UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.

LABORATORIO DE BIOQUMICA ESTRUCTURAL.

INFORME EXPERIMENTAL DE LA CINETICA ENZIMATICA DE LA UREASA.

CARMONA BARAJAS ANGEL.

PEREZ ALCALA ESTHER.
LOPEZ ARTEAGA FERNANDO.
EQUIPO 1.
GRUPO: 1603
07 DE NOVIEMBRE DEL 2007.
Cintica enzimtica de la ureasa.

Introduccin.
Las enzimas son los catalizadores que determinan el patrn de las transformaciones
qumicas en los sistemas biolgicos. Casi todas las enzimas son protenas que median la
transformacin de diferentes formas de energa; por ser protenas, son susceptibles a los
mismos factores que desnaturalizan a las protenas, como el calor, cidos fuertes, bases
fuertes, metales pesados y detergentes. Pueden tener componentes no proteicos, como
carbohidratos, fosfatos, lpidos, iones metlicos o pequeas molculas orgnicas. Un
sustrato es el compuesto especfico sobre el que acta una enzima afectando la
velocidad de la reaccin.
La cintica enzimtica se encarga de la velocidad de la reaccin y del modo es que sta
cambia en respuesta a cambios en los parmetros experimentales.
Un inhibidor es una sustancia que, cuando interacciona con una enzima, provoca una
disminucin en la actividad cataltica. La inhibicin enzimtica puede ser:
Reversible, si se produce una formacin de un complejo enzimtico inhibidor no
covalente.
Irreversible, si se forma un complejo covalente enzima-inhibidor. Se combinan con o se
destruyen un grupo del enzima que es esencial para su actividad, o aquellos que forman
una asociacin no covalente muy estable. Son tiles para estudiar los mecanismos de
reaccin. Los aminocidos con funciones catalticas clave en el sitio activo, pueden ser
identificados, determinado qu aminocido se ha unido covalentemente a un inhibidor
despus de la inactividad del enzima.
Los inhibidores suicidas son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio
activo de un enzima especfico. Pasa a travs de los primeros pasos de una reaccin
enzimtica normal, a continuacin se convierte en un compuesto muy reactivo que se
combina irreversiblemente con el enzima en lugar de ser transformado en el producto
normal.
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea en amoniaco y bicarbonato, donde el primero se
difunde a travs de la capa semipermeabe de acetato butirato de celulosa interpuesta
entre el reactivo y las capas de indicador para minimizar la difusin de los iones hidroxilo
del colorante.
La funcin de la enzima es degradar la urea en amonaco y dixido de carbono.
La ureasa se produce a partir de Lactobacillus fermentum. Dicha enzima pertenece al
grupo se las ureasas denominadas ureasas cidas. Se activa a pH bajo.
L. fermentum se cultiva en medio sinttico. Despus de la fermentacin se filtra el
cultivo, se lava con agua y las clulas se matan en alcohol de 50 % vol. La suspensin se
seca por liofilizacin o por pulverizacin.
La preparacin consiste en un polvo formado por clulas muertas enteras que contienen
la enzima.
La ureasa no debe contener ni substancias ni microorganismos ni actividades enzimticas
colaterales que puedan:
- ser perjudiciales para la salud,
- ser perjudiciales para la calidad de los productos tratados,
- llevar a la formacin de productos indeseables,
- ocasionar o facilitar un fraude.
La ureasa se presenta bajo forma de polvo cristalino, blanco, inodoro, de un sabor ms
bien dulce.
Las enzimas tiene un pH ptimo en el que su actividad es mxima; a valores superiores o
inferiores de pH la actividad disminuye. Algunas cadenas laterales de aminocidos
pueden actuar como cidos o bases dbiles que desarrollan funciones crticas en el sitio

activo de la enzima que dependen del mantenimiento de un cierto estado de ionizacin,

mientras que en otras zonas de la protena algunas cadenas laterales ionizadas pueden
jugar un papel esencial en las interacciones que mantienen la estructura de la protena.
El intervalo de pH n el que cambia la actividad puede proporcionar alguna pista sobre qu
aminocido est implicado. En el ambiente compacto de una protena, el pK a de las
cadenas laterales de los aminocidos puede cambiar significativamente.
Los efectos de la temperatura en las enzimas con muy complejos. Las enzimas funcionan
lentamente a grados de congelacin, y sus actividades incrementan al aumentar la
temperatura, puede llegar a elevarse lo suficiente como para destruir la actividad
enzimtica. La mayora de las enzimas muestran actividad ptima entre 30 y 40 C. Una
enzima es ms estable a la temperatura si se encuentra en un tejido intacto o si est en
presencia de carbohidratos, pectinas u otros protenas.
Los cambios a la temperatura afectan a:
a) Estabilidad de las enzimas.
b) Cambios en la ionizacin de grupos del sistema.
c) pH del medio
d) Afinidad de la enzima por el sustrato
e) Rapidez de ruptura del complejo E-S
f) Grado de asociacin de las enzimas que tienen ms de una subunidad.
Las enzimas pueden ser inactivadas por el calor, algunas pueden existir en forma
desnaturalizada reversible. Cuando esto pasa, adopta un estado conformacional activo, y
se vuelve a observar la actividad enzimtica.
Dada la mayor energa (temperatura) de las molculas, se sobrepone a la
desnaturalizacin de la enzima debido a su origen proteico. El resultado global de estas
dos interacciones da como resultado un perfil con un mximo de velocidad a una
temperatura dada, denominada temperatura ptima.
La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones controladas
aadindole una enzima a un substrato. S se trabaja con la condicin de que la
concentracin del substrato sea saturante, variando entonces la concentracin de
enzima, se observa que aumenta el producto de la reaccin, a pH y temperatura
constantes.
Si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variando la concentracin de
substrato se obtiene una curva hiperblica. Al principio un aumento de la concentracin
de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue
aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a
disminuir y a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la
velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran
saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de substrato
se define como la velocidad mxima (V) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones
especificadas. La concentracin de substrato (S), a la semivelocidad mxima de reaccin
(V/2) representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una caracterstica para cada
enzima. La inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el
substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de Km, mayor ser la afinidad de la enzima
por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato,
ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
La ecuacin de Michaelis describe la relacin cuantitativa entre la velocidad de reaccin y
la concentracin de substrato [S], si se conoce Vmax o Km:
v=
En donde:

v= es la velocidad de reaccin observada a una concentracin de substrato determinada

[S]
Km= constante de Michaelis en moles/ltro
Vmax= velocidad mxima a concentracin saturante de substrato.
Si v= Vmax/2; entonces
=
Km+[S] = 2[S]
Km =[S]
De tal forma que podemos concluir que Km es igual a la concentracin de substrato a la
semivelocidad mxima de reaccin.
Objetivos.
A partir de la extraccin de la ureasa del frijol de soya, estudiaremos los factores que
alteran a la velocidad de reaccin enzimtica, bajo condiciones ptimas de la ureasa.
Resultados.
Concentracin.
Tubo
Blanco
1
2
3
4
5

0
0.1
0.05
0.1
0.1

Problem
a
0.1
0.5
0.8
1
1.6

Concentracin
2
1.5
1
0.5
0
0.5

1.5

2.5

Concentracin. Blanco

3.5

4.5

Concentracin. Problema

5.5

pH
Tubos

Blanco
1
2
3
4
5

0
0.6
0.6
2
1.2

Problem
a
0
2
2
1.1
0.1

pH
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0.5

1.5

2.5

pH Blanco

Temperatura
C
Blanco
0
20
50
70
90

0.2
0.5
1
0.4
0.2

Problem
a
0.3
1.3
2
1.6
0.8

3.5

pH Problema

4.5

5.5

Temperatura
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

10

20

30

40

50

Temperatura Blanco

Tiempo
Segundo
s
10
20
30
40

Blanco
0.1
0.1
0.1
0.1

60

70

80

90

100

Temperatura Problema

Problem
a
0.3
0.2
0.1
0.1

Tiempo
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
5

10

15

20

Tiempo Blanco

Anlisis de resultados.
Conclusin.
Bibliografa.

25

30

35

Tiempo Problema

40

45

VARGAS RODRIGUEZ YOLANDA MARINA, OBAYA VALDIVIA ADOLFO EDUARDO,

Clculos de parmetros de rapidez en cintica qupimica y enzimtica, UNAM,
Cuautitln, Mxico, 2005.
WISEMAN ALAN, Manual de biotecnologa de las enzimas, Acribia, Espaa, 1991.
NELSON L. DAVID, COX M. MICHAEL, Lehninger, Principios de bioqumica, 4
edicin, Ediciones Omega, Espaa, 2005.