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INSTITUTO

POLITCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

MTODOS

DE

ANLISIS

Prctica

SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE


AZUL DE METILENO Y FLOURESCENA
USANDO CROMATOGRAFA POR
ADSORCION

Seccin 2
5QM2

Daz Lpez Mnica/ Trejo Solrzano Alejandra.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

INTRODUCCION
Existen ciertas sustancias slidas, qumicamente inertes, que tienen la propiedad de
adsorber o fijar dbilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La
fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado vara de un
compuesto a otro.
Entre los adsorbentes ms usuales: slica Gel (xido de silicio), almina (xido de
aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio.
La separacin se realiza por la diferente tendencia de adsorcin de los compuestos
orgnicos por la fase estacionaria.
La fase mvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla segn sea su afinidad
por la fase estacionaria es decir, los componentes ms polares estarn adsorbidos con
ms fuerza y sern ms difciles de separar de la fase estacionaria que los componentes
poco polares.
Los menos polares no presentan una interaccin importante con la fase estacionaria (gel
de slice) y no sern retenidos.
En un proceso de adsorcin los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase
estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorcin desorcin
hace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros.
La adsorcin es un proceso de superficie mientras que la absorcin es la penetracin de
una sustancia en el seno de otra (al escribir el papel adsorbe tinta mientras que la esponja
absorbe agua).
En cualquier fenmeno de adsorcin influyen tres variables independientes: el
adsorbente, el disolvente y las sustancias a separar.
Por tanto, s una molcula tiene una gran afinidad pasar muy lentamente mientras que
otro componente con menos afinidad lo har ms rpidamente.

OBJETIVOS

Conocer el manejo de algunas tcnicas para la separacin de dos componentes


de una mezcla.
Analizar los factores que influyen en el proceso de cromatografa por adsorcin,

Comprobar la separacin con base al perfil de elucin.

RESULTADOS
A.

CONSTRUCCION DEL PERFIL DE ELUCION.

Tabla No. 1 Valores de Absorbancia obtenidos para la separacin de azul de metileno y


fluorescena.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION


Volumen de elucin (ml)
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57

A493
-0.020
0.047
0.082
-0.011
-0.020
-0.083
-0.014
-0.010
-0.009
-0.017
-0.017
-0.019
-0.021
1.424
0.938
0.210
0.030
0.006
0.002

A668
-0.049
0.905
1.156
0.134
0.000
0.022
-0.002
-0.008
0.000
-0.006
-0.010
-0.011
-0.010
-0.010
-0.008
-0.008
-0.012
-0.011
-0.011

1.6
1.4

1.42

1.16

1.2

1.2

0.8
Absorbancia

1.4

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

0
9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57

-0.2

-0.2
Volumen de Elucion (mL)
Azul de Metileno

Flourescena

Figura No. 1. En esta grafica se muestra los valores de absorbancia obtenidos a partir de los
diferentes volmenes de elucin en la separacin por cromatografa de absorcin del azul de
metileno y la flourescena.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION


Preguntas Extras

1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatgrafico para esta


separacin.
Eluyente
Elucin

Eluato

Figura No. 2. Componentes de un sistema cromatgrafo y eluato/elucin

Eluato: Lquido que es colectado por elucin en la cromatografa en columna.


Elucin: Es la migracin de los solutos a lo largo de la columna desde el punto de
aplicacin.
Eluyente: Es la Fase Mvil que ocasiona la elucin.
2. Defina el Termino adsorcin y empleando formulas, esquematice que fuerzas
intermoleculares participan en el proceso de separacin de los solutos.
Adsorcin: Fenmeno de superficie en la cual las molculas en solucin tienden a
agruparse sobre la superficie de un slido poroso o una interfase en forma reversible.

3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique que


modificaciones hara para invertir el orden de la elucin.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION


Para invertir el orden de elucin de los colorantes podemos cambiar la fase
estacionaria que tenga menos afinidad por la Fluorescena que por el Azul de
Metileno. En este caso consideramos el pH; si a un pH acido la almina est cargada
positivamente y por atraccin retiene a la Fluorescena, podemos llevar a un pH cido
y as esta estar cargada negativamente y retendr con mayor afinidad al azul de
metileno.
Otro punto a considerar es elegir la polaridad del disolvente anloga a la de la muestra
a emplear en este caso podremos seguir utilizando el regulador de fosfatos.
Las fuerzas intermoleculares que actan son de atraccin en el caso de la almina y
el Azul de Metileno y de repulsin o menor atraccin con la Fluorescena por lo que
esta eluir primero.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

Cambio de Fase
Mvil

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION


Figura No. 3. Mecanismo de Separacin de la mezcla de dos colorantes (Azul de Metileno y
Fluorescena) por cromatografa de adsorcin.

ESTRUCTURAS DE LOS COLORANTES

AZUL DE METILENO

Fig. 4 Estructura qumica del azul de metileno

FLOURESCENA

Fig. 5 Estructura qumica de la fluorescena

DISCUSIN
Durante el procedimiento de separacin de nuestra mezcla por cromatografa de
adsorcin en columna, se debieron tomar en cuenta distintos cuidados:
-Mantener constante la hidratacin de la almina (fase estacionaria) razn por la cual el
volumen de la fase mvil se mantuvo 4 cm por arriba de la fase estacionaria
-Correcta colocacin del disco de lana
-La no formacin de burbujas de aire al momento de empaquetar.
-Elucin lenta y constante para evitar una estratificacin, es por eso que la velocidad de
goteo fue regulada a 10 gotas por 15 segundos.
La cromatografa por adsorcin considera la separacin de dos sustancias A y B en base
a la diferencia de afinidad de adsorcin sobre la superficie de un slido, implica el
transporte de una especie a travs de una columna por adicin sucesiva de fase mvil
(eluyente); haciendo descender a las molculas del analito a travs de una fase
estacionaria.
La Almina tiene propiedades anfteras en un amplio rango de pH. La capacidad de una
sustancia qumica para actuar ya sea como un cido o una base se llama anfoterismo.
Por lo cual mediante esta ventaja podemos separar la mezcla como se explica a
continuacin:
Si Observamos la Fig. No.3 se utiliza en un principio una almina con un pH de 12 por lo
tanto nuestra fase estacionaria est cargada positivamente, la fuerza con que es

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION


absorbido cada componente de la mezcla dependen de la polaridad de estos; lo cual se
puede deducir de acuerdo a su estructura qumica (Fig. No.4 y Fig. No. 5 ) El azul de
Metileno tiene una carga positiva y La Fluorescena una carga Negativa en consecuencia
al utilizar como primer fase mvil el agua destilada el primer componente en separarse
ser el azul de metileno ya que por repulsin con la almina ser desplazado fcilmente y
retenido con mayor afinidad la fluorescena.
Como ya antes se mencion la almina es de carcter anftero, aprovechando esta
caracterstica la fluorescena ser separada de la almina al cambiar la fase mvil, es por
esto que al terminar la completa recoleccin de los eluatos que puedan contener azul de
metileno se hace un cambio de fase mvil por regulador de fosfatos, que cambiara la
carga de la almina y esta pasara de estar cargada positivamente a estar cargada
negativamente, propiciando el desplazamiento de la fluorescena a lo largo de la columna.
Una vez obtenido nuestros componentes separados se procedi a leer nuestros eluatos a
dos longitudes de onda 493 y 668 para la construccin del perfil de elucin y para su
mayor representacin la grfica de absorbancia contra volumen de elucin.
Si analizamos la Fig. No 1 es comportamiento es el esperado en un volumen de elucin
de 3 mL obtenemos un pico de absorcin a 668 nm correspondiente a el azul de metileno,
el siguiente pico mximo corresponde a la fluorescena con un volumen de elucin de 42
mL a 493 nm en esta misma longitud de onda tambin podemos observar una pequea
cresta que se puede explicar, como correspondiente al azul de metileno que tambin es
capaz de absorber a esta longitud de onda pero en menor proporcin.

CONCLUSIONES
El azul de Metileno tiene un absorbancia mxima en una longitud de onda

de 493 nm
La fluorescena tiene una absorbancia mxima a una longitud de onda de
668 nm
Se obtuvo una buena separacin de colorantes utilizando la tcnica de
separacin por cromatografa por adsorcin.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica
%20ambiental/Tema6.pdf
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/pri
ncipios_de_cromatografia.pdf
http://www.dynamicadsorbents.com/spanishweb/aluminasuperior.htm

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