LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

DESAIN PRIMER PCR

DOSEN :
Dr. Ir. BADRUZSAUFARI, M.Sc

OLEH :
NAMA : ONE SAFITRI
NIM

: J1C113047

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI BIOLOGI
BANJARBARU
2016

I.

PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Primer yaitu suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleutida)
yang mempunya urutan nukleutida yang komplementer dengan urutan
nukleutida DNA templat. Primer merupakan komponen PCR yang sangat
menentukan akurasi sekuen DNA yang ingin diamplifikasi. Urutan
nukleutida primer akan menjadi penentu pada bagian mana oprimer akan
menempel pada genom. Jika urutan nukleutidanya tidak sesuai dengan kode
gen yang kita inginkan, maka dapat dipastikan produk PCR yang dihasilkan
akan keliru. Oleh karena itu, sebelum primer yang akan digunakan harus
dipstikan dulu spesifitasnya dengan cara membuat desain primer PCR.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini diharapkan mahasiswa mampu membuat
desain primer PCR dengan aplikasi vector NTI.

II.

METODELOGI
A. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, 12 Mei 2016 pukul
10.00 14.00 WITA bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat
Banjarbaru.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu laptop
A. Prosedur Kerja
Prosedur Kerja Desain Primer PCR
1) Mengimpor Sekuen
Sekuens RNA 16 dari E. coli diunduh.
Sekuen -200 (codingsequence) +200 yang

sudah

ditentukan diimpor ke dalam Vector NTI.

2) Memilih target fragmen
Target fragmen diseleksi, degan memilih Edit>Set
Selection. Pada kotak dialog Set Selection, dipilih region
201-1742.
3) Melakukan Analisis PCR

Untuk melakukan analisis PCR pada fragmen yang

dipilih, dipilih Analysis>Primer Design>Find PCR Primer

pada menu bar.

Pada kotak dialog FindPrimers, Region of Analysis
ditentukan sesuai dengan region fragmen (201-1742),
panjang minimum dan maksimum diubah menjadi 19

dan 25.Tombol OK diklik untuk memulai analisis PCR.

4) Menyimpan Primer PCR ke Database
Primer disimpan ke dalam database dengan mengklik
kanan padabaris sense primer diText Pane, dipilih Save
To Database. Kotak dialog New Oligo akan terbuka,

dengantab Generalaktif.
Nama primer dimasukkan pada kotak nama, misalnya
SP/rRNA 16 E. coli/201-1742, tombol OKdiklik, maka
primer akan disimpan ke dalam database.Prosedur ini

juga dilakukan untuk antisenseprimer.

5) Menambah Situs Enzim Retriksi ke Primer PCR
6) Target fragmen diseleksi, degan memilih Edit>Set
Selection. Pada kotak dialog Set Selection, dipilih region

201-1742.
Kotak dialog Find Primer dibuka dengan memilih
Analysis>PrimerDesign>Find PCR Primer pada menu
bar.Kotak User-Defined Primerdibuka dengan menekan

tombol More pada tab Primer.

Tombol Browse di samping kanan kotak senseprimer
ditekan untuk membuka oligo yang tersimpan di

database.
Senseprimer dipilih dan tombol OK diklik.
Untuk menambatkan situs enzim retriksike ujung 5 'dari
sense primer, tombol Browse pada kotak Attachto 5
terminus diklik. Kotak dialog Choose Database Enzyme
terbuka, bagian MAIN Enzyme dipilih,dicari dan dipilih
situs

enzim

restriksi

BamHI,tombol OKdiklik.

yang

diinginkan,

misalnya

Tombol OK di tengah bawah kotak dialog Find Primer

diklik, diklik OK saat Vector NTI menunjukkan kotak
dialog peringatan, dan diklikOK untuk menimpa hasil
analisis PCR sebelumnya.Prosedur ini juga dilakukan
untuk antisense primer dengan situs enzim restriksi

yang sama.
7) Menyimpan

Produk

PCR

ke

Database

dan

Membuka Jendela Tampilan Baru

Produk PCR yang baru disimpan dengan mengklik
kanan pada folder berlabel # 1 pada Text Pane, dipilih

Save to Data base and Create Window.

Dalam kotak dialog yang terbuka, di kotak nama,
dimasukkan nama produk PCR, dan klik OK. Bagian
tempat penyimpanan dipilih, dan diklik OK. Molekul
disimpan ke database, dan jendela tampilan baru yang
berisi molekul hasil PCR dibuat.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

B. Pembahasan
Pada praktikum ini, aplikasi yang digunakan adalah Vector NTI.
Langkah-langkah yang dikerjakan dalam praktikum yaitu mengimpor
sequen, memilih target fragmen, melakukan analisis PCR, menyimpan
primer ke database, menambah situs enzim retriksi ke primer PCR dan

menyimpan produk PCR ke database garfik akan muncul pada jendela

tampilan baru. Sequen yang digunakan pada praktikum desain primer
PCR

ini

adalah

rRNA

(codingsequence)

16

E.coli

200

dengan

yang

sekuen

sudah

-200

ditentukan.

Fragmen yang dipilih dengan target region 201-1742

yang selanjutnya dilakukan analisis PCR, hasil Primer PCR
disimpan ke Database. Penambahan situs enzim retriksi
ke primer PCR dengan menggunakan Kotak dialog Find
Primer. Pada kotak Attachto 5 terminus digunakan untuk
menambatkan situs enzim retriksi ke ujung 5 sense
primer.

Hasil dari desain primer PCR ini diberi nama

product PCR of RNA 16 E.coli dengan panjang 1515 bp.

Syarat primer yang baik adalah memiliki panjang
basa oligonukleotida antara 18-24 basa, selanjutnya
memiliki urutan basa-basa spesifik untuk melekat pada
DNA cetakan, selain itu tidak terdapat basa-basa yang
berkomplemen pada ujung 3 sehingga terjadi dimer, dan
komposisi basa sitosin dan guanin adalah 50% dari
seluruh basa. Selanjutnya dua primer yang di pasangkan
memiliki suhu melting
yang tidak berbeda jauh.
Faktor yang penting untuk dipertimbangkan dalam
merancang primer adalah struktur sekunder. Sekuen
tunggal

asam

nukleat

sekunder

(hairpin

kehadiran

urutan

loop

mungkin
dan

memiliki

dimer

komplementer

primer)

dalam

struktur
karena

panjangnya.

Hairpin loop atau struktur sekunder, jika ada dapat

sangat mengurangi efisiensi reaksi dengan membatasi
ketersediaan dan kemampuan untuk mengikat ke situs
target
IV.

KESIMPULAN
Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
sebagai berikut :

1. Desain primer yang digunakan yaitu

rRNA 16 E.coli dengan

sekuen -200 (codingsequence) + 200 dengan target

region 201-1742 Sense Prm dan Antisense Prm.
2. Untuk menambatkan situs enzim retriksike ujung 5
'dari sense primer,

situs enzim restriksi yang

digunakan adalah BamHI.