LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

ENZIM RETRIKSI DAN AMPLIFIKASI DNA

DOSEN :
Dr. Ir. BADRUZSAUFARI, M.Sc

OLEH :
NAMA

: ONE SAFITRI

NIM

: J1C113047

KELOMPOK

: III (TIGA)

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI BIOLOGI
BANJARBARU
2016

I.

PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Teknik Teknologi DNA rekombinan berkembang setelah ditemukan
suatu enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan
runtunan basa tertentu, sehingga disebut sebagai restriction endonuclease
atau restriction enzyme atau diterjemahkan sebagai enzim endonuklease
restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca:
double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim
restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences).
Pemanfaatan teknik DNA rekombinan dalam usaha penyisipan suatu gen
dari DNA donor ke plasmid bakteri membutuhkan enzim yang cocok untuk
pemotongan DNA. Sebelumnya harus diketahui terlebih dahulu ruas-ruas
restriksi yang mengapit gen yang akan diisolasi. Selain itu, setiap enzim
restriksi bersikap selektif sehingga akan dikenali oleh nama dan runtunan
basa ruas restriksinya.
Perbanyakan atau Amplifikasi DNA dapat dilakukan dengan
menggunakan metode PCR (Polimerase Chain Reaction) dan alat thermal
cycler memanfaatkan kombinasi suhu tinggi dan rendah dengan bantuan Taq
DNA polimerase. Perbanyakan DNA dapat mencapai puluhan siklus yang
menghasilkan jutaan copy DNA. Oleh karena itu, perlu dipelajari lebih lanjut
mengenail enzim restriksi yang merupakan alat biologis baru yang dapat
digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen serta
Amplifikasi DNA dapat diaplikasikan untuk memperbanyak DNA tertentu
yang dapat melakukan ekspresi gen dengan produk tertentu.
B. Tujuan
Tujuan daripraktikum ini adalah untuk mengetahui dan melakukan
pemotongan DNA dengan enzim Restriksi.

II.

METODELOGI
A. Waktu danTempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hariKamis, 14 Maret 2016dan 21

Maret 2016 pukul 10.00 14.00 WITA bertempat di Laboratorium
BiologiMolekuler Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu icebox, tabung
effendorf, tabung reaksi, pipet, sentrifus, mikrosentrifus,waterbath, freezer,
tabung PCR stips, dan thermal cycler Techne
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu es batu,
nuclease free water, deionized water, Restriction Enzyme, Acetylated BSA,
dan DNA.
C. Prosedur Kerja
Prosedur kerja dari praktikum ini adalah :
1. Icebox berisi es batu yang sudah dipecah menjadi kecil disiapkan
2. Tabung effendorf steril 0,2-0,5 ml disiapkan sebanyak 6 buah diatas es
batu
3. Konsentrasi DNA yang digunakan dihitung dan diambil secukupnya
lalu diencerkan sehingga menjadi 1 ug/ul. Jika konsentrasi DNA lebih
rendah tidak usah diencerkan, tetapi volume yang digunakan
ditingkatkan sesuai dengan komposisi digesti seperti pada tabel
dibawah, sehingga total DNA yang digunakan adalah 1 ug. Volume
nuclease free water disesuaikan agar volume total reaksi adalah 20 ul.
4. Siapkan reaksi berikut dengan mengisi tabung sesuai urutannya untuk
masing masing enzim :
komponen
Sterile, deionized water
Restriction Enzyme 10x
buffer

volume
16,1 ul
2 ul

Buffer H : EcoRI

2 ul

Buffer E : BamHI
Acetylated BSA 10

0,2 ul

ug/ul
DNA, 1 ug/ul

1,2 ul

Mix by pipetting, add :

Restriction enzyme, 10

0,5 ul

u/ul
Volume akhir
20 ul
5. Gunakan buffer H untuk restriksi tunggal dengan EcoRI dan buffer E
untuk restriksi tunggal dengan BamHI.
6. Campur perlahan dengan pipetting, ditutup tabungnya dan disentrifus
beberapa detik didalam mikrosentrifus sampai semua larutan
terkumpul didasar tabung.
7. Pada suhu 37 C sampel diinkubasi dengan waterbath selama 1 jam.
Kemudian untuk EcoRI perlu dideaktifasi dengan waterbath
(diinkubasi lagi) selama 20 menit pada suhu 65 C.
8. Sampel disentrifus beberapa detik didalam mikrosentrifus sampai
semua larutan terkumpul didasar tabung.
9. Simpan di freezer untuk analisis elektroforesis.
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL

23 4

1
1

Gambar 1. Gel Band hasil elektroforesis

Keterangan :
1. Kontrol
2. DNA Pisang
3. DNA Bacillus cereus

4. DNA E.coli

B. Pembahasan
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari
DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang
merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potonganpotongan jumlah pasangan basanya. Setelah dilakukan sintesis primer,
langkah selanjutnya adalah mereaksikan RAPD dalam DNA thermal
cycler, yaitu suatu perangkat PCR untuk menaikkan dan menurunkan
suhu dengan cepat. Reaksi ini bertujuan untuk mengamplifikasi
(mereplikasi) fragmen-fragmen DNA (amplikon) dengan riwayat khusus.
1. Amplifikasi ini meliputi 3 tahapan besar, yakni tahap denaturasi DNA
94oC selama 3 menit dan 1 menit, tahap penempelan (annealing) 62oC
selama 1 menit, tahap pemanjangan (ekstensi) 72oC selama 90 detik dan
10 menit. Saat annealing, homologi sekuens antara primer dan utas DNA
turut berperan menentukan keberhasilan reaksi. Tahapan-tahapan yang
ada akan berulang sebanyak 40 siklus hingga diperoleh sejumlah produk
amplikon yang memiliki sekuens acak. Adanya variasi urutan nukleotida
yang diakibatkan insersi atau delesi pada beberapa lokus gen nantinya
akan dianggap sebagai polimorfisme yang menjadi penanda diversitas
genetik suatu galur (breed). Hal ini dapat dilihat setelah divisualisasikan
dengan elektroforesis gel agarosa. Keberadaan profil DNA unik antar
lokus gen akan terlihat berupa pita terang setelah pewarnaan gel dengan
EtBr yang dilihat di bawah pendaran sinar UV.
Pada gambar 1 gel band hasil elektroforesis dengan panah nomor 1
menunjukkan control, sedangkan yang bernomor 2 adalah DNA pisang,
nomor 3 adalah DNA B. cereus, dan nomor 3 adalah DNA E.coli. Hasil
elektroforesis band DNA pisang, B. cereus, dan E.coli tidak muncul. Hal
ini menunjukkan bahwa ada pengerjaan untuk mendapatkan DNA dari
sampel tersebut kurang teliti, atau pada saat endapannya yang kurang
baik pengerjaannya. Dari foto hasil elektroforesis agarose tersebut, jarak
setiap band dan marker tidak dapat diukur karena karena tidak ada sama
sekali yang terlihat pita. Hasil elektroforesis yang terlihat hanya pada
band DNA control dan sebagian dari kelompok lain.

Keberadaan profil DNA yang unik antar lokus gen akan terlihat
berupa pita terang setelah pewarnaan gel yang dilihat di bawah pendaran
sinar UV. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi
oleh faktor-faktor seperti ukuran, partikel, komposisi, dan konsentrasi
gel, densitas muatan, kuat medan listrik, dsb.
Metode perbanyakan genom yang paling sering digunakan adalah
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Keuntungannya karena
sangat mudah dan membutuhkan jumlah DNA genom yang tidak terlalu
banyak. Pada dasarnya, metode ini hampir sama seperti PCR, tetapi
fragmen genom yang diperbanyak bersifat acak dengan satu atau banyak
primer pada arbitrary sequence (sekuens tidak tentu). Keberadaan profil
DNA unik antar lokus gen akan terlihat berupa pita terang setelah
pewarnaan gel dengan EtBr yang dilihat di bawah pendaran sinar UV.
RAPD memerlukan pasangan primer dalam kerjanya, biasanya
berukuran antara 8-mer hingga 12-mer, karena menggunakan teknik
PCR. Sejumlah pita (band) akan dihasilkan oleh tiap pasangan primer
yang akan tampak pada hasil elektroforesis gel. Pasangan primer yang
dipilih kemudia diberikan pada sampel-sampel DNA (disebut DNA
template) yang sudah dipersiapkan, selanjutnya PCR dijalankan.
Sewaktu proses PCR, primer akan menempel pada urutan-urutan basa
yang komplemen pada DNA templat. Di akhir PCR akan terdapat
sejumlah besar fragmen-fragmen pendek DNA hasil amplifikasi. Apabila
terdapat delesi untuk suatu lokasi templat, akan terjadi polimorfisme.
Dengan elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus apabila
terdapat polimorfisme (oleh karena itu bersifat dominan).

Tugas
1. Berapa unitkan enzim yang digunakan ?
- Bam HI = 10 Unit
- EcoRI = 12 Unit
2. Berapa kali lipatkah enzim yang digunakan dibandingkan dengan
DNA ?
- Pisang
Banm HI

= 17, 45 ng
= 1,75 kali

EcoRI
= 1,45 kali
Ecoli
= 124 ng
Bam HI
= 0,12 kali
EcoRI
= 0,10 kali
- B.Cereus
= 30,39 ng
Bam HI
= 3,04 kali
E.coli
= 2,53 kali
3. Jelaskan apa yang terjadi jika konsentrasi enzim atau DNA terlalu
-

berlebih !
Jika enzim retriksi yang digunakan terlalu banyak maka
enzim akan memotong pita-pita DNA menjadi berupa fragmenfragmen kecil sehingga saat di elektroforesis, maka pita DNA yang
diperoleh tidak sepenuhnya nampak. Jika DNA yang digunakan
terlalu banyak, maka saat di elektroforesis sisa DNA yang tidak
terpotong akan dilihat.
4. Apa Fungsi bovine serum albumin pada reaksi enzim retriksi di
atas ?
Fungsi BSA yaitu untuk mencegah presipitasi, mencegah
terjadinya agregasi, mengumpulkan protein.
5. Apakah yang dimaksud dengan star activity oleh enzim retriksi ?
sekuen apakah yang dipotong EcoRI jika mengalami star activity?
Star activity adalah suatu kondisi dimana enzim retriksi
kehilangan spesifikasinya dala memotong suatu rantai DNA pada
sequens sehingga enzim akan memotong DNA pada tempat yang
salah atau abnormal.
Sekuen yang akan dipotong EcoRI GAATTC

IV.

KESIMPULAN
Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
sebagai berikut :
2. Amplifikasi ini meliputi 3 tahapan besar, yakni tahap denaturasi DNA
94oC selama 3 menit dan 1 menit, tahap penempelan (annealing) 62oC
selama 1 menit, tahap pemanjangan (ekstensi) 72oC selama 90 detik dan
10 menit.
3. Hasil elektroforesis band DNA pisang, B. cereus, dan E.coli tidak

muncul sehingga jarak setiap band dan marker tidak dapat diukur. Hal
ini menunjukkan bahwa ada pengerjaan untuk mendapatkan DNA dari
sampel tersebut kurang teliti, atau pada saat endapannya yang kurang
baik pengerjaannya.