CARACTERSTICAS DE IDENTIFICACIN BIOQUMICAS

Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas sencillas que ponen de

manifiesto una caracterstica bioqumica, como la presencia o ausencia de una
determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o va metablica, crecimiento
a una temperatura dada, crecimiento en presencia de inhibidores, etc.
La realizacin de una prueba bioqumica implica:
1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado
sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la
degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por
agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn
producto de su degradacin.
2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el
sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la
actividad enzimtica.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en
un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza
inica, atmsfera y temperatura adecuados. Existe una gran variedad de pruebas
bioqumicas. A continuacin describiremos las ms frecuentes, agrupadas segn
el tipo de ensayo:
Enzimas vinculadas con la respiracin.
a) Citocromo oxidasa (o simplemente, oxidasa). Es un enzima de la cadena
de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de algunas
bacterias.
Para detectarla se utiliza un soporte (disco de papel o bastoncillo) que lleva
incorporado

el

sustrato

correspondiente

(Ej:

oxalato

de

paraaminodimetilanilina). Se impregna dicho soporte con una colonia y se

esperan unos minutos. Si el sustrato es degradado, la prueba es positiva y se
forma un color violeta caracterstico.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

Permite

diferenciar

los

bacilos

Gram

negativos

del

grupo

de

las

enterobacterias (oxidasa negativos) del gnero Pseudomonas (tambin bacilo

Gram negativo, pero oxidasa positiva).
b) Catalasa. Descompone el agua oxigenada en agua y oxgeno molecular; las
bacterias lo usan como sistema de defensa frente a perxidos y superxidos
que son productos txicos generados en la respiracin. La deteccin se basa
en aadir una gota de agua oxigenada sobre la colonia problema. Si la
reaccin es positiva, se produce un burbujeo de oxgeno. Tambin puede
depositarse la colonia sobre un porta y aadir el reactivo. Nunca debe
realizarse esta prueba en agar sangre, porque los eritrocitos tambin poseen
catalasa y dan resultados falsamente positivos.
La prueba de la catalasa diferencia dos grandes grupos de cocos Gram
positivos, estreptococos (catalasa negativos) y estafilococos (catalasa
positiva).

Requerimientos de oxgeno.
a) Prueba OF (test de Hugh-Leifson). Permite evidenciar la accin de las
bacterias sobre los carbohidratos. El medio de Hugh-Leifson es una base a la
que, tras esterilizar, se aade un azcar, normalmente glucosa esterilizada
por filtracin. Por ello, si decimos que una bacteria es oxidante o
fermentadora, se entiende con respecto al metabolismo de la glucosa.
Se realiza en dos tubos con medio semislido que inicialmente son de color
verde. Se inoculan por picadura en el centro del tubo y uno de ellos se
recubre con parafina lquida estril (que impide el contacto del medio con el
oxgeno atmosfrico).
El indicador es azul de bromotimol, que en medio cido (el metabolismo de
los azcares produce cidos, tanto en presencia como en ausencia de
oxgeno) es de color amarillo. Si el microorganismo es nicamente oxidante
(Pseudomonas, etc.), despus de incubar slo estar amarillo el medio sin
cubrir

con

parafina,

si

es

oxidante

fermentador

(caso

de

las

enterobacterias), en ambos tubos el color virar a amarillo y si slo puede

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

utilizar el azcar cuando no hay oxgeno sera fermentador (tubo con parafina
amarillo). Si la bacteria no oxida ni fermenta el azcar aadido, los tubos no
viran.
b) Crecimiento en tioglicolato. Determina el efecto del oxgeno sobre el
crecimiento microbiano. Se usa un tubo con medio semislido que contiene
tioglicolato para reducir el potencial redox del medio (slo hay oxgeno en la
superficie y no en el resto). El tubo es inoculado por picadura y se incuba
hasta crecimiento. Si el microorganismo es aerobio estricto crecer en la
parte de arriba del tubo, si es anaerobio estricto no crecer en la parte ms
alta del tubo y si es anaerobio facultativo crecer por todo el medio.

Produccin de cido y/o gas.

Las bacterias anaerobias o anaerobias facultativas a menudo fermentan
carbohidratos a cidos orgnicos y gas (H 2 o CO2). Estos pueden detectarse
sembrando en tubos de caldo que lleven incorporados un indicador de pH y una
campana Durham, que es un pequeo tubo abierto en uno de sus extremos. Si
hay produccin de cido el indicador vira, y si se produce gas, ste de deposita en
la campana formando burbujas.

Utilizacin de compuestos nitrogenados.

Se estudia la reduccin de nitratos. Hay dos pruebas:
o Reduccin de nitrato a nitrito. Algunas bacterias pueden usar nitratos
como aceptor final de electrones en la respiracin, con reduccin final a
nitritos. Las bacterias se inoculan en medios con nitrato potsico y el nitrito
formado puede detectarse aadiendo alfa-naftilamina y cido sulfanlico,
producindose un color rosa-rojo. Las enterobacterias y Pseudomonas son
usualmente positivos.
o Reduccin total de nitrato hasta nitrgeno gaseoso (desnitrificacin).
Si al aadir zinc en polvo al medio anterior no aparece color rojo es que no
queda nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificacin).

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

Descomposicin de aminocidos.
o Prueba del indol. Es un test de la batera IMVIC para enterobacterias, que
detecta la produccin de indol a partir de triptfano. Utiliza el reactivo de
Ehrlich o Kovacs (a base de paradimetilaminobenzaldehdo), que se aade
al medio lquido y da un anillo de color rojo con el indol. Es tpica de E. coli.
o Produccin de cido sulfhdrico (SH2) a partir de aminocidos
azufrados. Se usan medios en tubo con sales de hierro o plomo, que con
SH 2 forman sulfuros de estos metales, lo cual se evidencia como un
precipitado negro en el lugar de crecimiento. Se usa el agar acetato de
plomo, y tambin en medios combinados como el TSI o Kliger (se detallan
ms adelante).
o Fenialalanina desaminasa. Algunas bacterias desaminan la fenilalanina a
cido fenilpirvico, que con FeCl 3 en solucin cida produce un color
verdoso.
o Descarboxilacin de aminocidos. Diversas especies de enterobacterias
tienen descarboxilasas, que transforman los aminocidos en aminas, las
cuales en condiciones anaerobias alcalinizan el medio.
Las bacterias se inoculan en medios que contienen lisina, ornitina o arginina
y un indicador de pH (prpura de bromocresol, que vira a violeta en medio
alcalino).
o Urea. Muchas bacterias poseen ureasa, que desdobla la urea en amonaco,
agua y anhdrido carbnico. De esta manera se protegen de sus efectos
txicos.
Las bacterias se inoculan en agar urea que es un medio inclinado con urea
y rojo de fenol como indicador. La formacin de amoniaco alcaliniza el
medio y el indicador vira de amarillo a un rosa intenso. Se usa en la
identificacin de algunas especies como Proteus, Helicobacter pylori y para
la caracterizacin rpida de Brucella (vira en poco ms de una hora).

Test de crecimiento o inhibicin.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

o Temperatura. Se ve la temperatura a la que puede crecer el

microorganismo, si es termfila, etc.
o Crecimiento en medio salino. Los estafilococos pueden crecer en agar
Chapman (con manitol y ClNa al 7,5%). Tambin algunos vibrios halfilos
crecen en medios muy salinos.
o Pruebas de resistencia antibitica. Se ve la resistencia y sensibilidad de
la bacteria frente a diversos antimicrobianos. Pueden usarse discos de
papel impregnados con los antibiticos, colocados sobre una placa
previamente inoculada con la cepa problema. Si se produce halo de
inhibicin del crecimiento la bacteria es sensible al antibitico.

CARACTERSTICAS DE IDENTIFICACIN MORFOLGICAS

Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por

muchos aos a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos
anatmicos tan diferentes que pueden ser fcilmente utilizados en su clasificacin,
pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el microscopio tan
similares que se dificulta su clasificacin. Es decir, que estos microorganismos que

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades

bioqumicas, fisiolgicas y/o serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfologa
celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til para la
identificacin bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su
localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados.

Morfologa microscpica:
Casi todas las bacterias son similares en morfologa y slo se pueden establecer
algunos grandes grupos (Ej: cocos Gram positivos).
Se suele recurrir a la tincin de Gram o al examen en fresco. Algunas bacterias se
pueden identificar presuntivamente porque tienen formas muy peculiares. Por
ejemplo Fusobacterium es un bacilo Gram negativo fusiforme (muy alargado y fino
con los extremos puntiagudos). Campylobacter y Helicobacter son bacilos Gram
negativos en forma de ese. Bacillus y Clostridium son bacilos Gram positivos con
forma de caja.
De todas formas, la tincin de Gram presenta diversos inconvenientes. Las
caractersticas de tincin cambian con la antigedad del cultivo, e incluso la tincin
de la bacteria in vivo difiere a veces de la del cultivo. Igualmente, algunas
bacterias no presentan una forma constante (pleomorfismo).

Morfologa macroscpica:
Las bacterias crecen en los medios de cultivo slidos dando colonias que son
clones de clulas provenientes de una bacteria originaria.
El aspecto de las colonias es de gran ayuda en la identificacin. Cada bacteria
crece diferente, formando colonias de distinto color, forma, tamao, textura, olor,
brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes enteros,
estrellados, etc. Igualmente, algunas bacterias producen pigmentos que tien el
medio.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

La morfologa colonial tampoco es definitiva, pero dirige el diagnstico hacia un

grupo ms o menos amplio de microorganismos. Hay colonias muy caractersticas,
casi exclusivas de determinadas bacterias. Por ejemplo, Proteus se extiende
ampliamente por la placa formando un velo muy caracterstico, los neumococos
crecen en agar sangre dando colonias con dos bordes que le dan aspecto de
pequeas monedas, etc.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

CARACTERSTICAS DE IDENTIFICACIN MOLECULARES

Modernamente adquiere ms importancia el uso de mtodos basados en biologa

molecular donde, a travs de procedimientos y reactivos, se pueden detectar
determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente
microbiano. El mtodo que se est utilizando ampliamente en los laboratorios de
diagnstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente
para la identificacin de- microorganismos que no pueden ser cultivados por los
mtodos convencionales. A travs de este mtodo, puede aumentarse la cantidad
de ADN hasta niveles detectables mediante electroforesis o mediante sondas de
ADN.
El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n nmero de
veces:
1. Separacin de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura,
la cual rompe los enlaces de hidrgeno que mantiene unidos a las cadenas de
ADN.
2. Adicin de cadenas cortas de polinucletidos, denominados cebadores, que se
unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento
de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5 ---3 y otro a la cadena
35.
3. Disminucin de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con
las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases.
4. Adicin de la ADN polimerasa, los cuatro nucletidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y
dems cofactores, para que tenga lugar la sntesis de la cadena complementaria.
5. Repeticin de las etapas 1 a 4.
Este proceso se caracteriza por ser exponencial. En cada ciclo se duplica la regin
de ADN ubicada entre los cebadores.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

Este procedimiento se realiza en un equipo denominado termociclador, que

permite regular las diferentes temperaturas que se requieren para cada uno de los
pasos.
A continuacin se enumeran ejemplos de agentes microbianos subclasificados en
bacterias, virus y protozoario, que han sido identificados mediante PCR.
Bacterias:
Borrelia burghdoferi, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori,
Stahylococcus aureus, Chlamydea trachomatis, Shigella dysenteriae, Treponema
pallidum, Escherichia coli enterotoxinognica, Mycobacterium tuberculosis y
Legionella pneumonophilia, Campylobacter jejuni.
Virus: Parvovirus, Herpes-simplex virus, Rotavirus, Papillomavirus, Virus del
dengue, Virus Varicella-Zoster, Virus de la Rubola, Adenovirus, Rhinovirus.
Protozoarios: Plasmodium falciparium, Toxoplasma
histolyticum, Pneumocystis carinii, Trypnanosoma cruzi.

gondii,

Entamoeba

Ventajas y desventajas de los mtodos moleculares.

En la actualidad las tcnicas moleculares para la identificacin de
microorganismos estn teniendo un auge muy importante debido a: 1.Especificidad (pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters), 2.Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo),
3.-Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas) y 4.Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y
reducir los costos). El uso de tcnicas moleculares ha permitido identificar nuevos
microorganismos, los cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por
tcnicas tradicionales (Jan y LeBorgne, 2001). Adems permiten estudiar las
poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos
que pueden surgir con el cultivo de microorganismos (Chan y col., 2002). As
mismo estas tcnicas permiten la deteccin de microorganismos altamente
patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando as los riesgos de
infeccin del analista (Johansson y col., 2000). Las tcnicas moleculares han
demostraron ser muy tiles en situaciones clnicas donde los mtodos
convencionales son muy insensitivos (v.g. durante la etapa asintomtica de las
infecciones del VIH), muy lenta (cultivo microbacterial) o muy complicados para
ser usados a gran escala (v.g. aislamiento viral). Otra aplicacin importante es en
el monitoreo del surgimiento de mutaciones en el genoma, por ejemplo, la
seleccin de variantes resistentes durante la terapia antiviral/antibitica (Reischl,
1996).

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

Algunas de las desventajas asociadas a las tcnicas moleculares son: 1.-No

distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es
precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la bacteria
muere a temperaturas que no degradan la toxina as la deteccin de la bacteria
muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra. 2.-Se tiene que
contar con conocimientos de secuencias de nucletidos especificas del patgeno
diagnosticar, 3.-Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo
de las pruebas de identificacin, 4.-Se requiere equipo ms especfico para el
diagnstico, lo cual eleva la inversin inicial, y 5.-Se desarrollan procedimientos
con mltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de errores, adems de la
posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. El alto costo de las
tcnicas moleculares tendera a bajar a medida que se incremente el uso de estas
tcnicas. Por otra parte el problema de falsos positivos y falsos negativos se
puede solucionar si se incluye en cada anlisis un testigo positivo y un testigo
negativo (Ayala y col., 2004).

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

CARACTERSTICAS DE IDENTIFICACIN ANTIGNICAS

Los

mtodos

serolgicos,

implican

la

utilizacin

de

preparaciones

de

inmunoglobulinas especficas provenientes del suero o de un reactivo, y que

pueden ser de gran utilidad en la identificacin microbiana en muestras puras o en
muestras biolgicas. Cada uno de los mtodos tiene su fundamento particular,
pero en lneas generales, todos se basan en la reaccin de un antgeno presente
en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solucin que
contiene los anticuerpos se denomina antisuero.
Estos mtodos son muy tiles en diversas situaciones:
Si a travs de un sistema miniaturizado basado en pruebas bioqumicas se
determin que la bacteria causante de la infeccin es un miembro del
gnero Salmonella, utilizando una batera de antisueros contra el antgeno
O presente en el lipopolisacarido de las bacterias gram negativas, es
posible identificar a la Salmonella aislada hasta el nivel de serotipo (poli O,
A, B, C, D, etc.).

La inmunofluorescencia ha resultado ser sumamente til en casos de

infecciones de diferente origen. Puede utilizarse para la identificacin del
microorganismo aislado o presente en una muestra biolgica. En el mtodo
directo se fija la muestra problema a una lmina y se pone en contacto con
el antisuero especfico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o
fluorescena). Una vez transcurrido el tiempo para que tenga lugar la
reaccin antgeno anticuerpo, se expone la lmina a la radiacin ultravioleta
para visualizar la reaccin. Tambin existe la tcnica indirecta, donde en

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

primer lugar se utiliza el anticuerpo especfico no marcado y posteriormente

se utiliza un anti anticuerpo marcado.
En caso de una infeccin viral, los virus no pueden ser identificados
mediante pruebas bioqumicas, pero si pueden ser identificados en
diferentes fluidos biolgicos utilizando inmunoensayos, tales como el ELISA
(Enzyme-linked immunoabsorbent assay), el cual, a manera general, utiliza
anticuerpos monoclonales especficos para el antgeno a identificar,
marcados con una enzima.
En un ensayo de ELISA tipo sndwich, los anticuerpos especficos para el
antgeno, se colocan sobre los pozos de una microplaca, posteriormente se aade
la muestra donde se quiere determinar la presencia del agente (bacteria, virus,
protozoario). Si el agente est presente ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo;
luego del lavado se aade el anticuerpo especfico marcado con la enzima. Una
vez transcurrido el tiempo de incubacin y realizado el lavado correspondiente, se
aade el sustrato. Si se desarrolla un color se trata de un resultado positivo. Estos
ensayos, al igual que otros, involucran el uso de controles positivos y negativos.
Inmunoensayos tipo ELISA han sido desarrollados para la deteccin e
identificacin de varios tipos de agentes microbianos. Ejemplos: VIH, virus de la
Hepatitis A, B, C, Chlamydea trachomatis, Legionella pneumophili, Mycoplasma
pneumoniae, Escherichia coli, Entamoeba hystoliticum, Haemophilus influenzae,
Neisseria.

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Caractersticas de identificacin en los microorganismos.

CONCLUSIN

BIBLIOGRAFA