24/07/16

ADN recombinante
Bioseguridad y elADN
Recombinante

Combinacin ar3cial de ADN

de diferentes fuentes
Aparece en 1972
Liberacin de primeros OGMs
en la dcada de 1980
Biologa sint3ca aparece en
la dcada del 2000
Edicin de genomas CRISPR
aparece en la l3ma dcada
hQp://www.shmoop.com/dna/recombinant-
dna.html

Creando ADN recombinante

Edicin de Genomas
Reconocimiento
basado en protenas

Transformacin
Transformacin no
bacteriana
Transfeccin con fagos

Zinc Finger Nucleases

(ZFNs)
TAL Eector
Nucleases (TALENs)
Homing
Endonucleases (HEs)

Reconocimiento
basado en ARN

Clusters of Regulatory
Interspaced Short
Palindromic Repeats
(CRISPRs)

hQp://osp.od.nih.gov/sites/default/les/1_Carroll.pdf

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CRISPR-Cas9

M odificacin

Sistema de dos
componentes
Se basa en
reconocimiento
ARN-ADN
Cas9 es eciente y
si3o-especco
Puede usarse en
mul3plex
hQp://osp.od.nih.gov/sites/default/les/1_Carroll.pdf

Organismos genticamente
modificados
Poseen genes de otras
especies
Genes han sido insertados
ar3cialmente

Uso
s

Phillips, T. (2008) Genetically modified organisms (GMOs): Transgenic crops and recombinant DNA technology.
Nature Education 1(1):213

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Opinin pblica
Argumentos para el rechazo
Se juega a ser Dios
Se manipula a la naturaleza
Es inmoral

Rechazo incrementa cuando se trata de animales

Se exige e3quetar alimentos que con3enen OGMs

1984
1985
1988
1990
1991
1992
1993
1995
1996
1997
1997
1999
2000
2000
2002
2003
2004
2013

La FDA determa que regular los productos de terapia gnica (Rainsbury, 2000).
Un gruipo de trabajo en terapia gnica presenta una primera version de puntos a ser considerados en el documento
Design and Submission of Human Soma3c-Cell Gene Therapy Protocols (Points to consider, 1985).
El RAC aprueba su primer protocolo clnico de inves3gacin, para un studio con un marcador gnico, en medio de la
controversia pues el inves3gador se resiste a proveer la informacin sobre seguridad requerida (Rainsbury, 2000).
Inves3gadores emprenden el primer studio de transferencia gnica aprobado, pra un paciente con SCID
(Immunodeciencia combinada severa) (CouQs, 2011).
El FDA emite un documento gua, Points to Consider in Human Soma3c Cell Therapy and Gene Therapy, actualizado en
1998 (FDA, 1991, 1998).
El director del NIH aprueba una excepcin para el uso compasionado de transferencia gnica en ciertos pacientes, sin la
necesidad de una revision regular del protocolo.
La FDA publica una descripcin de sus mtodos para la regulacin de productos de terapia gnica.
El NIH y el FDA esbozan un acuerdo para que la FDA asuma la revision de protocolos de terapia gnica, siendo el RAC y la
FDA quienes decidan en conjunto cuales son los protocolos que requieren revision pblica por el RAC (Advisory
CommiQee to the Director, 2000).
El director del NIH propone la terminacin del RAC (No3ce of intent, 1996).
Se conrma que el RAC pasa a ser una en3dad de prevencin; el FDA es la nica en3dad capaz de aprobar protocolos de
transferencia gnica y productos de terapia gnica (Advisory CommiQee to the Director, 2000; U.S. Congress, 2000).
Los informes del RAC (RAC minutes) incluyen tablas de resumen sobre los reportes de efectos adversos recibidos.
Jesse Gelsinger mientras par3cipa en una prueba de transferencia gnica; inves3gaciones subsecuentes iden3can
muchas deciancias en la supervision de la inves3gacin.
La FDA anuncia nuevo plan para el monitoreo de pruebas clnicas en terapia gnica para fortalecer la proteccin para los
pacientes par3cipantes.
El NIH rec3ca sus guas y propone la revision de protocolos por parte del RAC antes de la revision de los Comits
Ins3tucionales de Bioseguridad (ICB) y las Juntas de Revisin Ins3tucionales (IRB) (Recombinant DNA research: Ac3on
under the guidelines, 2000).
La unidad administra3ve del FDA que evala terapia gnica, cellular y 3sular es elevada de division a ocina.
La FDA impone un moratorio temporal a los estudios de transferencia gnica usando vectores retrovirales en clulas
madre de sangre. El moratorio es levantado el mismo ao.
El NIH lanza GeMCRIS, una base de datos en la Web que permite el acceso pblico a informacin acerca de transferencia
gnica (NIH, 2004).
El NIH propone revisar las guas para remover el requerimiento de revision por el IBC de ciertos experimentos de
transferencia gnica de bajo riesgo que han sido aprobados por un IBC (NIH Guidelines], 2013).

Regulacin

Berg P, Mertz JE. Personal reflections on the origins and emergence of recombinant DNA technology. Genetics. 2010;184(1):917

Regulaci
n
1972

Se publican detalles sobre la creacin intencional de ADN recombinante (ADNr). Se postergan inves3gaciones hasta
analizar posibles riesgos relacionados con el potencial de causar cancer de virus recombinantes (Swazey et al., 1978).
19721973 En varias conferencias se discute sobre los posibles riesgos de seguridad y lasd opciones de contencin relacionadas
con procedimientos de ADNr (Fredrickson, 2001).
1973
En la conferencia de Asilomar se discute la evidencia de riesgo de cancer y se consideran los problemas de seguridad en
el laboratorio y contencin relacionado con virus modicados gen3camente
1973
Inves3gadores preparan una carta para el Na3onal Academy of Science (NAS) solicitando que se cree un comit que
examine los riesgos y benecios de la inves3gacin sobre ADNr y que proponga guas para este 3po de inves3gaciones.
1974
Julio: Se presentan las recomendaciones del comit, incluyendo la postergacin de la inves3gacin con ciertos 3pos de
ADN recombinante riesgosos; el establecimiento de un comit, por parte del Na3onal Ins3tutes of Health (NIH), para la
prevencin, que evale los riesgos de este 3po de inves3gacin, desarrolle procedimientos que minimicen el riesgo y
desarrolle guas para la inves3gacin; y la convocatoria a una conferencia para discu3r maneras de lidiar con los riesgos
de la inves3gacin con ADNr (Berg et al., 1974).
1974
Octubre: El NIH crea el Comit de Prevencin para el Programa de ADN Recombinante (Recombinant DNA Molecule
Program Advisory CommiQee) luego llamado Recombinant DNA Advisory CommiQee (RAC).
1975
Los par3cipantes de una segunda reunion en Asilomar discute sobre la posibilidad de con3nuar con el moratorio en la
inves3gacin con ADNr. Se propone que la inves3gacin con3nue tomando en cuenta medidas de seguridad acorde con
los riesgos del 3po de inves3gacin especca y con la condicin de que se desarrollen programas de educacin y
entrenamiento en mtodos de contencin (Berg et al., 1975).
1976
El NIH propone guas para la inves3gacin con ADNr y dene las responsabilidades de los inves3gadores, ins3tuciones
de inves3gacin y gobierno (Recombinant DNA research guidelines, 1976).
hQp://osp.od.nih.gov/sites/default/les/NIH_Guidelines.html#_Toc351276354
1980
El primer experiment de transferencia de genes con humanos es realizado por un inves3gador de Estados Unidos en
Italia e Israel. El inves3gador fue censurado por engaar a las agencias reguladoras y se le re3re los fondos del NIH
(Rainsbury, 2000).
1982
Una comisin designada por el president publica el documento Splicing Life, que propone cambios en le supervicin de
la inves3gacin con ADNr (President's Commission, 1982).
1984
El RAC establece un grupo de trabajo en terapia gnica para revisar y responder al reporte de la comisin del president
y establecer procedimientos para la revision y aprobacin de inves3gacin de transferencia gnica.

Guas de la OECD para

bioseguridad en biotecnologa
OECD: The Organisation for Economic Co-operation and Development
Recombinant DNA Safety Considerations, 1986.
Safety Considerations for Biotechnology, 1992 .
Safety Considerations for Biotechnology. Scale-up of crop plants, 1993.
Safety Evaluation of Foods Derived by Modern Biotechnology Concepts and Principles,1993
Safety Considerations for Biotechnology. Scale-up of micro-organisms
as biofertilizers, 1995
Biotechnology for Clean Industrial Products and Processes. Towards
Industrial Sustainability, 1998

hQp://dbtbiosafety.nic.in/guideline/OECD.htm

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Evaluacin de riesgospara OGMs

Riesgos asociados con elhusped

Organismo

Suscep3bilidad del husped

Patogenicidad de la cepa
husped, incluida la virulencia,
la infec3vidad y la produccin
de toxinas
Modicacin de la gama de
huspedes
Estado inmunitario del receptor
Consecuencias de la exposicin

Husped
Donante, caracters3ca introducida
Vector
Informacin sobre el organismo

Uso potencial
Ambiente en el que ser liberado

Riesgos asociados con eldonante

Determinar si el gen insertado con3ene:
Toxinas
Citoquinas
Hormonas
Reguladores de la expresin
gnica
Factores de virulencia o
potenciadores de la virulencia
Secuencias oncognicas
Resistencia a an3bi3cos
Alrgenos

Aplicaciones del ADN

recombinante
Industria

Farmacu3cos
Adi3vos
Qumicos

Agricultura

Mejoramiento de calidad nutricional

Incrementar resistencia a temperatura
Incrementar resistencia a pestes y
enfermedades
Control biolgico

Ambiente

Control de contaminacin
Extraccin de metales pesados
Recuperacin de aceites

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Etapas que presentan riesgo

Formacin.- Creacin del organismo
Lanzamiento.- Salida de los
organismos al ambiente
Proliferacin.- Mul3plicacin,
transporte, modicaciones en el
ambiente, transferencia de
material a otros organismos
Establecimiento.- en un ecosistema
o en otro organismos
Efecto.- en humanos o el ambiente
debido a la interaccin del organismo
con un hospedero o factor ambiental

Etapas que presentan riesgo

Formacin y lanzamiento.- Se pueden evaluar
cuan3cando las probabilidades asociadas con la
magnitud de las consecuencias
rboles de error
Simulaciones

Proliferacin y establecimiento.- Dixcil de evaluar

las interacciones de los organismos con el ambiente
Transporte y des3no en el ambiente
Interacciones en el ecosistema

Efecto.- Se pueden adaptar mtodos

convencionales de epidemiologa y toxicologa

Recomendaciones generales

Recomendaciones para
la industria

Estandarizar tcnicas entre laboratorios

No hay base cienyca para crear leyes especcas para
la u3lizacin de ADN recombinante
La aplicacin de guas no debera impedir el desarrollo
de la tecnologa
Poner nfasis en el desarrollo de mtodos, equipos y
conocimiento para minimizar las barreras entre pases y
maximizar contribuciones bilaterales
Procurar el entendimiento del pblico sobre las
tcnicas de ADN recombinante
Buscar formas de proteger propiedad intelectual

Aplicaciones industriales a gran escala deberan

usar microorganismos de bajo riesgo.
Se debe manejar a los microorganismos bajo
Buenas Prc3cas de Manufactura a Gran Escala
Para microorganismos de riesgo microbiolgico
medio y alto se deben usar mtodos de contencin
correspondientes
Hacer inves3gacin sobre mtodos de monitoreo y
contencin de organismos

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Riesgos en laindustria
Aerosoles

Presencia de microorganismos en el ambiente

Se usan generalmente microorganismos atenuados
Bacterias modicadas no incrementan el riesgo

Sanitarios

Infeccin
Alergia a microorganismos
Alergia a productos
Toxinas

ADN Recombinante

there is no scien3c basis for specic legisla3on to regulate

the use of r-DNA organisms (OECD, 1986)

Tarea
Escoger uno de los Experimentos cubiertos por las
guas del NIH y exponerlo en clase
hQp://osp.od.nih.gov/sites/default/les/NIH_Guideli
nes.html#_Toc351276354

Discusin
Cul es el verdadero riesgo agregado al trabajar
con tecnologa de ADN recombinante?

Recomendaciones para la
agriculturay ambiente
Para hacer evaluacin de riesgo se debe u3lizar la
informacin disponible sobre los efectos de organismos
en humanos y el ambiente
Se debe hacer una evaluacin de riesgo previo a la
liberacin
El desarrollo de aplicaciones basadas en organismos
modicados debe hacerse de manera ordenada
(laboratorio, cmara de crecimiento, invernadero,
campo)
Se debe hacer inves3gacin para mejorar la prediccin,
evaluacin y monitoreo de la aplicacin de OGMs

Trabajando con E.coliy fagos

Cepa&

Vector

Clasificacin* Regla** Comentario

K12 B o C No autotransmisible (tra-)

BSL 1

1. e, j

Mayora de sistemas
comerciales

K12 B o C autotransmisible (tra-)

BSL 2

2. e, j

Algunos sistemas mini

Tn5

Otras

BSL 2

3. e, j

Si no se prueba lo
contrario, se debe
considerar a estas cepas
patognicas

No autotransmisible (tra+)

Bury, J.; Dekeyser, R. 2004. Biosafety in the laboratory. Tercera Edicin. Flanders Interuniversity Ins3tute for
Biotechnology
&K12 B o C son cepas de E. coliatenuadas, no patognicas

*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso

**Revisar Anexo

Supercies fciles de descontaminar

Trabajar cerca del mechero
Inac3var todo material antes de desechar [excepto K12 (mob-)con autorizacin
explcita]
Se debe revisar dos veces al ao si la cepa u3lizada es la correcta

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Ejemplo prctico
Clonar quimosina en pUC18 usando E. coli JM109 como
receptor para realizar procedimientos estndar a pequea
escala
Paso 1. La combinacin vector-receptor es adecuada para
clasicacin de riesgo 1? Determinar si:
E. coli JM109 es del grupo de riesgo 1
PUIC18 puede ser clasicado en grupo 1
Paso 2. Revisar la categora de contencin en el anexo 2
Paso 3. Determinar el riesgo del inserto (quimosina)
Paso 4 Revisar detalles sobre:
El ambiente que va a ser expuesto al organismo
Las ac3vidades y nivel de bioseguridad de este
ambiente
Si se realizan procedimientos no estndar

Trabajando con lneas

celulares modificadas
celula
r

Schizosaccharomyces pombe y
Pichia pastorisson inocuas
Pueden ser u3lizadas en laboratorios BSL1 si
los genes insertados no son peligrosos
Si se u3liza un gen peligros deben ser
manejados en BSL2
Las levaduras pueden esparcirse en el aire
donde sobreviven por largos e 3empo
Pueden contaminar otros cul3vos
Pueden causar alergias
Todo desecho debe ser inac3vado

Trabajando con virusy vectores

viralesmodificados

Sec.viralesen
lalnea

Vector

Clasif.*
Regla**
Com entarios

Clulas primarias de
ratn

No se conoce

No es relevante

BSL2

Se puede clasicar en un nivel

ms bajo solo si se 3enen
pruebas de que no se producen
virus

NIH-3T3

Ninguno

SV40ori

BSL1

4. e, j

No hay riesgo de formacin de

virus

HELA

E6E7 de HPV

SV40ori

BSL1

4. e, j

Secuencias virales en vector y

receptor no producen paryculas
virales

293

E1E2 de
adenovirus

Vector adenoviral sin BSL2

E1

8. e, j

Secuencias virales en vector y

receptor pueden producir virus

Inmortalizadas con
EBV

EBV completo

No es relevante

La clasicacin corresponde a la
del virus en la lnea cel.

BSL2

Trabajando con levaduras

no patognicas
modificadas
Saccharomyces cerevisiae,

*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso

**Revisar Anexo

De acuerdo a su capacidad de producir agentes biolgicos peligrosos (virus)

Dis3ncin entre lneas primarias y establecidas
Primarias: al menos BSL2
Establecidas: Producen virus?

Nunca trabajar con clulas autlogas pues no sern reconocidas por el sistema inmune

Virus modicados se clasican de igual manera que

su contraparte no modicada a menos que el inserto
incremente el riesgo
Se considera la combinacin entre virus y lneas
celulares
Para la generacin de adenovirus y retrovirus se
recomienda BSL2 y BSC clase II
Los desechos deben ser inac3vados o tratados como
residuos mdicos peligrosos
Trabajo con diferentes 3pos de virus no deben ser
realizados en el mismo laboratorio al mismo 3empo
Se debe desinfectar la cabina de bioseguridad antes
de empezar un nuevo experimento
Si el inserto es peligroso (e.g. oncogenes celulares
dominantes), se incrementar el nivel de
bioseguridad, hasta nivel 3 en algunos casos
Hay que tener especial cuidado con vectores virales
que son producto de la combinacin de ms de un
3po de virus

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Trabajando con Agrobacterium

transformada
Cepa

Vector

Clasif.* Regla**

Comentarios

Desarmada

Binario u otro vector

de transf. de plantas

BSL1

1. e, j

Presentan contencin
biolgica

No
desarmada

Binario u otro vector

de transf. de plantas

BSL2

3. e, j

Son patognicas

A.
rhizogenes

Binario u otro vector

de transf. de plantas

BSL2

3. e, j

Son patognicas

*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso

**Revisar Anexo

La mayora de experimentos se llevan a cabo con cepas desarmadas

Cuando no se puede evitar la formaci`on de aerosoles se debe usar un cabina de
bioseguridad clase II
Desechos deben ser esterilizados

Tarea
Existen leyes en la cons3tucin Ecuatoriana
relacionadas con OGMs?
Qu dicen estas leyes?
Consultar sobre un caso donde el uso de GMOs
haya sido perjudicial para el ser humano o el
ambiente

Discusin
Cules son los riesgos de liberar OGMs?

Trabajando con plantas

transgnicas

Cmaras de crecimiento no deben tener salida al

ambiente
Cuando se trabaja en invernadero con plantas que
orecen, se debe evitar el ujo de polinizadores y
el aire interno no debe estar en contacto con el
ambiente
Antes de desechar:
Esterilizar material que pueda
contener A.tumefaciens
Inac3var partes reproduc3vas
Inac3var semillas
Inac3var el suelo que pudo
tener contacto con semillas

Jamiepighin, 2003. The Science Crea3ve Quarterly

Riesgos
Exposicin a nuevos alrgenos
Transferencia de genes de resistencia a ora
intes3nal
Transferencia horizontal de genes de resistencia a
herbicidas, pes3cidas o an3bi3cos (bajo)
Transferencia ver3cal de genes (alto)
Monocul3vos
Monopolios