Mtodos de deteccin Fluoromtrica

Contenido de nuestra muestra

Sin detergentes ni agentes reductores
Con detergentes (sin agentes
reductores)
Con agentes reductores (sin
detergentes)
Con agentes reductores y detergentes

Ensayo
Quant-iT Protein Assay Kit
Qubit Protein Assay Kit
CBQCA Protein Quantitation Kit
EZQ Protein Quantitation Kit
NanoOrange Protein Quantitation
Assay
EZQ Protein Quantitation Kit
EZQ Protein Quantitation Kit

Ensayo

Aplicaciones

Longit
ud de
onda

Sensibilidad y
rango
efectivo

Mecanismo de
accin

Quant-iT

>20 muestras

470/50
0

0,4 - 5 g en
1-20 L

Qubit

1-20 muestras

470/50
0

0,4 - 5 g en
1-20 L

NanoOran
ge

Preelectroforesis

470/50
0

10ng - 10g
por mL

CBQCA

En presencia
de lpidos,
fracciones de
membrana o
detergentes, y
para
lipoprotenas y

450/55
0

10ng - 150g
por mL

Se une al
detergente que
recubre a las
protenas, y a las
regiones
hidrofbicas. Los
restos no unidos
no fluorecen
Se une al
detergente que
recubre a las
protenas, y a las
regiones
hidrofbicas. Los
restos no unidos
no fluorecen
Se une al
detergente que
recubre a las
protenas, y a las
regiones
hidrofbicas. Los
restos no unidos
no fluorecen
Reacciona con los
grupos amino
primarios en
presencia de
cianuro y grupos
tioles. Los restos
no unidos no

Duraci
n de
la
seal
3h

3h

6h

5h

EZQ

pequeos
pptidos
Preelectroforesis

fluorecen
280,
450/61
8

Fluorescamina, MPDF, CBQCA NBD-Cl

50g 5mg
Por mL

Se une
electrostticament
e a los
aminocidos
bsicos, adems
de generar
interacciones
hidrofbicas
adicionales

---

Fluorescamina
Precio: 100mg 91,4 / 250mg 128,5 / 1g 593
Este ensayo puede detectar como mnimo 500 ng de protena. La fluorescencia es
medida en un fluormetro estndar con una longitud de onda a 390nm y emisin a
475nm. La fluorescamina se usa en exceso debido a que tiene una alta tasa de
hidrlisis.

Reaccin

La fluorescamina (intrnsecamente nofluorescente) reacciona con aminocidos

que contienen aminas primarias. Las
aminas primarias existen en las
protenas en el extremo amino y en la
posicin epsilon del aminocido lisina.
Esta reaccin es muy rpida (a
temperatura ambiente dura una fraccin
de segundo) y el exceso de reactivo es
concomitantemente destruido, dando
lugar a un producto no-fluorescente. El
producto
fluorescente
es
estable
durante varias horas, y es proporcional
a la concentracin de aminas.
Aunque todas las protenas contienen un
extremo
amino
terminal,
tienen
cantidades variables de residuos de lisina por lo que cantidades equivalentes de
distintas protenas devolvern seales fluorescentes diferentes.

Ventajas

ste ensayo es sensible (deteccin en el rango del nanogramo) e instantnea, por lo

que el ensayo se lleva a cabo en unos pocos minutos

Desventajas

El ensayo tiene una variacin moderada protena-protena. El reactivo es hidrolizado

muy rpido, por lo que es esencial mezclar rpido para obtener resultados
reproducibles. Como la fluorescamina reacciona con aminocidos que contienen
animas primarias, aquellos buffers que contienen tambin aminas primarias no son
compatibles con el ensayo (Tris y Glicina)

O-phthalaldehdo
Precios: 5g 285 / 945 mL ready to
use 238
Este ensayo es rpido y sensible.
La reaccin se completa en menos
de 1 minuto. En el ensayo
estndar,
el
mnimo
de
concentracin detectable es de 10
g/mL.
En
el
ensayo
en
microplacas, el lmite se extiende
hasta los 50 ng/mL. El Pierces
Fluoraldehyde
Protein/Peptide
assay est basado en el ophthalaldehdo
Reaccin
En la reaccin est implicado el uso de o-phthalaldehdo, que puede reaccionar con
aminas primarias de protenas. Dicha reaccin en presencia de mercaptoetanol
producen un producto azul fluorescente, que tiene un mximo de excitacin a
340nm y un mximo de emisin a 455nm. Este mtodo es bueno para protenas
libres de residuos de tirosina (debido a que interfiere)
Ventajas
El ensayo es muy sensitivo (rango del nanogramo) y la reaccin es instantntea. Al
contrario de lo que pasaba con la fluorescamina, el o-phthalaldehdo es estable. Los
agentes reductores, quelantes y la mayora de detergentes son compatibles con el
ensayo, pero deben ser includos en el blanco. La mayora de buffers y sustancias
constituyentes tambin son compatibles
Desventajas
El ensayo tiene una variacin protena-protena moderada. Los buffers como Tris y
Glicina son incompatibles con el ensayo

CBQCA
Precio: 377 cada 10mg, precio del Kit 366

Este ensayo es lineal y detecta un amplio

espectro de protenas desde los 10 ng a los
150 g. El uso de un buffer con pH
bsico (9 es ptimo) tiene como resultado
una mayor fluorescencia y una mayor
sensibilidad, dado que en este rango los
grupos aminos son ms susceptibles de ser
protonados. Valores por debajo del pH
ptimo
(6-9)
tambin
aportan
resultados aceptables.
Muchos sistemas tamponadores en este
rango de pH son vlidos (PBS, Borato de
sodio).

Reaccin

El 3-(4-carboxybenzoyl) quinoline -2- carboxaldehyde (CBQCA) reacciona con las

aminas primarias en presencia de cianuro y grupos tiol para formar intermediarios
fluorescentes. El producto fluorescente tiene un gran pico de absorcin, con
excitacin a 430-490 nm y emisin a 560 nm

Ventajas

Este compuesto funciona excepcionalmente bien con protenas asociadas a

lpidos. Las lipoprotenas, por ejemplo, pueden ser medidas sin ningn tipo de
extraccin de lpidos o adicin de detergentes. Otro tipo de muestras, como
extractos de tejido cerebral, tambin pueden funcionar bien con CBQCA, debido
a la alta tasa de presencia de lpidos.
El ensayo es lineal para un amplio rango de protenas (10 ng a 150 g). Funciona
bien en ore

Por otra parte, agentes aadidos comnmente a los extractos de protenas,

como Tritn X 100, Cloruro de cesio, glicerol, SDS, o azida de sodio, no
interfieren con el ensayo.

Desventajas

Aquellos buffers que contienen tambin aminas primarias no son compatibles con el
ensayo (Tris y Glicina). Aquellos que contienen una gran concetracion de grupos
tiol (DTT, mercaptoetanol) tambien interfieren en el ensayo. Sin embargo, la
adicin de NEM (N-etilmaeimida), que reacciona con los tioles libres, bloquea
dicha inferferencia, sin interferir el mismo en la determinacin de protenas.
Este ensayo requiere una larga incubacin (por lo menos 90 minutos a temperatura
ambiente)
En kits de casa comercial se presenta de la siguiente forma:
-

ATTO-TAG CBQCA reactivo

Cianuro de potasio
Dimetilsulfxido (DMSO)
BSA como estndar

NanoOrange
Precio: 560 para 2000 ensayos y lectura en microplaca
El NanoOrange de Molecular Probes (Thermo-Fisher) puede detectar protenas por
encima de los 10ng/mL. Este ensayo ofrece adems una baja variabilidad en la
seal por interacciones protena-protena. Para el ensayo, la muestra proteica se
aade al NanoOrange diluido, y la mezcla es calentada a 95C durante 10
minutos. La fluorescencia puede ser medida una vez la temperatura baje a la
ambiente. El producto es estable durante 6h, y la fluorescencia puede ser medida a
cualquier tiempo antes de esas 6h.

Reaccin

El fluorforo, de frmula desconocida, se une a la capa de detergentes que recubre

a las protenas, y a sus regiones hidrofbicas.

Ventajas

El ensayo tiene una baja variabilidad por interacciones protena-protena y es

compatible con agentes reductores.

Desventajas

El ensayo no es compatible con detergentes

Derivados del NanoOrange

Quant-iT Protein Assay 100 ensayos 97 / 500 ensayos 288 / Kit 578

La familia Quant-iT proporciona una serie de reactivos para la cuantificacin de

protenas a travs del uso de lectores de fluorescencia estndar o el fluormetro
Qubit.
Estos ensayos muestran un rango de deteccin entre 0,25 y 5 g, con pequea
diferencia de seal por interacciones protena-protena.
El ensayo tolera bien la presencia de contaminantes comunes como sales,
solventes, agentes reductores (ditiotreitol o 2-mercaptoetanol), aminocidos,
nucletidos y DNA, sin embargo, no es compatible con detergentes.
El kit contiene (para 1000 ensayos de 200 L en microplaca)
-

Reactivo Quant-iT para protenas

Tampn Quant-iT para protenas
Un set de 8 standards de BSA entre 0 y 500 ng/L

El fluorforo muestra mximos de excitacin/emisin a 470/570 nm, y es estable

durante 3 horas a temperatura ambiente.

EZQ
Precio: 560 para 2000 ensayos y lectura en microplaca
El reactivo EZQ proporciona un ensayo rpido y fcil, dado que no interfiere con
detergentes, agentes reductores o urea. Las muestras de protena se ponen en
papeles (incluidos por el distribuidor) de emsayo, tras lo cual son fijadas con
metanol y luego teidas con EZQ. El papel luego se sujeta a una microplaca de 96
pocillos y se introduce en un lector de microplacas. El tiempo completo del
protocolo es de una hora. El rango efectivo de ensayo se encuentra entre los 0,055mg/mL o 0,05-5 g en cada pocillo.
Epicocconona (FluoroProfile Sigma-Aldrich, Deep Purple Total GE
Healthcare, and Lava Cell Fluorotechnics)

El reactivo epicocconona reacciona

reversiblemente con las aminas
primarias de las protenas para dar
lugar a un compuesto que emite a 610
nm