INFORME

Cultivo de Microalgas (Tetraselmis sp)

Cuba Quispe, Jaqueline Bricet

Leon Dominguez, Keith Aaron Carl

Cultivos Menores
Ing. Muoz

Escuela Profesional de Ingeniera en Acuicultura

Facultad de Oceanografa, Pesquera, Ciencias Alimentarias y Acuicultura
Universidad Nacional Federico Villarreal

2016

INTRODUCCIN
El cultivo de microalgas conocido como cultivos de apoyo o cultivos anexos (considerando
en esta definicin tambin al cultivo de zooplancton) es primordial en el desarrollo de los
cultivos principales, esto es, para los moluscos durante todo su ciclo de vida crustceos y
peces en su etapa larvaria Las microalgas son las encargadas del suministro de energa por
medio de biomolculas sintetizadas de elementos menos complejos transformados a travs
de la fotosntesis .Estas microalgas son las que mayormente contribuyen a la produccin de
biomasa en los ocanos, estuarios, lagos y reservorios. La posicin de estos organismos
dentro de las redes trficas forma los pilares o bases de stas debido al aporte de energa de
las biomolculas sintetizadas por estos Hoff y Snell 2001. Es as como hasta el momento
estos microorganismos no se han podido sustituir como fuente nutricional para cualquier
organismo en cultivo (caizares et al 1994).
El cultivo de microalgas tuvo gran importancia para acuicultores, biotecnlogos, eclogos,
etc. por aos y durante la dcada de los noventa, producindose cultivos en forma masiva
con la finalidad de utilizar el producto como suplemento en la dieta alimenticia para
animales (larvas de crustceos, moluscos, peces), como fertilizantes de tierras de cultivo o
materia prima en la obtencin de productos qumicos (pigmentos, lpidos, glicerol).
Actualmente, la aplicabilidad de las microalgas y sus productos ha ido en aumento, dados
los avances generados por estudios bioqumicos y el desarrollo de nuevos sistemas de
cultivo tendientes a la obtencin de mayor produccin y aprovechamiento de su biomasa, la
cual ha sido utilizada en muchos aspectos para beneficio del ser humano, dada su riqueza
en cuanto a sus constituyentes, entre los que destacan los protenicos y lipdicos
El trmino microalga se refiere a aquellos microorganismos que contienen clorofila y otros
pigmentos fotosintticos capaces de realizar fotosntesis, estas especies aportan un alto
contenido nutricional para peces, crustceos y moluscos, adems de ofrecer facilidades de
manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en produccin a gran escala con
fines comerciales. El trmino microalga no tiene sentido taxonmico alguno y dentro del
mismo se incluyen organismos con dos tipos celulares distintos cianobacterias que tienen
estructura celular procariota y las restantes microalgas con estructura celular eucariota;
Pese a las grandes diferencias estructurales fisiolgicamente ambos tipos de microalgas
eucariota y procariota son similares con un metabolismo fotosinttico similar al de las
plantas superiores La reproduccin es generalmente por divisin binaria con tiempos de
duplicacin de una hora o menos para los procariotas cianobacterias y de 8 a 24 horas o
ms para las eucariotas Carpenter 1979 Dawes 1991.
El gnero Tetraselmis contiene aproximadamente ms de 50 especies, y sus caractersticas
pueden variar segn su hbitat. En su ambiente natural pueden encontrrseles en forma
solitaria de nado libre, coloniales, aflageladas y ssiles. Tambin pueden presentarse es
estado de quiste, segn sean las condiciones medioambientales, stos son esfricos y
presentan una pared celular bastante gruesa de naturaleza orgnica, que en algunos casos
puede presentar ornamentaciones.

MARCO TEORICO

Aspectos importantes del cultivo de microalgas:

Parmetros:
Al igual que como cualquier otro organismo vivo las condiciones fsicas tienen gran
influencia en el crecimiento de la microalga. Cada especie presenta un particular intervalo
de temperatura, intensidad de luz, preferencias espectrales, salinidad, bixido de carbono y
oxgeno para la produccin de un mximo crecimiento Tambin se debe mencionar que ms
que la influencia de un solo parmetro es el conjunto de parmetros o que crea
determinadas respuestas en el crecimiento de las microalgas (Caizares 1994).
REQUERIMIENTOS
Luz

Fsicos

Temperatura
Salinidad
pH

COMPUESTOS
VALORES
QUIMICOS
2,000
4,000 lux
15 22C
0.37
79

Redox
C
O, H
Nutritivos
N
P
S
Na, K, Ca, Mg
Fe, Zn, Mn, B, Br, Si
Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb,
Al, et
Vitaminas

CO2CO3
O2H2O
N2NH4+ NO3
PO4
SO4
Sales
Sales

g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
mg/100 ml

Sales

g/100 ml

B12, tiamina,
biotina

g/100 ml

TABLA 1. PARMETROS PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

En esta tabla se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus
valores aproximados. En cada caso habr que estudiar los requerimientos particulares de la
especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que
se van a utilizar, por lo que estos datos son slo orientacin (Kinne, 1979).

Parmetros Fsicos:
La luz:
las microalgas son fotoauttrofas encargadas de convertir la energa luminosa en
metablica por medio de la fotosntesis y sus periodos de exposicin a sta pueden
ser continuos mediante luz artificial, discontinuos periodos de iluminacin
alternados con periodos de oscuridad, tambin con luz artificial o el ciclo natural da
y
noche
(Richmond
1986).
La aireacin:
asegura la distribucin homognea de las clulas y los nutrientes dentro del cultivo
dejndolos disponible para su mejor aprovechamiento, mejora la distribucin de la
luz a las clulas asegurando que permanezcan fotosintticamente activas evitando
que se sedimenten y previene una estratificacin trmica (Richmond 1986).
Temperatura:
las microalgas en las que se est interesado generalmente para su cultivo son las
consideradas como especies tropicales debido a que su crecimiento no sufre
alteraciones en un intervalo de 16 a 27C presentando un ptimo de 24C. Bajas
temperaturas en referencia con el intervalo anterior no matan a la microalga, sin
embargo puede provocar una disminucin de crecimiento, temperaturas arriba de
35C provocaran que la mayora de las microalgas colapsaran (Hoof y Snell 2001).
Salinidad:
El intervalo ptimo para una microalga depender de la especie. Generalmente en
el cultivo a interiores este parmetro no es controlado y se maneja la salinidad
presente en el agua de mar. En un cultivo a exterior la salinidad se convierte en el
parmetro control en el crecimiento de las microalgas (Abalde et al 1995).

Parmetros Qumicos:
Dentro de los requerimientos qumicos necesarios para un buen crecimiento de las
microalgas en cultivo se encuentran entre otras cosas el balance entre los macronutrientes
especficos y los micronutrientes. Un desbalance en la proporcin suministrada de estos
nutrientes invariablemente se manifiesta ya sea como un descenso en el crecimiento o hasta
la detencin del mismo (Hoof y Snell 2001)

 Macronutrientes:
se consideran la fuente de nitratos fosfatos y en el caso de las diatomeas la adicin
de silicatos.
Micronutrientes:
son aquellos que se suministran en poca cantidad trazas en comparacin con los
anteriores
mencionados
pero
no
por
ello
menos
importantes.
Se sabe que en soluciones alcalinas algunos metales se precipitan agentes quelantes
tales como el EDTA, Acido Etilen, diamino tetractico se utilizan para mantener los
metales en solucin hacindolos disponibles para las microalgas (Kaplan et al 1986)
*Un alta o baja excesiva en el pH disminuye el crecimiento de la microalga por el
rompimiento de muchos procesos celulares. Si el nitrgeno no es suministrado al cultivo
como sal de amonio la mayora de las microalgas selectiva mente tomaran el ion amonio
provocando una baja en el pH Si los iones nitratos son eliminados por el alga el pH tiende a
incrementarse pero usualmente controlado por suministro de bixido de carbono del
cultivo.
Contaminacin:
La contaminacin de los cultivos de microalgas puede ser biolgica qumica o fsica, sin
embargo puede afectar de manera particular o ser una combinacin de estos tipos.
Indicadores de Contaminacin Qumica:
Existen diversos patrones indicativos de este tipo de contaminacin, si el cultivo se
ha cado (alta disminucin en el numero celular) recin sembrada la microalga;
conservando sta su color natural; el problema podra deberse a la composicin del
agua, poca circulacin o cambio repentino de temperatura. En este caso las clulas
estn vivas y deben reponerse incrementando la agitacin.
Cuando el cultivo se toma blanco dentro de las 24 h de sembrado probablemente se
debe al cloro residual y otros qumicos disueltos en el agua.
Si el cultivo conserva un color claro despus de 3 4 das observando poco
crecimiento, se puede deber a que la fuente de luz es poca o existe un desbalance en
los
nutrientes.
Cultivos viejos (de 15 o ms das de cultivo) que inician una deficiencia en
nutrientes generalmente se toman turbios y algunos otros levemente claros.
Esfuerzos por recobrar estos cultivos ya carentes de nutrientes son intiles
Indicadores de contaminacin biolgica:
los tipos ms comunes de contaminacin biolgica son excesivos niveles de
bacterias, otras microalgas, protozoarios o macroalgas. Si un cultivo despus de 3
7 das cambia de color y eventualmente se aclara la causa ms comn se debe
considerar provocada por protozoarios. Excesivo crecimiento de bacterias se
manifiesta como agua turbia bajo crecimiento y colapso del cultivo.

Conteo de microalgas:
HEMATOCITMETRO O CAMARA DE NEUBAUER:

Presenta dos cmaras. En la cara superior del portaobjetos se encuentran cuatro

canales longitudinales y un canal transversal central a cuyos lados superior e
inferior existen grabados dos cuadros de 9 mm2 de superficie, subdivididos a su vez
en una cuadrcula ms fina.

Cmara de conteo Neubauer. Utilizada para conocer la concentracin de un cultiv.

Al colocar el cubreobjetos encima de la superficie donde se encuentra grabada la

cuadrcula, existe entre ellos (cuadrcula y cubreobjetos) una distancia fija
(profundidad) de 0.1 mm, misma que viene indicada en el portaobjetos. Por lo
tanto, el volumen de la muestra problema en uno de los cuadros grandes de (1 mm 2
de superficie) ser igual a 1.0 mm2 X 0 1 mm = 0.1 mm3. Las tcnicas de conteo
consideran el nmero de individuos presentes en la muestra de volumen
determinado y comnmente se expresan como nmero de individuos por cada
mililitro. Ya que 1 mL = cm3 = 1000 mm3 y como 1000 mm3 = 10,000 X 0.1 mm3
entonces 1 mL = 10,000 veces el volumen de la muestra, que como ya se vio es
siempre de 0 1 mm3.

MEDIOS DE CULTIVOS

Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de

microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe
sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van
a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las
frmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales.
El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del
medio. En trminos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento
el carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en
cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro,
Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores
cantidades.
Para proporcionar estos nutrientes se debe seleccionar el medio de cultivo que se va a
utilizar. El agua marina es un medio de cultivo ideal para el crecimiento de las microalgas
marinas sin embargo es necesario enriquecerla con nutrientes. Los medios de cultivo son
muy diversos pero todos coinciden en una fuente principal de nitrgeno fsforo y una
mezcla de metales traza con solucin de quelante y vitaminas (Provasoli et al 1957 Stein
1973). Existen diversas formulaciones de medios de cultivo algunos de estos han sido
seleccionados de diferentes laboratorios y utilizados. De igual forma se han formulado
medios especficos para algunas especies de microalgas (provasoli et al 1957). Adems es
prctica comn que a partir de un medio formulado se realicen modificaciones
empricamente hasta que se satisfagan los requerimientos de diversas microalgas utilizadas
para investigacin (Myers 1962).
Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se
ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no
crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las
principales frmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada
por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta frmulas especficas para
familias como la frmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas,
Provasoli 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F.1973; Droop,
1975, 1979; Schoene, 1982, etc.
Existen otros medios que incluyen en su composicin sustancias orgnicas (vitaminas,
aminocidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxtrofas, es decir que no
sintetizan por medio de la fotosntesis este tipo de compuestos y resultan factores que
pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas
Bacillariophyceas.

Medio de cultivo f2 de Guilllard y Ryther (1973)

Formulacin para la preparacin:

*Disolverlos reactivos en 1 litro de agua destilada Solucin de trabajo Usar 1 mL por cada
Iitro de agua marina para cultivo.

*Disolver el reactivo en 1 litro de agua destilada en un recipiente por separado. Usar 1 mL

por cada Iitro de agua marina para cultivo. Silicatos se les considera parte de los
macronutrientes pero solo se utilizan para las diatomeas.

*Para preparar la solucin de trabajo de micronutrientes primero disolver en su totalidad el

EDTA disdica, agregar el cloruro frrico hasta que se disuelva, finalmente agregar 1 mL

de cada una de las soluciones stock de metales traza aforando a 1000 mL de agua
destilada .Usar 1 mL de esta solucin por cada litro de agua marina para cultivo.

*Para preparar la solucin de trabajo de vitaminas, se disuelve la tiamina y se adiciona 1 ml

de la solucin stock de B6 y 1ml de 812 y aforar a 1 litro de agua destilada.
Usar 0,5 ml por litro de agua marina para cultivo .
*OTRA VIA:
Disolver dos ampolletas de DOXEMINAS Genrico Intercambiable 900 mg de 812 198g
deB1
Aforar a 1L agua destilada para preparar la solucin primaria. De sta solucin tomar 1 ml
en 1L de agua destilada para la solucin de trabajo, de la cual se tomaran 0 5 ml por litro de
agua marina a utilizar para cultivo.

OBJETIVOS

Objetivo General:

Conocer los procedimientos adecuados para el cultivo de microalgas en el medio

Guillard y aspectos relevantes para su desarrollo.

Objetivos Especficos:

Adiestrarnos en el trabajo prctico a fines profesionales.

Aprender y conocer la importancia de los medios de cultivo.
Aprender a desarrollar una curva de crecimiento.
Conocer las caractersticas de Tetraselmis sp

MTODO

mbito espacial y temporal

La prctica ejecutada se realiz los das 13- 24 de junio en el laboratorio de Cultivos
Menores en la Facultad de Oceanografa, Pesquera, Ciencias Alimentarias y
Acuicultura.

Unidad de muestra:
Se trabaj con muestras suministradas por el laboratorio de Cultivos menores.

Materiales:

Vidrio:

Tubo de ensayo
Matraz Erlenmeyer.
Embudo de vidrio.
Bagueta.
Pipetas.
Mechero de alcohol.
Porta y cubre objetos.
Vasos precipitados.
Cmara neubauer.

Equipos:

Mechero Fisher.
Microscopio.
Autoclave.
Estufa.

Reactivos:
*Para preparara el medio guillard es necesario agua destilada.
Cantidades requeridas para nutrir el agua de mar:

Nitrato: NaNO3 (10 ml/1L)

Fosfato: NaH2PO4.6H2O (10 ml/1L)
Trazas de metales: FeCl3.6H2O (10 ml/1L)
Vitaminas: (0,5 ml/1L)

Otros:

Frascos de vidrio.
Propipeta.
Asa de siembra.
Gradillas.
Algodn.
Fuentes.
Paliglobos.
Lugol.

Agua de mar.
Botella.
Papel filtro.
Papel aluminio.
Rotuladores.
Manguera.
Llave de unin.
Papel toalla.

Procedimientos:

Preparacin del medio guillar:

Pesar en la balanza analtica y disolver las cantidades requeridas de reactivos para
llevar acabo la elaboracin del medio guillard.

Preparacin del agua de mar con el medio guillard:

1 Desinfectar la mesa de trabajo y

ambiente; en el caso de la mesa se
desinfectara usando algodn y alcohol
sobre toda la superficie, para que el
ambiente este desinfectado se us el
mechero Fisher durante toda el
proceso.

metales n04 y vitaminas n05.

2 Para la preparacin del medio se

utiliza un vaso de precipitado de 500
ml lleno con agua de mar ya
previamente filtrada y esterilizada. De
los reactivos preparados se proceden a
echarlos en orden y cantidad
indicados en la imagen n01, luego se
tapa con papel aluminio.
*en caso de diatomeas se le adiciona
el silicato 5ml y el orden para este
reactivo seria el n03, trazas de

Imagen n 01. Se muestra la cantidad, los reactivo

y el orden en que se deben agregar al vaso
de precipitados.

3 Se prepar por cada alumno 2 tubos de ensayo con cierta cantidad del agua de
mar tratada y nutrida. Se sembr en estas a partir de una muestra otorgada por la
profesora, la especie fue Tetraselmis sp. y se sembr usando una varilla de cobre, y
directamente de tubo a tubo, respectivamente a cada uno de los 2 tubos.

*Toda esta accin se realiz cerca de un mechero encendido para mantener el rea
estril y habiendo tambin esterilizado la zona de trabajo previamente.

4 Se sellaron los tubos con un tampn de algodn y se colocaron en la gradilla, la

cual fue expuesta bajo la luz artificial de un fluorescente durante toda una semana y
requiri adems, el continuo movimiento diario para la homogenizacin de
nutrientes y oxgeno.

Reproduccin de la cepa en Erlenmeyer:

5 Pasada la semana de la primera etapa de siembra, se seleccion el tubo de ensayo

con mayor turbidez (mayor contenido de microalgas visiblemente) y se realiz la
operacin de siembra; transportando una pequea parte de la cepa del tubo a un
Erlenmeyer de 250 ml con cierta cantidad de agua de mar nutrida de la misma
manera que en la primera fase.

6 Se elabor un tampn de algodn y se mantuvo nuevamente bajo luz artificial

hasta la semana prxima que se realiz el cultivo.

*Antes de realizar el procedimiento se desinfecta la mesa usando algodn y

alcohol sobre toda la superficie (eso se realiza por cada alumno ), para que el
ambiente este desinfectado se us el mechero Fisher durante toda el proceso, se

requiri el continuo movimiento diario para la homogenizacin de nutrientes y

oxgeno.

Siembra Final:

7 En la botella de 2,5 L ( debe estar llena y sin abrir), se vaca el contenido, se

rotula con la especie y los nombres de los encargados del cultivo.

8 Con el Mechero Fisher encendido y la mesa de trabajo limpia, se procede a

llenar la botella con 1 litro del medio Guillar quemando antes la boquilla del vaso
con el mechero y luego verter el contenido, 1 litro aproximadamente

9 Se hacen las conexiones respectivas con las mangueras y las uniones

10 Se hace el cultivo de la especie en la botella y se pasa a conectarlo a la fuente

de oxgeno. A partir de aqu se har el conteo diario.

11 El conteo se realiza retirando el paliglobo, sacando un poco de , muestra y

ponindolo en el frasco, agregar lugol; todo este proceso se hace con el mechero de
alcohol encendido y cerca de la boquilla de la botella, el paliglobo usado deber
estar esterilizado con agua hirviendo y se usara una sola vez.

12 En la botella de 2,5 L ( debe estar llena y sin abrir), se vaca el contenido, se

rotula con la especie y los nombres de los encargados del cultivo.

13 Con el Mechero Fisher encendido y la mesa de trabajo limpia, se procede a

llenar la botella con 1 litro de agua de mar nutrida quemando antes la boquilla del
vaso con el mechero y luego verter el contenido, 1 litro aproximadamente.

14 se procedi a hacer la siembra en la botella tomando el Erlenmeyer de la cepa

anterior y echando una poca cantidad de cepa dentro de la botella.

15 Se acondicion un sistema de oxigenacin mediante mangueras; se elabor un

tampn con un paliglobo en medio para la botella, el cual se conect al sistema de

oxigenacin. A partir de aqu se har el conteo diario

Conteo diario:

*Se inici el conteo desde el mismo da de siembra, para saber cul fue la densidad
inicial sembrada de la microalga.

16 Con un paliglobo previamente desinfectado con agua caliente; se procedi

retirar le paliglobo con algodn y a tomar una muestra de la botella sembrada,
usando el paliglobo a modo de pipeta, el cual retena cierta cantidad de muestra y
esta fue puesta en un frasco de vidrio.

17 A la muestra obtenida se le agreg unas gotas de lugol, todo este proceso se

hace con el mechero de alcohol encendido y cerca de la boquilla de la botella.
Se coloc unas gotas de la muestra con lugol en la cmara neubauer para su conteo
en
el
microscopio.
18 Despus de terminado el conteo los alumnos deban lavar los utensilios y
dejarlos tal y como estaban, acto que fue repetido durante las dos semanas de la
siembra, en los que se anotaron las densidades y los das para luego poder realizar la
curva de crecimiento de la especie cultivada.

Resultados

Del conteo total se obtuvieron los datos mostrados en la tabla n2 a continuacin:

Tabla2 . DATOS OBTENIDOS POR EL CONTEO.

Das
de
Junio
13
14
15
16
17
20

organism
o
10^6/ml
2,22
3,11
13
15,6
39,1
43,22

21
22
23
24

63,33
71,56
46,78
38,11

La curva de crecimiento para estos datos se presenta anexada en el Grfico 3 al final

del presente informe.

Conclusiones

Se presentan 3 fases en la curva de crecimiento de las microalgas, la primera es la

fase inestable de siembra, donde la densidad de microalgas cultivadas tiende a caer
pequeamente a corto plazo; la segunda fase es la de reproduccin, en la cual las
microalgas alcanzan su mximo nivel de productividad y la tercera fase de
limitacin y decaimiento, donde las microalgas han excedido la poblacin limite y
el consumo de nutrientes por parte de estas hace que reduzca drsticamente los
mismos nutrientes y el oxgeno.

Se debe considerar que la fase ms conveniente para cosechar las microalgas es la

segunda fase en la que su productividad es mxima, y no cuando su densidad es
mayor.

Referencias Bibliogrficas

Torrentera, B. L. y A.G.J. Tacon.1989. La produccin de alimento vivo y su

importancia en acuacultura una diagnosis. FAO. Documento de campo 12.
GCP/RLA/075/ITA, Roma. 120 pp.
ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/y5720s/y5720s02.pdf
http://www.clave21.es/files/articulos/C01_CultivoMicroalgas.pdf
http://www.revbiolmar.cl/escaneados/153-287.pdf
http://www.fao.org/docrep/009/y5720s/y5720s07.htm
http://www.urp.edu.pe/pdf/biologia/TESIS%20Tetraselmis.pdf
http://biblio.uabcs.mx/tesis/TE1366.pdf
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf
http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/1251/Capitulo6.pdf
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de
%20microorganismos.pdf

ANEXOS

Relacion del crecimiento de Tetraselmis

70
60
50
Dias de Junio organismo 10^6/ml

40

Polinomica

30
20
10
1

0
12

13

2
14

3
15

4
16

5
17

18

19

20

7
21

8
22

9
23

10

24

En la imagen se muestra la relacin del crecimiento de Tetraselmis en 10 das