Sistema CRISPR-Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para editar el genoma

celular, donde incluimos el genoma humano. Podemos pensar en este sistema como unas
tijeras moleculares capaces de cortar el DNA de manera muy precisa, controlada y eficaz
permitiendo as la modificacin, eliminacin o insercin de secuencias en el DNA.
Empezando con su historia, ya en el ao 1987 se public un artculo en el que se describa
cmo algunas bacterias (Streptococcus pyogenes) se defendan de las infecciones vricas.
En concreto se observ que las bacterias tenan unas enzimas capaces de distinguir entre
el material gentico de la bacteria y el del virus infectivo y, una vez detectada la distincin,
destruan el material gentico vrico.
Poco tiempo despus, una vez que se consigui mapear los genomas de algunas bacterias y
otros microorganismos, se encontr que haba una zona determinada del genoma de estos
microorganismos llena de repeticiones palindrmicas separadas entre s mediante unas
secuencias denominadas espaciadores que se parecan a otras de virus y plsmidos.
Delante de estas repeticiones hay unas secuencias lder a las que llamaron CRISPR
(Repeticiones Palindrmicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas). Cerca
de este agrupamiento se podan encontrar unos genes que codificaban para un tipo de
nucleasas: los genes cas.
Se observ que todo este
entramado serva a la bacteria
como sistema de defensa frente
al ataque vrico. Cuando el virus
entra en la bacteria, su material
gentico interacciona con el
complejo protena Cas unida a un
RNA producido a partir de las
secuencias CRISPR, de esta
manera
es
inactivado
y
posteriormente degradado. Las
protenas Cas cogen una pequea
parte del DNA viral, lo modifican
e integran dentro del conjunto de
secuencias CRISPR. De esta
manera, si la bacteria (o la
descendencia de esta) se
encuentra con ese mismo virus,
ser capaz de inactivar de forma
ms eficiente al material gentico
viral.

En los aos posteriores se continu la investigacin sobre este sistema y fue en el ao

2012 cuando se convirti en realmente una herramienta molecular til en laboratorio. El
equipo que consigui esto estaba dirigido por Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna
cuyo artculo publicado en Science demostr que este mecanismo poda usarse para editar
de manera programable cualquier cadena de DNA in vitro. Es decir, lograron programar el
sistema para que se dirigiera a una posicin especfica de un DNA cualquiera y lo cortaran.
Bsicamente lo que se hace es disear una molcula de RNA (CRISPR o RNA gua) que
posteriormente es insertada en una clula, donde posteriormente reconoce el sitio exacto
del genoma donde la enzima Cas9 debe cortar.
Primero el RNA gua se asocia con la enzima Cas9 y se dirige a una secuencia concreta del
DNA de la que es complementaria e hibrida con ella. En ese momento acta Cas9, enzima
con actividad endonucleasa, que corta el DNA en esa regin.
Posteriormente se activan al menos dos mecanismos de reparacin naturales del DNA
cortado. Uno es el indeI (insercin-delecin) que hace que en el sitio donde se ha cortado
aparezca un hueco o que se inserte un trozo ms de cadena. De esta manera se logra una
prdida de la funcin original del segmento de ADN cortado. Otro mecanismo permite
incorporar una secuencia concreta exactamente en el sitio original del corte, dndole,
evidentemente, esa secuencia para que sea integrada.

Como vemos, con la tecnologa CRISPR/Cas9 podemos regular la expresin gnica,

etiquetar sitios especficos del genoma en clulas vivas, identificar y modificar funciones
de genes y corregir genes defectuosos.

Este sistema nos permitir, no en un futuro muy lejano, curar enfermedades cuya
causa gentica se conozca, lo que se conoce como terapia gnica. Hoy da ya se est
trabajando con esta tecnologa en enfermedades como la Corea de Huntington, el

Sndrome de Down o la anemia falciforme. Otra aplicacin que actualmente se est

trabajando es la modificacin gentica de embriones humanos, tema que no escapa de
controversias ticas. Uno de los estudios que se han llevado a cabo ha sido la introduccin
de una mutacin en el material gentico de embriones humanos para hacerlos resistentes
al virus VIH. Aunque los resultados no han sido correctos en su totalidad, se ha cumplido el
objetivo para el que se realiz el estudio, establecer principios para la introduccin de
modificaciones genticas en embriones humanos tempranos.

Introduccin de modificaciones genticas en embriones humanos

por edicin genmica mediada por CRISPR/Cas9
El gen mutado ha sido el CCR5, que codifica el principal correceptor utilizado por VIH-1
para infectar las clulas humanas, y cuya mutacin ha sido generar el alelo nulo CCR532,
que en organismos heterocigotos y homocigotos para este alelo hace que sean saludables y
tengan una progresin ms lenta o resistencia a infecciones por el VIH.
El procedimiento fue el siguiente: se obtuvieron 213 embriones 3PN (tripronuclear), que
solo viven 3 das y son incapaces de desarrollarse in vivo, de un total de 87 pacientes.
Estos se inyectaron con una mezcla de ARNm de Cas9 y ARN gua (RNAg), y dos oligos
(oligodeoxinucleotidos o ssODNs de 90 bp) o DNA donante (1 kb).

Respecto al protocolo, para la produccin del ARNm de Cas9, se llev a cabo la

transcripcin in vitro (IVT), siendo aadido un promotor T7 a la regin codificante de
Cas9 por amplificacin por PCR. El producto de PCR fue purificado y usado como plantilla
para IVT. Para el ARNg, las plantillas IVT fueron generadas por amplificacin por PCR
usando las cartillas enumeradas en tabla S1. El producto de PCR de gRNA T7 fue
purificado y utilizado como plantilla para IVT.
Tras la amplificacin de todo el genoma (Whole-Genome Amplification) y su purificacin,
el ADN purificado fue corrido en geles de agarosa para confirmar el xito de dicha
amplificacin.
En cuanto al procedimiento, los dos gRNAs diseados tenan como objetivos cada extremo
de la frontera de la secuencia de 32 bp deseada dentro del exn 4 del gen CCR5 (Fig. 1a).
Cuando los DSBs (Double-Strand DNA) mediados por CRISPR/Cas son reparados por nonhomologous end-joining (NHEJ), pequeas inserciones o deleciones (indels) pueden
ocurrir y conducir a alelos mutantes de CCR5.

En primer lugar, se intent evaluar el potencial del desarrollo in vitro de cigotos 3PN
inyectados con el sistema CRISPR/Cas. El mRNA de Cas9 y los gRNA1 o gRNA2 fueron
inyectados en los cigotos por inyeccin citoplasmtica, y fueron cultivados durante 3 das
hasta llegar a una etapa de 8-16 clulas (Fig. 1b). Aproximadamente el 72% de los
embriones inyectados con agua (grupo control) llegaron a dicha etapa. En comparacin, el
64 y 62% de los cigotos inyectados con mRNA de Cas9 y gRNA1 o gRNA2,
respectivamente, llegaron a tal etapa de 8-16 clulas, lo que sugiere un efecto
mnimamente perjudicial.

Cada embrin inyectado que se desarroll fue aislado y su ADN genmico fue amplificado,
y la regin especfica, secuenciada por mtodo SANGER. Los productos PCR de mutantes
identificados fueron clonados en plsmidos, y cada alelo fue identificado por secuenciacin
(Fig. 1 c). La eficacia de la modificacin gentica fue superior al 50% con gRNA1 o gRNA2,
lo que indica que podran introducirse potencialmente beneficiosas modificaciones
genticas en los embriones humanos tempranos con alta eficiencia (tabla 1).

A continuacin, se prob si se podra presentar el alelo 32 precisamente en el lugar

geomtrico de CCR5 a travs de la va HDR (Homology Directed Repair) mediante el uso
de ssODNs como donantes. Dos ssODNs largos (90 nucletidos) fueron diseados a partir
de la cadena con sentido (ssODN1) y la cadena anti-sentido (ssODN2) del lugar geomtrico
del CCR5, cada uno con 45 nt homlogos a la secuencia de cada lado de la secuencia de 32
pb (tabla S2). Se inyect la mezcla de mRNA de Cas9, gRNA1 y ssODN1. Esto dio como
resultado la produccin del alelo CCR532 en uno de los 20 embriones totales (Fig. 1 d,
tabla 1). Se intent mejorar esta eficiencia proporcionando un donante de 1 kb con
homologa total pero no se vea mejora significativa (tabla 1).

Como NHEJ es ms eficiente y como dos DSBs pueden unirse precisamente a travs de la
va NHEJ, se co-inyect el mRNA de Cas9 junto con ambos gRNAs a los lmites de la regin
de 32 bp sin proporcionar ningn donante de ADN. As se consiguieron generar embriones
con el alelo CCR532 en 4 de las 26 muestras totales (tablas 1 y 2). Todos los alelos
identificados de los embriones que contienen el alelo CCR532 se muestran en la figura 2,
y los resultados del PCR subcloning se resumen en las tabla 2. En los embriones que
contienen el alelo CCR532, los otros alelos en el mismo locus siguen siendo de tipo
salvaje o contienen mutaciones indel diferentes que no estaban predefinidas.

Tabla 1. El sistema CRISPR/Cas fue inyectado por inyeccin citoplasmtica en

todos los cigotos 3PN, excepto el marcado con PN, por inyeccin pronuclear.

Tabla 2. Clonado (subcloning) de los productos de PCR de los embriones humanos

3PN que contienen el alelo CCR532.

En este estudio, se ha demostrado que un alelo beneficioso obtenido naturalmente puede

ser introducido en embriones humanos tempranos 3PN a travs de la inyeccin del
sistema CRIPSR/Cas9 en el cigoto. Probando diferentes estrategias, se logr introducir el
alelo CCR5D32 en el embrin humano temprano 3PN.
Debido a la escasez de embriones humanos, se tiene un nmero relativamente bajo de
muestras para cada grupo. Adems, las diferencias en el desarrollo y las tasas de mutacin
entre los grupos no son significativas, y no se puede sacar ninguna conclusin precisa.
Incluso en los embriones en los que se introdujo satisfactoriamente el alelo CCR5D32, los
alelos que se encontraban en los embriones en el mismo locus no podan ser controlados
por su naturaleza silvestre (wild type) o por contener mutaciones indel.
Los posibles efectos fuera del gen diana son un gran problema para el sistema
CRIPSR/Cas9. Algunos estudios han informado acerca de mutaciones heredables inducidas
tanto en humanos como en ratones. A pesar de esto, se sigue investigando cmo poder
optimizar este sistema de modificacin gentica para poder resolver, sin lugar a dudas, en
un futuro no muy lejano un gran nmero de enfermedades.

Para acabar, vamos a hablar de otro logro en el que este sistema fue protagonista:
Un equipo de investigadores del Instituto Tecnolgico de Massachusets, consigui curar
ratones de una rara enfermedad del hgado causada por una mutacin gentica, usando
este mtodo del que ya hemos hablado. Este logro, segn ellos, supuso la primera
evidencia de que se pueden revertir sntomas de enfermedad en animales vivos y que la
tcnica CRISPR tiene potencial para tratar distintos trastornos genticos.
Utilizaron este sistema de igual forma a la ya relatada: cas9 se lig a la hebra de ARN
programada para vincularse a una secuencia de genoma especfica, y esta sirvi como gua
indicndole a Cas9 la parte de ADN que deba cortar. Introdujeron en clulas de ratones
una hebra de ADN que funcionaba como patrn de manera que cuando la clula reparaba
el dao producido con la enzima Cas9, lo haca copiando ese modelo e introduciendo
nuevo material gentico en el genoma. El equipo dise tres hebras de ARN guas dirigidas
a tres secuencias de ADN objetivo distintas, cercanas a la mutacin gentica que causa la
enfermedad tirosinemia de tipo I, causante de que el cuerpo no pueda romper el
aminocido tirosina, lo que provoca alteraciones a nivel heptico y renal, adems de

retraso mental. Esta enfermedad est ocasionada de manera ms especfica por una
mutacin en el gen que codifica la enzima fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH). El
suministro de los componentes del sistema CRISPR a ratones con esta mutacin se hizo
mediante inyeccin de alta presin, con una jeringuilla potente que descarga rpidamente
el material en las venas del animal. As lograron insertar el gen correcto en
aproximadamente uno de cada 250 hepatocitos de los ratones. Despus de 30 das, esas
clulas sanas comenzaron a proliferar y a sustituir a las enfermas, hasta formar
aproximadamente un tercio del total de los hepatocitos. Esto fue suficiente para curar la
enfermedad y permitir que los ratones sobrevivieran sin el medicamento que se suele
suministrar.

Bibliografa:
Sistema CRISPR: http://dciencia.es/que-es-la-tecnologia-crispr-cas9/
Introduccin de modificaciones genticas en embriones humanos por
edicin genmica mediada por CRISPR/Cas9:
http://www.gwern.net/docs/genetics/2016-kang.pdf
Artculo: Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by
CRISPR/Cas-mediated genome editing
Technological innovations
2016
ltima noticia:
http://www.tendencias21.net/Eliminan-una-mutacion-genetica-aplicando-unmetodo-de-edicion-del-ADN_a32590.html