Cul es el calibre de la aguja utilizada para el procedimiento de venipuncin?
c. Por qu se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extraccin sangunea?
24

d. Por qu no se debe de realizar la extraccin sangunea en una vena muy delgada y

e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
l.
m.
n.
o.
p.
q.
r.
s.
t.
cul es la consecuencia de hacerlo?

Cules pueden ser las causas por la cual deja de salir sangre durante la extraccin
sangunea?
Mencione tres precauciones para evitar hemlisis de la muestra de sangre obtenida
Mencione tres precauciones para evitar hematomas
Como se debe de introducir el bisel de la aguja y Por qu?
Explique porqu no debe de pasarse la sangre de la jeringa al tubo sin quitar la aguja
Mencione dos soluciones desinfectantes que se pueden utilizar, adems del etanol al
70%
Defina que es un anticoagulante
Qu anticoagulante contienen cada uno de los tubos vacutainer que se identifican con
los tapones de los siguientes colores
a. Celeste
b. Morado
c. Verde
d. Rojo
Qu ventajas tiene la utilizacin de mariposas para extraer sangre?
En qu se diferencia la sangre arterial de la sangre venosa?
Qu diferencia hay entre suero y plasma?
Qu ventaja tiene la extraccin venosa sobre la capilar?
Defina qu es un sistema de extraccin tipo vacutainer, como funciona y qu se
requiere para la extraccin con vacutainer a diferencia de la extraccin con jeringa
Qu diferencia hay entre venopuncin y venociclis?
Qu hacer en caso de no tener vena visible para la extraccin sangunea?
Que venas se pueden utilizar para realizar la flebotoma en el brazo
NOTA: coloque su bibliografa al final del cuestionario

10. Bibliografa
-
William W., et al. Hematologa. Barcelona: Salvat, 1979. x + 455p.
Fink N., et al. Mtodos del laboratorio hematolgico.

Universidad Nacional de la Plata, 2005. 58p.
Prez JR., Fernndez J. Manual de prcticas de laboratorio de hematologa. 3 ed.

Guatemala: Universidad de San Carlos, 1997. 102p.
Albarenga S., Crdoba C., Plazas L. Sangre. Mar de Plata: Escuela de Enfermera
Hospital de la Comunidad, 2004. 11p.
Phlebotomy.
Disponible
en
URL:
http://www.medlib.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/
TUTORIAL.html#2 Fecha de consulta: Junio, 2006.

25
Primera parte.
Argentina:

CLULAS SANGUNEAS
Prctica 3
1. Introduccin
La frmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases
de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso
calcularse el nmero real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto),
conocindose el total de leucocitos.
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrfilos segmentados y el recuento total de leucocitos es de 20 000,
entonces el valor absoluto de neutrfilos segmentados sera: 60/100 x 20 000 = 12 000.
Valores de referencia absolutos de neutrfilos segmentados = 3000 5000 por mm3
Conclusin: Los valores relativos slo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos
se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se
debe emplear la frmula para obtener el valor real, y as determinar que elemento celular
se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido.
2. Objetivos
-
Conocer las clulas que conforman la sangre
Identificar la morfologa de cada una de los leucocitos presentes en la sangre
Realizar una formula leucocitaria y conocer las distintas patologas donde hay
alteracin.
3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr identificar las distintas morfologas de los
leucocitos presentes en la sangre, as como la aplicacin de de la realizacin de una
formula leucocitaria y su importancia en el diagnstico de determinadas patologas.
4. Antecedentes
4.1 Granulocitos
Aquellos que tienen grnulos especficos: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Los grnulos
observados en extendido estn cargados de lisosomas y enzimas hidrosolubles que son
agentes antibacterianos necesarios para la digestin de partculas fagocitarias. Aqu
tenemos:
26

4.1.1 Neutrfilos
4.1.1.1 Neutrfilos en cayado (Fig. 1)
Es el granulocito en banda. Mide de 10m a 14m, ncleo condensado que puede presentar
una dos constricciones, pero no tiene puente de cromatina. El citoplasma presenta
grnulos especficos e inespecficos, membrana celular lisa, citoplasma de color
ligeramente rosado dependiendo de la coloracin.
4.1.1.2 Neutrfilos segmentados (Fig. 2)
Mide igualmente de 10m a 14m, ncleo que presenta mayor condensacin y est formado
por varios lbulos (hasta 4) unidos por puentes de cromatina. El citoplasma est cargado
de grnulos.
Alteraciones leucocitarias de los neutrfilos
Granulaciones txicas (Fig. 3)
Son grnulos basfilos ms oscuros que lo normal y se observan durante el transcurso de
infecciones severas y estadios txicos.
Vacuolas txicas (Fig. 4)
Se observan en el citoplasma de los neutrfilos durante infecciones severas y estados
txicos.
Cuerpos de Dohle (Fig. 5)
Son reas teidas de azul en el citoplasma de los polimorfonucleares neutrfilos y se
encuentra en infecciones, especialmente en neumonas.
Palillo de tambor (Fig. 6)
Es un pequeo apndice (cromatina sexual) que permite conocer el sexo del individuo
mediante una simple observacin en un frotis de sangre perifrica en los neutrfilos. Se
presenta en las mujeres. Polisegmentacin (Fig. 7)
Son neutrfilos con 5 o ms lobulaciones. Se observa en las anemias por deficiencia de
vitamina B-12 y cido flico, Sndrome de Down y otras anomalas.
Existe aumento en el nmero de neutrofilos (neutrofilia) en:
-
Infecciones bacterianas por agentes piognicos.
Abscesos y septicemias.
Procesos inflamatorios y necrosis tisular.
Trastornos metablicos por intoxicacin.
Procesos malignos: Carcinoma -
Postesplenectoma.
Hemorragias y hemlisis.
27

Fig. 1 Neutrfilo en banda Fig. 2 Neutrfilos segmentados

Granulacin txica y
neutrfilo segmentado
Fig. 4 Vacuolizacin delcitoplasma

Fig. 6 Palillo de tambor
Fig. 3
Fig. 5 Cuerpos de Dohle
Fig. 7. Polisegmentacin
28

Desviacin a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o

cayado, y juveniles) dentro de los neutrfilos. Constituye un importante valor diagnstico
y pronstico. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones.
Desviacin a la derecha: Corresponde a la hipersegmentacin nuclear. La mayora de
polimorfonucleares presenta ms de 5 lobulaciones. Ocurre en:
-
Anemia perniciosa.
Hipersegmentacin constitucional hereditaria.
Reacciones mieloides de la sepsis.
Afecciones hepticas.
Leucemia mieloide.
En la agona.
Existe disminucin de neutrfilos (neutropenia) en:

-
Aplasia medular
Mieloptisis de la mdula sea
Agentes citotxicos
Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblsticas).
4.1.2 Eosinfilos (Fig. 8)

Son parecidos a los neutrfilos, pero son algo mayores.
Generalmente el ncleo es bilobulado y lo que ms caracteriza
a esta clula es la presencia de grnulos color naranja-marrn
vistos claramente, muchas veces estos grnulos hacen que se
pierda la membrana celular por el rompimiento de sta, ya que
estas clulas son muy frgiles.
Patologa: Existe aumento de eosinfilos (eosinofilia) en:
-
Infecciones parasitarias.
Reacciones alrgicas.
Enfermedades cutneas.
Neoplasias.
Figura .8Eosinofilo
4.1.3 Basfilos (Fig. 9)

La caracterstica ms importante de esta clula es la cantidad
de grnulos de color azul negruzco que se encuentra ocupando
toda la clula (esto cuando la clula es madura) y parte de la
clula cuando sta es inmadura. Presenta un ncleo que
muchas veces no logra observarse por la cantidad de grnulos
que contienen histamina y heparina.
29
Figura .9Basofilo

Patologa: Existe aumento (basofilia) en Leucemia por basfilos.

4.2 Agranulocitos
No poseen grnulos. Aqu tenemos a los linfocitos y monocitos.
4.2.1 Linfocitos: Linfocitos grandes y linfocitos pequeos.
4.2.1.1 Linfocitos grandes (Fig. 10)
Miden de 15m a 25m, presentan generalmente un ncleo ligeramente oval discretamente
indentado, la cromatina es densa pero no tanto como en el linfocito pequeo (esto lo puede
confundir con el monocito). Citoplasma abundante, azul plido y puede contener grnulos
azurfilos inespecficos.
4.2.1.2 Linfocitos atpicos (Fig. 11)
Llamados tambin virus linfocitos, clulas linfomonocitoides, clulas activadas de Turk,
clulas de Turk, virocitos, inmunoblastos, etc. Miden de 15m a 30m, ncleo irregular,
indentado, excntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es amplio, color azul
tenue, y puede presentar grnulos azurfilos y vacuolas. Estas clulas pueden observarse
en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades autoinmunes y
normalmente pueden hallarse hasta en 5%.
4.2.1.3 Linfocitos con mitosis o binucleados (Fig. 12) Pueden
encontrarse en enfermedades virales.
4.2.1.4 Linfocitosvacuolados (Fig. 14)
En caso de linfocitos que reaccionan por efecto de la radiacin ultravioleta o respuesta a
tratamientos de quimioterapia. 4.2.1.5 Linfocitos pequeos (Fig. 10b)
Miden de 9m a 15m, presentan un ncleo que ocupa casi toda la clula, excntrico, cromatina
fuertemente densa. El citoplasma es escaso, basfilo y puede contener
grnulos azurfilos inespecficos.
Figura 10
. Linfocitos Figura 11
. Linfocitos
grandes y pequeos
atpicos
Figura 12
. Linfocitos
en mitosis
30
Figura 13.
Linfocitos
vacuolados

4.2.2 Monocitos (Fig. 14)

Son los leucocitos de mayor tamao en la sangre (14m a
20m). Su ncleo es generalmente excntrico, aunque puede
ser central. Su cromatina nuclear es laxa, distribuida en forma
regular, la forma del ncleo generalmente es de una madeja de
lana o arrionada, aunque puede tener forma de un
abastonado. El citoplasma es de color gris y puede presentar
grnulos inespecficos (azurfilos) que carecen de significado
clnico.
Patologa:
Los
monocitos
estn
elevados
en:
Tuberculosis.
Figura 14. Monocito
Endocarditis bacteriana.
Enfermedades virales como sarampin, rubola, etc.
Colagenosis, neoplasias, etc.
CRITERIOS PARA EL DESARROLLO DE UN LEUCOGRAMA

-
Se considera leucocitosis cuando la cifra de glbulos blancos excede de 10 000.
Se considera leucopenia cuando la cifra de glbulos blancos es inferior a 5 000.
No olvidar que el ejercicio produce leucocitosis fisiolgica de consideracin, de all

que el recuento debe hacerse en condiciones basales.
En los granulocitos debe informarse el nmero de lobulaciones del ncleo. A mayor

edad de la clula mayor el nmero de lbulos y lo contrario.
citoplasma
-
5. Materiales
-
Aceite de inmersin
Alcohol 70%
Algodn
Beaker con cloro al 5%
Cloro 5%
Colorante de Wright
Laminas portaobjetos (3/A)
Muestras de sangre
Pizeta con agua de chorro -
Varillas para tincin
31

6. Procedimiento
-
Preparar frotes sanguneos utilizando para ello una gota de sangre sobre un
portaobjetos limpio y desengrasado.
Extender la gota de sangre con otro portaobjetos, procurando una capa fina de clulas
Teir los frotes con colorante de Wright durante 10 minutos.
Agregar agua destilada hasta formar una capa tornasolada.
Lavar.
Limpiar los frotes con algodn y alcohol en la parte de abajo para quitar el exceso de
colorante.
Examinar la lmina a pequeo aumento para comprobar si los elementos celulares

estn bien distribuidos. Si es favorable se examina con el objetivo de inmersin.
La parte ideal para visualizar clulas para la frmula leucocitaria es en la parte final
del cuerpo y comienzos de la cola, recorriendo la lmina de izquierda a derecha o de
arriba hacia abajo hasta contar 100 leucocitos incluidos los agranulocitos y
granulocitos. Aqu no se incluyen los elementos inmaduros de sangre roja.
Anotar a medida que se va contando, el nmero de cada una de las clases de glbulos
blancos observados.
Determinar luego los porcentajes de cada uno de ellos para luego comparar con los
porcentajes normales.
LEUCOCITOS Valores relativos (%)
Valores absolutos (%)
Neutrfilos segmentados
55-65 3000-5000
Neutrfilos en banda 3-5
150-400
Eosinfilos
0,5-4,0
20-350
Basfilos 0-0,5 10-60
Monocitos
4-8
100-500
Linfocitos
25-35 1500-400
Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo se
est trabajando con muestras potencialmente infectivas.
8. Formato de presentacin de resultados Entregar un informe completo de sus

resultados.
32

9. Cuestionario
1.
Indique las caractersticas de un frote sanguneo bien preparado, dibuje
2.
Realice un cuadro comparativo de las anormalidades morfolgicas que pueden

observarse en los leucocitos diferenciando cada una de las clulas: Neutrfilos,
eosinfilos, linfocitos, basfilos y monocitos y haciendo un dibujo de cada una de ellas
3.
Qu colorantes componen el reactivo de Wright, y que componentes celulares tie cada

uno de ellos?
4.
Por qu se debe de agregar buffer o agua de chorro durante la tincin?
5.
Si su paciente tiene un conteo total de leucocitos de 8,000 clulas/mm3 y 3500

eosinofilos/mm3 Cul es el valor relativo de eosinofilos, expresado en porcentaje? Deje
constancia de sus clculos matemticos
33

INMUNODIFUSIN RADIAL
Precipitacin I
Prctica 4
1. Introduccin
El principio de la inmunodifusin es la precipitacin, la cual consiste en la unin del
antgeno con el anticuerpo estando ambos en solucin, los cuales al unirse forman un
complejo insoluble que precipita. Esta es una tcnica que permite determinar cualitativa
y cuantitativamente la concentracin de un antgeno y que utiliza un soporte o matriz de
agar en el que difunden Ag y Ac. Es un mtodo sensible que es usado clnicamente para
detectar niveles de protenas plasmticas. En la zona del agar en donde se establece el
equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac se observa una banda de precipitado.
La difusin puede realizarse en una o dos dimensiones y adems en tubo y en placa.
Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoqumicos a
mediados de la dcada de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusin simple en
una dimensin en tubos conteniendo gel de agar. El demostr que un sistema sencillo
Ag-Ac daba lugar a una banda de precipitina y que la mezcla de sistemas en el mismo
tubo daba bandas mltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones
de precipitina se desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas.
Los mtodos en gel tienen significativamente mayor sensibilidad y mayor poder de
resolucin que las tcnicas sin medio de soporte. Adems, los geles actuales pueden ser
fotografiados y almacenados, ya que los inmunoprecipitados insolubles que se forman en
la zona de equivalencia, son atrapados permanentemente en la matriz del gel.
Muchas modificaciones han surgido despus del mtodo de difusin de Oudin y
probablemente las ms usadas sean la inmunodifusin doble y la inmunodifusin radial
para estudios cualitativos y cuantitativos, respectivamente. La combinacin de la
electroforesis con la difusin ha resultado en mtodos muy importantes, que sern
tratados en otra prctica.
La difusin simple en agar se basa en la incorporacipon de un anticuerpo es en agarosa

fundida, la cual es vertida dentro de una caja de Petri la cual se deja solidificar. Se cortan
34

pequeos pozos dentro de la agarosa y estos son llenados con concentraciones conocidas
de antgeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de construir una curva de
calibracin. Las muestras desconocidas se colocan dentro de los pozos. Los antgenos
en solucin difundirn hacia fuera del pozo en un patrn circular rodeando al pozo. El
anticuerpo est presente en exceso y la difusin del antgeno continuar hasta que se
forme un precipitado antgeno-anticuerpo en forma de anillo estable.
Figura 1. Inmunodifusin simple

Habr complejo Ag-Ac en toda la zona circundante al pozo dentro de la lnea de
precipitina. En esta lnea es donde est presente el mayor nmero de complejos, ya que
en ese punto el antgeno y el anticuerpo estn en proporciones iguales. Esta es conocida
como la zona de equivalencia.
Generalmente toma de 24 a 48 horas para que ocurra la difusin ptima y la

precipitacin se haga evidente. Para cada antgeno, se formar una precipitacin final en
anillo de cierto dimetro. De las concentraciones conocidas estndar, se traza una curva
de calibracin, colocando en los ejes: concentracin de antgeno vrs mediciones de
dimetro cuadrado de los anillos. A partir de esta curva de calibracin lineal, la presencia
y cantidad de antgeno en las muestras desconocidas pueden ser determinadas.
2. Objetivos
- Comprender la naturaleza de la reaccin antgeno-anticuerpo in vitro.
-
Conocer los factores que intervienen en la reaccin Ag-Ac y la forma en que afectan
el resultado final.
35

Conocer la diferencia entre la reaccin primaria y las reacciones secundarias.
Conocer los diferentes tipos de reacciones secundarias, sus ventajas, desventajas y

sus aplicaciones.
3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr visualizar los tipos de reaccin Ag-Ac in vitro
que existen as como la aplicacin de cada una de ellas de acuerdo a sus caractersticas
individuales en el diagnstico serolgico.
4. Antecedentes
La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una unin molecular entre el epitopo
(antgeno) y la regin hipervariable del anticuerpo, mediante interacciones no covalentes
o secundarias. Estas uniones son dbiles tales como: puentes de hidrgeno, fuerzas
inicas y fuerzas de van der Waals. Estas fuerzas slo se convierten en agentes de unin
efectivos cuando ocurren a distancias muy cercanas. Las interacciones hidrofbicas
intervienen tambin y constituyen el 50% de la fuerza total. De tal manera que debe ocurrir
una combinacin de molculas complementarias entre el sitio de unin del anticuerpo y el
determinante antignico o epitopo. Mientras ms se complementan las configuraciones
moleculares, ms uniones secundarias se forman entre el antgeno y el anticuerpo, y es
ms difcil que ese complejo sea alterado por fuerzas tales como la agitacin trmica.
La asociacin Ag-Ac est determinada por la ley de accin de masas, es reversible y est
definida por una constante de equilibrio K = AcAg/(Ac)(Ag).
La velocidad de la reaccin depende de tres factores:
-
afinidad,
avidez
especificidad
Aunque estos dos trminos a menudo son usados indistintamente, no son

exactamente lo mismo. La avidez se refiere a la fuerza de unin mostrada por los
anticuerpos a un antgeno complejo (antgeno que contiene una variedad de epitopos), y
la afinidad se refiere a la fuerza de unin entre el anticuerpo y un epitopo; es la suma de
las fuerzas de atraccin sobre las de repulsin.
En la unin Ag-Ac ocurren dos reacciones:
-
La reaccin primaria es la formacin del complejo Ag-Ac

La reaccin secundaria es la evidencia de esos complejos mediante la observacin
de un fenmeno, el cual depende de la naturaleza del antgeno, las propiedades de
los anticuerpos y la presencia de otros factores en el medio de reaccin.
La mayor aplicacin de estas reacciones in vitro son las pruebas serolgicas. Son
llamadas as porque es el suero el vehculo habitual de los anticuerpos. Sin embargo,
pueden realizarse en otros fluidos corporales tales como plasma, orina o lquido
cefalorraqudeo, en busca de antgenos o anticuerpos especficos.
36

Una prueba serolgica para un antgeno especfico idealmente es realizada usando

un reactivo de anticuerpo monoespecfico (que contenga anticuerpos reactivos con una
sola clase de epitopo). No siempre es posible obtener anticuerpos monoespecficos, por
lo que en estos casos son usados los antisueros polivalentes (que contienen anticuerpos
de ms de una especificidad.
Existen dos trminos importantes en los mtodos serolgicos:
Idealmente, las pruebas serolgicas debieran ser 100% especficas y 100% sensibles.
La especificidad se refiere a la relativa ausencia de reaccin cruzada de los anticuerpos
con sustancias que estn qumicamente relacionadas (pero no idnticas) al antgeno
contra el que se produjeron, y la sensibilidad se refiere a la cantidad ms pequea de
sustancia desconocida (antgeno o anticuerpo) que pueda ser detectada por la prueba. Si
una muestra reacciona cruzadamente con sustancias naturales diferentes a las que se
intentan determinar en la prueba, decimos que se obtiene un resultado biolgico falso
positivo (BFP). Si una prueba serolgica no detecta la sustancia que se est buscando y
que realmente s est contenida en la muestra, se obtiene un resultado biolgico falso
negativo (BFN). Si en cien muestras de suero que contienen todos los mismos antgenos,
la prueba produce cinco BFN, se dice que tiene una sensibilidad del 95%.
Existen otros factores, tales como los errores tcnicos, que producen resultados falsos
positivos y negativos, pero no son considerados de origen biolgico.
5. Materiales
-
Agarosa al 3%
Alcohol al 70%
Laminas con muestras positivas

y negativas para inmunodifuisn
radial
Algodn
Muestras de suero desconocidas
Antiglobulina humana
Pipetas automticas de 20 uL
Pipetas serolgicas de 10 mL
Cmara hmeda
Pipetores o bulbos
Cloro al 5%
Puntas amarillas para pipeta
Lmina porta objetos de vidrio automtica
Rosetones para perforar las laminas de agarosa
6. Procedimiento
Preparacin de una lmina con agarosa:
-
Colocar la lmina horizontalmente y con la ayuda de un hisopo estril embadurnar

con agarosa al 3% toda la superficie. Dejar secar por unos minutos.
Con la ayuda de una pipeta serolgica verter el contenido del tubo con agarosa 12 %
fundida a una temperatura de unos 37-40C.
37

Dejar enfriar. Horadar los pozos sobre el agar como se indica en la plantilla. Marcar
la esquina superior derecha haciendo un corte sobre el agar.
Colocar en cmara hmeda y refrigerar hasta que se vaya a utilizar.
Abrir con la ayuda de la plantilla cinco agujeros en el centro de la lamina
Colocar en el centro el antgeno a utilizar (antiglobulina humana) y en los agujeros de

la periferia suero desconocido (Anticuerpos)
Observar la reaccin
7. Interpretacin de resultados
Interpretar las lminas de difusin en agar, determinando en que pozos hay reaccin AgAc
Interpretacin:
Rosetn 1
1. Positivo
2. Positivo
3. Negativo
Rosetn 4
4. Negativo
Todos negativos
5. Negativo
6. Negativo
1
6
5
1
2
2
3
4
1
Rosetn 2
1. Positivo
2. Positivo
3. Negativo
4. Negativo
5. Positivo
6. Negativo
3
4
Existen tres tipos de reacciones

-
Reaccin de identidad:
precipitacin.
los dos sistemas difunden en una nica banda de
Reaccin de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando

bandas de precipitacin que se cruzan.
Reaccin de identidad parcial: Se produce cuando uno de los antgenos tiene menos
de un componente y es capaz de dar una reaccin cruzada con un anticuerpo
elaborado contra un antgeno ms simple. En este caso las bandas de ambos
sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin
38

o espoln. Esto indica que en este antgeno hay componentes antignicos no

compartidos.

Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo
se est trabajando con muestras potencialmente infectivas.
Entregar un informe completo sobre sus resultados obtenidos.
10. Cuestionario
a. Qu aplicaciones tiene la inmundodifusin radial en el diagnstico de enfermedades?
b. Por qu se utiliza agarosa al 3% para la prueba de inmunodifusin radial?
c. Qu diferencia existe entre inmunodifusin simple y doble?
d. Mencione tres ventajas de la tcnica de inmunodifusin
e. Mencione tres desventajas de la tcnica de inmunodifusin
11. Bibliografa
-
Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM,
2000.
Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.
REACCIN DE FLOCULACIN
Precipitacin II
Prctica 5
39

1. Introduccin
Los precipitados inmunolgicos son complejos insolubles formados por la unin de
anticuerpos (precipitinas) y antgenos (precipitgenos) que se encuentran en solucin.
Para la formacin de una malla de precipitado se requiere que tanto las precipitinas como
los precipitgenos sean al menos bivalentes.
Esta reaccin tiende a ocurrir ms rpido con el aumento de la temperatura, aunque la
precipitacin ms completa es obtenida usualmente a temperaturas bajas (0-4C). Est
determinada por el fenmeno de zona, lo cual quiere decir que la mxima precipitacin
ocurre en un punto o zona de equivalencia que para poder ser visible es necesario
determinar las proporciones ptimas de los reactivos.
2. Objetivos
-
Comprender las bases tericas de la reaccin de precipitacin
Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin
Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la precipitacin de Ag-Ac Conocer las aplicaciones clnicas de la precipitacin
3. Alcance
Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del
fenmeno de precipitacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las destrezas
para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin.
4. Antecedentes
La precipitacin de los complejos antgeno-anticuerpo en solucin, ha sido utilizada desde
1920 para la cuantificacin de antgenos y anticuerpos.
Todas las reacciones de precipitacin estn basadas en los mismos principios
fsicoqumicos. Los aspectos bsicos de exceso y de equivalencia de antgeno o
anticuerpo son de particular importancia; de hecho, la relativa solubilidad de los complejos
con un exceso significativo de cualquiera de los reactantes y la insolubilidad de los mismos
en la zona cercana a la equivalencia (proporciones ptimas), son crticos para el proceso
de visualizacin.
La reaccin de precipitacin tiene base en la reaccin fundamental antgenoanticuerpo in
vivo, ya que la formacin de este complejo es el primer paso en la remocin de agentes
infecciosos del cuerpo por el sistema inmune. Estos complejos forman precipitados que
pueden ser depurados por diversos mecanismos.
Tcnica de VDRL
Las "reaginas" presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en suero
por la reaccin con un antgeno cardiolipnico purificado y estabilizado conocido como
40

reactivo de VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory). Si la muestra contiene

reagina, sta se unir al antgeno produciendo una floculacin visible en microscopio. Una
tcnica modificada es la de USR (UnheatedSerumReagin) en la que no es necesario
inactivar la muestra y disminuye las reacciones inespecficas con el empleo de antgeno
altamente purificado y el agregado de cloruro de colina.
Interpretacin de los resultados
Reactivo: presencia de floculacin.
No reactivo: ausencia completa de floculacin.
Prueba semicuantitativa: el ttulo estar dado por la inversa de la ltima dilucin que se
observe reactiva.
Limitaciones de la prueba
Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros
patolgicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma,
tuberculosis, cncer, diabetes y enfermedades autoinmunes.
Estos casos no son muy comunes y generalmente presentan reacciones con ttulos bajos
y una historia clnica que no coincide con las caractersticas de sfilis.
Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cualitativa reactiva realizar la
prueba semicuantitativa.
Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el fenmeno
de prozona.
5. Materiales
-
Alcohol al 70% - Algodn
Agua destilada
Cloro al 5%
Lminas de reaccin de VDRL
Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l -
Papel aluminio
Reactivo de VDRL
Toallas de papel
6. Procedimiento
41
Muestras desconocidas.

Floculacin: Reaccin de VDRL

-
Tomar la placa e identificar los pozos como control positivo, control negativo y
muestra.
Colocar una gota de reactivo de VDRL en cada pozo
Con la pipeta colocar una gota de la muestra (pozo de Mx) y una de control (pozo
control)
Mover la placa suavemente
Observar en el microscopio la formacin de precipitado y cuantificar por cruces,

utilizando el aumento de 10x.
7. Interpretacin:
Reactivo
No reactivo

Tener en mente que trabaja con materiales biolgicos, potencialmente infecciosos.
Aplicar las medidas de bioseguridad tanto personales, como en el descarte de los
materiales.
Presentar los resultados en forma grfica y en forma escrita, con una discusin de los
mismos.
10. Bibliografa de referencia

-
2000.
11. Cuestionario
1. De la sfilis investigue
a. Agente causal
42

b. Etapas clnicas de la enfermedad

2. Qu diferencia existe entre la prueba de VDRL y RPR?
3. Explique,Por qu el VDRL no es una prueba confirmatoria para sfilis?
4. Qu otras enfermedades autoinmunes pueden dar un falso positivo en la prueba de VDRL
5. Qu otras pruebas inmunolgicas se pueden utilizar para el diagnstico de sfilis?,
mencione por lo menos dos
43

REACCIONES DE AGLUTINACIN
Prctica 6
1. Introduccin
Las reacciones de aglutinacin consisten en la agregacin de material en partculas,
tales como clulas o material sinttico. En este caso, el antgeno o el anticuerpo se
encuentra en la superficie de una partcula (inmunolgicamente inerte) y la formacin del
complejo inmune es evidente por formar un entramado visible. La reaccin toma lugar
sobre la superficie de las partculas (o clulas) en donde el antgeno se une a los sitios de
unin especfica de los anticuerpos. La aglutinacin es un ejemplo de una reaccin
inmune secundaria.
Las primeras reacciones de aglutinacin involucraban aglutininas bacterianas en
experimentos llevados a cabo por los primeros bacterilogos. Este trabajo llev a la
formulacin de la idea de anticuerpos. La utilidad de este simple procedimiento dio lugar
a la era del serodiagnstico en microbiologa. El uso prctico de los procedimientos de
aglutinacin se ha expandido de las reas de la infectologa e inmunohematologa para el
estudio de enfermedades infecciosas, autoinmunes, ensayos endcrinos y otros. Las
tcnicas clsicas de aglutinacin directa han dado lugar a una variedad de tcnicas que
involucran el recubrimiento de partculas portadoras con antgeno (o anticuerpo), ya sea
por procesos de adsorcin pasiva o a travs de la unin covalente de los antgenos al
portador, mediante una manipulacin qumica.
2. Objetivos
-
Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin
Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la aglutinacin
Conocer las aplicaciones clnicas de la aglutinacin
3. Alcance
fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las destrezas
para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin.
4. Antecedentes
Bordet propuso que la aglutinacin tomaba lugar en dos fases: a) la combinacin
especfica del anticuerpo y el antgeno y b) la agregacin visible de las partculas. Ambas
fases son mediadas por la atraccin especfica entre el anticuerpo y el antgeno. Las
partculas tales como los eritrocitos y las bacterias, poseen cargas ligeramente negativas
en suspensin (potencial z) y se repelen unos a otros. La reduccin de la fuerza inica
mediante protenas u otras sustancias inorgnicas, reduce las distancias entre las
44

partculas, permitiendo la formacin de puentes y de una malla del complejo Ag-Ac visible:
la aglutinacin.
Aunque la carga es importante para determinar que la aglutinacin sea completa, es
evidente que otros efectos juegan un papel en la aglutinacin de las partculas por los
anticuerpos. La viscosidad del medio de prueba, por ejemplo, aumenta la aglutinacin.
La principal desventaja del fenmeno de aglutinacin es que la reaccin es
semicuantitativa. Sin embargo, el hecho de que numerosos sistemas permiten reacciones
de aglutinacin, la simplicidad bsica del sistema de aglutinacin desarrollado en la
actualidad y la alta sensibilidad de esta reaccin, la hace de amplia aplicacin y uso.
La exitosa aplicacin de las reacciones de aglutinacin para la deteccin de antgenos
o anticuerpos, requiere una partcula estable, un antgeno puro y un anticuerpo especfico.
Generalmente, el uso del fenmeno de aglutinacin tambin requiere el conocimiento de
la posibilidad de que la reaccin se realice. Los anticuerpos IgM en el medio de prueba
usualmente agregan al antgeno sobre las partculas, en base al tamao de la molcula
de IgM, mientras que los anticuerpos de tipo IgG por s mismos, no pueden completar la
reaccin. Se dice que la IgM es unas 750 veces ms eficiente que la IgG en las reacciones
de aglutinacin.
Tambin debe tenerse en mente que el llamado fenmeno de zona (pro-zona) puede
contribuir a que la reaccin de aglutinacin no sea completa, an con ttulos adecuados
de anticuerpos IgM en el medio. Este fenmeno puede producirse por diversos factores:
por ejemplo, un suero de baja dilucin puede no ser capaz de agregar partculas debido
al recubrimiento de los sitios antignicos con un gran nmero de anticuerpos individuales,
situacin que bajo las condiciones de equilibrio, disminuye el nmero de complejos. De
forma similar, la cantidad de reaccin tambin puede disminuir cuando se aumenta la
concentracin de antgeno. El fenmeno de prozona tambin puede ser producido por la
alteracin de protenas (por calor, por ejemplo) o por interferencia con la aproximacin
excesiva de partculas por la presencia de material coloidal extrao.
En general, las reacciones de aglutinacin pueden ser observadas a simple vista, sin
necesidad de aumento ni la ayuda de microscopio.
En la actualidad, las partculas ms empleadas como portadoras de antgeno o
anticuerpo en las reacciones de aglutinacin son: ltex, partculas de gelatina y partculas
de carbn. Los eritrocitos son empleados para las reacciones de hemaglutinacin.
Los ensayos de aglutinacin puede clasificarse en:
-
Ensayo de aglutinacin directa: es la clsica reaccin que involucra la agregacin

de clulas o antgenos en partculas.
Ensayo de aglutinacin indirecta o pasiva: el desarrollo de esta tcnica tiene

numerosas ramificaciones en el laboratorio. Esta consiste en la aglutinacin de
clulas o partculas recubiertas artificialmente con antgeno soluble.
Ensayo de aglutinacin pasiva en reversa: es la modalidad de la aglutinacin, en la

que el anticuerpo est unido a las partculas.
5. Materiales
- Agua destilada - Alcohol al 70%
45

Algodn
Aplicadores
Calibradores con concentraciones conocidas de antgeno de ASO o FR
Cloro al 5%
Descartadores de punzo cortantes
Lminas de reaccin de fondo oscuro - Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l

-
Muestras desconocidas.
6. Procedimiento
Aglutinacin pasiva de ltex: Deteccin de Factor Reumatoideo, Antiestreptolisina O.
-
Lleve los reactivos, sueros control y muestras de suero de pacientes a temperatura

ambiente.
Agregue sobre el rea de reaccin 50 l de suero o control.
Agite el reactivo de ltex, asegurndose que est en homogneo antes de usarlo.
Agregue una gota de la suspensin de partculas antignicas sobre la gota de suero.
Con la ayuda de un aplicador, distribuya la mezcla en el rea de reaccin,

homogneamente.
Agitar por 2-5 minutos sobre un agitador mecnico o con un movimiento rotatorio y
gentil entre sus manos.
Realice la lectura de resultados despus del tiempo de agitacin, teniendo cuidado

que la mezcla no se seque.

Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe
observar las medidas universales de bioseguridad.
Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales.
Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos.
Investigue las aplicaciones de la reaccin de aglutinacin y especficamente sobre la
deteccin de Factor Reumatoideo y Antiestreptolisina O sus usos y su importancia.
46

2000.
10. Cuestionario
a. Qu diferencias existen entre las reacciones de aglutinacin y precipitacin?
b. Investigue sobre la importancia de detectar el Factor Reumatoideo(FR) y la
Antiestreptolisina O (ASO) en un paciente.
c. Qu es la PCR? En qu patologas se encuentra elevada?
d. Esquematice la reaccin que se lleva a cabo durante la aglutinacin con el reactivo de
PCR, ASO y FR, indicando si se detecta Ag o Ac en la muestra del paciente y el contenido
de los reactivos (tome en cuenta que cada uno mide Ag o/y Ac en la muestra del paciente
y que los reactivos contienen diferentes Ag o Ac)
e. Describa en que consiste la prueba RPR
11. Anexo
Figura 1. Reaccin de aglutinacin
REACCIONES DE HEMAGLUTINACIN DIRECTA E INDIRECTA

(Grupo ABO y Rh)
Prctica 7
1. Introduccin
La hemaglutinacin es una reaccin de aglutinacin, especficamente involucrando al
eritrocito como el portador del antgeno o del anticuerpo. La determinacin de grupo
sanguneo se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, la cual se puede llevar a cabo de
47

forma directa (determinando los antgenos presentes en la superficie del eritrocito del
paciente al contacto del reactivo anti A, B, AB o D) o indirecta (determinando los
anticuerpos presentes en el suero del paciente y enfrentndolo a eritrocitos conocidos (A,
B o AB).
2. Objetivos
-
Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin para la determinacin

de grupo sanguneo
3. Alcance
fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo para la determinacin de
grupo sanguneo ABO y RH y que adquiera las destrezas para aplicar diferentes
metodologas basadas en dicha reaccin.
4. Antecedentes
El grupo sanguneo son los tipos en que se ha clasificado la sangre de las personas
en relacin con la compatibilidad de los hemates y suero de otro individuo que la recibe.
Segn la clasificacin de Landsteiner (clasificacin hoy universal) y se denominan: O,
A, B, AB. Se caracterizan por las diferentes combinaciones de dos aglutingenos
existentes en los glbulos rojos y de dos aglutininas contenidas en el suero.
Los eritrocitos poseen antgenos en su membrana que son distintos para cada
individuos; las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificacin sangunea
relacionada a los diversos grupos sanguneos, aprovechan las caractersticas
inmunolgicas que expresa cada individuo de acuerdo a su particular codificacin
gentica. En dichas pruebas se evidencian los antgenos y/o anticuerpos del grupo
sanguneo, de acuerdo a su comportamiento in vitro.
En el sistema ABO se investigan tanto antgenos o aglutingenos como los anticuerpos o
isoaglutininas naturales.
El factor Rh es un aglutingeno encontrado en 1940 por Landsteiner y Weiner, en los
glbulos rojos de primates (Macacusrhesus) y que tambin existe normalmente en el 85%
de los humanos, que por esta causa se denomina Rh positivos. En el sistema Rh, existen
varios antgenos: D, C, c, E, e; sin embargo, de rutina, solo se determina la presencia del
antgeno D en los eritrocitos y de acuerdo a su presencia o ausencia se dice que un
individuo es Rh D positivo o Rh D negativo.
5. Materiales
-
Alcohol al 70%
Algodn
48

Cloro al 5%
Descartadores de punzo cortantes
Glbulos rojos A, B y O
a. Lminas de reaccin de fondo oscuro

-
Palillos
Suero Anti A, Anti B, Anti A,B y anti D (anti Rh)
Laminas portaobjetos
Tubos de ensayo
Suero de grupos A, B, AB y O
6. Procedimiento
Hemoclasificacin directa Mtodo
en lmina
-
Marcar tres lminas portaobjeto como A, B, AB y D.
Adicionar una gota de anti A, anti B, anti AB y anti D en su lugar correspondiente.
Agregar una gota de eritrcitos del paciente a cada antisuero.
Mezclar cada preparacin con un palillo de madera.
Rotar manualmente cada lamina con cuidado de que no se mezclen.
Observar aglutinacin y registrar los resultados:
POSITIVO: La aglutinacin fuerte de los glbulos rojos en presencia de cualquier anticuerpo

ABO y Rh. Las reacciones positivas muestran 3+ de aglutinacin.
NEGATIVO: La presencia de una suspensin uniforme (O) de glbulos rojos.
Mtodo en tubo
- Separar el plasma de los eritrocitos de la muestra desconocida.
-
Lavar los glbulos rojos del paciente 3 veces consecutivos en solucin salina y
preparar una suspensin final al 2% en dicha solucin.
Rotular cuatro tubos con Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D.
Colocar una gota de suero Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D en el tubo respectivo.
Agregar una gota de la suspensin al 2 % de eritrocitos a cada uno de los tubos.
Mezclar cada tubo y centrifugar 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm.
Resuspender suavemente los botones celulares y observar aglutinacin:

(4+) Botn completo, fcilmente desprendible, fondo limpio
(3+) Botn disperso, 2 o 3 partes, fondo limpio
49

(2+) No hay botn, pequeos grumos

(1+) Pequeos grumos
(0) No hay seales de grumos (aglutinacin)
Hemoclasificacin inversa Mtodo
en tubo
-
Marcar tres tubos como A, B y O.
Adicionar dos gotas de suero del paciente a cada tubo.
Agregar una gota de suspensin de eritrocitos del grupo A al tubo rotulado como A,
una gota de eritrocitos del grupo B al tubo rotulado como B y una gota de eritrocitos
del grupo O al tubo rotulado como O.
Incubar de 5 15 minutos a temperatura ambiente
Centrifugar por 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm.
Resuspender los botones celulares y observar aglutinacin.
Interpretar los resultados.

-
2000.
10. Cuestionario
a. Cules son los carbohidratos presentes en los grupos A, B, AB y O
b. Complete el siguiente cuadro
DONADOR DE
Antgeno en la superficie
ERITROCITOS
del eritrocito
Grupo 0
Grupo A
Grupo B
50
Anticuerpo en el plasma

Grupo AB
c. Qu inmunoglobulina son los anticuerpos presentes en el grupo ABO?
d. Qu inmunoglobulina son los anticuerpos presentes en el Rh?
e. Por qu la reaccin de aglutinacin es ms evidente en la determinacin de ABO que
en Rh?, explique su respuesta
11. Anexo
Figura 1. Antgenos presentes en los
grupos sanguneos ABO
Figura 2. Esquema de reaccin en la prueba de

tipificacin directa de grupo
sanguneo ABO
51

HEMAGLUTINACIN PASIVA
Practica 8
1.
Introduccin
La hemaglutinacin indirecta (HAI), tambin llamada hemaglutinacin reversa pasiva,

se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos de producir aglutinacin especfica en
presencia de glbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antgenos.
En el suero existen anticuerpos inespecficos (heterfilos) que son capaces de
aglutinar glbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el
suero con glbulos rojos no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan
mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.
2.
Alcance
En esta prctica el estudiante comprender los conceptos bsicos de la hemaglutinacin

pasiva y su aplicacin en el diagnstico de la enfermedad de Chagas.
3.
Objetivos Especficos Que el estudiante:

-
Sea capaz de describir el principio de la hemaglutinacin pasiva.
Comprenda el uso eritrocitos como fuente de antgenos
Diferencie entre un eritrocito sensibilizado y no sensibilizado
Conozca las ventajas y desventajas de sta tcnica

- Guantes, S, M y L
4.
Materiales y equipo Alcohol al 70%
Kit de hemaglutinacin
Pipetas automaticas de 25
uL
Algodn
Beaker
Pizetas cloro 5%
Bolsas blancas y rojas
Pizetas etanol 70%
Cloro al 5%
Placas de fondo en U
Descartadores de punzo
cortantes
Puntas amarillas
Torundas de algodn
Frasco vaco de 10 mL
Sueros control
Goteros de 25 uL
5.
Antecedentes
Aglutinacin pasiva: los anticuerpos se dirigen contra molculas que se han adherido
intencionalmente a una partcula que acta como medio de soporte pasivo
(eritrocitos).
52

Es una tcnica que puede emplearse para la determinacin de anticuerpos en muestras

de pacientes en enfermedades como sfilis, chagas, toxoplasmosis, etc.
Reactivos provistos en el kit:
-
Antgeno HAI: glbulos rojos de carnero sensibilizados con antgenos citoplasmticos

del agente infeccioso a determinar
Glbulos rojos no sensibilizados: suspensin al 1% de eritrocitos de carnero no

sensibilizados, para control de heterofilia.
2-Mercaptoetanol: alcohol utilizado para eliminar anticuerpos interferentes
Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra el agente infeccioso

a determinar
Control Negativo: suero no reactivo, inactivado
6.
Procedimiento
Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Diluyente de Sueros HAI en todos los
pocillos a usar de la policubeta.
Tomar una alcuota de cada suero a ensayar con microdilutores de 25 ul (uno para
cada muestra). Colocar cada microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo menos
10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra.
Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin 1/2), pasando los
microdilutores al pocillo siguiente (dilucin 1/4) y as sucesivamente hasta la dilucin
que se desea investigar (por ejemplo: 1/8, 1/16, 1/32), rotando en cada paso el
microdilutor por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la
muestra. Si se emplea una micropipeta automtica de 25 ul para la toma y/o dilucin
de la muestra, homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 ul de pocillo a
pocillo hasta la dilucin que se desee investigar. Descartar los ltimos 25 ul.
Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones y 1/4, una gota (25 ul) de GR
no sensibilizados para control de heterofilia.
En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de Antgeno HAI.
Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta.
Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
Leer a partir de los 90 minutos. Se puede aumentar la nitidez de la apreciacin,

leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel
blanco y traslcido entre la policubeta y la fuente de luz.
7.
Interpretacin
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn.
53

8.
Reactivo: formacin de una pelcula o manto en el fondo de los pocillos. En caso

de observar la presencia de un pequeo anillo de bordes regulares, la muestra se
considerar dudosa y deber ser ensayada por otro mtodo
Formato de presentacin de resultados
Realice una discusin de resultados y conclusiones de la teora e indique con un

esquema el principio de la prueba (anexo)
9.
Precauciones
Los Reactivos Provistos son para uso diagnstico "in vitro". Las muestras deben
manipularse como si fueran capaces de transmitir la infeccin. Los sueros controles han
sido examinados para antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) encontrndose no reactivos. Sin embargo deben
emplearse como si se tratara de material infectivo.
Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la
inactivacin de agentes patgenos.
No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.
-
2000.
Mazza, S. - VI Congreso Nacional de Medicina (Crdoba), pg. 155 (1938).
Cerisola, J.A. - La Prensa Mdica Argentina 49/34:1761 (1962).
Fontenla S., Moretti, E. y Gonzlez, G. - 50 Triduo de la ABA, Huerta Grande

(Crdoba), 1985.
Basso, A. y col. - 50 Triduo de la ABA. Huerta Grande (Crdoba), 1985.
Lorenzo , L.; Capriotti, G.; Rojkn, F. - Rev. Arg. Transf. XVII/ 1: 51, 1991.
Ministerio de Salud y Accin Social, Instituto Nacional de Parasitologa "Doctor

Mario FatalaChabn" - Normas para el diagnstico de la infeccin chagsica Resolucin ministerial 523/97, 1998
11. Cuestionario
a. Defina que es un eritrocito sensibilizado
b. Por qu se utiliza eritrocitos no sensibilizado como control?
c. Cul es el procedimiento in vitro de sensibilizacin de eritrocitos con antgenos de un
agente causal de enfermedad?
d. Describa brevemente la inmunopatologa de la enfermedad de la prueba utilizada
54

e. Si usted tiene un paciente cuyo ttulo de anticuerpos es 128, y le da tratamiento. Al

realizarle nuevamente la prueba el ttulo es 256. Explique que est sucediendo con
el paciente. Explique, Qu hara en este caso? f. 12. Anexo
Figura 1. Esquema de la prueba
Figura 2. Interpretacin de resultados
INMUNOCROMATOGRAFA
Prctica 9
1. Introduccin
La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas
cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba. Actualmente se utiliza
como prueba rpida de tamizaje para la deteccin de antgenos o anticuerpos presentes
en el suero del paciente.
2. Objetivos
55

Explicar el fundamento inmunolgico de la prueba de inmunocromatografa
Conocer las aplicaciones de la prueba
Conocer los diferentes tipos de pruebas que existen en el mercado basados en esta
tcnica-
3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr describir el principio de las pruebas de
inmunocromatografa, as como su interpretacin.
4. Antecedentes
La inmunocromatografa se basa en la migracin de una muestra a travs de una
membrana de nitrocelulosa. La muestra es aadida en la zona del conjugado, el cual est
formado por un anticuerpo especfico contra uno de los eptopos del antgeno a detectar
y un reactivo de deteccin. Si la muestra contiene el antgeno a problema, ste se unir al
conjugado formando un complejo inmune y migrar a travs de la membrana de
nitrocelulosa. De lo contrario, migrarn el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro
eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unin
del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear (muestras positivas).
En el caso contrario las muestras son negativas.
La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea es un control
de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas
y negativa.
Figura 1. Esquema de la prueba de inmunocromatografa
5. Materiales
56

Pipetas pasteur
Pruebas rpidas de inmunocromatografa
Papel mayordomo
Descartador de punzocortantes
Muestras de suero - Beaker con cloro
6. Procedimiento
-
Anotar cada una de las pruebas a realizar
Colocar una gota de muestra de suero de paciente en cada una de las pruebas
rpidas que se le proporcionan.
Dejar que la muestra fluja a lo largo de la prueba de inmunocromatografa Anotar los resultados positivos y negativos
7. Interpretacin de resultados o Positivo: dos lneas en el casete o Negativo: una

lnea en el casete
NOTA: Si no aparece la lnea de control, la prueba debe de repetirse.
10. Cuestionario
a. Defina que es conjugado
b. Escriba tres ventajas y tres desventajas de estas pruebas
c. Mencione cinco aplicaciones en el diagnstico de enfermedades que se pueden
realizar por inmunocromatografa
d. De qu
prueba
est compuesto
el
de inmunocromatografa?
control
interno
de
la
e. Cules son las razones por las cuales se considera una prueba de
inmunocromatografainvalida?
57

11. Bibliografa
Inmunocromatografa. Disponible en http://es.scribd.com/doc/36487446/
INMUNOCROMATOGRAFIA-pba-rapida.
http://www.socpemi.org/Doc/pruebasrapidas.pdf
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mariamc/lacteos/practica8.htm
58

ENSAYO INMUNOENZIMTICOS (ELISA)

Prctica 10
1. Introduccin
La tcnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la
deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una reaccin marcada enzimticamente cuyo producto,
puede ser medido espectrofotomtricamente. La cantidad de antgeno se determina
comparando la curva estndar generada con cantidades conocidas del antgeno.
Ventajas: verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y
consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin
retenida y la fraccin libre, es fcil de adaptar a analizadores automticos. Este se
caracteriza por ser un mtodo cuantitativamente exacto por la medicin de la velocidad
de la reaccin y la duracin de la reaccin en un instante fijo nico
Desventajas: para adaptarlo a analizadores automticos se necesitan de reactivos muy
purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas.
2. Alcance
En esta prctica el estudiante comprender y observar la aplicacin y la elaboracin del
ensayo de inmunoabsorbencia ligada a enzima (ELISA).
3. Objetivos
Que el estudiante:
-
Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA
Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboracin del la prueba de ELISA.
Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicacin en el mbito de la

medicina.
4. Antecedentes
Dispositivos Empleados En Elisa
Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes
a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad
de absorcin de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar
las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de
lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn
desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos,
adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS,
High throughput system).
59

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada
uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional,
con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera
continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura
de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para
determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados.
Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos.
La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos
tratados que tienen gran afinidad por protenas.
Generalmenteeste paso ya no se realiza debido a que los kits comerciales ya lo traen.
2. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos:

Se realiza al agregar la muestra del paciente que contiene los antgenos o anticuerpos
a detectar.
En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo
anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario antiantgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo
mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos
secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se
incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes
relaciones de antgeno frio frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el
ensayo de competicin del antgeno.
60

3. Conjugado:
Se agrega un anti-anticuerpo ligado a una enzima (fosfatasa o peroxidasa) que se une
al inmunocomplejo que ya se ha formado.
4. Revelado de la reaccin enzimtica.

Despus de un lavado para eliminar todas las molculas marcadas no fijadas en forma
de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin (cromgeno). Se deja
reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra.
Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin
por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinacin de la subclase
(idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. La versin ms
comn de ELISA es el ensayo sandwich.
-
Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia
de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que
sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, etc.) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen
controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se
le ha aadido).
61

Ensayo indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la

anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de
deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno
secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo
secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la
inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos.
Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante

inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de
anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que
ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de
un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con
un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo
anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.
Aplicaciones
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los
que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico,
deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc.
Enzima Sustrato Tampn
Estas enzimas son utilizadas en la etapa de deteccin, las cuales unen de manera
covalente a mAbs (anticuerpos monoclonales), sin afectar la capacidad de unin a
antgenos del anticuerpo, o bien, sin inhibir la actividad de la enzima. Una gran variedad
de sustratos se puede incubar con estas enzimas para generar productos de color
susceptibles de cuantificacin mediante espectrofotmetros con placas de microtitulacin.
Las enzimas ms comunes empleadas en la etapa de deteccin son: peroxidasa de suero
de caballo y la fosfatasa alcalina. A continuacin se describe la preparacin de las enzimas
ms comunes:
HRP (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH

5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30%
AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl0.1 M pH 9.8

+1 mM cloruro de magnesio
TMB (tetrametilbenzidina) 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn

citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30%
62

5. Materiales
-
Alcohol al 70%
Algodn
Cloro al 5%
Kit de reactivos para ELISA
Puntas azules para pipetas de 200-1000uL
Puntas amarillas para pipetas de 200-1000uL
6. Procedimiento
-
Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Organizar y etiqueta con
el nmero necesario de tiras.
Aadir 100 uL control positivo, control negativo y suero de paciente por duplicado en
los pocillos. o Pozos B1,C1 y D1: C- o Pozos E1 y F1: C+ o Pozos G1 y H1: Mx 1
Aadir 50 ul de conjugado en los pozos B1 al H2. Cubrir con cinta adhesiva. Mezcle
suavemente. Incubar durante 90 minutos a 37C.
Lavar llenando cada pozo con 350 uL de solucin de lavado. Repetir el procedimiento
5 veces
Aadir 100 ul de cromgeno (sustrato) a los pozos A1 a H1. Mezcle suavemente.

Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 minutos protegidos de la luz.
Aada 50 ul de solucin de parada a los pozos A1 a H1. Si el cambio de color no

parece uniforme, golpee suavemente la placa para que se mezcle bien.

Aplique las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales, suero y manejo de
reactivos.
Investigue los diferentes anlisis que se pueden realizar utilizando en ensayo de ELISA
9. Bibliografa
63

- Parslow t, Stites d et al. Inmunologa bsica y clnica 10 Ed. 2002. Editorial El manual
moderno Mxico. P.917 (Pg. 254 257).
10. Cuestionario
Indique cual es la funcin de los siguientes pasos en la prueba de ELISA
a. Incubacin inicial de la muestra en el pocillo
b. Lavados
c. Adicin del conjugado
d. Adicin del cromgeno
e. Cubrir los pozos del ELISA una vez que se ha agregado el cromgeno
64

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REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE INMUNOLOGA

Si tiene el cuaderno incompleto o hay evidencia de copia entre dos o ms

4. En el laboratorio est prohibido el ingreso de:

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El cuaderno de laboratorio contiene las siguientes secciones:

Indicar claramente el nmero, ttulo y la fecha en que se llevar a

Para todos los reactivos utilizados en la prctica deber indicar en

Se describir el principio inmunolgico en el que se basa la

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Se calificar el orden, legibilidad de la escritura, limpieza y que el

2. DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO

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El reporte de laboratorio incluye las siguientes secciones:

Debe mostrar toda la informacin de identificacin del

Debe expresar en forma clara y breve los objetivos, as como

Es un anlisis e interpretacin de los resultados obtenidos,

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Responden a los objetivos y se derivan de los resultados

Responder las interrogantes planteadas al final de cada

NOTA: Algunas secciones no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega

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DISTRIBUCIN DE LA ZONA DE LABORATORIO

Trabajo en grupo sobre inmunopatologa

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1. Bioseguridad y buenas prcticas en el laboratorio

2. Venopuncin y manejo de especmenes hematolgicos

3. Clulas sanguneas. Observacin microscpica de la

Primeros exmenes parciales Teora

7. Reacciones de hemaglutinacin (grupo sanguneo y Rh)

Ensayos inmunoenzimticos (ELISA)

Segundos exmenes parciales Teora

Presentaciones: Inmunologa de enfermedad reumtica

Presentacin: Inmunologa de lupus

Presentacin: Inmunologa del cncer

Presentacin: Enfermedad tiroidea

Presentaciones: Inmunodeficiencia (VIH/SIDA)

Examen final de laboratorio

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Practica 2. Venipuncin y manejo de especmenes

Practica 4. Inmunodifusin radial

Practica 5. Reacciones de Precipitacin

Practica 6. Reacciones de Aglutinacin

Practica 7. Reacciones de Hemaglutinacin directa e indirecta

Practica 8. Hemaglutinacin pasiva

Practica 10. Ensayo inmunoenzimticos (ELISA)

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

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w. Debe mantenerse un programa efectivo de control de insectos y roedores.

Se familiarice las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunologa

Conozca la importancia de los riesgos biolgicos del manejo de material infeccioso

Aplique sus conocimientos en la resolucin de casos de accidente ocupacional con

Revise literatura sobre bioseguridad en el laboratorio y esuelva los siguientes casos de

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Situacin: hemoptisis y hematemesis activa durante el procedimiento de colocacin de la

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VENIPUNCIN Y MANEJO DE ESPECMENES HEMATOLGICOS