Cabrera Daniel 2526d

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE
Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Biologa Celular y Molecular
Laboratorio de Diferenciacin Celular y Patologa
IMPACTO DE LA FIBROSIS EN LA FISIOLOGA

MUSCULAR ESQUELTICA: PAPEL DEL
ANDROGRAFLIDO
DANIEL ALEJANDRO CABRERA GARCA
Memoria de investigacin entregada a la Facultad de Ciencias Biolgicas de la

Pontificia Universidad Catlica de Chile en cumplimiento de los requisitos para optar
al grado de Doctor en Ciencias Biolgicas mencin Biologa Celular y Molecular
Director de Memoria: Dr. Enrique Brandan
2012
INDICE

INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ 5

INDICE DE TABLAS .......................................................................................................... 8
ABREVIATURAS ................................................................................................................ 9
RESUMEN .......................................................................................................................... 11
ABSTRACT ........................................................................................................................ 14

INTRODUCCIN .............................................................................................................. 17
Distrofia muscular de Duchenne ....................................................................................... 18
El ratn mdx: modelo de la DMD ..................................................................................... 20
Dao y reparacin muscular ............................................................................................. 21
Terapias para tratar las distofias musculares .................................................................... 24
Relacin entre factores pro-fibrosantes y pro-inflamatorios en la DMD. ........................ 26
HIPTESIS......................................................................................................................... 35
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 35
OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................ 35
1. Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos de TGF y
CTGF en el msculo esqueltico. ................................................................................. 35
1.1. Evaluar el efecto del andrograflido sobre la expresin de CTGF y TGF en
msculos distrficos. ................................................................................................. 35
1.2. Determinar el efecto del andrograflido sobre los niveles de MEC e inflamacin
en msculos distrficos. ............................................................................................ 35
1.3. Estudiar el efecto del andrograflido en la inflamacin y fibrosis muscular
inducida por TGF. ................................................................................................. 35
1.4. Evaluar el efecto del andrograflido en la inflamacin y fibrosis muscular
inducida por CTGF. ................................................................................................... 35
2. Determinar si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta la migracin
celular, la eficiencia de las terapias celulares y la funcin muscular. ........................... 36
2.1. Estudiar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido facilita la
migracin celular en el msculo esqueltico. ............................................................ 36
2.2. Determinar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido aumenta el

nmero de fibras capaces de revertir distrofina ......................................................... 36
2.3. Evaluar el efecto del andrograflido en la fuerza muscular ............................... 36
MATERIALES Y METODOLOGA ............................................................................... 35
1. Materiales .................................................................................................................. 37
1.1
Material Biolgico.............................................................................................. 37
1.1.1
Cepas de Bacterias ...................................................................................... 37
1.1.2
Vectores y plasmidios. ................................................................................ 37
1.1.3
Lneas Celulares Eucariticas ..................................................................... 38
1.1.4
Animales de Experimentacin .................................................................... 39
1.2
Anticuerpos ........................................................................................................ 39
1.3
Partidores para RT-PCR en tiempo real ............................................................. 41
1.4
Material Anestsico y Quirrgico ...................................................................... 42
1.5
Material de Cultivo Celular ................................................................................ 42
2.1
Reactivos Generales ........................................................................................... 44
2.2
Reactivos para Histologa e Inmunofluorescencia ............................................. 44
2.3
Reactivos de Biologa Molecular ....................................................................... 45
2.4
Marcadores de Masa Molecular ......................................................................... 45
2.5
Enzimas Comerciales ......................................................................................... 46
2.6
Sistemas Comerciales ......................................................................................... 46
2.7
Medios de Cultivo Celular ................................................................................. 47
3. Metodologa ............................................................................................................... 48
3.1
Cultivo Celular ................................................................................................... 48
3.1.1.
Mantencin de Lneas Celulares ................................................................. 48
3.1.2.
Diferenciacin de clulas C2C12................................................................ 48
3.1.3
Transfeccin Transiente en Clulas Eucariontes ........................................ 49
3.2.
Ensayos enzimticos .......................................................................................... 50
3.2.1.
Ensayo de luciferasa ................................................................................... 50
3.2.2.. -galactosidasa ............................................................................................ 50

3.3.
Ensayo de Northern ............................................................................................ 51
3.3.1. Electroforesis de RNA en geles de agarosa y transferencia a membranas de

Nytran 51
3.3.2.
Marcacin radioactiva de la sonda de DNA ............................................... 52
3.3.3.
Hibridacin y lavados ................................................................................. 52
3.4
Amplificacin y Purificacin de Adenovirus Recombinantes ........................... 53
3.5.
Preparacin de Lisados Celulares ...................................................................... 54
3.6.
Genotipificacin Ratones mdx ........................................................................... 54
3.7.
Infeccin de Animales con Adenovirus Recombinantes.................................... 55
3.8.
Inyeccin intramuscular de TGF ................................................................... 55
3.9.
Tratamiento con andrograflido y PARACTIN. ................................................ 56
3.10.
Inyeccin intramuscular de fibroblastos. ........................................................ 56
3.11. Induccin de fibrosis por ejercicio en ratones mdx .............................................. 57

3.12.
Trasplante intramuscular de miobloastos ....................................................... 58
3.13.
Ciruga y Toma de Muestras .......................................................................... 62
3.14.
Obtencin de Homogenizado Total de Msculo ............................................ 62
3.15. Determinacin de Protenas en Lisados Celulares y en Homogenizados de

Msculo. ........................................................................................................................ 63
3.16.
Hibridacin tipo Western Blot ........................................................................ 63
3.17.
Extraccin de RNA en msculo esqueltico y sntesis de cDNA .................. 64
3.18.
RT-PCR en tiempo real .................................................................................. 65
3.19.
Ensayos de electrofisiologa ........................................................................... 66
3.20.
Ensayos de Inmunofluorescencia ................................................................... 67
3.21.
Ensayos de Inmunohistoqumica .................................................................... 68
3.22.
Tinciones histolgicas .................................................................................... 68
3.22.1.
Tincin de Hematoxilina y Eosina .......................................................... 68
3.22.2.
Tincin de Rojo de Picrosirio.................................................................. 69
3.23.
Anlisis Estadstico......................................................................................... 69
RESULTADOS ................................................................................................................... 70
1.-Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos de TGF y
CTGF en el msculo esqueltico. ..................................................................................... 70

msculos distrficos. ..................................................................................................... 70
en msculos distrficos. ................................................................................................ 79
inducida por TGF. ..................................................................................................... 86
2.- Determinar si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta la migracin
celular, la eficiencia de las terapias celulares y la funcin muscular.............................. 104
2.1. Evaluar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido facilita la migracin
celular en el msculo esqueltico. ............................................................................... 105
nmero de fibras capaces de revertir distrofina .......................................................... 106
2.3. Evaluar el efecto del andrograflido en la fuerza muscular ................................. 109
DISCUSIN ...................................................................................................................... 115
Expresin de TGF y CTGF en msculos distrficos: papel del andrograflido ........ 117
TGF y CTGF como pro-inflamatorios ....................................................................... 120
Inflamacin en el msculo distrfico: Papel del andrograflido sobre las clulas
inflamatorias ................................................................................................................... 123
Otros agentes reguladores de la inflamacin y la fibrosis en msculos distrficos....... 127
Impacto de la fibrosis en la migracin celular ................................................................ 129
Impacto de la fibrosis en la eficiencia de las terapias celulares ...................................... 132
Impacto de la fibrosis en la fuerza muscular .................................................................. 133
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 136
REFERENCIAS ............................................................................................................... 138

INDICE DE FIGURAS
Figura 1. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico
de animales distrficos mdx
de animales distrficos mdx.
de animales distrficos mdx.
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresin de TGF en msculos
distrficos.
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el numero ncleos positivos para la protena
smad 3 fosforilada en ratones mdx.
Figura 6. El ejercicio induce un aumento en la expresin de CTGF en msculos
distrficos.
Figura 7. El andrograflido no afecta la induccin de TGF en ratones mdx ejercitados.
Figura 8. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF en msculo de ratones mdx
ejercitados.
Figura 9. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 10. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 11. El andrograflido disminuye el numero de macrfagos en el msculo distrfico
de ratones mdx
Figura 12. El andrograflido disminuye el numero de clulas inflamatorias en el msculo
distrfico de ratones mdx
Figura 13. El andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos.
Figura 14. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos
ditsrficos.
Figura 15. El andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx.
Figura 16. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF por TGF.

Figura 17. El andrograflido inhibe la induccin de protenas de MEC por TGF en
clulas musculares.
Figura 18. El andrograflido inhibe la insuccin de colgeno tipo III por TGF.
Figura 19. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III por TGF.
Figura 20. El andrograflido inhibe la induccin de protena de MEC por TGF en
miotubos y fibroblastos.
Figura 21. El andrograflido inhibe la inflamacin inducida por TGF en el msculo
esqueltico
Figura 22. El andrograflido no afecta la fosforilacin de smad-3 inducida por TGF en
clulas musculares.
Figura 23. El andrograflido no afecta la translocacin nuclear de smad-3 inducida por
TGF en clulas musculares.
Figura 24. TGF es capaz de activar la ruta de activacin cannica de NFkB en clulas
musculares C2C12.
Figura 25. TGF induce la actividad de un reportero para NFkB en clulas musculares
C2C12.
Figura 26. El andrograflido inhibe la formacin de fibras de estrs inducida por CTGF en
clulas musculares.
Figura 27. El andrograflido inhibe el aumento de colgeno tipo III inducido por CTGF en
el msculo esqueltico.
Figura 28. CTGF induce fibrosis e inflamacin en el musculo esqueltico y el
andrograflido es capaz de inhibir estos efectos.
Figura 29. CTGF induce un aumento en la infiltracin de macrofgos en el musculo
esqueltico y el andrograflido inhibe este efecto.
Figura 30. El andrograflido disminuye principalmente el nmero de Macrfagos M1
inducidos por CTGF en el msculo esqueltico.
Figura 31. La fibrosis inhibe la migracin celular y el andrograflido revierte este efecto.
Figura 32. Las clulas migratorias se encuentran preferentemente en areas con bajo
contenido de Colgeno tipo III.
Figura 33. El tratamiento previo con andrograflido aumenta la eficiencia de la terapia
celular.
Figura 34. El andrograflido induce un aumento en la fuerza en msculos distrficos.
Figura 35. El andrograflido induce un aumento en la fuerza en msculos distrfico.
Figura 36. El andrograflido mejora el performance de los animales distrficos frente al
ejercicio.
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizados...40
Tabla 2. Lista de partidores utilizados para la expresin de genes a travs de RT-PCR en

tiempo real.41

ABREVIATURAS

AraC
Citosina -D-arabinofuransido
BCA
Acido bicinconnico
BCIP/NBT
5-bromo-4-cloro-3-indolil-1-fosfato/azul nitro tetrazolium
cDNA
DNA complementario
CTGF
Factor de crecimiento de tejido conectivo
dCTP
Desoxicitosntrifosfato
DEPC
Di-etilpirocarbonato
DMEM
Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO
Dimetilsulfxido
DNA
Acido desoxirribonucleico
dTs
Desoxitimidinas
MEC
Matriz extracelular
NFB
Factor nuclear kappa B
EDTA
Acido etiln-diamino tetra-actico
FAK
Quinasa de adhesin focal
FITC
Tetrametil-fluoresceina isotiocianato cristalina
kb
Kilobase
kDa
Kilo Daltones
Luc
Luciferasa
MAP
Quinasa activada por mitgenos
mRNA
cido ribonucleico mensajero
PMSF
Fenil metil sulfonil metilo
RNA
cido ribonucleico
RT-PCR
Transcripcin reversa y reaccin en cadena de polimerasa
SDS
Dodecil sulfato de sodio
SFB
Suero fetal bovino
TA
Msculo tibialis anterior
TCA
Acido tri-cloractico
TGF-
Factor de crecimiento transformante tipo
TNF-
Factor de necrosis tumoral tipo a
TRITC
Tetrametil-rodamina isotiocianato cristalina
UV
Ultravioleta
RESUMEN
La fibrosis se caracteriza por una acumulacin excesiva de componentes de la
matriz extracelular (MEC) y es el resultado De una cascada de eventos posteriores a una
lesin y que resulta en la formacin de cicatrices permanentes. En el msculo esqueltico la
fibrosis est mayormente asociada a las distrofias musculares. La ms severa de estas, es la
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), patologa gentica recesiva ligada al cromosoma
X, caracterizada por la ausencia de la protena distrofina. El modelo murino de la DMD es
el ratn mdx. En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para la DMD. Se han
estudiado diversas estrategias para intentar re-expresar la protena distrofina en el musculo
de los pacientes y del ratn mdx, mediante la utilizacin de vectores virales como tambin
mediante terapias celulares utilizando diferentes tipos celulares con potencial miognico,
sin embargo, todas ellas han mostrado una baja efectividad debido a la escasa o nula
incorporacin de los vectores en el tejido muscular. El grupo de Giulio Cossu, demostr
que clulas con potencial miognico pero que sobre-expresan la enzima MMP-9 han
mostrado una efectividad significativamente mayor. Este resultado puso de manifiesto que
la fibrosis presente en los msculos distrficos dificulta la incorporacin celular en el
tejido. Dentro de los factores involucrados en la induccin de fibrosis en los msculos
distrficos encontramos el factor de crecimiento transformante tipo (TGF-) y el factor
de transcripcin NFB. Un elemento comn es el factor de crecimiento de tejido conectivo
(CTGF), el cual es inducido por TGF y adems presenta en su promotor sitios de unin
para NFB. Se ha demostrado que CTGF es capaz de mediar la accin pro-fibrosante de
TGF. Sin embargo, los mecanismos por los cuales NFB y TGF colaboran en la
regulacin de la expresin de CTGF no han sido dilucidados. Un potente inhibidor de la

actividad de NFB es el anti-inflamatorio de origen natural, andrograflido, el cual ha sido
utilizado para combatir la esclerosis mltiple y la artritis reumatoide, sin presentar efectos
secundarios nocivos.
En esta tesis nos planteamos como hiptesis que: El andrograflido inhibe la
fibrosis, la cual afecta la fisiologa muscular en un mecanismo que involucra a CTGF
y TGF. Cuyos objetivos generales fueron: Determinar el efecto del andrograflido
sobre la expresin y los efectos de TGF y CTGF en el msculo esqueltico y evaluar
si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta la migracin celular, la
eficiencia de las terapias celulares y la funcin muscular.
Mediante el modelo de induccin de fibrosis por ejercicio en ratones mdx,
estudiamos la regulacin de la expresin de las citoquinas CTGF y TGF, observando que
el andrograflido es capaz de inhibir la expresin de CTGF, sin afectar la de TGF
Dentro de este contexto, demostramos que tanto TGF y CTGF tienen actividad proinflamatoria en el msculo esqueltico y que TGF puede activar a NFB en clulas
musculares. Mediante ensayos in vivo, mostramos que la fibrosis disminuye
considerablemente la migracin celular y que estos efectos pueden ser revertidos mediante
la utilizacin del andrograflido. Del mismo modo, demostramos que el tratamiento previo
con andrograflido, de msculos distrficos aumenta en un 300% el nmero de fibras
musculares capaces de re-expresar distrofina en respuesta a protocolos de terapia celular y
que la inhibicin de la fibrosis, por si sola provoca efectos benficos en la fisiologa
muscular desde el punto de vista de la generacin de fuerza contrctil y de la resistencia de
animales distrficos a protocolos de ejercitacin extenuante.
ABSTRACT
Fibrosis is characterized by an excessive accumulation of extracellular matrix components

(ECM), as a result of a cascade of events after a lesion, which end-up in the formation of a
permanent scar. In the skeletal muscle, the fibrosis is generally associated to muscular
dystrophies. The most severe of these diseases is the Duchenne Muscular Dystrophy
(DMD), a genetic pathology linked to the X chromosome, characterized by absence of
dystrophin. The murine model of DMD is the mdx mice. At this moment does not exist an
effective treatment for DMD. Diverse strategies have been studied attempting to re-express
dystrophin in both patients and mdx mice muscles, using viral vectors as well as cellular
therapies with cell types with miogenic potential. However, all of them have shown a
reduced efficiency due to the few or nule incorporation of vectors in the muscular tissue.
Giulio Cossu and co-workers, demonstrated that cells with miogenic potential
overexpressing the enzyme MMP-9 are significantly more effective. These findings
unveiled that fibrosis in the dystrophic muscles difficult cellular incorporation at the tissue.
From the factors involved in the induction of fibrosis at the dystrophic muscles, we found
the transforming growth factor type (TGF-) and the transcription factor NFB. A
common element is the connective tissue growth factor (CTGF), which is induced by
TGF and also have NFB binding sites at its promoter. It has been demonstrated that
CTGF mediates the pro-fibrotic effects of TGF. However, the mechanism by which
NFB and TGF collaborates in the regulation of the CTGF expression have not been yet
elucidated. A potent inhibitor of the NFB activity is the natural derived anti-inflammatory,
andrographolide, which has been used to treat multiple sclerosis and rheumatoid arthritis,
without side effects.
In this Thesis we propose the following hypothesis: The andrographolide
inhibits the fibrosis, which affects the muscle physiology in a mechanism that involves
CTGF and TGF-. The goal of this thesis work was: To determine the effect of
andrographolide over TGF- and CTGF in the skeletal muscle. And also evaluate if
the modulation of fibrosis by andrographolide affects cellular migration, efficiency of
cell based therapies and muscle function.
By using the exercise-induced model of fibrosis in mdx mice, we studied the
regulation CTGF and TGF expression, observing that andrographolide is able to inhibit
CTGF expression, without affecting the TGF expression. On this context, we
demonstrated that TGF, as well as CTGF, have pro-inflammatory activity in the skeletal
muscle and TGF can activate NFB in muscle cells. In in vivo assays, we show that
fibrosis significantly decreases the cell migration, effect that can be reverted by
andrographolide treatment. Moreover, we demonstrated that prophylactic treatment of
dystrophic muscles with andrographolide, increases in 300% the number of muscular fibers
able to re-express dystrophin in response to cell based therapies. Besides, the inhibition of
fibrosis by andrographolide per se, has benefic effects in the muscle physiology increasing
contractile force and performance of mdx mice in exercise protocols.
INTRODUCCIN
La fibrosis fisiopatolgica, se caracteriza esencialmente por una acumulacin

excesiva de componentes de la matriz extracelular (MEC), particularmente colgeno, y es
el resultado final de una cascada de eventos posteriores a una lesin de los tejidos y que
resulta en la formacin de cicatrices permanentes.
La fibrosis puede afectar la funcin de los tejidos y causar enfermedades crnicas en
una gran variedad de rganos y tejidos vitales como el renal, heptico, pulmonar, muscular,
etc. Pero, a pesar de la amplia gama de tejidos susceptibles a la fibrosis, toda las reacciones
fibrticas comparten mecanismos celulares y moleculares comunes, tales como la
degeneracin celular del tejido, la infiltracin de clulas inflamatorias, la persistencia de la
inflamacin en los tejidos y la proliferacin de clulas tipo fibroblastos (Serrano y cols.,
2011). La interaccin y el desequilibrio de diferentes tipos de clulas sustenta la produccin
de numerosos factores de crecimiento, enzimas proteolticas, factores angiognicos y
citoquinas fibrognicas, que en conjunto perturban el microambiente del tejido daado y
estimulan la deposicin de elementos del tejido conectivo que progresivamente van
remodelando, destruyendo y sustituyendo a la arquitectura normal del tejido. Sin embargo,
a pesar de muchos elementos en comn, tambin hay diferencias importantes entre los
distintos sistemas y es as como la identidad de algunos de los factores celulares que inician
y contribuyen a las vas fibrognicas an se desconocen. Por lo tanto, mejorar nuestra
comprensin de los factores y mecanismos involucrados en este proceso es crucial para el
desarrollo de estrategias de tratamiento para estas enfermedades.
Distrofia muscular de Duchenne
En el msculo esqueltico la fibrosis est mayormente asociada con un grupo

clnico y molecularmente heterogneo de enfermedades, conocidas como distrofias
musculares. Fenotpicamente, estas enfermedades se caracterizan por la inflamacin y el
debilitamiento del tejido muscular, el cual compromete la movilidad de los pacientes
pudiendo dejarlos confinados de por vida a la utilizacin de una silla de ruedas (Amato and
Griggs, 2011; Durbeej and Campbell, 2002). La ms severa de las distrofias musculares, es
la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Es una patologa gentica recesiva ligada al
cromosoma X, en la cual la ausencia de la protena distrofina se debe a una mutacin en el
gen que la codifica (Ervasti y Campbell, 1993).
La DMD tiene una incidencia de 1/3500 nios varones nacidos (Emery, 2002)
provoca degeneracin muscular progresiva que conduce a la muerte alrededor de la
segunda o tercera dcada de vida (Blake y cols., 2002). Los nios comienzan con debilidad
muscular proximal lo cual les dificulta pararse, luego deambular y, alrededor de los 12
aos, deben utilizar silla de ruedas. Dado la debilidad de las masas musculares de la espalda
tambin desarrollan escoliosis, la cual, unida a atrofia en los msculos respiratorios provoca
complicaciones respiratorias, siendo las neumonas causa frecuente de muerte. El
compromiso cardaco es frecuente, el 25% de los pacientes presentan evidencia de
cardiomiopatas preclnicas antes de cumplir 6 aos. Hacia la tercera dcada de vida cerca
de un 100% de los pacientes presenta algn tipo de cardiopata (McNally, 2007).
Molecularmente la DMD se caracteriza por mutaciones en el gen que codifica la

protena distrofina, produciendo una disminucin severa o ausencia de sta. El gen, de
alrededor de 2500 Mb est compuesto de 86 exones y localizado en Xp21(Muntoni y cols.,
2003). Distrofina es una protena de 427 kDa que, en su forma completa (tambin existen
isoformas ms cortas) se expresa principalmente en el msculo esqueltico, cardaco y en el
cerebro. La expresin de la protena completa, est comandada por tres promotores que
determinan la presencia de distrofina en los tejidos antes mencionados. Tambin existen
promotores internos que comandan la expresin de isoformas truncadas de la protena
principalmente en sistema nervioso central adems de la isoforma ms pequea, Dp71, que
se expresa en la mayora de los tejidos. En el msculo se localiza bajo el sarcolema
(membrana plasmtica de la fibra muscular) y se ancla al citoesqueleto de actina y a un
conjunto de glicoprotenas de transmembrana (complejo de glicoprotenas asociadas a
distrofina o DGAC) a travs de -distroglicn (Blake y cols., 2002). A su vez, este conjunto
de protenas se unen a protenas de la MEC, y en este sentido distrofina actuara como un
puente que ancla el citoesqueleto de la fibra muscular al espacio extracelular dndole
estabilidad a la fibra durante los ciclos de contraccin y relajacin muscular. De hecho, en
ausencia de distrofina existe una disrupcin de la membrana celular evidenciable por la
entrada y salida de molculas de alto peso molecular. Sin embargo, esta funcin de
andamiaje no parece ser la nica de la protena ya que podra jugar un papel en sealizacin
intracelular a travs de su asociacin al complejo DGAC (Batchelor and Winder, 2006).
Histolgicamente, la biopsia de tejido muscular de pacientes con DMD muestra
degeneracin, regeneracin, fibras hipertrficas aisladas y un reemplazo significativo del
tejido muscular por grasa y tejido conectivo. Incluso en las primeras biopsias realizadas por
Duchenne y reportadas en 1868 se describe que La hiperplasia del tejido conectivo

intersticial, con produccin de ms o menos tejido fibroso, es la lesin anatmica
fundamental de los msculos en la parlisis pseudohipertrfica(Tyler, 2003). Estudios
posteriores han identificado a las molculas de MEC que aumentadas estn en los msculos
distrficos de ratones y humanos. Colgeno I y III, y fibronectina estn aumentados en los
espacios endomisiales y perimisiales (Morrison y cols., 2000).
El ratn mdx: modelo de la DMD
Existen varios modelos animales para la DMD como el perro, GRMD (golden
retriever muscular dystrophy), el gato, HFMD (hypertrophic feline muscular dystrophy), y
el ratn, mdx (x-linked muscular dystrophy). Los tres modelos no expresan distrofina, pero
es el perro el modelo que ms asemeja la patologa en el humano (Blake y cols., 2002).
El ratn mdx fue descubierto por un grupo de investigadores que buscaban mutantes
de actividad enzimtica glicoltica en ratones, quienes observaron que una de sus cepas
presentaba en el plasma, niveles elevados de piruvato quinasa y creatina quinasa (Bulfield y
cols., 1984). Los autores describieron el hallazgo de un modelo animal que presenta
cambios distrficos en los msculos que son dependientes de la edad del ratn y ligados al
cromosoma X tal como lo son la DMD y DMB (distrofia muscular de Becker). Dada la
facilidad para trabajar con el ratn, ste se ha convertido en el modelo in vivo ms utilizado
para estudiar la patologa. La progresin de la enfermedad en este modelo sigue un curso
temporal bien delimitado, existe un perodo de necrosis alcanzando un mximo entre las 34 semanas y una respuesta regenerativa importante que se evidencia por la presencia de
ncleos centrales en las fibras (Blake y cols., 2002). Si bien el ratn mdx tampoco expresa
distrofina, el grado de distrofia en los msculos de las extremidades es mucho menor en
comparacin con el nio. Sin embargo el diafragma del ratn mdx ha sido descrito como el
msculo que presenta mayor degeneracin y ms se asemeja al msculo distrfico de la
DMD (Stedman y cols., 1991). Este tambin sufre reemplazo del parnquima muscular por
tejido fibrtico y se ha observado un aumento en la cantidad del factores pro-fibrosantes
(Andreetta y cols., 2006). Dentro de este contexto, se ha demostrado que el ejercicio es
capaz de inducir dao muscular en este modelo, evaluado a travs de la actividad creatina
quinasa presente en el plasma de estos ratones (De luca A. y cols., 2005). Estos
antecedentes, sugieren que el excesivo dao observado en el msculo diafragma se debe
principalmente a la actividad fsica a la cual est sometido.
Dao y reparacin muscular
El msculo esqueltico tiene una gran capacidad regenerativa y sta depende de una
poblacin de clulas que se encuentran bajo la lmina basal de las fibras musculares y que
estn normalmente mitticamente inactivas, las clulas satlite. En respuesta a estmulos
como estrs inducido por traumas, las clulas satlite se activan, expresan marcadores de
clulas musculares y comienzan a proliferar, luego se diferencian y forman nuevas fibras o
se fusionan con fibras pre-existentes (Chen and Goldhamer, 2003; Hawke and Garry, 2001;
Seale and Rudnicki, 2000).
En la reparacin normal del msculo despus de una lesin aguda, como en
animales de experimentacin o en humanos luego de lesiones deportivas o accidentes, las
fibras daadas o muertas son removidas por clulas inflamatorias como los macrfagos,
para luego ser reparadas o reemplazadas por clulas satlites residentes del tejido muscular
(Mauro, 1961). Sin embargo, en enfermedades humanas crnicas como la DMD, las fibras
musculares recin generadas son tambin susceptibles a la degeneracin, ya que conservan
el defecto molecular, lo que conlleva a constantes ciclos de degeneracin de las fibras
musculares estableciendo un proceso inflamatorio crnico (Porter y cols., 2002a). En la
DMD, la poblacin celular de clulas satlite va disminuyendo a medida que progresa la
enfermedad, resultando en un reemplazo progresivo del tejido muscular por tejido adiposo
y fibrtico. Sin embargo, los eventos celulares y moleculares que ligan al fenmeno de
inflamacin con el desarrollo de fibrosis aun son desconocidos. Por consiguiente, es
importante determinar los factores involucrados con el fin de obtener nuevos blancos
teraputicos que logren separar ambos procesos.
Los macrfagos son el principal tipo de clula inflamatoria encontrada luego de una
lesin muscular. En el msculo distrfico, actan por un lado removiendo los restos
celulares como tambin modulando el proceso de regeneracin. La evidencia actual apunta
a que la naturaleza, duracin e intensidad de la respuesta inflamatoria en el msculo daado
impacta crticamente en el desarrollo ptimo del proceso de reparacin del msculo o,
alternativamente, en la formacin de tejido fibroso, particularmente durante la progresin
de las distrofias musculares. Cuando se interfiere con la respuesta inflamatoria transitoria,
originada luego de una lesin aguda, puede afectar negativamente la remocin de los restos
celulares y por ende la formacin de nuevas fibras musculares, mientras que por otro lado
el interferir con la inflamacin crnica en las distrofias musculares parece ser beneficiosa
en la atenuacin de la degeneracin y la progresin de la fibrosis, al tiempo que mejora la
regeneracin (Tidball, 2005). Estudios que utilizan una variedad de agentes antiinflamatorios en ratones mdx, que actan sobre citoquinas, como TNF- y sus receptores
celulares, y sobre las principales vas pro-inflamatorias, tales como NFB, han dado como
resultado una mejora de la progresin de la distrofia (Pelosi y cols., 2007; Peterson and
Guttridge, 2008; Radley y cols., 2008). Estudios realizados por Arnold y cols. han
demostrado que los macrfagos presentes luego de una lesin muscular constituyen una
poblacin heterognea, cuyas funciones seran opuestas (Arnold y cols., 2007). Una
poblacin de macrfagos (M1, ED-1 (CD68) positivos) producen altos niveles de
citoquinas pro-inflamatorias como TNF e IL-1 y se encuentran en las primeras etapas
despus de una lesin muscular en asociacin con el reclutamiento de monocitos y la
eliminacin de material necrtico. Por otra parte, una subpoblacion de macrfagos antiinflamatorios (M2C, ED-2 (CD163) positivos) son abundantes en las etapas avanzadas del
proceso de regeneracin en asociacin con la recuperacin y reparacin de tejidos en los
que secretan IL-10 y tienen una funcin de desactivacin de la primera oleada de
macrfagos M1 (Arnold y cols., 2007). In vitro, los macrfagos pro-inflamatorios
aumentan la proliferacin e inhiben su diferenciacin, mientras que los macrfagos antiinflamatorios estimulan la diferenciacin y la fusin de stos. Es importante destacar que el
agotamiento de cualquiera de estos tipos de macrfagos tiene efectos negativos en el
proceso de reparacin despus de una lesin muscular (Arnold y cols., 2007).
Terapias para tratar las distofias musculares
Un estudio longitudinal de 25 pacientes con DMD, con un seguimiento medio de

ms de 10 aos, mostr que entre las caractersticas patolgicas, las cuales incluyen atrofia
miofibrilar, necrosis y reemplazo por tejido graso, solo la fibrosis observada en biopsias de
estados iniciales de la enfermedad se correlacion con pobres resultados en fuerza
muscular y debilitamiento progresivo con la edad. Este hallazgo apoya la idea de que la
fibrosis contribuye directamente a la disfuncin muscular progresiva y al fenotipo letal de
la DMD (Emery, 1993).
En la actualidad, no existe ningn tratamiento eficaz para la DMD. Hoy en da el
manejo y control de los pacientes con DMD, consiste en la administracin de
corticosteroides (Prednisona), lo que prolonga parcialmente la fuerza muscular y la
habilidad de caminar en los primeros aos, pero a las larga conduce a efectos secundarios
indeseables e invalidantes (Angelini, 2007). Aunque inicialmente la prednisona fue
evaluada para inhibir la inflamacin muscular, su mecanismo de accin en la DMD, no se
comprende del todo. En este contexto, no existen terapias efectivas para combatir la fibrosis
en la DMD.
Dado que el defecto primario en la DMD es la ausencia de distrofina, se han
planteado diversas terapias para revertir este problema, no obstante uno de los principales
obstculos es la necesidad de realizar terapias sistmicas, ya que el tejido muscular
comprende a ms de 600 msculos en todo el organismo, lo cual hace imposible la
realizacin de terapias directas y locales. Dentro de las terapias que se han intentado,
podemos encontrar las del tipo gnico con la finalidad de revertir la mutacin que impide la
expresin correcta de la protena distrofina, la utilizacin vectores de sobrexpresin, como

tambin intentos de realizar exn-skipping (Adkin y cols., 2011) para generar isoformas
funcionales de la protena distrofina. Por otro lado, se han realizado terapias celulares
utilizando diferentes clulas con potencial miognico, es as que se han utilizado clulas
derivadas de la medula sea (Mafi y cols., 2011), clulas satlites propiamente tal, pericitos
(Peault y cols., 2007) y mesangioblastos (Sampaolesi y cols., 2006). Sin embargo, la
eficiencia de estas aproximaciones aun es un problema. Por otra parte, la fibrosis y la
prdida de tejido muscular en las distrofias musculares no solo reducen las funciones
mviles y de contraccin, sino que tambin provocan mayores obstculos a eventuales
intervenciones teraputicas, ya que por un lado el deterioro progresivo y la prdida de masa
muscular, disminuye la cantidad de tejido blanco para estas intervenciones. como tambin
el exceso de tejido conectivo y MEC impondra una barrera fsica, la cual podra
menoscabar la eficacias de estas terapias (Muir and Chamberlain, 2009). Dentro de este
contexto, se han observado los siguientes problemas en terapias celulares para la DMD. En
primer lugar, las clulas inyectadas se distribuyen de manera local, lo cual implica que en
un paciente se deban realizar mltiples inyecciones para tratar un msculo completo
(Huard, 1992). Segundo, se ha descrito una respuesta inmune en contra de las clulas
satlites inyectadas incluso en los casos de coincidencia entre los complejos mayores de
histocompatibilidad, por lo tanto las nuevas terapias deben considerar una forma de
regulacin inhibitoria de la respuesta inflamatoria y por ltimo, la mayora de las clulas
satlites muere en las primeras 72 horas luego de la inyeccin (Fan, 1996; Guerrete, 1997).
Una posible explicacin a la baja eficiencia de estas terapias queda de manifiesto en un
trabajo del grupo de Giulio Cossu (Gargioli y cols., 2008) quienes demostraron que la
eficiencia puede ser aumentada al utilizar clulas con potencial miognico que
sobrexpresen la metaloproteinasa MMP-9. Esta enzima tiene como sustratos mltiples
protenas de MEC como colgeno tipo I, III y fibronectina (Hrabec y cols., 2007), lo cual
sugiere que estas clulas al tener la capacidad de degradar la MEC adquieren mayor
capacidad migratoria y por ende se distribuyen de mejor manera en el msculo distrfico.
Por lo tanto, es interesante evaluar si una disminucin en la fibrosis aumenta la migracin
celular y de esta forma la eficiencia de las terapias celulares.
Relacin entre factores pro-fibrosantes y pro-inflamatorios en la DMD.
El microambiente de los msculos distrficos se caracteriza por un elevado nmero

de clulas inflamatorias. En particular, los niveles de TNF se encuentran incrementados
en msculos de animales distrficos y pacientes con DMD (Porreca y cols., 1999; Porter y
cols., 2002b). Entre sus efectos pleiotrpicos, TNF acta como un potente inductor del
factor de transcripcin de respuesta inflamatoria (NFB) (Hayden and Ghosh, 2004; Li y
cols., 2005). NFB es un dmero compuesto de varias combinaciones de protenas: p65
(RelA), RelB, C-Rel, p50 y p52, de las cuales p50/p65 es el complejo ms tpico. Se ha
encontrado a NFB constitutivamente activo en el diafragma de ratones mdx (Kumar and
Boriek, 2003).
La importancia de NFB en el progreso de procesos fibrticos, en especial en la
fibrosis asociada a distrofias musculares, ha sido estudiada a travs de modelos animales de
ratones mdx heterocigotos para la subunidad p65 de NFB (Acharyya y cols., 2007), los
que presentan menor dao y fibrosis muscular, lo cual sugiere fuertemente la participacin
de NFB en la patologa fibrtica muscular. A nivel molecular la actividad de NFB es
regulada principalmente por la protena IB. NFB es secuestrada por IB en el
citoplasma impidiendo su translocacin al ncleo y la consiguiente activacin
transcripcional (Ahn y cols., 2007). La accin de IB depende de un citoesqueleto de
actina estable. A nivel muscular la ausencia de distrofina produce la inestabilidad del
citoesqueleto de actina (Rybakova y cols., 2000) lo que producira una ineficiente
inhibicin de NFB. Agentes que estabilizan IB y por ende impiden la activacin de
NFB han mostrado tener efectos protectores frente al dao muscular (Carlson y cols.,
2005). Existen diversos inhibidores especficos para NFB, dentro de ellos se encuentra el
andrograflido. El andrograflido es un terpeno de origen natural, encontrado
abundantemente como el principal compuesto activo en extractos de la planta
angiosprmica Andrographis paniculata (PARACTIN). El andrograflido es un potente
inhibidor de la actividad de NFB modifica en forma covalente un residuo de cistena de la
subunidad p50 (Xia y cols., 2004), lo cual impide la unin al DNA de este factor de
transcripcin. El andrograflido no afecta las rutas de activacin NFB (fosforilacin y
degradacin proteasomal de IB), como tampoco afecta la translocacin nuclear, de esta
forma inhibe la expresin de varias protenas pro-inflamatorias que son inducidas por
NFB (Burgos y cols., 2005; Hidalgo y cols., 2005; Iruretagoyena y cols., 2005). El
andrograflido ha sido utilizado como frmaco para el tratamiento del resfro comn
(Gabrielian y cols. 2002), artritis reumatoide (Burgos y cols., 2009) y esclerosis mltiple,
(Iruretagoyena y cols., 2005), sin presentar efectos secundarios adversos, lo cual desde el
punto de vista farmacolgico lo hace muy atractivo. Por lo tanto sera interesante estudiar el
uso del andrograflido para entender como factores relacionados con inflamacin y fibrosis
se relacionan entre si en el msculo esqueltico
La mayora de los factores pro-fibrognicos son producidos por la clulas
inflamatorias infiltradas en el tejido, por clulas mesenquimales, fibroblastos y como
tambin por clulas especificas del tejido, lo que facilita los efectos profibrognicos
paracrinos que perpetan la fibrosis impulsada por la inflamacin (Wynn, 2008). Una de las
ms potentes citoquinas pro-fibrognicas es el factor de crecimiento transformante tipo beta
o TGF. A la fecha se han descrito tres isoformas de TGF (TGF1, TGF2 y
TGF3), todas las cuales son sintetizadas como protenas precursoras (Zhou y cols.,
2006). Cuando TGF se activa se libera y se une a un receptor heterodimrico. La ruta de
sealizacin clsica activada por TGF consiste en la unin de TGF a su receptor lo
activando el dominio quinasa de ste, lo cual resulta en la fosforilacin de las protenas
smad-2 y smad-3, las cuales unen smad 4 para formar un complejo que transloca dentro del
ncleo, activando la transcripcin (Bonniaud y cols., 2005). Sin embargo, tambin se ha
demostrado que TGF puede sealizar a travs de varias vas adicionales, dentro de las
cuales podemos encontrar la protena quinasa p38 activada por mitgenos (MAPK), ERK,
c-abl, JNK, etc.(Shi and Massague, 2003). Estas vas de sealizacin aparentemente
modifican la expresin de genes de una manera selectiva. Por ejemplo, FAK, JNK y TAK1
se requieren para la diferenciacin de fibroblastos a un fenotipo fibrtico denominado
miofibroblastos, cuya caracterstica principal es su alta capacidad de sintetizar MEC y tener
actividad contrctil debido a la expresin de SMA (alfa actina de msculo liso)
(Vaughan y cols., 2000; Hinz y cols., 2007). Por otro lado, ERK es necesaria para la
expresin de colgeno tipo I. Sin embargo, p38 MAPK no parece estar involucrado en la
actividad fibrognica de TGF. Por lo tanto, es probable que otras vas de sealizacin
sean anormalmente activadas en fibroblastos o clulas musculares de una manera
independiente de la ruta cannica de TGF.
TGF se expresa en el msculo normal despus de la lesin y en el msculo
distrfico de los pacientes con DMD y ratones mdx. Igualmente importante es la capacidad
de TGF de disminuir la produccin de enzimas que degradan la MEC, tales como la
enzima colagenasa, al tiempo que aumenta la produccin de protenas que inhiben las
enzimas que degradan MEC como las TIMPs y PAI-1. La inyeccin, in vivo, directa de
TGF recombinante en el msculo estimula la expresin de TGF en clulas musculares
en una forma autocrina e induce la formacin del tejido conectivo en el rea de la inyeccin
(Brandan y cols., 2008; Zhu y cols., 2007). En conjunto, estos estudios ponen de relieve el
papel crucial de TGF en la iniciacin de los procesos de fibrosis, y en la induccin de
diferenciacin de las clulas musculares en miofibroblastos en el msculo lesionado. El
antagonismo de la sealizacin de TGF por una serie de estrategias han demostrado que
inhibe la fibrosis y mejora la regeneracin muscular en varios modelos experimentales. Sin
embargo, no se ha demostrado ningn agente con la capacidad de reducir la fibrosis, una
vez formada. Por ejemplo, la inmunomodulacin directa de TGF inhibi la acumulacin
de tejido conectivo (Isaka y cols., 2000; Denton y cols., 2007) y la progresin de la fibrosis
en el diafragma de ratones mdx, aunque la inflamacin aument considerablemente
(Andreetta y cols., 2006). Estos resultados sugieren una fuerte relacin entre el fenmeno
de fibrosis y el de inflamacin.
Dentro de los genes regulados por TGF-, se encuentra una protena de sumo inters
en las patologas fibrticas: el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) (Igarishi y
cols., 1993). Una de las principales caractersticas de CTGF, es su efecto sobre la
produccin de MEC, donde regula positivamente la expresin de colgeno tipo I, integrina
5 y fibronectina (Frazier y cols., 1996).
Basado en estudios de expresin de CTGF durante el desarrollo se ha sugerido que
este factor cumple una funcin en la formacin de cartlago, hueso, dientes y maduracin
de clulas nerviosas (Leask y Abraham, 2003). Consistente con esto los ratones deficientes
en CTGF mueren al nacer debido a una alteracin de los embriones en la produccin de
matriz especfica de hueso, incapacidad de condrocitos para proliferar y una alterada
osificacin de las costillas (Ivkovic y cols., 2003).
CTGF es una protena modular rica en cistena perteneciente a la familia
Cyr61/CTGF/NOV (CCN) de factores de crecimiento (Perbal, 2004) cuyos miembros
tienen una gran variedad de funciones biolgicas altamente dependientes de su contexto
celular, dentro de las que se incluyen la proliferacin, migracin y diferenciacin celular
(Perbal, 2004; Leask y Abraham, 2003; Leask y Abraham, 2006). CTGF est involucrado
en una serie de procesos celulares que incluyen la diferenciacin, proliferacin (Yosimishi
y cols., 2001; Grotendorst y cols., 2004), adhesin (Ball y cols., 2003), migracin (Gao y
Brigstock, 2006), apoptosis (Hishikawa y cols., 1999), produccin de MEC (Frazier y cols.,
1996), condrognesis (Ivkovic y cols., 2003) y angiognesis (Babic y cols., 1999). Hasta la
fecha no se ha identificado un receptor especfico de alta afinidad para CTGF, pero se sabe
que algunas de sus funciones tales como adhesin y migracin las realiza a travs de
integrinas y proteoglicanes de heparn sulfato (Babic y cols., 1999; Ball y cols., 2003; Gao
y Brigstock, 2004; Droppelmann y cols., 2009). CTGF adems interacta con el receptor
relacionado al receptor de lipoprotenas de baja densidad (LRP-1) a travs del cual sera
internalizado y degradado va endosomas (Segarini y cols., 2001).
Los niveles de CTGF se correlacionan con el grado y severidad de fibrosis en
muchos tejidos incluyendo desrdenes fibrticos de la piel como esclerosis sistmica y
queloides (Igarishi y cols., 1993), lesiones ateroesclerticas (Oemar y cols., 1997), fibrosis
pulmonar (Lasky y cols., 1998), fibrosis renal (Ito y cols., 1998), pancreatitis crnica (di
Mola y cols., 1999), fibrosis heptica (Paradis y cols., 1999) y distrofias musculares (Sun y
cols., 2008).
Los efectos de TGF sobre la fibrosis pueden ser, al menos parcialmente, imitados
y amplificados por CTGF. Se han reportado aumentos en los niveles de CTGF en el
msculo esqueltico de pacientes con DMD, perros distrficos y ratones mdx. La inyeccin
subcutnea de TGF indujo la produccin de CTGF, mientras que la inyeccin de CTGF
puede causar una reaccin fibrtica equivalente a la de TGF. Esta respuesta fibrtica es
especfica para TGF y CTGF, y no es imitada por EGF, PDGF o FGF2 (Frazier y cols.,
1996). Estos resultados sugieren un papel de ambos (TGF y CTGF) en la induccin de
fibrosis, inhibicin de la miognesis y promocin de desdiferenciacin de mioblastos en
miofibroblastos (Vial y cols., 2008). Debido a que muchas actividades de CTGF son
paralelas a aquellas inducidas por TGF-, se ha sugerido que algunas de las respuestas de
TGF- son mediadas a travs de CTGF (Gore-Hyer y cols., 2002; Grotendorst y cols.,
2004). Se ha observado que durante el proceso de reparacin frente a un dao TGF- es
inducido antes que CTGF sugiriendo que este factor es un mediador ro abajo de TGF-
(Igarishi y cols., 1993).
Con estos antecedentes muchas de las terapias se han enfocado a modular la

actividad pro-fibrtica de TGF- a travs de la inhibicin directa de su blanco CTGF,
mediante RNA de interferencia en modelos de fibrosis hepticas (Li y cols., 2008),
oligonucletidos antisentido en modelos de nefropata diabtica (Guha y cols., 2007; Sisco
y cols., 2008) anticuerpos bloqueantes (Usinger y cols., 2005; Schwartz y cols., 2007;
Ikawa y cols., 2008). En estos estudios, tanto el uso de RNA de interferencia como
anticuerpos bloqueantes especficos para CTGF revelan que existe una disminucin en la
cantidad de protenas de MEC y una mejora del fenotipo fibrtico en los modelos
analizados.
En nuestro laboratorio se demostr, que la expresin de CTGF es inducida por
TGF- en clulas de msculo esqueltico. Ms an CTGF induce la sntesis de MEC en
mioblastos ejerciendo adems un efecto inhibitorio sobre la diferenciacin muscular,
provocando la desdiferenciacin de mioblastos C2C12 (Vial y cols., 2008). Esto ltimo
indicara que la expresin de CTGF en clulas musculares podra estar involucrada en el
proceso de regeneracin muscular. Estudios sobre la expresin de CTGF han mostrado un
incremento en su mRNA en msculo esqueltico de perros distrficos (Passerini y cols.,
2002), y de ratones mdx (Cabello-Verrugio y cols., 2011; Porter y cols., 2003)).
Recientemente se ha encontrado que msculos distrficos de pacientes DMD presentan un
aumento de CTGF localizado en la lmina basal de la fibra muscular, fibras en
regeneracin y en intersticio. Adems se observ una colocalizacin de TGF- y CTGF en
fibroblastos activados de estos pacientes (Sun y cols., 2008), sugiriendo que la expresin de
CTGF es regulada a travs de TGF- y que ambas vas se encuentran ligadas a la
patognesis de la fibrosis muscular esqueltica. Adems, en nuestro laboratorio se demostr
que ratones mdx heterocigotos para CTGF presentan menor grado de fibrosis muscular
(Tesis Gabriela Morales, en curso) y que, adems, la sobrexpresin de CTGF en el msculo
esqueltico de un ratn control induce similares caractersticas a las observadas en un
msculo distrfico (Morales y cols., 2011). En resumen, estos antecedentes indicaran que
al igual que en otros tejidos fibrticos CTGF se correlaciona con el desarrollo y la
severidad de la fibrosis muscular esqueltica, por lo que sera relevante buscar formas de
inhibir su expresin o actividad para prevenir su efecto fibrtico.
Aunque en el adulto CTGF no se expresa bajo condiciones normales en la mayora
de los tejidos, la expresin de esta protena puede ser inducida por TGF-, factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF),
angiotensina II, glucocorticoides, endotelina 1 e hipoxia, el cido lisofosfatdico (LPA),
entre otros estmulos (Leask y Abraham, 2006; Leask y cols., 2009;(Muehlich y cols.,
2004; Ruperez y cols., 2003; Vial y cols., 2008)).
Un factor comn a todos estos inductores es NFB. El promotor de CTGF presenta
sitios de reconocimiento de diferentes factores de transcripcin y dentro de este punto se ha
demostrado que el promotor de CTGF presenta sitios para NFB, los cuales son
importantes para la expresin de CTGF, ya que al ser mutados, inhiben la expresin de un
reportero para CTGF en respuesta a estmulos como el estrs mecnico (Chaqour y cols.,
2006). Adems la sola inhibicin de NFB disminuye la expresin de CTGF y colgeno
tipo I. Estos antecedentes sugieren una fuerte relacin entre la citoquina profibrosante
CTGF y el factor de transcripcin relacionado con inflamacin NFB.
Estudios recientes han sugerido la participacin de CTGF en la respuesta
inflamatoria en donde acta como factor quimiotctico para monocitos y aumenta la
produccin de factores pro-inflamatorios (Cicha, 2005). Esto indicara que CTGF adems
de su propiedad pro-fibrtica estara involucrado en la respuesta inflamatoria, la cual es una
caracterstica de la DMD. De este modo es importante determinar si CTGF y/o TGF
tienen actividad proinflamatoria en el msculo esqueltico.
Esta tesis plantea estudiar los eventos celulares y moleculares involucrados en la
fibrosis muscular esqueltica asociada a las distrofias musculares. Determinando el papel
de las citoquinas TGF y CTGF y su relacin con los procesos de inflamacin y fibrosis,
como tambien la participacin del factor de transcripcin NFB a travs del inhibidor de
origen botnico andrograflido.
HIPOTSIS
El andrograflido inhibe la fibrosis, la cual afecta la fisiologa muscular en un
mecanismo que involucra a CTGF y TGF
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto del andrograflido en la fibrosis, inflamacin y funcin de msculos
distrficos.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos de TGF y

CTGF en el msculo esqueltico.

msculos distrficos.
1.2. Determinar el efecto del andrograflido sobre los niveles de MEC e
inflamacin en msculos distrficos.
inducida por TGF.
inducida por CTGF.
2. Determinar si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta la migracin

celular, la eficiencia de las terapias celulares y la funcin muscular.
2.1. Estudiar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido facilita la

migracin celular en el msculo esqueltico.
nmero de fibras capaces de revertir distrofina
2.3. Evaluar el efecto del andrograflido en la fuerza muscular
MATERIALES Y METODOLOGA
1.
Materiales
1.1
Material Biolgico
1.1.1 Cepas de Bacterias

La cepa de E. Coli XL1-Blue (supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA46, thi, relA1,
lac-, F (proAB+, lacIq, lacZM15, Tn10 (tetr)) forma parte del cepario de bacterias
utilizadas para tcnicas de DNA recombinante del Laboratorio de Diferenciacin Celular y
Patologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Pontificia Universidad Catlica de
Chile.
La cepa comercial BJ5183-Easy (endA, sbcBC, rec, BC galK, met, thi- 1, bioT,
hsdR (Strr)) transformada con el vector adenoviral AdEasy-1se obtuvo de Stratagene (Santa
Clara, CA, USA).
1.1.2 Vectores y plasmidios.

a)
pAdTrack-CMV: Vector que permite la expresin del gen de inters bajo el
control del promotor de citomegalovirus (CMV) adems, contiene como secuencia

bicistrnica el gen codificante para la protena fluorescente verde (GFP) bajo un promotor
independiente de CMV. Este vector fue donado gentilmente por la Dra. Silvana Zanlungo
del Departamento de Gastroenterologa, Facultad de Medicina, pontificia Universidad
Catlica de Chile, Santiago, Chile.
b)
pCMV-Sport6-mCTGF: Vector comercial obtenido de la empresa Open
Biosystem (Thermo Fisher Scientific, Walthman MA, USA), el cual contiene el cDNA de
CTGF ratn, con su secuencia 5 y 3 UTR.
c)
pGL2-Basic, fue obtenido de Promega, WI, EE.UU., gen reportador para la enzima
luciferasa (Luc) de Photinus pyralis, que contiene resistencia a ampicilina.

d)
pNFB-Luc, fue donado por el Dr. Francesc Ventura (Unidad de Bioqumica,
Ciencias Fisiolgicas II, Universidad de Barcelona, Espaa). Contiene el DNAc del

promotor para NFB clonado en pGL2-Basic, el que contiene resistencia a ampicilina
(Lopez-Rovira y cols., 2000).
e)
p3Tp-Luc, Reportero inducible por TGF el que contiene la regin promotora del
inhibidor del inductor del plasmingeno (PAI-1) sub-clonado en un vector modificado que
contiene el cDNA para la luciferasa de lucirnaga. Fue donado por el Dr. Fernando Lopez
Casillas, Universidad Nacional de Mexico (Wrana y cols., 1992).
1.1.3 Lneas Celulares Eucariticas

Las siguientes lneas celulares fueron obtenidas de ATCC, American Type Culture
Collection (Manassas, VA, USA).
a)
C2C12 (ATCC CRL-1772): Subcln derivado de Blau y colaboradores (Blau, y
cols., 1985) utilizando la lnea celular establecida por Yeffe y Saxel a partir del msculo
esqueltico de la extremidad posterior de un ratn C3H normal (Yaffe y Saxel, 1977).
b)
NIH/3T3 (ATCC CRL-1658): Lnea permanente de fibroblastos embrionarios de
ratn espontneamente inmortalizados (Todaro y cols., 1967).
1.1.4 Animales de Experimentacin

Los ratones mdx corresponden a una cepa de animales reproductores con un
background gentico C57BL/10 ScSn que junto con los ratones controles C57BL/10 fueron
obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Estos animales poseen una
mutacin puntual en el exn 23 del gen que codifica para distrofina (Sicinski y cols, 1989).
Los ratones se mantuvieron en el vivero de la Facultad de Ciencias Biolgicas de
la Pontificia Universidad Catlica de Chile, a temperatura controlada (21C) y sometidos a
un rgimen de luz correspondiente a ciclos alternados de 12 horas (luz: 9 AM 9 PM) para
la mantencin de un ritmo circadiano constante. Los animales tuvieron libre acceso a agua
y a una dieta estndar que permite una adecuada reproduccin y crecimiento de los ratones
manteniendo un estado metablico estable.
Todos los procedimientos con animales se desarrollaron con la aprobacin del
Comit de Biotica de la Pontificia Universidad Catlica de Chile.
1.2
Anticuerpos
Los anticuerpos que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis
son detallados en la Tabla 1, en la cual se indican sus caractersticas as como tambin la

tcnica para la la cual fueron utilizados.
Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizadas. WB: Western
blot, IFI: Inmunofluorescencia indirecta, IHC: Inmunohistoqumica
Nombre
Anti-CTGF
Anti-GFP
Antgeno (Especie)
CTGF (humano)
GFP (aequoerea)
Origen
Cabra
Conejo
Tcnica y
Fuente de
Dilucin
obtencin
WB:1/500
Santa Cruz
IHC:1/100
(CA, USA)
WB:1/1000
Santa Cruz
(CA, USA)
Anti-Fibronectina
Anti-Colgeno I
Fibronectina (humano)
Colgeno tipo I (humano)
Conejo
Conejo
WB:1/5000
Sigma
IFI:1/100
(MO, USA)
WB:1/1000
IFI:1/100
Anti-Colgeno III
Anti-fosfo Smad3
Colgeno tipo III (humano)
Smad-3
Conejo
Conejo
Fosfoserinas 423 y 425
WB:1/500
Rockland
IFI:1/50
(PA, USA)
WB:1/1000
Cell
IFI:1/50
Signaling
(humano)
Anti-Smad3
Smad-3
(MA, USA)
Conejo
Cell
(humano)
Signaling
(MA, USA)
Anti-GAPDH
Gliceraldehdo
Ratn
WB:1/5000
Chemicon-
deshidrogenasa (ratn)
Millipore
(MA, USA)
Anti-Tubulina
-Tubulina
Ratn
WB:1/5000
(erizo de mar)
Anti-Miosina
Miosina neonatal
neonatal
(humano)
Anti CD 68
Anti CD 68 (ratn)
Anti CD 206
Anti F4/80
1.3
Anti CD 206 (ratn)
Anti F4/80 (rata)
Sigma
(MO, USA)
Ratn
Conejo
Conejo
Cabra
WB:
Santa Cruz
IFI:1/50
(CA, USA)
WB:1/500
Serotec
IFI:1/100
(OX, UK)
WB:1/500
Serotec
IFI:1/100
(OX, UK)
WB:1/500
Abcam
IFI:1/100
(CA, USA)
Partidores para RT-PCR en tiempo real
Los partidores que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis son
detallados en la Tabla 2, en la cual se indican sus secuencias.
Tabla 2. Lista de partidores utilizados para la expresin de genes a travs de RT-PCR en

tiempo real.
Gen
Forward primer
Reverse Primer
IFN-g
5-GACAATCAGGCCATCAGCAAC-3
5-CGGATGAGCTCATTGAATGCTT-3
CD68
5-CAAAGCTTCTGCTGTGGAAAT-3
5-GACTGGTCACGGTTGCAAG-3

CD206
5-GGATTGTGGAGCAGATGGAAG-3
5-CTTGAATGGAAATGCACAGAC-3
IL-6
5-GAACAACGATGATGCACTTGC-3
5-CTTCATGTACTCCAGGTAGCTATGGT-3
IL-4
5-GGATGTGCCAAACGTCCTC-3
5-GAGTTCTTCTTCAAGCATGGAG-3
CD163
5-GCAAAAACTGGCAGTGGG -3
5-GTCAAAATCACAGACGGAGC-3
MCP-1
5-GCTCAGCCAGATGCAGTTAAC-3
5-CTCTCTCTTGAGCTTGGTGAC-3
B-actin
5-CAACCGTGAAAAGATGACCC -3
5-GTAGATGGGCACAGTGTGGG-3
RNSP1
5- AGGCTCACCAGGAATGTGAC-3
5- CTTGGCCATCAATTTGTCCT-3
SRP14
5- GAGACGAGCAGTTCCTGAC-3
5- CGGTGCTGATCTTCCTTTTC-3
1.4
Material Anestsico y Quirrgico

Durante la ciruga de los animales de experimentacin, se utiliz como anestsico
isofluorano administrado por va area a travs de sistema de anestesia Moduflex

Anesthesia Equipment (Moduflex, San Diego, CA, USA)
Para la administracin de andrograflido por va intraperitoneal se utilizaron
jeringas insulnicas de 0.5 ml obtenidas de Terumo Medical Corporation (New Jersey, NY,
USA). Para la toma de muestra de sangre se utilizaron jeringas de 1 ml de Beckton
Dickinson Ind. Cirrgicas Ltda. (Curitiba, Brasil).
El material quirrgico fue obtenido de Kent Scientific (Torrington, CT, USA), el
cual fue autoclavado previo a cada ciruga.
1.5
Material de Cultivo Celular

Los siguientes materiales para cultivo celular se obtuvieron de Orange Scientific
(Braine-l'Alleud, Blgica): frascos de 25 cm2 y 75 cm2, placas de 20 mm, 60 mm y 150
mm, pipetas estriles desechables de 5 ml y 10 ml y rastrillos estriles desechables. Los

tubos cnicos de polipropileno de 15 ml y 50 ml se obtuvieron de Falcon (St. Louis, MO,
USA). Los filtros de 0.22 m se adquirieron de Millipore (Bedford, MA, USA).
Reactivos
2.1
Reactivos Generales
De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA): se obtuvieron los siguientes
reactivos: Tritn X-100, albmina de suero de bovino (BSA), acrilamida, bisacrilamida,

Tween 20, persulfato de amonio (PSA), -mercaptoetanol, azul de bromofenol
tetrametiletilendiamina (TEMED), NaHCO3, CsCl, dimetilsulfxido (DMSO), fluoruro de
fenil metil sulfonilo (PMSF), NP-40, sarcosil, glicerol y andrograflido.
De Merck (Darmstadt, Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: NaCl,
KCl,
MgCl2,
MgSO4,
Na2HPO4,
KH2PO4,
CH3COONa,
CaCl2x2H2O,
cido
etilendiamintetractico (EDTA), piperazina-N,N'-bis cido etanosulfnico (PIPES),

glucosa, y los solventes de grado analtico.
De US Biological (Swampscott, MA, USA), se obtuvieron los siguientes reactivos,
tris base, dodecil sulfato de sodio (SDS) y glicina.
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvo el suero de
cabra.
TGF-I humano recombinante en su forma soluble, se obtuvo en R&D systems,
MN, EE.UU
2.2
Reactivos para Histologa e Inmunofluorescencia

De Dako (Glostrup, Dinamarca) se obtuvo la solucin de montaje para
inmunofluorescencia Fluoromont y diaminobencidina (DAB)
De Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) se obtuvo el reactivo de bloqueo

para anticuerpos monoclonales Mouse on Mouse Basic Kit (MOM) y el lpiz hidrofbico
para inmunofluorescencia, ImmEdge.
De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA) se obtuvo el lquido de montaje
Entellan, Rojo Sirio F3BA, cido pcrico, cido fosfomolbdico (PMA)
De Merck (Darmstadt, Alemania) se obtuvo eosina Y, 2-metibutano (isopentano),
xilol y hematoxilina de Mayer.
2.3
Reactivos de Biologa Molecular

Los siguientes reactivos de grado biologa molecular se obtuvieron de Invitrogen
Life Technologies (Carlsbad, CA, USA): Agarosa, SybrSafe, desoxiadenosinatrifosfato

(dATP),
desoxitiminatrifosfato
(dTTP),
desoxiguaninatrifosfato
(dGTP),
desoxicitosinatrifosfato (dCTP), estndar de peso molecular de 1 Kb y 100 pb DNA, medio

de crecimiento de bacterias Terrific Broth y agar.
Los antibiticos kanamicina, tetraciclina y estreptomicina se obtuvieron de Gibco
(Grand Island, USA).
2.4
Marcadores de Masa Molecular

De Fermentas (MD, USA,) fueron obtenidos los estndares preteidos para
electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS,
2.5
Enzimas Comerciales
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvieron las enzima
Taq DNA polimerasa recombinante, DNAse I, transcriptasa reversa M-MLV RT (Moloney

Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) y Proteinasa K.
2.6
Sistemas Comerciales
De Qiagen (Valencia, CA, USA) se obtuvieron los sistemas de purificacin de
DNA plasmidial HiSpeed Plasmid Midi Kit y QIAquick Gel Extraction Kit.
De Axygen (Union City, CA, USA) se obtuvo el sistema de purificacin de DNA
plasmidial AxyPrep Plasmid Miniprep Kit.
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvo el sistema de
transcripcin reversa de DNA SuperScript II RT First-Strand Synthesis System.
De Applied Biosystem (Grand Island, NY, USA) se obtuvo el sistema comercial
de extraccin de RNA Arcturus Pico-Pure RNA kit.
De Thermo Fisher Scientific (Walthman, MA, USA) se obtuvieron los sistemas de
deteccin de quimioluminiscencia utilizados para los ensayos de Western blot; West Pico,
West Dura y West Femto.
De BioRad se obtuvo el IQ SYBR Green supermix utilizado para los ensayos de
RT-PCR en tiempo real.
2.7
Medios de Cultivo Celular

Los siguientes reactivos se obtuvieron de Gibco (Grand Island, USA): medio de
cultivo Dulbeccos Modified Eagle (DMEM), Opti-MEM, suero fetal bovino, tripsinaEDTA y mezcla de antibiticos-antimictico.
La lipofectamina utilizada para transfeccin transiente de clulas en cultivo se
obtuvo de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA).
3.
Metodologa
3.1
Cultivo Celular
3.1.1. Mantencin de Lneas Celulares

Las lnea celular NIH/3T3 fue mantenida en medio de cultivo DMEM
suplementado con 5% suero fetal de bovino inactivado y 1% de antibitico-antimictico a
37C y 5% de CO2.
El cultivo celular C2C12 se mantuvo en medio de cultivo DMEM suplementado
con 10% suero fetal de bovino y 1% de antibitico-antimictico a 37C y 8% de CO2.
El medio de cultivo de ambas lneas se cambi en forma peridica y cuando las
clulas alcanzaban 80% de confluencia eran tripsinizadas y resembradas para continuar su
crecimiento.
3.1.2. Diferenciacin de clulas C2C12

Se plaquearon 6000 clulas/cm2 en 6 ml (para placas de 55 cm2) o 3 ml (para placas
de 21 cm2) de medio de crecimiento por 2 a 3 das o hasta alcanzar un 80% de confluencia.
Las clulas obtenidas en esta etapa, se denominarn mioblastos. Para inducir su
diferenciacin, el cultivo de clulas se lav 3 veces con medio mnimo y se incub por 2
das en el mismo volumen de medio de diferenciacin, que corresponde a medio mnimo
suplementado con SC 5% (v/v). El medio se reemplaz cada 2 das, o bien, como se indica
en cada experimento. En algunos experimentos, el medio de diferenciacin que se agreg
desde 2 das despus de gatillada la diferenciacin contena AraC 0,1 mM (Larrain y cols.,
1997a).
3.1.3 Transfeccin Transiente en Clulas Eucariontes

Se sembraron 9000 clulas/cm2 en placas de 10 cm2 y, despus de 48 horas, stas
fueron transfectadas con los plasmidios pGL2-Basic, pId1-Luc, pNfkB-Luc o p3TP-LUC.
Se tomaron 5 g o 2,5 g (para triple transfeccin) de los DNA plasmidiales mencionados,
previamente purificados por MaxiPrep y se disolvieron en 0,125 ml de Opti-MEM I.
Despus de filtrar la mezcla (en filtros de 0,2 m), se adicionaron 4 l del reactivo PLUS y
se incub 15 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla, se adicion gota a gota y con
agitacin a un tubo que contena 6 l de lipofectAMINA, previamente disuelta en 0,125 ml
de Opti-MEM I y se incub por 15 minutos adicionales. La mezcla DNA/lipofectAMINAPLUS, se adicion gota a gota a placas que haban sido lavadas 3 veces con Opti-MEM I, y
que contenan 1 ml del mismo medio. Se adicionaron 0,139 ml de SFB y 7 l de extracto de
embrin de pollo y las placas se incubaron por 12-14 h a 37C, CO2 8% y 95% de
humedad. Las placas se lavaron tres veces con HBSS, se tripsinizaron y las clulas resuspendidas en medio de crecimiento, fueron repartidas en 6 pocillos de 1,9 cm2. Luego de
4 horas, las clulas fueron lavadas con medio mnimo y se comenzaron los tratamientos con
TGF, H2O2, andrograflido, PARACTIN, etc. Todos re-suspendidos en medio mnimo
y suplementados con 0,1% SFB (v/v).
3.2.
Ensayos enzimticos
3.2.1. Ensayo de luciferasa

Se utiliz el kit Luciferase Reporter Assay System. Clulas transfectadas en forma
transiente, y luego del tratamiento correspondiente, fueron lavadas 2 veces con tampn PBS
e incubadas durante 20 minutos a 37C con 0,1 ml de un tampn de lisis pasiva, provisto
por el fabricante. Para cuantificar la actividad de luciferasa 20 l de extracto celular,
previamente removido con un raspador de clulas, fueron incubados con 0,1 ml del reactivo
de ensayo de luciferasa (LAR II) y cuantificado en un luminmetro TD-20/20, Turner
Designs, con un tiempo de preincubacin de 5 segundos y 10 segundos de medida.
3.2.2.. -galactosidasa
Se utiliz el kit Luminiscent -galactosidase Detection kit, el que permite la
deteccin luminiscente de la actividad de -galactosidasa. La determinacin, fue realizada
en los mismos extractos obtenidos para la deteccin de actividad de luciferasa. 50 l de
extractos, fueron incubados con 0,1 ml del reactivo de ensayo de -galactosidasa, e
incubados por 1 hora a temperatura ambiente. La cuantificacin se hizo en un luminmetro
TD-20/20, Turner Designs, con un tiempo de lectura de 10 segundos.
3.3.
Ensayo de Northern
3.3.1. Electroforesis de RNA en geles de agarosa y transferencia a membranas de

Nytran
Las muestras de RNA total, se fraccionaron en geles de agarosa al 1,2% (p/v), los
que se prepararon en amortiguador MOPS (cido morfolinopropanosulfnico 40 mM, pH:
7,0, acetato de sodio 10 mM y EDTA 1mM), conteniendo formaldehido 0,66 M y que
haban sido precorridos a 70 V por 1 hora en tampn MOPS. Se denaturaron 10 g de RNA
total disuelto en formamida, que contenan amortiguador de carga (0,75 ml formamida
desionizada, 0,15 ml de tampn MOPS 10X, 0,24 ml formaldehido al 37% p/v, 0,1 ml de
agua tratada con DEPC, 0,1 ml glicerol y 0,08 ml de una solucin de azul de bromofenol al
10% p/v) y 3 l de bromuro de etidio 1 mg/ml. Las muestras se aplicaron al gel y ste se
corri a un voltaje constante de 70 V, hasta que el frente de azul de bromofenol llegara al
final del gel. El gel se fotografi, previo a la transferencia.
Para la transferencia a membranas de Nytran, se preincubaron el gel y la membrana
en una solucin SSC 10X (NaCl 1,5 M, citrato de sodio 0,15 M, pH: 7,0), que contena
DEPC durante 20 minutos con agitacin suave. El gel, se coloc sobre un trozo de papel
Whatmann 3MM, cuyos extremos estaban sumergidos en un recipiente que contena SSC
10X. Sobre el gel, se coloc la membrana de Nytran y sobre sta, un trozo de papel
Whatmann 3MM (ambos del mismo tamao del gel) y, finalmente, papeles absorbentes. La
transferencia por capilaridad, se dej proceder por 12 horas. Los cidos nucleicos se
entrecruzaron a la membrana, exponiendo esta ltima 2 minutos en un transiluminador UV
(302 nm).
3.3.2. Marcacin radioactiva de la sonda de DNA

Las sondas de DNAc, obtenidas mediante PCR a partir de sondas, previamente
preparadas, fueron marcadas utilizando el kit Rediprime II Random Prime Labelling
System. Para esto, 25 ng de la sonda fueron ajustados a un volumen final de 45 l en
tampn TE y denaturados incubando 5 minutos a 100C y 5 minutos a 4C. A uno de los
tubos del kit, que contena la enzima Klenow, dATP, dGTP y dTTP en una solucin
tampn, se agregaron la sonda denaturada y 5 l de -[32P]dCTP (3000 mCi/mmol), se
mezcl e incub a 37C durante 20 minutos. La reaccin se detuvo agregando 5 l de una
solucin EDTA 0,2 M. Previo a la hibridacin, la sonda fue denaturada en las condiciones
descritas.
3.3.3. Hibridacin y lavados

Para bloquear la unin inespecfica, las membranas se prehibridaron con el tampn
Rapid-hyb, provisto por el fabricante, que contena DNA de espermio de salmn 0,1 mg/ml
previamente denaturado. Despus de una incubacin de 20 minutos, a 65C, con agitacin
continua en un horno de hibridacin Shel Lab, 1012, se adicion la sonda marcada y
denaturada sobre el mismo tampn y se incub a 65C durante 60 minutos. Las
membranas, se lavaron una vez con tampn SSC 2X, SDS 0,1% (p/v) por 30 minutos, y dos
veces, con tampn SSC 0,1X, SDS 0,1% (p/v) por 15 minutos cada uno, a 65C. Las
membranas se expusieron a pelculas de rayos X a -80C.
3.4
Amplificacin y Purificacin de Adenovirus Recombinantes
Los adenovirus recombinantes Ad.GFP y Ad.CTGF fueron replicados a gran

escala como ha sido descrito previamente (He y cols., 1998). Las clulas HEK-293 se
crecieron en 50 placas de 150 mm hasta confluencia en medio de cultivo DMEM
suplementado con 10% suero fetal de bovino y 1% de antibitico-antimictico. Las clulas
fueron infectadas con 1x1010 partculas por placa en 4 ml de DMEM suplementado con 2%
suero fetal de bovino y 1% antibitico-antimictico. Las clulas infectadas se incubaron por
2 hrs. a 37C y luego se adicionaron 10 ml de medio de cultivo completo.
Despus de 30 hrs. de incubacin a 37C, las clulas fueron cosechadas en tubos
de polipropileno cnico de 50 ml y centrifugadas a 1000 g por 5 min. a 4C, se elimin el
sobrenadante y las clulas se resuspendieron en 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM pH 8,1 por
placa.
Luego,
las
clulas
se
lisaron
tres
veces
mediante
un
proceso
de
congelamiento/descongelamiento en alcohol-hielo seco/bao a 37C para liberar las

partculas virales desde el interior de las clulas. Los lisados se centrifugaron a 2000 g por
10 min. a 4C y se recuper el sobrenadante donde se recuperan las partculas virales. Este
sobrenadante se someti a un fraccionamiento en una gradiente de cloruro de cesio
discontinua y se ultracentrifug por 2 hrs. a 30000 g a 5C. La banda inferior de la
gradiente formada post centrifugacin fue recolectada y se realiz un proceso de
purificacin final del DNA en una columna de Sephadex G-25 grado DNA (Pharmacia,
Uppsala, Suecia) para eliminar el exceso de sales. La cuantificacin de la concentracin se
realiz midiendo la DO260nm de las fracciones obtenidas, recuperndose el virus
mayoritariamente entre la fraccin 4 a 6.
El virus recombinante as obtenido se guard alicuotado en PBS-glicerol al 10% a

80C hasta el momento de ser utilizado en la infeccin de animales.
3.5.
Preparacin de Lisados Celulares
Las clulas se lavaron 3 veces con 2 ml de PBS fro, se desprendieron mediante un

rastrillo y se traspasaron a un tubo de microcentrfuga junto con 1,5 ml de PBS para
centrifugacin a 800 g por 5 min. a 4C. El pellet de clulas se resuspendi en 100-300 l
buffer de lisis (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM MgCl2 y 0,5% NP-40, 1mM PMSF) y se incub
por 15 min. a 4C. Finalmente, el lisado se centrifug a 15700 g por 10 min. a 4C para
eliminar la fraccin nuclear y los restos celulares y el sobrenadante se almacen a -20C
hasta su utilizacin para ensayos de Western blot.
3.6.
Genotipificacin Ratones mdx
La reaccin de PCR para la genotipificacin de ratones mdx se realiz segn

Amalfitano y cols (1996) con algunas modificaciones. Brevemente se utilizaron los
oligonocleotidos p9427 (5'-AAC TCAT CAA ATA TGC GTG TTA GTG-3'), P260E (5'GTC ACT CAG ATA GTT GAA GCC ATT TAG-3') y p259E (5'-GTC ACT CAG ATA
GTT GAA GCC ATT TAA-3'). La combinacin de los oligonucletidos P9427 y P259E
amplifican la zona donde se encuentra el codn prematuro de trmino en el exn 23 en el
gen de distrofina de los ratones mdx. La combinacin de oligonucletidos P9427 y P260E
amplifican la misma zona pero en un animal silvestre. Ambas reacciones generan un
producto de 100 pb. El DNA genmico se obtuvo como se detall en Metodologa 2.12.1.
La reaccin de PCR se llev a cabo como se detalla en la seccin Metodologa 2.12.2. El
producto de PCR obtenido se visualiz en un gel de agarosa al 2%.
3.7.
Infeccin de Animales con Adenovirus Recombinantes
En el desarrollo de todos los experimentos con infeccin adenoviral, se utiliz

ratones machos C57BL/10 de 12 semanas de edad. Para administrar el adenovirus (Morales
y cols., 2010), los animales fueron anestesiados con isoflurano. Se identific en tibialis
anterior y se inyect directamente en el msculo 2x1011 partculas de adenovirus
recombinante en 50 l de amortiguador fosfato salino con una jeringa insulina de 0.5 ml.
Como grupos controles, se utiliz animales inyectados exclusivamente con solucin salina
(PBS) o con un adenovirus control (Ad.GFP).
Luego de la infeccin, los ratones se mantuvieron desde 5 das das en dieta
control con disposicin a alimento y agua ad libitum. La administracin de adenovirus en
animales se desarroll con la aprobacin del Comit de Biotica Animal de la Pontificia
Universidad Catlica de Chile.
3.8.
Inyeccin intramuscular de TGF
En el desarrollo de todos los experimentos con inyeccin intramuscular de TGF,

se utiliz ratones machos C57BL/10 de 12 semanas de edad. Para administrar la citoquina,
los animales fueron anestesiados con isoflurano. Se identific el TA y se inyect
directamente en el msculo un total de 5ng de TGF1 en 50 l de suero fisiolgico con

una jeringa de insulina de 0.5 ml. Como grupos controles, se utiliz animales inyectados
exclusivamente con solucin salina (PBS).
Luego de la inyeccin, los ratones se mantuvieron durante 5 das en dieta control
con disposicin a alimento y agua ad libitum.
3.9.
Tratamiento con andrograflido y PARACTIN.
La administracin de andrograflido (2mg/Kg) en ratones mdx se realiz en forma

intraperitoneal en un volumen mximo de 50 l de suero salino, utilizando jeringas de
insulina de 0,5 ml. La administracin de andrograflido se realiz 3 veces por semana en el
cuadrante inferior derecho de cada animal, introduciendo la aguja paralela a la lnea de la
pierna e ingresando a travs de la pared abdominal hasta el interior de la cavidad peritoneal.
Para el tratamiento con el PARACTIN (andrograflido al 37%) en forma oral, se
calcul la cantidad de agua que los animales beben diariamente, esta fue estimada en 2 ml.
De esta forma el PARACTIN fue diluido en el bebedero de los animales a una
concentracin tal, que por cada 2 ml de lquido se encuentre una cantidad de 2 mg de
andrograflido total. Los animales no tuvieron acceso a otro tipo de lquido.
3.10. Inyeccin intramuscular de fibroblastos.
Se aislaron fibroblastos provenientes del tendn de Aquiles de ratones control recin

nacidos. Estos fibroblastos se caracterizan por su alta capacidad migratoria, adems de ser
capaces de subsistir en condiciones de hipoxia. Para aislar los fibroblastos, primero se

procedi a extraer el tendn y luego fue triturado para ser incubado con la enzima
colagenasa durante 10 minutos. Luego fueron filtrados a travs de un tamiz celular y el
eludo fue sembrado en placas de 60 mm permitiendo su adherencia durante 30 minutos.
Posteriormente se retir el sobrenadante y las clulas adheridas fueron cultivadas en una
estufa a 37c y 5% de CO2.
Una vez alcanzada una alta confluencia, los fibroblastos aislados de tendn fueron
teidos segn las indicaciones del fabricante con la sonda lipoflica fluorescente DiI
(Molecular probes). Una vez teidas se procedi a inyectar, 5 millones de estas clulas en
el centro del msculo tibialis anterior de ratones mdx, para luego de un mes, evaluar
mediante inmunofluorescencia su localizacin intramuscular.
3.11. Induccin de fibrosis por ejercicio en ratones mdx
Para acelerar el fenotipo fibrtico en el msculo de las extremidades de ratones

mdx, estos fueron sometidos a protocolos de ejercitacin sobre una cinta trotadora a una
velocidad de 12 metros/minuto (Bizario y cols., 2009). La duracin del protocolo fue de 30
minutos totales de ejercitacin con descansos cada 3 y 5 minutos para los ratones mdx y
C57BL/10 respectivamente. El protocolo de ejercitacin se realiz 3 veces a la semana
durante periodos que variaron desde 1 a 4 meses.
El protocolo de resistencia al ejercicio consisti en una ronda de 5 minutos a una
velocidad de 15 metros/min y se contabiliz el nmero de veces en que los ratones
retrocedan en la cinta trotadora.
Previo a la experimentacin correspondiente de esta tesis, realizamos la

caracterizacin de este modelo. En primer lugar caracterizamos mediante tincin de
Hematoxilina/Eosina el fenotipo muscular en respuesta a diferentes periodos de
ejercitacin. Como se muestra en la figura 1, el ejercicio acelera el fenotipo fibrtico, lo
cual fue corroborado mediante inmunofluorescencia indirecta para la protena colgeno tipo
III (figura 2) y mediante ensayos de western blot para la protena fibronectina (figura 3)
En algunos experimentos los ratones fueron tratados con andrograflido a una dosis
de 2 mg/Kg de peso de andrograflido, el cual fue inyectado intraperitonealmente 3 veces
por semana.
3.12. Trasplante intramuscular de miobloastos
Msculos soleos de animales C57BL/10 fueron digregados enzimticamente con

colagenasa y mecnicamente a travs de pipeteo extensivo para obtener fibras musculares,
intactas las cuales sirven como vehculos para llevar las clulas satlites a los msculo de
ratones mdx que fueron sometidos a protocolos de terapia celular, tanto el tratamiento con
andrograflido como los protocolos de ejercitacin se detuvieron 1 semana antes del
trasplante con el propsito de que los animales eliminen todo el andrograflido y evitar el
efecto de este sobre las clulas trasplantadas evaluando as solo el efecto del ambiente, de
tal manera que el trasplante se realiz en animales de 7 meses. Luego del trasplante se
esper un mes (sin terapia, ni andrograflido ni ejercicio) antes de la eutanasia y
congelamiento de los msculos para realizar cortes histlogicos. Por lo tanto los cortes
histolgicos corresponden a animales de 8 meses.
0 1 2 3
*
*
mdx
C57BL/10
Figura 1. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico de animales
distrficos mdx. Ratones mdx y controles, de 3 meses de edad, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin,
3 veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante la tincin de Hematoxilina/Eosina. Los
asteriscos sealan fibras necrticas y las flechas ffocos de fibras musculares regenerantes.
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
mdx
C57BL/10
distrficos mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3
veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante inmunofluorescencia para la protena de
MEC, colgeno tipo III (verde), en azul se muestran la tincin nuclear (Hoechst).
Ejercicio
(meses)
C57BL/10
mdx
Ejercicio (meses) 0 1 2 3 0 1 2 3
FN
GAPDH
C57BL/10
mdx
Veces de induccin de
(FibrionecFna/GAPDH)
2,5
1,5
1
0,5
0
1
4
5
6
Meses de ejercicio
Figura 3. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo

esqueltico de animales distrficos mdx. A. Ratones mdx y controles fueron
sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana, por el periodo de
tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo Tibialis
Anterior para evaluar los niveles de fibronectina mediante western blot, como
control se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Cuantificacin de 3
ensayos distintos. Las barras azules representan muestras provenientes de ratones
control y las barras rojas muestras provenientes de animales mdx.
3.13. Ciruga y Toma de Muestras

Los ratones fueron anestesiados con isofluorano, se registr el peso de cada animal
y se procedi a realizar una incisin abdominal para dejar expuesta la vena cava inferior, de
donde se procedi a extraer sangre con una jeringa de 1 ml heparinizada. El plasma se
separ del resto de los componentes sanguneos por centrifugacin a 1500 g por 20 min. a
temperatura ambiente. Posteriormente los ratones fueron sacrificados a travs de
dislocacin cervical y se procedi a remover los msculos de las extremidades,
gastrocnemius y tibialis anterior. Los msculos utilizados para los ensayos de
electrofisiologa fueron mantenidos en buffer Krebs-Ringer (118 mM NaCl, 25 mM
NaHCO3, 11 mM D-glucosa, 4,7 mM KCl, 3,2 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM
MgSO4) oxigenado a temperatura ambiente hasta su anlisis.
Los msculos utilizados para obtencin de homogenizado total de msculo para
ensayos de western blot, fueron rpidamente congelados en N2 lquido y almacenados a 80C hasta su procesamiento. Los msculos utilizados para anlisis histolgico e
inmunofluorescencia fueron rpidamente congelados en isopentano enfriado en N2 lquido
y almacenados a -80C hasta su procesamiento.
3.14. Obtencin de Homogenizado Total de Msculo

Los msculos fueron homogenizados en 10 volmenes de amortiguador de

homogenizacin (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM EDTA pH 8,0, 1 mM PMSF) por 1 min.
mediante Ultraturrax (Kinematica, Littau, Suiza). El homogenizado resultante se mezcl
con amortiguador de tratamiento 2X (0,125 M Tris pH 6,8, 4% SDS, 20% Glicerol) y se

incubo por 20 min. a 50C. Posteriormente se centrifug a 16000 g por 20 min. para
eliminar el material insoluble. Al sobrenadante obtenido se le determin la concentracin
de protenas y se almacen a -20C.
3.15. Determinacin de Protenas en Lisados Celulares y en Homogenizados de

Msculo.

La concentracin de protenas se determin mediante el ensayo del cido

bicinconnico, utilizando el kit comercial BCA protein assay (Thermo Fisher Scientific,
Walthman MA, USA). La reaccin se llev a cabo en una placa de 96 pocillos segn las
instrucciones del proveedor y se midi la DO505nm. Los valores de absorbancia corregidos
por los blancos respectivos se interpolaron en una curva de calibracin preparada a partir de
una solucin de BSA de concentracin conocida.
3.16. Hibridacin tipo Western Blot

Para el anlisis de Western blot de lisados celulares y homogenizados de msculo,

20 g y 80 g de protenas respectivamente. Las muestras de protenas se mezclaron con un
1/5 de su volumen de una solucin de carga (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 25% glicerol, 2%
SDS, 0,7 M -mercaptoetanol, 0,1% azul de bromofenol) y luego fueron sometidas a
electroforesis denaturante en un gel del 8% al 12% de poliacrilamida-0,1% dodecilsulfato
de sodio (SDS-PAGE) en amortiguador 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM glicina, 0,1%
p/v SDS a 100 V por 1,5-2 hrs. y luego transferidas a una membrana de PVDF (Thermo
Fisher Scientific, Walthman MA, USA) en amortiguador 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM
glicina, 20% v/v metanol a 350 mA por 2,5 hrs. Despus de la transferencia, la membrana
fue bloqueada con metanol, secada a 37C y almacenada a temperatura ambiente hasta su
posterior uso. Las membranas fueron incubadas con los distintos anticuerpos en TBS (150
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5)-Tween 20 0.1% - leche 5% por una hora a temperatura
ambiente. Luego, se procedi a lavar la membrana 3 veces con TBS-Tween 20 0,1% - leche
5% por 5 min. y se adicion el anticuerpo secundario contra la IgG respectiva del primario
en TBS-Tween 20 0.1%-leche 5% por una hora a temperatura ambiente.
La unin del complejo anticuerpo primario/anticuerpo secundario a las muestras
proteicas fue visualizada usando el procedimiento de quimioluminiscencia (Thermo Fisher
Scientific, Walthman MA, USA) y detectadas a travs de un sistema de documentacin de
imgenes Chemidoc. (UVP, Upland CA, USA)
Las seales proteicas detectadas en los Western blots se cuantificaron mediante el
programa Image J (NIH, USA) y los niveles de expresin se normalizaron con respecto a
los niveles del control de carga respectivo en cada muestra.
3.17. Extraccin de RNA en msculo esqueltico y sntesis de cDNA

El RNA total obtenido de corte histolgicos mediante Microdiseccin Lser

(LMD) se extrajo a travs del sistema comercial Arcturus Pico-Pure RNA kit de acuerdo a
las instrucciones del fabricante.
Para la sntesis de DNA complementario (cDNA) se utiliz y el sistema comercial

Superscript RT II. La reaccin de transcripcin reversa se realiz en un volumen de 20 ul
,para lo cual 1 ug de RNA total se mezclo con 50 ug/ml de Oligo(dT), 50 ng de random
hexmeros y 1 mM de dNTP, la mezcla se incub por 5 min a 65C y se enfri rpidamente
en hielo. Posteriormente se adicion 1/5 de volumen de buffer de la enzima (250 mM TrisHCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 5 mM MgCl2), 10 mM DTT y 2 unidades RNAsaOUT, la
mezcla se incub por 2 min. a 42C. Luego se adicion 200 unidades de la transcriptasa
reversa SuperScript II RT y se incub por 10 min. a 25C, 50 min a 42C y finalmente 15
min. a 70C. El cDNA obtenido se almacen a -20C hasta su posterior uso..
3.18. RT-PCR en tiempo real

Las reacciones cuantitativas de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado en

el sistema de deteccin ABI Prism 7700 (Applied Biosystem, Grand Island, NY, USA) Un
10% del producto de transcripcin reversa (Metodologa 2.17) se utiliz para la reaccin de
PCR en tiempo real en un volumen final de 25 l, utilizando 0,05 volmenes de mezcla de
partidores y sondas pre-diseadas Taqman (Materiales X:X), 0,5 volmenes de la mezcla
universal de Taqman y H2O libre de nucleasas para completar el volumen final. La
expresin del mRNA fue cuantificado usando el mtodo comparativo del dCt usando
GAPDH como gen de referencia.
3.19. Ensayos de electrofisiologa

La fuerza muscular se determin segn Gregoveric 2002 y Bognadovick 2002.

Brevemente los msculos posicionados horizontalmente en un bao de rganos que
contena solucin Krebs-Ringer oxigenada. Un extremo fue unido directamente a un
transductor de fuerza isomtrica (MLT0201, Panlab, Espaa), dos electrodos de platino
(MLA0303, Panlab, Espaa) fueron posicionados en el bao de rganos flanqueando el
largo del msculo. Los msculos fueron estimulados por un estimulador generador de
pulsos de ondas cuadradas (S48 Stimulator, Grass, USA). Los parmetros de estimulacin y
la respuesta muscular se controlaron y midieron usando el programa LabChart (AD
Instrument, USA)
El largo muscular ptimo y el voltaje de estimulacin fueron determinados por
micromanipulacin del largo muscular para producir la mxima contraccin isomtrica. La
fuerza isomtrica mxima tetnica fue determinada del valor mximo de la curva de
relacin entre fuerza isomtrica especifica (mN/mm2) y la frecuencia de estimulacin entre
1 a 200 Hz por 450 mseg. con 2 minutos de descanso entre cada estmulo. Finalizado los
ensayos funcionales los msculos fueron removidos del bao, se elimin el tendn y tejido
adherente no muscular, se secaron brevemente papel filtro y se pesaron. La masa muscular
y el largo optimo fueron usados para calcular la fuerza neta especifica (fuerza normalizada
por el area transversal de msculo (CSA, mN/mm2).
3.20. Ensayos de Inmunofluorescencia

Mioblastos C2C12 fueron sembrados y crecidos directamente en cubreobjetos de

vidrio por el tiempo correspondiente al ensayo utilizado. Posteriormente las clulas fueron
lavadas 2 veces en buffer fosfato salino (PBS) y luego fijadas en PBS-3%
paraformaldehido por 20 min. Para permeabilizar las clulas se incubaron con PBS-Tritn
X-100 0,05% por 5 min. Para evitar la unin inespecfica eptope-anticuerpo las clulas se
incubaron por 1 hr. en solucin de bloqueo TBS-2% BSA.
Para ensayos de inmunofluorescencia en tejido muscular esqueltico utilizando
anticuerpos policlonales, criosecciones de 7 m de grosor fueron fijadas por 2 min. en
TBS-4% paraformaldehido y bloqueadas por 1 hora en TBS-10% suero de cabra para
anticuerpos policlonales. Para anticuerpos monoclonales el tejido se fij por 20 min en
acetona fra (-20C) y posteriormente se incub por 1 hora con el sistema comercial MOM
en solucin de bloqueo (TBS-Triton-MOM).
Posteriormente los cortes fueron incubados con el anticuerpo primario
correspondiente (tabla anticuerpos), diluidos segn tabla en solucin de bloqueo. Como
anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpos anti-rabbit de cabra y anti-mouse de
conejo conjugados a fluorforos Alexa 408 y 505. Los cuales fueron diluidos 1000 veces en
solucin de bloqueo e incubados por 1 hora. Para la tincin nuclear las secciones se
incubaron con 1mg/ml de Hoechst 33258 en PBS por 10 min., despus de lavar 3 veces en
PBS, las secciones fueron montadas con cubrebjetos usando Fluoromont y visualizados a
travs del microscopio invertido Nikon Diaphot (equipado con epifluorescencia.
3.21. Ensayos de Inmunohistoqumica

Para ensayos de inmunohistoqumica en tejido muscular esqueltico, criosecciones

de 7 m de grosor fueron fijadas por 20 min en acetona fra (-20C), secadas al aire por 10
min. y posteriormente incubadas toda la noche a 4C con anti-CTGF en PBS-5% suero de
cabra, las muestras se lavaron 3 veces en PBS-0,05% Tween-20 y luego se incubaron por 1
hora con anticuerpo anti-goat hecho en conejo en PBS-5% suero de cabra, finalizada la las
muestras fueron bloqueadas por 15 min en metanol-3% H2O2, para bloquear la actividad
peroxidasa endgena del tejido. Posteriormente las muestras se incubaron por 1 hora con
poly-HRP anti-rabbit IgG (Immunologic, Netherlands), lavadas 3 veces con PBS e
incubadas con diaminobencidina (DAB), la reaccin cromognica se detuvo con H2O
destilada. Los ncleos fueron teidos con hematoxilina por 5 min., lavados con H2O de la
llave por 10 min y finalmente deshidratadas bajo batera de alcoholes desde 70% a 100%,
incubadas en xilol y montadas en Entellan.
3.22. Tinciones histolgicas
3.22.1. Tincin de Hematoxilina y Eosina

Para las tinciones histolgicas criosecciones de 7 m de grosor fueron fijadas por
10 min. en 10% de formalina, lavadas en H2O destilada por 10 min. Los ncleos fueron
teidos con 20% de hematoxilina en PBS por 10 min. y lavadas por 10 min. bajo agua de la
llave. La tincin citoplasmtica se realiz incubando las muestras por 30 seg. en 0,25% de
eosina en 80% etanol, las muestras se lavaron con H2O destilada y posteriormente fueron
deshidratadas bajo batera de alcoholes desde 70% a 100%. Finalmente las muestras fueron
incubadas en xilol y montadas en Entellan.
3.22.2. Tincin de Rojo de Picrosirio

Para las deteccin de colgeno intersticial, criosecciones de 7 m de grosor fueron
fijadas por 30 min en etanol 100% a -20C, lavadas por 3 min en H2O destilada e incubadas
en cido pcrico acuoso saturado, por 60 min a 50C. Luego las muestras fueron lavadas por
3 min en H2O destilada, incubadas por 2 min. en 0,2% PMA acuoso y lavadas 2 veces por 3
min en H2O destilada. Posteriormente las muestras fueron incubadas en 0,1% de Rojo de
Picrosirio en cido pcrico acuoso saturado por 5 min, lavados en HCl 0,001N por 2 min y
en etanol 70% por 5 min. Finalmente las muestras fueron deshidratadas por batera de
alcoholes desde alcohol 70% a 100%, pasadas por xilol y montadas con Entellan.
3.23. Anlisis Estadstico

La significancia estadstica de las diferencias entre los promedios de ms de dos
grupos experimentales se evalu usando el anlisis de varianza de 1 va (ANOVA) con un

test mltiple de comparacin posterior de Bonferroni (Prism 3,0, GraphPad). Las
diferencias fueron consideradas estadsticamente significativas con un valor de p<0,05.
La significancia estadstica de las diferencias entre los promedios de dos grupos
experimentales se evalu usando el anlisis de t de student (Prism 3,0, GraphPad). Las
diferencias fueron consideradas estadsticamente significativas con un valor de p<0,05.
RESULTADOS
1.-Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos

de TGF y CTGF en el msculo esqueltico.

msculos distrficos.
Como se coment en la introduccin, es posible inducir y acelerar la fibrosis en los

msculos de las extremidades del ratn mdx, mediante protocolos de ejercitacin (Ver
materiales y mtodos). En primer lugar, evaluamos si el ejercicio induce un aumento en la
expresin de TGF, en msculos de animales distrficos mdx. La figura 4 muestran
mediante anlisis de RT-PCR y RT-PCR en tiempo real, que el ejercicio induce
significativamente la expresin del mRNA para TGF en el msculo esqueltico de
ratones mdx. Para determinar si el aumento de la expresin de TGF, se correlaciona con
un aumento en la actividad de su ruta de sealizacin cannica, evaluamos mediante
inmunofluorescencia indirecta, en cortes histolgicos de msculo esqueltico, el nmero de
ncleos positivos para la protena smad-3 fosforilada. Como se demuestra en la figura 5, el
nmero
de
clulas
positivas
para
la
protena
smad-3
fosforilada,
aumenta
significativamente en respuesta al ejercicio en el msculo de ratones mdx y no as en

msculos de animales control. Este aumento en el nmero de ncleos positivos se relaciona
directamente con un aumento en el nmero de clulas infiltradas en el tejido, ya que no se
mdx
Ejercicio
+ mdx
mdx
+mdx
Ejercicio
(meses)
0 +
0
0
1 - 1 1 +2 2
32 3 3
PARACTIN
-
Ejercicio
meses)
Ejercicio
((meses)
TGF- CTGF CTGF
CTGF
28s
Niveles relativos de expresin del

mRNA para TGF-

4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
28s 28s
28s
01
21
2
3
43
Ejercicio (meses)
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresin de TGF- en

msculos distrficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a
protocolos de ejercitacin 3 veces por semana a una velocidad de 12 metros por
minuto, por un perodo de 1, 2 y 3 meses. Al finalizar el protocolo se procedi a
extraer el RNA total del msculo tibialis anterior para evaluar la expresin de TGF en este msculo. A) Se evalu la expresin de TGF- mediante RT-PCR. B) Del
mismo modo se evalu en forma cuantitativa los niveles del mensajero para TGF-
mediante RT-PCR en tiempo real.
C57 BL/10 Sedentario
C57 BL/10 ejercitado
mdx Sedentario
mdx ejercitado
50 m
B
100
%Nucleos positivos para smad-3

fosforilada/nucleos totales
90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el nmero ncleos positivos para la

protena smad-3 fosforilada en ratones mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de
edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana, durante 3 meses.
A. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el msculo tibialis anterior para mediante
inmunofluorescencia para el nmero de ncleos positivos para la protena smad 3
fosforilada (rojo). B. Razn entre ncleos positivos para smad-3 fosforilada y ncleos
totales..
observaron cambios en la razn entre ncleos positivos y ncleos totales. Un blanco de

TGF es CTGF, por esta razn evaluamos mediante RT-PCR y RT-PCR en tiempo real,
la expresin del mRNA de CTGF en respuesta al ejercicio en ratones mdx. La figura 6
muestra, mediante ensayos de RT-PCR y RT-PCR en tiempo real, que el ejercicio indujo la
expresin del mRNA de CTGF en el msculo esqueltico de ratones distrficos mdx.
En este modelo de induccin de TGF y CTGF, por protocolos de ejercitacin, en
msculo esqueltico de ratones mdx, estudiamos el efecto del antiinflamatorio de origen
botnico, andrograflido. La figura 7 muestra mediante anlisis de expresin, que el
andrograflido disminuye los niveles basales del mRNA de TGF, pero no su induccin
por ejercicio. Dado este resultado, en el cual mostramos que el andrograflido no tiene
efectos sobre los niveles de expresin de TGF inducidos por ejercicio, decidimos evaluar
a expresin de su mediador ro abajo CTGF mediante anlisis de expresin (RT-PCR y RTPCR en tiempo real). A diferencia de lo observado para TGF, La figura 8 muestra que el
andrograflido inhibe la induccin de CTGF en respuesta al ejercicio, en el msculo de
animales distrficos. Estos resultados, en conjunto, muestran que el andrograflido slo
afecta la expresin de CTGF y no la de TGF inducida por ejercicio. Como TGF,
induce a CTGF y para ahondar en un posible mecanismo de accin del andrograflido,
evaluamos si este ltimo, afectaba la ruta de sealizacin cannica activada por TGF.
Por esta razn, estudiamos mediante inmunofluorescencia indirecta, el efecto del
andrograflido sobre la fosoforilacin de smad-3 (figura 9), observando que el
andrograflido disminuy el aumento en el nmero de ncleos positivos para smad-3
fosforilada en ratones mdx ejercitados, no obstante la razn entre ncleos positivos para la
protena smad 3 fosforilada y ncleos totales no fue afectada (figura 10), lo cual sugiere
mdx
Ejercicio (meses)
0 1 2 3
CTGF
28s

Niveles relativos de expresin
del mRNA para CTGF
3
2,5
2
3
3
4
2
1,5
1
0,5
0
0
1
1
2
Ejercicio (meses)

distrficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de
ejercitacin 3 veces por semana durante 1, 2 y 3 meses. A) Se evalu de forma
cualitativa la expresin de CTGF mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evalu
en forma cuantitativa los niveles del mensajero para CTGF mediante RT-PCR en
tiempo real.
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
TGF-
28s

mRNA para TGF-

2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Figura 7. El andrograflido no afecta la induccin de TGF- en ratones mdx

ejercitados. Ratones mdx tratados o no con andrograflido, fueron ejercitados
durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el
protocolo se procedi a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar
A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresin del mRNA de TGF- como
tambin en forma cuantitativa a travs de RT-PCR en tiempo real (B).
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
CTGF
28s
B
mRNA para CTGF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Figura 8. El Andrograflido inhibe la induccin de CTGF en msculo de

ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con Andrograflido fueron
ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al
finalizar el protocolo se procedi a extraer RNA total del musculo Gastronemio para
determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresin de CTGF como
Ejercicio
+ +
50 m
mdx
C57BL/10
Figura 9. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para smad-3

fosforilada en ratones mdx ejercitados. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad, tratados o no con el
Andrograflido, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana. Al finalizar el protocolo se
procedi a aislar el musculo tibialis anterior para evaluar mediante inmunofluorescencia indirecta el nmero de
ncleos positivos para la protena smad-3 fosforilada (rojo).
Andrograflido
A
Nucleos positivos para smad-3 fosforilada
100
90
80
70
60
mdx
C57BL/10
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
100

90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
Figura 10. El andrograflido inhibe el aumento clulas positivas para smad-3

fosforilado en respuesta al ejercicio en ratones mdx. Ratones mdx y C57BL/10
fueron ejercitados durante 3 meses. Al finalizar el protocolo se realiz una
inmunofluorescencia para la protena smad-3 fosforilada. A. cuantificacin del
promedio total de ncleos por seccin. B. Proporcin de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada y ncleos totales (DAPI).
una disminucin en el nmero de clulas positivas para la protena smad3 fosforilada

presente en el tejido.
Conclusiones objetivo 1.1. El andrograflido inhibe la expresin de CTGF, pero no la de

TGF inducida por ejercicio en msculos de ratones mdx. El aumento en la expresin de
TGF se correlaciona con un aumento en el nmero de clulas positivas para smad-3
fosforilada. El andrograflido disminuye el nmero de clulas positivas para smad-3
fosforilada inducidas por ejercicio en el msculo de ratones mdx.
en msculos distrficos.
Los resultados del objetivo anterior sugieren que existe una regulacin del nmero
de clulas presentes en el tejido muscular distrfico en respuesta al ejercicio y al
andrograflido. El msculo esqueltico distrfico se caracteriza por presentar un alto
nmero de clulas inflamatorias (Macrfagos, linfocitos, etc.), muchas de las cuales son
capaces de responder a TGF. En colaboracin con el laboratorio del Dr. James Tidball
(University of California Los ngeles, Estados Unidos) estudiamos la presencia de clulas
inflamatorias en el msculo esqueltico de ratones mdx y el efecto del andrograflido sobre
estas poblaciones. Mediante inmunohistoqumica determinamos la presencia de macrfagos
(F4/80 positivos), linfocitos ayudadores (CD4 positivos, CD4+), linfocitos cito-txicos
(CD8 positivos, CD8+) y eosinfilos (MBP positivos, MBP+). Las figuras 11 y 12
muestran que el andrograflido redujo significativamente el nmero de macrfagos
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
Figura 11. El Andrograflido disminuye el numero de macrfagos en el msculo distrfico de

ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas
con Andrograflido, para luego evaluar mediante inmunohistoqumica en el musculo Gastronemio
(A)y diafragma (B), la presencia de macrfagos (F4/80).
16000
14000
Clulas/mm2
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Macrofagos
Eosinlos
CD4+
CD8+
mdx + Vehculo
12145
4635
841
339
mdx + PARACTIN
6323
2298
417
170
Figura 12. El Andrograflido disminuye el numero de clulas inflamatorias en el msculo

distrfico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes
2 semanas con Andrograflido, para luego evaluar mediante inmunohistqumica en el musculo
quadriceps, la cantidad de clulas inflamatorias presentes por unidad de area. A) inmuhistoqumica
para diferentes tipos de clulas inflamatorias encontradas en el msculo distrfico, eosinfilos
(MBP), macrfagos (F4/80), Linfocitos citotxicos (CD8+) y linfocitos ayudadores (CD4+). B)
Cuantificacin del numero total de clulas inflamatorias encontradas en el musculo de los animales
distrficos tratados o no con el Andrograflido.
infiltrados en el msculo distrfico de animales mdx, como tambin la cantidad de otras

clulas de origen inflamatorio como los eosinfilos, los linfocitos T cito-txicos (CD8+) y
los linfocitos T ayudadores (CD4+).
La infiltracin de clulas inflamatorias en un tejido, se correlaciona con un
incremento en el dao tisular y con un aumento en el contenido de MEC (fibrosis). Por esta
razn, estudiamos el fenotipo muscular mediante tincin de hematoxilina/eosina y la
deposicin de protenas de MEC, como colgeno tipo III, mediante ensayos de
inmunofluorescencia indirecta. La figura 13 muestran que el andrograflido inhibi la
induccin de fibrosis por ejercicio en el msculo esqueltico de ratones mdx, como tambin
inhibi el nmero de sitios de alta infiltracin inflamatoria. Al evaluar especficamente los
niveles de MEC, mediante inmunofluorescencia indirecta, para detectar el contenido de
colgeno tipo III alrededor de las fibras musculares, observamos que el andrograflido
inhibi el aumento de esta molcula de MEC inducida por ejercicio en msculos distrficos
(Figura 14). Estos resultados fueron corroborados mediante ensayos de western blot
determinando los niveles de la protena colgeno tipo III y de otra protena de MEC como
lo es fibronectina (Figura 15). Los resultados muestran que el ejercicio no es capaz de
inducir fibrosis muscular en animales distrficos que han sido tratados con el
andrograflido.
Conclusin 1.2. El andrograflido inhibi la induccin por el ejercicio, de protenas de

MEC como colgeno tipo II y fibronectina, en ratones mdx. Adems, el andrograflido
disminuy el nmero de clulas inflamatorias, especialmente macrfagos, en el msculo
-
-
+
-
-
+
+ +
50 m
Figura 13. El Andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos. Ratones mdx de 3
meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al
finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante tincin de
Hematoxilina/Eosina.
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
-
-
+
-
-
+
+ +
50 m
Figura 14. El Andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos ditsrficos. Ratones
mdx de 3 meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3
meses. Al finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante
inmunofluorescencia indirecta para detectar la protena de MEC, colgeno tipo III (verde).
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
A
C57BL/10
Ejercicio
Ejercicio
Andrograflido
PARACTIN
+ -
mdx
+ +
+
+ +
+ -
+
FN
Col III
GAPDH
mdx
Ejercicio
Paractin
Ejercicio
Andrograflido
-
-
+ -
+
-
+ +
FN
Tub
Figura 15. El Andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx. A.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrograflido y
adems fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisl
el msculo Tibialis Anterior y se procedi a realizar un extracto de protenas para determinar los
niveles de Fibronectina (FN) y colgeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot.
Como control de carga se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Ratones mdx de 2
semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrograflido) y a partir de los
3 meses de edad fueron tambin ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el
protocolo, se aisl el msculo Tibialis Anterior y se procedi a determinar los niveles de
fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evalu la protena
Tubulina (Tub).
esqueltico distrfico. Por ltimo, el andrograflido inhibi la induccin de fibrosis e

inflamacin muscular inducida por ejercicio en msculos distrficos.

inducida por TGF.

En los captulos anteriores, los resultados sugieren que el andrograflido inhibe la

induccin de fibrosis e inflamacin en el msculo esqueltico de ratones mdx y que este
efecto se correlaciona con un efecto ro abajo de TGF y ro arriba de CTGF. Por esta
razn, para ahondar en este mecanismo, evaluamos, in vitro, si el andrograflido afecta la
expresin del mediador ro abajo de TGF, CTGF. Para ello utilizamos la lnea celular de
msculo C2C12 la cual fue incubada con TGF durante 6 horas en presencia y ausencia
de andrograflido para determinar posteriormente mediante ensayos de northern blot la
expresin del mRNA para CTGF. Como se observa en la Figura 16, el andrograflido
inhibi la expresin de CTGF inducida por TGF en clulas musculares C2C12. La dosis
ptima de andrograflido para efectuar el efecto inhibitorio fue de 50 . Del mismo
modo, evaluamos en clulas musculares C2C12, el efecto del andrograflido sobre la
induccin de protenas de MEC, mediante ensayos de western blot e inmunofluorescencia
indirecta. La figura 17 muestra que una dosis de 50 de andrograflido es capaz de
inhibir la induccin de protenas de MEC como fibronectina y colgeno tipo III. Asimismo,
evaluamos los niveles proteicos de CTGF inducidos por TGF en presencia y ausencia del
andrograflido (figura 17), encontrando similares efectos a los encontrados mediante
northern blot en la figura 16, en el cual el andrograflido inhibi la induccin de CTGF por
A
--
-- -- -- --
--
--
+ + + + TGF- 1 (10 ng/ml)
50 25 12.5 -- 50 25 12.5 Andrograflido (M)
CTGF
B
--
-- -- + + + TGF- 1 (10 ng/ml)
--
50 --
--
50 25
--
Andrograflido (M)
CTGF
28S
18S
Figura 16. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF por TGF-. Clulas

musculares C2C12 fueron incubadas durante 6 horas con TGF- en presencia y
ausencia de Andrograflido, al finalizar la incubacin se procedi a extraer el RNA
total de los extractos para evaluar mediante ensayos de Northern Blot los niveles de
expresin del mRNA de CTGF en respuesta a TGF-. Como control de carga se
muestran las subunidades ribosomales 28s y 18s.
mdx
TGF-
TGF- (10
ng/ml)
+ +
Andrograflido
(50M)
PARACTIN
+ -
+
FN
COL III
CTGF
GAPDH
Figura 17. El Andrograflido inhibe la induccin de protenas de MEC por
TGF- en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas
durante 24 horas con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido. Finalizado
el protocolo se evalu mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina,
Colgeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utiliz la protena GAPDH.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + Andrograflido
TGF- + PARACTIN
Figura 18. El Andrograflido inhibe la insuccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de Andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo se evalu mediante inmunofluorescencia
indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulacin de Colgeno tipo III
(verde). En azul (Hoechst) se muestran los ncleos celulares.
TGF. Para caracterizar la localizacin extracelular de estos componente de la MEC,

evaluamos mediante inmunofluorescencia indirecta en clulas musculares C2C12 no
permeabilizadas, la deposicin de Colgeno tipo III en respuesta a TGF. La figura 18
muestra la inhibicin de la induccin de colgeno tipo III por TGF, cuando las clulas
estn en presencia de andrograflido o extractos enriquecidos en l (PARACTIN). Para
demostrar que el colgeno se encuentra depositado sobre la MEC y no adherido a las
clulas, realizamos una inmunofluorescencia, en la cual previamente las clulas fueron
soltadas con una solucin tampn que contena EDTA (figura 19), observando que el
andrograflido ininibi la induccin de colgeno tipo III depositado en la MEC por TGF
en clulas musculares C2C12. Para determinar si este efecto era capaz de replicarse en
otros tipos celulares presentes en los msculos, como fibras musculares y fibroblastos,
evaluamos mediante ensayos de western blot, el efecto del andrograflido sobre la
induccin de protenas de MEC (colgeno tipo III y fibronectina) en clulas musculares
C2C12 diferenciadas (miotubos) y en fibroblastos (lnea celular de fibroblastos 3T3). Los
resultados de la figura 20 muestran que el andrograflido tambin fue capaz de inhibir la
induccin de colgeno tipo III y fibronectina en estos tipos celulares.
Dado los efectos inhibitorios del andrograflido sobre la accin de TGF
observados in vitro, decidimos determinar si el andrograflido poda actuar del mismo
modo in vivo. Para ello inyectamos con TGF msculos tibialis anterior de ratones control
tratados o no con el andrograflido, para evaluar mediante RT-PCR en tiempo real, la
expresin de molculas de MEC y de marcadores relacionados con inflamacin. Como se
puede observar en la figura 21, TGF indujo la expresin de colgeno tipo I, la cual fue
inhibida en ratones tratados con andrograflido. Asimismo, TGF indujo la expresin de
Control
Andrograflido
Paractin
TGF- + Paractin
Hoechst
TGF-
Figura 19. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo, las clulas fueron soltadas utilizando el
quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia
indirecta, la deposicin de Colgeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran
los ncleos celulares. Se utiliz la tincin Hoechst para demostrar que la seal es
proveniente de la MEC y no de clulas adheridas.
A
TGF-

Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col III
Tub
B
TGF-

Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col III
Tub
Figura 20. El Andrograflido inhibe la induccin de protena de MEC por
TGF- en miotubos y fibroblastos. A. Clulas musculares C2C12 fueron
diferenciadas para formar miotubos, al da 5 de diferenciacin fueron incubadas
el protocolo se evalu mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina
y colgeno tipo III, como control de carga se utiliz la protena GAPDH. B.
Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y
ausencia de Andrograflido. Finalizado el protocolo se evalu mediante ensayos de
western blot los niveles de fibronectina y colgeno tipo III, como control de carga
se utiliz la protena GAPDH.
B
12
Veces de induccin IFN-gamma
Veces de induccin C olgeno

D68
tipo
I
A
12 10
10 8
8 6
6
4
2
4
2
0
12
10
8
6
4
2
Vehculo
D
12
12
Veces de induccin C D 206
Veces de induccin C D68
TGF-
+
BSA
TGF-
BSA ++
TGFb
+ Vehiculo
TGFb ++
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
+
BSA BSA
+ Vehiculo
TGF-
+ +
BSA
+ +
BSA
+ +
TGF-
+ +
Adv
GFP
Adv
GFP
Adv
C TGF
Adv
C TGF
Vehculo
0
Vehiculo Andrograflido
Andrograflido Vehculo
Andrograflido
TGF- +
BSA +
+
TGF- +
TGFb BSA
+ Vehiculo
TGFb +
TGFb
+ Vehiculo
TGFb +
Andrograflido
Andrograflido
10
8
6
4
2
10
8
6
4
2
0
TGF- +
BSA +
TGF- +
TGFb +
TGFb
+ Vehiculo
TGFb +
Andrograflido
+
TGFb BSA
+ Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF-
+
BSA
TGF-
TGFb ++
TGFb
+ Vehiculo
TGFb ++
Andrograflido
+
TGFb BSA
+ Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
Figura 21. El andrograflido inhibe la inflamacin inducida por TGF- en el

msculo esqueltico. Msculos tibialis anterior de ratones C57 BL/10 tratados o no
con andrograflido, fueron inyectados con TGF-b1, para evaluar mediante RT-PCR
en tiempo real, los niveles de expresin de molculas relacionadas con fibrosis
como colgeno tipo I (A) e inflamacin como IFN- (B), adems se evaluaron los
niveles de expresin de marcadores celulares especficos de macrfagos del tipo M1
como es CD68 (C) y de macrfagos M2 como CD 206 (D).
marcadores inflamatorios como IFN-, marcadores especficos de macrfagos del tipo M1

(CD68) y de macrfagos M2 (CD206), efectos que fueron inhibidos por el andrograflido.
No obstante, es interesante destacar que el andrograflido mostr un efecto inhibitorio
mayor sobre la induccin de marcadores de macrfagos M1 en comparacin a los de
macrfagos M2.
Estos resultados muestran que los efectos inhibitorios del andrograflido sobre la
accin de TGF, pueden replicarse in vivo. Gran parte de los efectos pro-fibrosantes son
mediados a travs de las protenas smad (ruta de sealizacin cannica) y el andrograflido
es un inhibidor covalente de la subunidad p50 de NFB, por ende, para descartar un efecto
del andrograflido sobre las rutas de activacin cannica de TGF, evaluamos, in vitro, si
el andrograflido afectaba la fosforilacin de las protenas smad 2/3. La figura 22 muestra
un western blot para la protena smad-3 fosforilada de extractos provenientes de clulas
musculares C2C12 tratadas con TGF en presencia y ausencia de andrograflido. Se
puede observar que el andrograflido no tuvo un efecto significativo sobre la fosforilacin
de smad-3. Para corroborar este resultado, realizamos inmunofluorescencia indirecta para la
protena smad-3 fosforilada y de esta forma evaluar si la translocacin nuclear de esta se
encontraba afectada. En la figura 23 se observa que el andrograflido, como tambin el
extracto enriquecido en l (PARACTIN), no afecta la translocacin nuclear de la protena
smad-3 fosforilada en respuesta a TGF. Por ltimo, realizamos ensayos de genes
reporteros especficos para TGF encontrando que el andrograflido no tuvo efecto sobre
la induccin de este reportero (Figura 24). Estos resultados sugieren que el andrograflido
no afecta la va de sealizacin cannica activada por TGF.
TGF- (1ng/ml)
Andrograflido(50M)
-
-
- +
+ -
+
p-smad3
smad3
Figura 22. El Andrograflido no afecta la fosforilacin de smad-3 inducida por

durante 30 min. con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar
mediante ensayos de western blot la fosforilacin de la protena smad-3. Como
control se determinaron los niveles de la protena smad-3 total.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + PARACTIN
Figura 23. El Andrograflido no afecta la translocacin nuclear de smad-3

inducida por TGF- en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron
incubadas durante 1 hora con TGF-, en presencia y ausencia de Andrograflido y
PARACTIN, para evaluar mediante inmunofluorescencia la translocacin nuclear
de la protena smad-3 fosforilada (verde).
Veces de induccin reportero p3Tp-Luc
25
20
15
10
5
0
control
TGF-b
andrograflido andrograflido
+ TGF-b
Figura 24. El andrograflido no afecta la induccin del reportero especifico para

TGF-, p3Tp-Luc en mioblastos C2C12. Mioblastos C2C12 fueron transfectadas
transitoriamente con el reportero especifico para TGF-, p3Tp-Luc, para luego ser
estimuladas durante 48 horas con 10ng/ml de TGF-1 en presencia y ausencia de 50
M de andrograflido. Finalizado el protocolo se determin la actividad de la enzima
luciferasa.
Dado que est descrito que el andrograflido inhibe a NFB y en esta investigacin
hemos demostrado que adems inhibe los efectos de TGF decidimos determinar si
TGF es capaz de activar a NFB en clulas musculares C2C12. Existen ciertos eventos
necesarios que conllevan a la activacin de NFB, como la fosforilacin de IB y la
posterior degradacin de este. La figura 25a muestra que TGF induce la fosforilacin de
IB, adems observamos que esta fosforilacin trajo por consecuencia la degradacin de la
protena IB (figura 25b). Para corroborar la observacin de que TGF podra activar la
ruta de sealizacin de NFB en clulas musculares, evaluamos la actividad de un gen
reportero que posee elementos de respuesta especficos para NFB en respuesta a TGF
en clulas musculares C2C12. Los resultados obtenidos sugieren que TGF es capaz de
inducir la actividad del reportero para NFB y que esta es inhibida completamente por el
andrograflido (Figura 26). Adems, se observa que existe una menor actividad del
reportero en las clulas no inducidas con TGF pero tratadas con andrograflido, lo cual
indica una inhibicin de la actividad basal de NFB en estas clulas.
Conclusiones objetivo 1.3: El andrograflido inhibe los efectos pro-fibrosantes y proinflamatorios inducidos por TGF de una manera smad independiente. Adems TGF es
capaz de activar la ruta cannica de NFB en clulas musculares C2C12, la cual es inhibida
por el andrograflido.
TGF-
(1ng/ml)
TGF-PARACTIN

Andrograflido
(TGF-
50M)
Andrograflido
-
+ +
--
+
+ ++
+
+
+ - -- +++
- -
-
- -
P-P-IB
IB
IB
IB total
IB total
B
60
60
60 3360
-
-
PARACTIN
TGF-
--
P-IB
(1ng/ml)
TGF-TGF-
(1 ng/ml)

IB
-
+ +
+ -
+
Veces de induccin gen
reportero NFB
Figura 25. TGF- es capaz de activar la ruta de activacin cannica de NFB

en clulas musculares C2C12. A) Clulas musculares C2C12 fueron incubadas
durante 30 min. con TGF-b en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar
mediante western blot la fosforilacin de la protena IB, como control positivo se
utiliz TNF-. B) Clulas musculares C2C12 fueron incubadas con TGF- durante
60 y 360 min. en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar mediante
western blot los niveles de la protena IB, como control positivo se utiliz TNF-.
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Andrograflido (50 M)
PARACTIN
H2O2
TGF- (10 ng/ml)
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
Figura 26. TGF- induce la actividad de un reportero para NFB en clulas

musculares C2C12. Clulas musculares C2C12 fueron transfectadas con un
reportero especfico para NFB y posteriormente fueron incubadas durante 24 horas
con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido y/o PARACTIN. Como
control positivo de la induccin del reportero se utiliz H2O2 (200 M).
1.4. Evaluar el efecto del andrograflido en la inflamacin y la fibrosis muscular

inducida por CTGF.
En el objetivo anterior demostramos que el andrograflido inhibe los efectos profibrticos y pro-inflamatorios inducidos por TGF tanto in vivo como in vitro. Por lo
tanto, nos planteamos estudiar si este efecto era exclusivo para TGF o tambin poda
afectar los efectos de su mediador ro abajo CTGF. Un ensayo para determinar la actividad
de CTGF, es evaluar la formacin de fibras de estrs en respuesta a CTGF en clulas
musculares C2C12. La figura 27 muestra, a travs de inumonofluorescencia, que en clulas
tratadas con andrograflido, CTGF no es capaz de inducir la formacin de fibras de estrs,
lo cual sugiere que el andrograflido no slo afecta la expresin de CTGF, como se mostr
en el sub objetivo anterior, sino que tambin tiene un efecto ro abajo de la sealizacin de
CTGF (figura 27).
En nuestro laboratorio, Gabriela Morales (Morales y cols., 2011) demostr que
CTGF es capaz de inducir fibrosis en el msculo esqueltico de ratones control. Por ello,
decidimos evaluar si el andrograflido era capaz de inhibir, in vivo, los efectos profibrosantes inducidos por CTGF. Para tal efecto, ratones control fueron tratados o no con
andrograflido e inyectados en el msculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene
la secuencia codificante para CTGF. La figura 28 muestra una inmunohistoqumica para
colgeno tipo III en cortes histlogicos de msculo Tibialis Anterior, en donde se observa
que el andrograflido inhibi la induccin de este marcador de MEC por CTGF. Adems,
mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real (figura 29), evaluamos los niveles de
expresin de marcadores de fibrosis (colgeno tipo I) e inflamacin (IFN-, CD68 y
Control
Andrograflido
CTGF
CTGF + Andrograflido
Figura 27. El andrograflido inhibe la formacin de fibras de estrs inducida

por CTGF en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron preincubadas durante 2 horas con andrograflido para luego ser co-incubadas con
CTGF durante 1 hora. Al finalizar la incubacin las muestras fueron estudiadas
mediante inmunofluorescencia utilizando la toxina faloidina acoplada a FITC
(verde).
Adv CTGF + PBS
Adv CTGF + Andrograflido
100 m
Figura 28. El andrograflido inhibe el aumento de colgeno tipo III inducido

por CTGF en el msculo esqueltico. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el
msculo Tibialis Anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante
para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrograflido durante 2
das previos a la inyeccin y durante los 5 das posteriores a la inyeccin. Se evalu
mediante inmunohistoqumica la protena de MEC colgeno tipo III.
B
12
12
Veces de induccin Colgeno tipo I
A
10
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
Adv
+
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
BSA
+ VGFP
ehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
+
BSA
+ PGFP
ARACTIN
Andrograflido
TGFb
Vehiculo
Adv+CTGF
+
Vehculo
Adv+ CTGF
+
TGFb
PARACTIN
Andrograflido
D
12
Veces de induccin CD 206
12
Veces de induccin CD68
10
10
8
6
4
10
8
6
4
2
0
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
+
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Adv
Andrograflido
Vehiculo
PARACTIN
Vehculo

andrograflido es capaz de inhibir estos efectos. Msculos tibialis anterior de
ratones C57BL/10 tratados o no con andrograflido, fueron inyectados con un
adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF, para evaluar mediante
real time RT-PCR, los niveles de expresin de molculas relacionadas con fibrosis
como es CD68 (C) y de macrfagos M2 CD206 (D).
CD206), observando que CTGF no solo acta como un pro-fibrtico sino que tambin tiene
actividad pro-inflamatoria. Ambos tipos de actividades fueron inhibidas por el
andrograflido, teniendo este un mayor efecto sobre la induccin de marcadores del tipo
M1 (CD68) por sobre M2 (CD206). Para ahondar en este tema, evaluamos mediante
inmunofluorescencia indirecta la presencia de clulas inflamatorias, especficamente
macrfagos, en el msculo esqueltico de animales tratados o no con el andrograflido que
fueron inyectados con el adenovirus codificante para CTGF. La figura 30 muestra que
CTGF indujo una elevada infiltracin macrofgica tanto del tipo M1 (F4/80 positivos y
CD206 negativos) como del tipo M2 (F4/80 positivos y CD206 positivos). El
andrograflido disminuy considerablemente esta respuesta inflamatoria inducida por
CTGF, teniendo un efecto principalmente sobre la respuesta inflamatoria del tipo M1 como
se puede observar en la figura 31.
Conclusiones objetivo 1.4. El andrograflido inhibe, in vitro, la formacin de fibras de

estrs inducidas por CTGF. CTGF no solo es capaz de inducir fibrosis, sino que tambin
induce inflamacin en el msculo esqueltico. El andrograflido inhibi tanto los efectos
pro-fibrosantes como los pro-inflamatorios inducidos por CTGF, afectando principalmente
la respuesta inflamatoria del tipo M1 inducida por CTGF.
Conclusiones generales objetivo 1. TGF es capaz de activar a NFB en clulas

musculares y el andrograflido es capaz de inhibir los efectos de TGF de una manera
smad independiente. CTGF y TGF tienen efectos pro-fibrticos y pro-inflamatorios en el
msculo esqueltico, los cuales son inhibidos por el andrograflido.
A
Adv CTGF + PBS
50 m
50 m
Figura 30. CTGF induce un aumento en la infiltracin de macrofgos en el

musculo esqueletico y el andrograflido inhibe este efecto. Ratones C57BL/10
fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la
secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con
andrograflido durante 2 das previos a la inyeccin y durante los 5 das posteriores
a la inyeccin. A) Se evalu mediante inmunofluorescencia utilizando los
anticuerpos anti F4/80 (verde) y CD206 (rojo) para determinar los tipos de
poblaciones presentes en el tejido. Los macrofagos del tipo M1 (F4/80 positivos y
CD206 negativos) se observan en verde, mientras los macrfagos del tipo M2
(F4/80 positivos y CD206 positivos). Se observan en color amarillo. (B) Para
determinar de forma ms especfica la presencia de macrfagos M1, determinamos
mediante inmunohistoqumica la presencia de estos utilizando el anticuerpo anti
CD68.
B
2000
N de Macrfagos M2/mm2
1600
1400
1200
1000
800
600
400
Macrfagos M2
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
200
Adv CTGF + Vehculo
Adv CTGF + Vehculo
100
% de Macrfagos M1 o M2/
Macrfagos totales
2000
Macrfagos M1
1800
90
80
70
60
50
Macrfagos M1
40
Macrfagos M2
30
20
10
0
Adv CTGF + Vehculo
Figura 31. El andrograflido disminuye principalmente el nmero de

Macrfagos M1 inducidos por CTGF en el msculo esqueltico. Ratones
C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que
contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente, los ratones fueron
tratados con andrograflido durante 2 das previos a la inyeccin y durante los 5
das posteriores a la inyeccin. A) Cuantificacin del nmero de macrfagos M1
por unidad de rea, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y
CD206 negativos). B) Cuantificacin del nmero de macrfagos M2, evaluados
mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 positivos) por unidad de
rea. C) Porcentaje del nmero de macrfagos M1 y M2 versus el nmero total de
Macrfagos.
2. Determinar si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta

la migracin celular, la eficiencia de las terapias celulares y la funcin
muscular.
2.1. Evaluar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido facilita la migracin

celular en el msculo esqueltico.

En el objetivo 1, hemos demostrado que tanto TGF y CTGF poseen efectos proinflamatorios y pro-fibrosantes y que adems el andrograflido es capaz de inhibir estos
efectos. No obstante, consideramos importante y necesario evaluar el impacto de estos
fenmenos patolgicos en la fisiologa del msculo esqueltico. Observamos que tanto
CTGF y TGF se relacionan con un deterioro del fenotipo muscular y que estos
fenmenos pueden ser reveritidos por el andrograflido, Sin embargo no queda claro cules
son los procesos celulares que la fibrosis podra estar afectando. Por un lado, para que
exista una correcta reparacin de las fibras daadas, las clulas precursoras deben llegar a
tiempo a los sitios en donde comenzarn a formar fibras musculares nuevas, por lo tanto, es
plausible pensar que en el tejido muscular fibrtico este proceso se vea dificultado. Por otra
parte, no necesariamente un msculo distrfico con menor grado de fibrosis se traducir en
un msculo de mejores caractersticas funcionales o contrctiles.
Para determinar si la fibrosis propiamente tal, afecta la migracin celular en
msculos distrficos, aislamos fibroblastos de tendn, los cuales tienen un alta capacidad
migratoria adems de tener la facultad de sobrevivir en zonas con alto contenido de MEC y
bajo contenido de oxigeno (Gargioli y cols., 2008). Estos fibroblastos fueron teidos con
una sonda lipoflica fluorescente (DiI) y fueron inyectados en el msculo tibialis anterior.
Luego de un mes los msculos fueron procesados para anlisis inmunohistolgicos. La
figura 32 muestra que la migracin se ve disminuida en msculos de animales distrficos
con un mayor grado de fibrosis (msculo ejercitado), el tratamiento previo con el
andrograflido para inhibir la induccin de fibrosis, logr recuperar a niveles control la
migracin celular. Del mismo modo, en la figura 33 se puede observar como las clulas
migratorias migran hacia zonas con menor deposicin de colgeno tipo III.
Conclusin objetivo 2.1. La fibrosis producto del ejercicio inhibe la migracin celular en
msculo de ratones mdx, efecto que puede revertirse con el tratamiento con adrograflido.
Del mismo modo, fibroblastos migratorios se distribuyen preferentemente en zonas con
bajo contenido de MEC.

nmero de fibras capaces de revertir distrofina
Como demostramos en el sub objetivo anterior la fibrosis afecta la migracin

celular, impidiendo que las clulas puedan distribuirse en forma homognea en el tejido,
este efecto fue revertido por el uso del andrograflido, por dicha razn decidimos evaluar si
la inhibicin de la fibrosis por el andrograflido es capaz de incrementar la eficiencia de las
terapias celulares cuya finalidad es la de re-expresar la protena distrofina en las fibras
musculares de msculos distrficos. Para tal efecto, ratones mdx fueron tratados
previamente con el andrograflido para disminuir la fibrosis y luego fueron trasplantados
mdx sedentario + vehculo
mdx ejercitado + Andrograflido
mdx ejercitado+ Andrograflido
30
25
20
15
10
5
0
Ejercicio
Andrograflido
- 1
-
+ 2
-
- 3
+
4
+
+
Figure 32. La fibrosis inhibe la migracin celular y el andrograflido revierte este efecto.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrograflido y adems
ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedi a inyectar 5 millones de
clulas migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis
Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyeccin se cuantific el nmero de clulas
encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyeccin en relacin al numero total de clulas
encontradas por seccin. En verde se muestra la protena colgeno tipo III teida mediante
inmunofluorescencia. B. Cuantificacin del porcentaje de clulas encontradas en zonas
alejadas al sitio de la inyeccin (mayor a 1 mm de distancia).
% de celulas migratorias
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
% de colgeno 6po III
Figura 33. Las clulas migratorias se encuentran preferentemente en areas

con bajo contenido de Colgeno tipo III. Msculos tibialis anterior de animales
mdx tratados o no con andrograflido, fueron inyectado con 5 millones de clulas
migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo). Luego de un mes se
procedi a realizar cortes histolgicos y del msculo para determinar el nmero de
clulas migratorias en diferentes zonas con diferentes niveles de colgeno tipo III
(verde). El contenido se colgeno se cuantifico de forma indirecta, mediante el
software image J (NIH/USA), determinando el area de la imagen ocupada por
colgeno.
en el msculo Tibialis Anterior con precursores miognicos (clulas satlites) estos ensayos
fueron realizados en colaboracin con el Dr. Jaime Gutirrez de nuestro laboratorio. La
figura 34 muestra una inmunofluorescencia doble, en donde se observa la disminucin de
la protena colgeno III (verde) en ratones mdx tratados con el andrograflido y un aumento
significativo en el nmero de fibras musculares que re-expresan la protena distrofina
(rojo), llegando a un incremente de ms de un 300% en comparacin a la reversin
observada en msculos provenientes de ratones mdx no tratados con el andrograflido.
Conclusiones 2.2. El tratamiento previo con andrograflido aumenta el nmero de fibras

musculares que re-expresan distrofina en msculos distrficos trasplantados con clulas
miognicas.
2.3. Evaluar el efecto del andrograflido en la fuerza muscular
Dado que el ejercicio indujo fibrosis en el msculo esqueltico de los ratones mdx y
sta es disminuida por el andrograflido (como se observ en el objetivo 1), nos
propusimos determinar cmo estos eventos afectan la funcionalidad muscular. De esta
forma, nos enfocamos en determinar directamente la fuerza muscular desarrollada en
msculos aislados, mediante tcnicas de electrofisiologa. Primero se procedi a determinar
la frecuencia en la cual el msculo desarrolla una contraccin mxima (sacudida),
realizando un barrido de 0 a 200 pulsos/segundo (pps) (De Luca y cols., 2005). En la figura
35 se observa una medicin electrofisiolgica para el msculo Gastronemio, en donde se
aprecia una curva tpica de frecuencia versus fuerza muscular tanto para el msculo de
Vehculo
Andrograflido
# Fibras distrona (+) / Tibialis

Anterior
200
160
120
80
40
0
mdx + Vehculo
mdx + PARACTIN

celular. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados durante 2 meses con
andrograflido. Finalizado este tratamiento se esperaron 2 semanas para luego trasplantar
mioblastos de musculo control en el musculo Tibialis Anterior de estos ratones. A) Al cabo
de 1 mes se procedi a analizar los msculos mediante inmunofluorecencia indirecta para
determinar el numero de fibras capaces de expresar distrofina (rojo). Para demostrar que los
msculos provenientes de ratones mdx tratados con andrograflido presentan menos
fibrosis, realizamos inmunofluorescencia para la protena de MEC (colgeno tipo III)
mostrada en color verde, en azul se muestran los ncleos celulares teidos con Hoechst. B)
cuantificacin del numero de fibras musculares positivas para distrofina.
35
30
mN/mm2
25
20
* *
C57
+ Vehculo
C57 BL/10
+ Vehculo
C57
+ Andrograflido
C57 BL/10
+ PARACTIN
mdx
+ Andrograflido
mdx BL/10
+ PARACTIN
15
mdx
+ Vehculo
mdx BL/10
+ Vehculo
10
5
0
0
20
40
60
Frecuencia (pps)
80
100
Figura 35. El andrograflido induce un aumento en la fuerza en msculos

distrficos. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrograflido a partir
de las 2 semanas de edad durante 4 meses. Al finalizar el protocolo se procedi a
evaluar mediante electrofisiologa la fuerza inmediata (sacudida) a diferentes
frecuencias.
ratones control como mdx tratados o no con el andrograflido. A partir de una frecuencia de
30 pps las curvas comienzan a diferenciarse significativamente, llegando el msculo del
animal control a desarrollar ms del doble de fuerza por unidad de rea que su par mdx.
Cuando se analizaron los msculos provenientes de ratones mdx y se compararon con los
provenientes de mdx tratados con andrograflido, se observ que estos ltimos desarrollan
alrededor de un 40% ms de fuerza. Este resultado es muy interesante, ya que muestra que
el andrograflido no solo inhibe la induccin de inflamacin y fibrosis, sino que a su vez es
capaz de mejorar la capacidad de generar fuerza, lo cual es vital en modelos de
enfermedades distrficas como la DMD. De la misma forma, luego de obtenida la
frecuencia mnima con la que se genera mayor fuerza contrctil, procedimos a determinar la
fuerza sostenida (ttanos) producida por estos msculos. En la figura35 podemos observar
que ratones mdx tratados con el andrograflido producen mayor fuerza contrctil llegando
incluso hasta un incremento cercano al 50%.
Se sabe que los ratones mdx presentan una disminucin en su rendimiento frente al
ejercicio cuando se comparan con ratones control. La principal caracterstica observada es
la acentuada fatiga que presentan cuando son ejercitados. De esta forma decidimos
determinar si esta caracterstica est relacionada directamente con la induccin de fibrosis.
Para dicho objetivo, montamos un protocolo para evaluar el rendimiento de los animales
frente al ejercicio (ver materiales y mtodos). En este ensayo se evalu el nmero de veces
en que los animales tienden a descansar sobre la cinta corredora. En la figura 36 se puede
observar que el nmero de veces que retrocede el ratn mdx es 5 veces mayor que sus pares
control. En contraste, los ratones mdx que recibieron el tratamiento con el andrograflido
presentan una menor fatiga, la cual en promedio es solo 3 veces mayor que las de los
30
25
mN/mm2
20
15
10
5
0
C57Bl/10 +
C57Bl/10 + mdx+ Vehculo
mdx +
Andrograflido

distrfico. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrograflido a partir
evaluar mediante electrofisiologa la fuerza tetnica producida a la mnima
frecuencia que produjo la mayor fuerza inmediata (sacudida).
30
mN/mm2
#Retrocesos
25
35
30
20
25
15
20
10
15
105
5
00
C57Bl/10 +
mdx +
C57 + Vehculo
C57 +
mdx + Vehculo
mdx +
Andrograflido
PARACTIN
PARACTIN
Figura 37. El andrograflido mejora el performance de los animales distrficos

frente al ejercicio. A. Ratones mdx y control fueron tratados o no con
andrograflido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. A partir del 6
semanas de edad comenzaron a ser entrenados en una cinta trotadora durante los
siguientes 3 meses. Luego fueron desafiados un protocolo de ejercicio extenuante
durante 5 minutos y se evalu el nmero de veces en que estos paraban y
retrocedan en la cinta trotadora, cruzando la zona demarcada con la lnea roja. B.
Cuantificacin de un promedio de 5 mediciones de 8 animales distintos para cada
tratamiento.
animales control, o dicho de otra manera alrededor de un 50% menor que la presentada por
ratones mdx no tratados. Estos resultados en conjunto sugieren que una disminucin en la
fibrosis muscular, como tambin en la inflamacin crnica en msculos distrficos
repercute positivamente en la funcionalidad del tejido muscular.
Conclusin objetivo 2.3: El tratamiento con andrograflido produjo un aumento

considerable en la fuerza desarrollada por ratones mdx. El tratamiento con el andrograflido
mejor considerablemente la resistencia de los ratones mdx frente al ejercicio, no teniendo
efectos sobre el rendimiento en ratones control, lo cual sugiere un rol especfico del
andrograflido sobre la patologa distrfica.
Conclusiones generales objetivo 3. El grado de fibrosis determina una inapropiada

migracin celular, la cual puede ser revertida con el tratamiento con andrograflido. El
tratamiento con andrograflido aumenta la eficiencia del trasplante de clulas satlite
aumentando el nmero de fibras musculares capaces de re-expresar distrofina. Por ltimo,
ratones mdx que presentan menor grado de fibrosis, gracias al tratamiento con
andrograflido, desarrollan mayor fuerza y resistencia frente a protocolos de ejercitacin.
Discusin
Gran parte de la investigacin cientfica acerca de la DMD se ha centrado en evaluar

tratamientos dirigidos a restablecer la expresin de distrofina en las fibras musculares. Para
ello las aproximaciones que han sido probadas varan desde diferentes tipos de terapias
gnicas (Bachrach y cols., 2004; van Deutekom, 2005; van Deutekom and van Ommen,
2003), potenciar la reparacin muscular, mediante la utilizacin de clulas con potencial
miognico (Auda-Boucher y cols., 2007; Sampaolesi y cols., 2006) como tambin se ha
estudiado el uso de molculas capaces de potenciar el proceso de reparacin muscular
(Bogdanovich y cols., 2002; Harcourt y cols., 2005; Minetti y cols., 2006). No obstante,
estas no han sido exitosas debido principalmente a la baja efectivad que han mostrado en
ensayos in vivo, utilizando modelos de la DMD, como el ratn mdx y perros distrdicos
(GRMD) (Gargioli y cols., 2008; Muir and Chamberlain, 2009; Sampaolesi y cols., 2006).
Los pacientes con DMD, son tratados en clnica al igual que pacientes afectados por una
patologa que cursa con inflamacin crnica, prescribindoles una vez confirmada la
ausencia de distrofina, mediante ensayos histolgicos y de PCR, el uso de corticosteroides,
los cuales han mostrado tener efectos positivos disminuyendo la inflamacin muscular, la
fibrosis y finalmente retardando el uso de sillas de ruedas y aumentando levemente la
esperanza de vida de estos pacientes. No obstante, dada la periodicidad y dosis del uso de
este tipo de frmacos, se provocan en los pacientes un sinnmero de efectos secundarios
severos e incluso acentuando los efectos invalidantes de la patologa distrfica (De Luca y
cols., 2005). Est claro que existe una estrecha relacin entre el fenmeno de inflamacin
con el de fibrosis, sin embargo los mecanismos celulares y moleculares que ligan ambos
eventos no estn del todo claro.
En esta tesis demostramos que el andrografolido es capaz de inhibir la actividad
pro-fibrosante y pro-inflamatoria de TGF y CTGF en el msculo esqueltico. Adems,
demostramos que la fibrosis dificulta la correcta migracin celular en el msculo
esqueltico y que la disminucin de la fibrosis aumenta la eficiencia de las terapias
celulares as como tambin provoca un aumento en el desarrollo de fuerza muscular.
Expresin de TGF y CTGF en msculos distrficos: papel del

andrograflido
Los patrones de expresin de TGF- y sus receptores en el msculo esqueltico de

pacientes con DMD y ratones mdx apoyan un papel patognico de esta citoquina en la
fibrosis muscular asociada con la deficiencia de la distrofina. Los niveles de expresin de
TGF- se relacionan con la fibrosis muscular en biopsias de pacientes con DMD
(Bernasconi y cols., 1995). Adems, la expresin de TGF- y sus receptores se encuentra
aumentada tambin en los msculos esquelticos de ratones mdx y se localiza
principalmente en reas inflamatorias y de fibrosis (Bernasconi y cols., 1995; Zhou y cols.,
2006). Del mismo modo, en otros tejidos la fibrosis se relaciona directamente con la
expresin de TGF. Utilizando el modelo de aceleracin del fenotipo fibrtico en las
extremidades del ratn mdx mediante protocolos de ejercitacin (De Luca y cols., 2005),
demostramos que la expresin de las citoquinas pro-fibrosantes CTGF y TGF, en
respuesta al ejercicio, se indujo en forma sostenida. Esto pudo deberse a un efecto directo
del ejercicio sobre la expresin de estas citoquinas o por consecuencia del dao
inflamatorio producto del estrs mecnico. En este contexto, se ha demostrado que la
expresin de CTGF, puede ser inducida en forma transitoria en respuesta al ejercicio en
msculos de individuos sanos (Kivela y cols., 2007), probablemente producto de la tensin
mecnica a la cual se someten la fibras musculares en actividad contrctil. Esta evidencia se
sustenta con experimentos in vitro que demuestran que la sola tensin mecnica de clulas
musculares induce transitoriamente la expresin de CTGF (Chaqour y cols., 2006). Estas
observaciones podran explicar la causa del aumento de la expresin de CTGF en ratones
mdx sometidos a ejercitacin, no obstante en este ltimo caso la expresin de CTGF fue
sostenida en el tiempo, lo cual da cuenta de una diferencia tangencial entre el aumento
transitorio de CTGF en msculos sanos en respuesta al ejercicio en comparacin al
aumento sostenido observado en msculo distrfico. Nuestros resultados sugieren que el
proceso de inflamacin est involucrado en este proceso, ya que demostramos que el antiinflamatorio de origen botnico, andrograflido, inhibe la induccin de CTGF en respuesta
al ejercicio sin afectar la induccin de la expresin de TGF. Nuestros resultados se
correlacionaron con la disminucin de la fibrosis inducida por ejercicio en el msculo
distrfico de ratones mdx tratados con el andrograflido, en donde observamos que el uso
del andrograflido inhibi la induccin de colgeno tipo III y fibronectina. El aumento de
expresin de TGF por el ejercicio result ser concomitante con un aumento en el nmero
de clulas positivas para la protena smad-3 fosforilada, lo cual sugiere un aumento en la
actividad de esta ruta, no obstante la razn de clulas positivas para smad-3 fosforilada y el
nmero de clulas totales, no present cambios significativos, lo cual sugiere un cambio en
el nmero total de clulas que responden a TGF y no en su actividad. Por su parte, el
andrografolido disminuy el nmero de clulas positivas para smad-3 fosforilada, lo cual

sugiere que la poblacin celular que responde a TGF en el msculo esqueltico
distrfico corresponde principalmente a clulas de origen inflamatorio. Estos resultados
proponen un efecto del andrograflido ro abajo de TGF pero ro arriba de CTGF.
El andrograflido inhibi en clulas musculares y fibroblastos, la induccin de
CTGF y de molculas de la MEC (colgeno tipo III y fibronectina) en respuesta a TGF.
Estos efectos pueden explicarse mediante la participacin de NFB, ya que CTGF presenta
en su promotor sitios funcionales de unin a este factor de transcripcin (Xia y cols., 2004)
y se ha demostrado que el andrograflido lo inhibe en forma especfica, impidiendo que
pueda unirse directamente al DNA y modular la transcripcin de sus genes blancos
(Chaqour y cols., 2006). Nuestros resultados muestran que TGF indujo la activacin de
la ruta cannica de NFB, ya que indujo la fosforilacin y la posterior degradacin de la
protena de IB (protena que secuestra a NFB en el citoplasma), adems de Inducir la
actividad de un gen reportero para NFB. En este ltimo ensayo, se demostr adems que
la induccin del reportero de NFB es inhibida por el andrograflido, lo cual demuestra
que el andrograflido es capaz de inhibir la actividad de NFB. Se ha descrito, en otros
sistemas, la capacidad de TGF de activar a NFB e incluso se ha demostrado que NFB
es capaz de interactuar funcionalmente con las protenas adaptadoras smad (Lopez-Rovira y
cols., 2000). No obstante, no es posible descartar que el andrograflido tambin tenga
efectos sobre otras vas de sealizacin necesarias para la expresin de factores profibrticos como CTGF. La ruta de sealizacin clsica activada por TGF es a travs de
cascadas de fosforilacin mediadas por las protenas smad 2/3 y se sabe que esta ruta es
clave para la induccin de CTGF en respuesta a TGF (Leask and Abraham, 2004).
Nuestros resultados indican que el andrograflido no afecta la ruta de sealizacin cannica
activada por TGF, descartando de esta forma una accin inespecfica del andrograflido,
al menos, en esta ruta de sealizacin.
TGF y CTGF como pro-inflamatorios
En esta tesis hemos demostrado que TGF tiene actividad pro-inflamatoria in vivo.
TGF indujo la expresin de protenas de MEC como colgeno tipo III y de marcadores
especficos de clulas inflamatoria. Todos estos efectos fueron inhibidos o al menos
reducidos cuando los ratones haban sido tratados con andrograflido, por lo tanto el
andrograflido es capaz de inhibir in vivo la accin pro-inflamatoria de TGF. Es
interesante destacar, el fuerte efecto pro-inflamatorio observado en respuesta a TGF en
el msculo esqueltico, el cual indujo un fuerte aumento de los marcadores de macrfagos
M1 y M2. No obstante, este resultado no indica una accin directa de TGF sobre estas
poblaciones de clulas inflamatorias. Otra observacin importante, es que el andrograflido
tuvo un efecto inhibitorio mayor en la induccin de CD68 (marcador de macrfagos M1)
por TGF en comparacin a la expresin de CD206 (macrfagos M2).
Es interesante destacar que todos los efectos evaluados, inducidos por TGF,
fueron emulados por la sobrexpresin adenoviral de CTGF en el msculo esqueltico.
CTGF indujo una fuerte respuesta inflamatoria, caracterizada por una elevada infiltracin
de macrfagos M1 y M2. De la misma manera que lo observado para TGF, el
andrograflido inhibi la inflamacin inducida por CTGF. En otros tejidos se ha descrito

una accin pro-inflamatoria similar, inducida por CTGF, por ejemplo en el tejido renal se
ha demostrado que CTGF induce inflamacin en un mecanismo mediado por NFB,
resultados que concuerdan con lo que hemos observado durante el desarrollo de esta tesis,
en el msculo esqueltico, mediante el uso del andrograflido. Sin embargo, an falta
dilucidar los mecanismos especficos por los cuales CTGF podra inducir inflamacin en el
msculo esqueltico.
Existe la posibilidad de que TGF y/ o CTGF induzcan fibrosis e inflamacin en
un mecanismo que involucre un incremento en el dao tisular, sin embargo no existe
informacin en la literatura acerca de estos posibles roles, al contrario, hay un gran nmero
de evidencias que sealan como ambas citoquinas aumentan la sobrevida celular e inducen
proliferacin en cultivos celulares, sin embargo una posibilidad es que su accin sea
indirecta, mediante el reclutamiento de otros tipos celulares con caractersticas fagociticas
como los macrfagos. En este mbito, demostramos que ambas citoquinas son capaces de
inducir la expresin de IFN- y este ltimo factor participa en el dao tisular a travs de la
regulacin de la migracin de clulas inmunolgicas contribuyendo a la acumulacin de
clulas inflamatorias principalmente macrfagos en el tejido daado (Carvalho-Pinto y
cols., 2002; Rice y cols., 2003).
Existe un extenso debate acerca de la regulacin del proceso inflamatorio por parte
de TGF, existen trabajos que apoyan tanto la idea de que TGF es un inhibidor del
proceso inflamatorio, como tambin la idea de que TGF es un potente pro-inflamatorio.
Andreetta y cols. evaluaron si la inmunomodulacin de TGF- podra mejorar la fibrosis en
los ratones mdx (Andreetta y cols., 2006). Con esa finalidad, trataron a ratones mdx de 6 a
12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de anticuerpos bloqueantes de

TGF. Los ratones mdx tratados mostraron una reduccin significativa de la fibrosis con
disminucin de la expresin de TGF- y la expresin de protenas de MEC. Sin embargo,
TGF- al actuar tambin como una citoquina inmunosupresora, trajo por consecuencia un
aumento descontrolado de linfocitos CD4+ y una desregulacin de los procesos
inflamatorios. Por dicha razn, los autores sugirieron que tratamientos a largo plazo con
inhibidores de TGF deben ser evaluados.
Se ha demostrado que CTGF puede actuar como un quemoatractante de monocitos
en cultivo (Crean y cols., 2002) y que participa en fenmenos de migracin y adhesin (Wu
y cols., 2006). Existen evidencias experimentales que demuestran que CTGF es capaz de
activar la ruta cannica de NFB (Barnes and Karin, 1997; Guijarro and Egido, 2001). Del
mismo modo, CTGF es capaz de inducir la expresin de genes blancos de NFB como
MCP-1, IL-6, e ICAM-1, todos involucrados en la respuesta inflamatoria. Las quemoquinas
son mediadores importantes al reclutar sub-poblaciones de clulas inflamatorias en los
tejidos. Por ejemplo, MCP-1 tiene un papel clave en el reclutamiento de macrfagos en
modelos animales de dao renal y en biopsias renales de pacientes con diabetes tipo I y tipo
II (Ruster and Wolf, 2008).
La administracin sistmica de CTGF en ratones induce la produccin de factores
quemo-tcticos como MCP-1 y RANTES (Sanchez-Lopez y cols., 2009). MCP-1 es un
potente factor quemotctico para los macrfagos. Como hemos observado en nuestros
resultados, CTGF indujo una fuerte infiltracin macrofgica en el msculo esqueltico. La
transmigracin es considerada como un evento clave en el proceso de inflamacin. Durante
este proceso, los estmulos inflamatorios activan las clulas endoteliales para expresar
molculas de adhesin y quemoquinas, las cuales reclutan linfocitos al sitio de dao. CTGF
contribuye activamente a este fenmeno, de hecho estudios in vitro demuestran que CTGF
induce la adhesin de monocitos y macrfagos de una manera dependiente de integrinas
(Bai y cols., 2010; Schober y cols., 2002). La administracin sistmica de CTGF promueve
la infiltracin de linfocitos T y macrfagos en el intersticio renal (Sanchez-Lopez y cols.,
2009).
Inflamacin en el msculo distrfico: Papel del andrograflido sobre las

clulas inflamatorias
En los ltimos aos ha ganado importancia el estudio de la regulacin del proceso

de inflamacin por parte de sub-poblaciones de clulas inflamatorias con funciones
opuestas, en este contexto se ha comenzado a estudiar el papel de poblaciones de
macrfagos del tipo M1 y M2. En esta tesis demostramos que tanto TGF como CTGF
son capaces de inducir la infiltracin de estas poblaciones inflamatorias y que en ambos
casos el andrograflido inhibi esta accin pro-inflamatoria, teniendo un efecto mayor
sobre la poblacin de macrfagos M1. Las clulas de tipo M1 secretan citoquinas
caractersticas como IFN-, IL-2, IL-12, IL-18 y CD40L y evocan la inmunidad mediada
por clulas y la inflamacin dependiente de fagocitosis. Por otro lado las clulas de la
respuesta inflamatoria del tipo M2 secretan otro tipo de citoquinas tales como IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, y evocan un fuerte respuesta de anticuerpos (incluyendo los de
clase IgE) y acumulacin de eosinfilos, pero inhiben varias de las funciones de las clulas
fagocticas (inflamacin independiente de fagocitosis) (Uhm y cols., 2003).
Dentro de la caracterizacin del andrograflido, demostramos que este afect la

fibrosis muscular en el ratn mdx y que esta se relacion directamente con una fuerte
inhibicin de la progresin inflamatoria de la patologa, observando que el andrograflido
disminuy a menos de la mitad el nmero de clulas inflamatorias presentes en el tejido
muscular distrfico, dentro de las cuales encontramos linfocitos CD8+, linfocitos CD4+,
eosinfilos y macrfagos. Previamente, Wehling-Henricks y cols. obtuvieron resultados
muy similares para el corticosteroide prednisona, el cual es el nico frmaco que ha
mostrado, al menos una parcial efectividad clnica.
Las clulas inflamatorias son las principales fuentes celulares de factores de
crecimiento fibrognicos (como se ha demostrado para la expresin de TGF- y PDGF), y
sus receptores tambin son sobre-expresados y localizados con clulas inflamatorias en los
msculos de pacientes con DMD y ratones mdx (Bernasconi y cols., 1995; Tidball y cols.,
1992; Zhao y cols., 2003; Zhou y cols., 2008). Las clulas inflamatorias que en el msculo
esqueltico mdx consisten en linfocitos, macrfagos, neutrfilos, eosinfilos y en menor
proporcin de mastocitos (Cai y cols., 2000; Gorospe y cols., 1994; Hodgetts y cols., 2006;
Spencer y cols., 2001; Wehling y cols., 2001). Producen, adems de factores de
crecimiento, linfoquinas que juegan un rol crtico en el establecimiento de entornos que
pueden ser pro-inflamatorioss, anti-inflamatorios o pro-fibrticos en los tejidos. La fibrosis
tisular est estrechamente regulada por la respuesta celular de linfocitos T ayudadores
(CD4+) (Wynn, 2004) y la fibrognesis est fuertemente ligada a la respuesta celular del
tipo TH2 de estos linfocitos, la cual involucra la sntesis de citoquinas como IL-4, IL-5 e
IL-13. La respuesta celular TH1 de los linfocitos CD4 + involucra la produccin de
interfern- (IFN-) e IL-12 para promover la inflamacin de los tejidos.
El rol de los linfocitos en la patologa distrfica se ha estudiado mediante la

utilizacin de ratones mdx/scid (Farini y cols., 2007). Los ratones mdx/scid mostraron una
menor fibrosis muscular a los 12 meses y una disminucin de los niveles de TGF- en el
msculo en comparacin con los ratones mdx. Una disminucin funcional de linfocitos T en
ratones mdx/nu/nu/ tambin redujo la fibrosis (Morrison y cols., 2005). Estos hallazgos
apoyan un papel patognico de las clulas T en la fibrognesis del ratn mdx e indica que
los linfocitos son una fuente importante de TGF-. Por otro lado, una disminucin postnatal
de clulas T mediante timectoma a la edad de 4 semanas, seguida por tratamiento con
anticuerpos anti-CD4 y/o anti-CD8 no logr mejorar la fibrosis muscular. Estos resultados
sugieren que la activacin temprana de las clulas T o clulas T residentes puede jugar un
papel fundamental en la induccin de la fibrosis en el msculo de ratones mdx (Gordon,
2003).
Los macrfagos son una poblacin numerosa en el msculo esqueltico de pacientes
con DMD y ratones mdx y son las principales fuentes de TGF-1. El agotamiento de los
macrfagos que circulan por va intraperitoneal, gracias a inyecciones de anticuerpos contra
la protena F4/80 en ratones mdx de 1 a 4 semanas suprimi la fibrosis y el dao de los
msculos en etapas tempranas de la enfermedad (Wehling y cols., 2001).El efecto a largo
plazo de la deplecin de los macrfagos en el msculo esqueltico distrfico de ratones
mdx no ha sido estudiado.
Los macrfagos pueden mostrar diferentes fenotipos funcionales en funcin de las
citoquinas presentes el medio ambiente del tejido (Gordon, 2003; Martinez y cols., 2009).
Los macrfagos activados clsicamente (M1) son activados por citoquinas del tipo TH-1
como IFN- e IL-12, y estos se caracterizan por expresar altos niveles de la xido ntrico
sintasa inducible (iNOS). Estos aumentan la expresin de TNF , IL-1, xido ntrico, y
las principales molculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II para de esta
forma promover la inflamacin de los tejidos. Por su parte, los macrfagos alternativamente
activados (M2) son activados por las citoquinas TH-2, IL-4 e IL-13 y expresan altos niveles
de la enzima arginasa, pero un bajo nivel de iNOS. Estos macrfagos suprimen la respuesta
TH-1 e inhiben la expresin de TNF e IL-1. El receptor de manosa CD206 parece ser
un marcador relativamente especfico de esta poblacin celular. Debido a que la arginasa
puede catalizar la conversin de arginina en L-prolina, una molcula precursora de la
sntesis de colgeno, se cree que los macrfagos M2 pueden promover la fibrosis de los
tejidos. Sin embargo, un estudio reciente demostr que la arginasa-1 que expresan los
macrfagos suprime las citoquinas TH-2 impulsada por la inflamacin y la fibrosis en el
hgado inducida por la infeccin con Schistosoma mansoni (Pesce y cols., 2009). En este
modelo de la enfermedad, la arginasa-1 que expresan los macrfagos suprime la
proliferacin de los linfocitos T CD4 + e inhibe tanto las repuestas TH-1 y TH-2 de la
arginina. Estos resultados indican que el M2 puede funcionar como un supresor de la
inflamacin y la fibrosis del tejido. La L-arginina tambin suprimi la inflamacin en los
msculos de ratones mdx. La inyeccin intraperitoneal de L-arginina en ratones mdx
suprimi la inflamacin muscular y redujo la expresin de mediadores inflamatorios,
incluyendo IL-1, TNF, IL-6 y NFB (Hnia y cols., 2008). El efecto de la L-arginina en la
fibrgenesis del msculo mdx no ha sido abordada an. Villalta y cols. estudiaron subpoblaciones funcionales de macrfagos en los ratones mdx y encontraron que ambos, M1 y
M2, estn presentes a las 4 semanas en el msculo de ratones mdx en zonas de necrosis e
inflamacin prominente (Villalta y cols., 2009). In vitro, los macrfagos M1 promueven la
lisis muscular en un mecanismo mediado por xido ntrico, mientras que los macrfagos
M2 inhiben este efecto a travs de la competencia de la enzima arginasa con la iNOS por su
sustrato en comn, la arginina. A las 12 semanas, mientras que la expresin de ambas
enzimas, iNOS y arginasa, se redujo, la expresin de IL-4 e IL-10 se increment,
desactivando el fenotipo M1. La IL-10 tambin activ el fenotipo M2, promoviendo la
proliferacin de clulas satlites para la regeneracin muscular. Estos resultados sugieren
que un cambio en el fenotipo de macrfagos pueden contribuir a la regeneracin muscular y
a la resolucin de la inflamacin en los msculos de ratones mdx. La
poblacin
de
eosinfilos se encuentra claramente aumentada en las biopsias musculares de pacientes con

DMD y en los msculos esquelticos de ratones mdx (Cai y cols., 2000). Los eosinfilos
pueden promover la respuesta TH-2 mediante la produccin de IL-4 e IL-10 para influir en
la fibrgenesis de los tejidos. Los eosinfilos tambin producen la protena bsica mayor-1
(MBP-1), la cual puede atenuar la respuesta inmune celular. Ratones MBP-1-/-/mdx
mostraron reduccin de la sin ningn cambio de los macrfagos o la de la expresin de la
iNOS, TNF, IFN (Wehling-Henricks y cols., 2008). Por lo tanto, MBP-1 podra servir
como un blanco para el tratamiento de la fibrosis muscular en la DMD.
Otros agentes reguladores de la inflamacin y la fibrosis en msculos

distrficos
Se han estudiado diversos agentes farmacolgicos con la finalidad de regular la

inflamacin y la fibrosis en el msculo distrfico. El Imatinib es un agente antineoplsico
que bloquea selectiva y competitivamente los sitios de unin de ATPde varias protenas
tirosina quinasas, incluyendo c-abl, c-kit, y los receptores de PDGF (Druker, 2004) y ha
sido aprobado por la FDA de EE.UU. para el tratamiento de varios tumores malignos. El
Imatinib tambin se ha demostrado para reducir la fibrosis del tejido a travs de bloqueo de
c-abl y el receptor de PDGF en muchos modelos experimental de fibrosis, incluyendo la
fibrosis pulmonar (Abdollahi y cols., 2005; Daniels y cols., 2004), cirrosis (Yoshiji y cols.,
2005), esclerosis renal (Wang y cols., 2005), y fibrosis en la piel (Distler y cols., 2007). La
sealizacin de c-abl es una ruta alternativa no-Smad que media los efectos fibrognicos de
TGF-, adems la actividad quinasa de c-abl puede ser activada tambin por PDGF
(Daniels y cols., 2004; Wang y cols., 2005). La expresin gnica y proteca de TGF- y
PDGF (as como la de sus receptores) se encuentra aumentada en las clulas inflamatorias y
en la regeneracin de las fibras de los msculos esquelticos de pacientes con DMD y
ratones mdx (Bernasconi y cols., 1995; Tidball y cols., 1992; Zhao y cols., 2003). Se ha
probado que el Imatinib reduce la fibrosis en el ratn mdx. El Imatinib redujo la necrosis
del msculo esqueltico, la inflamacin y la fibrosis, adems de mejorar la funcin
muscular. En otro estudio realizado por Bizario y cols. Se demostr que el Imatinib reduce
la fibrosis inducida por ejercicio en ratones mdx, pero produjo una significativa prdida de
peso en los animales (Bizario y cols., 2009).
El losartn, el cual es un inhibidor del receptor I de Angiotensina II y que se ha
utilizado ampliamente como un medicamento antihipertensivo. La Angiotensina II
estimula directamente la produccin de TGF- aumentando su sealizacin mediante el
aumento de los niveles de Smad-2 y la translocacin nuclear de Smad-3 fosforilada
(Rosenkranz, 2004). Cohn y cols. trataron ratones mdx de 7 semanas a 9 meses con losartn
oral y demostraro que el tratamiento inhibe la sealizacin de TGF- y redujo
significativamente la fibrosis en el ratn mdx sin efectos secundarios significativos (Cohn y

cols., 2007).
Del mismo modo la Halofuginona, un potente agente antifibrtico que suprime la
sntesis de colgeno mediada por la sealizacin de TGF- (Granot y cols., 1993; Halevy y
cols., 1996) inhibe la fosforilacin y la activacin de Smad-3 (McGaha y cols., 2002). El
tratamiento de ratones mdx con inyecciones intraperitoneales de halofuginona redujo el
nivel de Smad3 fosforilada y depsito de colgeno en las extremidades y los msculos
cardacos y este ltimo fue acompaado de mejora de la funcin cardiaca (Huebner y cols.,
2008; Turgeman y cols., 2008). Sin embargo, el uso a largo plazo de esta droga trae serios
efectos secundarios adversos, debido a la inhibicin de la sntesis de colgeno.
En este contexto el andrograflido ha sido usado por perodos prolongados para el
tratamiento de patologas como la esclerosis mltiple y la artritis reumatoide, por lo cual es
un buen candidato como alternativa teraputica para pacientes con DMD.
Impacto de la fibrosis en la migracin celular
En la actualidad no hay una terapia efectiva para la DMD. La terapia gnica y la

terapia celular para reemplazar el gen de la distrofina tienen un gran potencial, pero no
estn desarolladas lo suficiente, como para pensar en una aplicacin clnica amplia. En
1990, Peter Law y su equipo reportaron el primer transplante de clulas satlite en un nio
de 9 aos de edad afectado por DMD, demostrando la produccin de distrofina por las
fibras musculares y la seguridad de estas terapias (Law y cols., 1990). Luego surgieron 11
ensayos clnicos en pacientes con DMD, los cuales fueron conducidos utilizando
inyecciones intramusculares de clulas satlites (Neumeyer y cols., 1998; Huard y cols.,

1992; Law y cols., 1992; Gussoni y cols., 1992; Tremblay y cols., 1993; Morandi y cols.,
1995; Mendell y cols., 1995; Miller y cols., 1997; Skuk y cols., 2006). Aunque no
existieron efectos adversos, la produccin de distrofina solo fue demostrada en muchos
casos pero no en todos y no se observaron beneficios clnicos en ninguno de ellos (cossu y
cols., 2007; Partridge y cols., 2000). Esto no es sorprendente considerando que la inyeccin
intramuscular debe realizarse en varios msculos, por lo cual no puede mostrar un efecto
general, aunque se detect un efecto benfico, en la fuerza muscular de los msculos
inyectados en el 15% de los pacientes tratados. El tratamiento de las distrofias musculares
por inyeccin intramuscular presenta varios problemas que aun no han sido resueltos. En
primer lugar, las clulas inyectadas intramuscularmente se distribuyen de manera local,
debido a la baja capacidad migratoria de estas clulas y al denso entramado fibrtico
impuesto por la MEC en el msculo distrfico, lo cual implica que en un paciente se deban
realizas mltiples inyecciones para tratar un msculo completo (Huard y cols., 1992).
Segundo, se ha descrito una respuesta inmune en contra de las clulas satlites inyectadas
incluso en los casos de coincidencia entre los complejos mayores de histocompatibilidad,
por lo tanto las nuevas terapias deben considerar una forma de regulacin inhibitoria de la
respuesta inflamatoria. Por ltimo, la mayora de las clulas satlites muere en las primeras
72 horas luego de la inyeccin, producto del ambiente desfavorable, causado por una baja
irrigacin sangunea que tiene por consecuencia el generar un entorno hipxico (Fan y
cols., 1996; Guerrete y cols., 1997). Las investigaciones posteriores se han enfocado en
resolver estos problemas y una prueba clnica en fase I ha sido completada (Skuk y cols.,
2006). Aunque se han obtenido resultados esperanzadores, este mtodo sigue siendo
limitado por la imposibilidad de inyectar estas clulas de manera sistmica a travs de la

circulacin.
En esta tesis hemos demostrado que la migracin celular en los msculos distrficos
depende directamente del grado de fibrosis de este. Demostramos que la migracin celular
en msculos con alto grado de fibrosis (msculos de animales distrficos ejercitados), era
significativamente menor que la observada en msculos tambin distrficos pero con un
fenotipo menos severo (msculos de animales distrficos sedentarios). El efecto directo que
pudiese tener el ejercicio sobre la migracin celular puede ser descartado, ya que en
animales mdx ejercitados pero tratados con andrograflido, observamos una recuperacin
en la migracin y adems el protocolo de ejercitacin se detuvo una semana antes del inicio
de los ensayos. Del mismo modo, descartamos un efecto directo del andrograflido sobre la
migracin celular, ya que el andrograflido fue administrado previamente a la inyeccin de
los fibroblastos migratorios, por lo tanto la nica diferencia fenotpica evidente es el grado
de fibrosis y la inflamacin asociada. No obstante, sera interesante evaluar el efecto directo
del andrograflido sobre la migracin celular.
Demostramos, adems que la clulas no solo recorran una mayor distancia, sino
que se distribuan preferentemente en zonas con menor contenido de colgeno (reas no
fibrticas). Experimentos realizados por el laboratorio de Giulio Cossu (Gargioli y cols.,
2008), han demostrado que clulas que sobre-expresan la enzima MMP-9 tienen una mayor
capacidad migracional en msculos distrficos (Gargioli y cols., 2008). Los sustratos
principales de la MMP-9 son en su mayora protenas de MEC, como colgeno tipo I, III y
fibronectina (Hrabec y cols., 2007). Esto sugiere que la fibrosis presente en msculos
distrficos, dificulta la correcta migracin celular. Lo cual explica en parte nuestros
resultados. No obstante, otra explicacin plausible, es el efecto de la fibrosis o de msculos

distrficos fibrticos, sobre la sobrevida celular, ya que la fibrosis asociada a la DMD, se
caracteriza por una disminucin en la irrigacin sangunea, debido al reemplazo de
capilares por tejido conectivo, lo cual genera un ambiente inhspito para clulas con altos
requerimientos energticos y de oxigenacin, como las clulas musculares. Sin embargo, en
nuestro ensayo, este efecto puede descartarse, ya que el nmero total de clulas migratorias
al finalizar el protocolo de migracin permaneci constante.
Impacto de la fibrosis en la eficiencia de las terapias celulares
Como se ha comentado anteriormente, la causa inicial de la DMD es la ausencia de

la protena distrofina, por lo tanto las terapias deben restituir la expresin de esta o de una
protena anloga, para eliminar el problema gnico. Demostramos que la fibrosis dificulta
la migracin celular en los msculos distrficos y que esto se correlacion directamente
con una menor eficiencia en la re-expresin de distrofina. Nuestros resultados demostraron
que en los animales que recibieron el tratamiento previo con el andrografolido y que por
ende presentan menor dao fibrtico, la eficiencia de la terapia celular aument un 300%
en comparacin a la observada en animales mdx no tratados con la droga botnica. Estos
resultados demuestran que por un lado la fibrosis afecta la eficiencia de las terapias
celulares y que la disminucin de la fibrosis e inflamacin por el androgrflido claramente
mejora la eficiencia de estas. Una explicacin para este fenmeno es que la fibrosis
probablemente acta como una barrera fsica que impide la correcta migracin de las
clulas. Otra posibilidad es que lugares ricos en tejido cicatricial, presentan una baja
irrigacin sangunea debido a la escasa presencia y deterioro de los vasos sanguneos, lo

cual produce zonas isqumicas en el tejido, lo cual por un lado induce la muerte de clulas
con altos requerimientos de oxigeno como las clulas musculares (Wynn, 2008).
Una publicacin reciente del grupo de Paula Clemens (Reay y cols. 2012) avala
nuestros resultados. Ellos demostraron que al combinar la sobre-expresin de un inhibidor
de NFB y una versin de la protena distrofina, mejora ostensiblemente la expresin de
distrofina por las fibras musculares en comparacin a la terapia gnica sin sobre-expresin
del inhibidor de NFB.
Impacto de la fibrosis en la fuerza muscular
Disminuir la fibrosis de un tejido no es garanta de una mejora en la funcionalidad

tisular. Por lo tanto, cuando se piensa en terapias netamente anti-fibrticas es importante
evaluar el efecto de la disminucin de la fibrosis sobre la funcin del tejido. En el caso del
msculo esqueltico, existe una estrecha correlacin entre el grado de fibrosis y la
capacidad contrctil del msculo. Nuestros resultados mostraron un sorprendente
incremento en la fuerza efectuada por los msculos de ratones distrficos tratados con el
andrograflido. No hay que olvidar que la causa inicial del deterioro y debilitamiento en
msculos distrficos se debe a una mutacin gentica que causa la ausencia de la protena
distrofina, (Straub y cols., 1997) y como hemos mencionado anteriormente el
andrograflido es un anti-inflamatorio el cual inhibe especficamente a NFB, no atacando
por tanto el problema gentico causante de la patologa distrfica. Estos resultados ponen
de manifiesto que la ausencia de distrofina no es el nico agente causal del debilitamiento
muscular, si no que este es potenciado por el fenmeno inflamatorio y fibrtico. Esto apoya
la idea de que una buena alternativa para tratar pacientes con DMD es la utilizacin de una
terapia combinada, que por un lado restablezca la expresin de distrofina en los msculos
afectados y que por otro atene la inflamacin y la fibrosis tisular para facilitar la
infiltracin, migracin e incorporacin celular en el tejido blanco
Por otra parte, evaluamos de manera sistmica si el aumento de fuerza producido
por el Andrografldio observado mediante tcnicas electofosiolgicas de msculos
aislados, repercute en una mejora en el comportamiento fsico del animal. Tanto los
pacientes con DMD como su modelo animal mdx, se caracterizan por tener un
comportamiento ms bien sedentario a medida que progresa la patologa, por un lado
debido al debilitamiento muscular y por otro, ya que la actividad fsica, aumenta el dao
mecnico por contraccin de las fibras musculares, lo cual acelera la progresin de la
patologa. Sin ir ms lejos, en clnica se recomienda a los pacientes con DMD que
desarrollen la menor actividad fsica posible, para de esta forma retardar la progresin de la
enfermedad, el uso de silla de ruedas y as tambin aumentar la esperanza de vida (Bizario
y cols., 2009).
Frente a protocolos de ejercitacin, los ratones mdx presentan un rendimiento muy
por debajo del observado en ratones control, tendiendo a descansar sobe la cinta trotadora
un mayor nmero de veces. Nuestros resultados demuestran que los animales mdx tratados
con el andrograflido presentan un claro aumento en su rendimiento frente a este protocolo,
lo cual pone de manifiesto que la accin anti-inflamatoria y anti-fibrtica de esta droga no
solo repercute en una mayor fuerza muscular sino que tiene claros efectos positivos en el
comportamiento sistmico del animal. No obstante, con estos resultados no es posible
descartar que el andrograflido tenga un efecto directo sobre la fuerza muscular,

modulando la expresin de actina y miosina, induciendo hipertrofia y/o hiperplasia
muscular, etc. Sin embargo, al observar el efecto del andrograflido sobre animales control,
encontramos que este no tuvo efectos sobre el desarrollo de fuerza contrctil de los
msculos y tampoco sobre el rendimiento frente a protocolos de ejercitacin, lo cual
sugiere que la accin del andrograflido no producira en forma directa tales efectos.
Es probable que para una cura definitiva para esta devastadora enfermedad se
requieran enfoques integrales, lo cuales combinen farmacoterapia con terapia gnica o
terapia celular. Se necesitan ms estudios de caracterizacin de la fibrognesis asociada a
los msculos deficientes de distrofina y explorar la seguridad y efectividad de las terapias
anti-fibrticas. La fibrosis muscular no slo causa la disfuncin del msculo, sino que
tambin afecta la regeneracin de este y reduce eficiencia de las terapias (Cordier y cols.,
2000; Gargioli y cols., 2008). Por lo tanto, la terapia anti-fbrtica representar una til y
necesaria complementacin a las terapias gnicas y celulares para optimizar el tratamiento
de la DMD. Un cctel farmacoterpico dirigido a diferentes aspectos de la fibrogenesis
muscular ser necesario para lograr un adecuado efecto anti-fibrtico en la DMD.
CONCLUSIONES
1.- El andrograflido inhibi la expresin de CTGF, pero no la de TGF inducida por

ejercicio en msculos de ratones mdx.
2.- El aumento en la expresin de TGF por el ejercicio se correlaciona con un aumento
en el nmero de clulas positivas para smad-3 fosforilada, las cuales disminuyen en
respuesta al tratamiento con el andrograflido.
3.- El andrograflido inhibi la induccin de protenas de MEC (colgeno tipo III y
fibronectina) por el ejercicio en ratones mdx.
4.- El tratamiento con andrograflido disminuy el nmero de clulas inflamatorias,
especialmente macrfagos, presentes en el msculo esqueltico distrfico.
5.- El andrograflido inhibe de una manera no smad dependiente los efectos pro-fibrosantes
y pro-inflamatorios inducidos por TGF-
6.- TGF- es capaz de activar la ruta cannica de NFkB en clulas musculares C2C12, la
cual es inhibida por el andrograflido.
7.- CTGF no solo es capaz de inducir fibrosis, sino que tambin induce inflamacin en el
msculo esqueltico, ambos efectos son inhibidos por el tratamiento con andrograflido.
8.- El efecto anti-inflamatorio del andrograflido es principalmente a travs de la inhibicin
de la respuesta inflamatoria del tipo M1.
9.- La fibrosis producto del ejercicio inhibe la migracin celular en msculo de ratones mdx
10.- Fibroblastos migratorios se distribuyen preferentemente en zonas con bajo contenido

de MEC.
11.- El andrograflido aumenta el nmero de fibras musculares que re-expresan distrofina
en msculos distrficos trasplantados con clulas miognicas.
12.- El tratamiento con andrograflido produjo un aumento considerable en la fuerza
muscular desarrollada por ratones mdx y en la resistencia a protocolos de ejercitacin.
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0 1 2 3
*
*
mdx
C57BL/10
distrficos mdx. Ratones mdx y controles, de 3 meses de edad, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin,
3 veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante la tincin de Hematoxilina/Eosina. Los
asteriscos sealan fibras necrticas y las flechas ffocos de fibras musculares regenerantes.
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
mdx
C57BL/10
distrficos mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3
veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante inmunofluorescencia para la protena de
MEC, colgeno tipo III (verde), en azul se muestran la tincin nuclear (Hoechst).
Ejercicio
(meses)
C57BL/10
mdx
Ejercicio (meses) 0 1 2 3 0 1 2 3
FN
GAPDH
C57BL/10
mdx
Veces de induccin de
(FibrionecFna/GAPDH)
2,5
1,5
1
0,5
0
1
4
5
6
Meses de ejercicio
Figura 3. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo

esqueltico de animales distrficos mdx. A. Ratones mdx y controles fueron
sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana, por el periodo de
tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo Tibialis
Anterior para evaluar los niveles de fibronectina mediante western blot, como
control se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Cuantificacin de 3
ensayos distintos. Las barras azules representan muestras provenientes de ratones
control y las barras rojas muestras provenientes de animales mdx.
mdx
Ejercicio
+ mdx
mdx
+mdx
Ejercicio
(meses)
0 +
0
0
1 - 1 1 +2 2
32 3 3
PARACTIN
-
Ejercicio
meses)
Ejercicio
((meses)
TGF- CTGF CTGF
CTGF
28s

mRNA para TGF-

4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
28s 28s
28s
01
21
2
3
43
Ejercicio (meses)
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresin de TGF- en

msculos distrficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a
protocolos de ejercitacin 3 veces por semana a una velocidad de 12 metros por
minuto, por un perodo de 1, 2 y 3 meses. Al finalizar el protocolo se procedi a
extraer el RNA total del msculo tibialis anterior para evaluar la expresin de TGF en este msculo. A) Se evalu la expresin de TGF- mediante RT-PCR. B) Del
mismo modo se evalu en forma cuantitativa los niveles del mensajero para TGF-
mediante RT-PCR en tiempo real.
C57 BL/10 Sedentario
C57 BL/10 ejercitado
mdx Sedentario
mdx ejercitado
50 m
B
100

90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el nmero ncleos positivos para la

protena smad-3 fosforilada en ratones mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de
edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana, durante 3 meses.
A. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el msculo tibialis anterior para mediante
inmunofluorescencia para el nmero de ncleos positivos para la protena smad 3
fosforilada (rojo). B. Razn entre ncleos positivos para smad-3 fosforilada y ncleos
totales..
mdx
Ejercicio (meses)
0 1 2 3
CTGF
28s

Niveles relativos de expresin
del mRNA para CTGF
3
2,5
2
3
3
4
2
1,5
1
0,5
0
0
1
1
2
Ejercicio (meses)

distrficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de
ejercitacin 3 veces por semana durante 1, 2 y 3 meses. A) Se evalu de forma
cualitativa la expresin de CTGF mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evalu
en forma cuantitativa los niveles del mensajero para CTGF mediante RT-PCR en
tiempo real.
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
TGF-
28s

mRNA para TGF-

2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Figura 7. El andrograflido no afecta la induccin de TGF- en ratones mdx

ejercitados. Ratones mdx tratados o no con andrograflido, fueron ejercitados
durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el
protocolo se procedi a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar
A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresin del mRNA de TGF- como
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
CTGF
28s
B
mRNA para CTGF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Figura 8. El Andrograflido inhibe la induccin de CTGF en msculo de

ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con Andrograflido fueron
ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al
finalizar el protocolo se procedi a extraer RNA total del musculo Gastronemio para
determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresin de CTGF como
Ejercicio
+ +
50 m
mdx
C57BL/10
Figura 9. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para smad-3

fosforilada en ratones mdx ejercitados. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad, tratados o no con el
Andrograflido, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3 veces por semana. Al finalizar el protocolo se
procedi a aislar el musculo tibialis anterior para evaluar mediante inmunofluorescencia indirecta el nmero de
ncleos positivos para la protena smad-3 fosforilada (rojo).
Andrograflido
A
Nucleos positivos para smad-3 fosforilada
100
90
80
70
60
mdx
C57BL/10
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
100

90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
Figura 10. El andrograflido inhibe el aumento clulas positivas para smad-3

fosforilado en respuesta al ejercicio en ratones mdx. Ratones mdx y C57BL/10
fueron ejercitados durante 3 meses. Al finalizar el protocolo se realiz una
inmunofluorescencia para la protena smad-3 fosforilada. A. cuantificacin del
promedio total de ncleos por seccin. B. Proporcin de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada y ncleos totales (DAPI).
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
Figura 11. El Andrograflido disminuye el numero de macrfagos en el msculo distrfico de

ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas
con Andrograflido, para luego evaluar mediante inmunohistoqumica en el musculo Gastronemio
(A)y diafragma (B), la presencia de macrfagos (F4/80).
16000
14000
Clulas/mm2
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Macrofagos
Eosinlos
CD4+
CD8+
mdx + Vehculo
12145
4635
841
339
mdx + PARACTIN
6323
2298
417
170
Figura 12. El Andrograflido disminuye el numero de clulas inflamatorias en el msculo

distrfico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes
2 semanas con Andrograflido, para luego evaluar mediante inmunohistqumica en el musculo
quadriceps, la cantidad de clulas inflamatorias presentes por unidad de area. A) inmuhistoqumica
para diferentes tipos de clulas inflamatorias encontradas en el msculo distrfico, eosinfilos
(MBP), macrfagos (F4/80), Linfocitos citotxicos (CD8+) y linfocitos ayudadores (CD4+). B)
Cuantificacin del numero total de clulas inflamatorias encontradas en el musculo de los animales
distrficos tratados o no con el Andrograflido.
-
-
+
-
-
+
+ +
50 m
Figura 13. El Andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos. Ratones mdx de 3
meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al
finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante tincin de
Hematoxilina/Eosina.
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
-
-
+
-
-
+
+ +
50 m
Figura 14. El Andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos ditsrficos. Ratones
mdx de 3 meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3
meses. Al finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante
inmunofluorescencia indirecta para detectar la protena de MEC, colgeno tipo III (verde).
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
A
C57BL/10
Ejercicio
Ejercicio
Andrograflido
PARACTIN
+ -
mdx
+ +
+
+ +
+ -
+
FN
Col III
GAPDH
mdx
Ejercicio
Paractin
Ejercicio
Andrograflido
-
-
+ -
+
-
+ +
FN
Tub
Figura 15. El Andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx. A.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrograflido y
adems fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisl
el msculo Tibialis Anterior y se procedi a realizar un extracto de protenas para determinar los
niveles de Fibronectina (FN) y colgeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot.
Como control de carga se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Ratones mdx de 2
semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrograflido) y a partir de los
3 meses de edad fueron tambin ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el
protocolo, se aisl el msculo Tibialis Anterior y se procedi a determinar los niveles de
fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evalu la protena
Tubulina (Tub).
A
--
-- -- -- --
--
--
+ + + + TGF- 1 (10 ng/ml)
50 25 12.5 -- 50 25 12.5 Andrograflido (M)
CTGF
B
--
-- -- + + + TGF- 1 (10 ng/ml)
--
50 --
--
50 25
--
Andrograflido (M)
CTGF
28S
18S
Figura 16. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF por TGF-. Clulas

musculares C2C12 fueron incubadas durante 6 horas con TGF- en presencia y
ausencia de Andrograflido, al finalizar la incubacin se procedi a extraer el RNA
total de los extractos para evaluar mediante ensayos de Northern Blot los niveles de
expresin del mRNA de CTGF en respuesta a TGF-. Como control de carga se
muestran las subunidades ribosomales 28s y 18s.
mdx
TGF-
TGF- (10
ng/ml)
+ +
Andrograflido
(50M)
PARACTIN
+ -
+
FN
COL III
CTGF
GAPDH
Figura 17. El Andrograflido inhibe la induccin de protenas de MEC por
el protocolo se evalu mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina,
Colgeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utiliz la protena GAPDH.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + PARACTIN
Figura 18. El Andrograflido inhibe la insuccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de Andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo se evalu mediante inmunofluorescencia
indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulacin de Colgeno tipo III
(verde). En azul (Hoechst) se muestran los ncleos celulares.
Control
Andrograflido
Paractin
TGF- + Paractin
Hoechst
TGF-
Figura 19. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo, las clulas fueron soltadas utilizando el
quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia
indirecta, la deposicin de Colgeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran
los ncleos celulares. Se utiliz la tincin Hoechst para demostrar que la seal es
proveniente de la MEC y no de clulas adheridas.
A
TGF-

Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col III
Tub
B
TGF-

Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col III
Tub
Figura 20. El Andrograflido inhibe la induccin de protena de MEC por
TGF- en miotubos y fibroblastos. A. Clulas musculares C2C12 fueron
diferenciadas para formar miotubos, al da 5 de diferenciacin fueron incubadas
el protocolo se evalu mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina
y colgeno tipo III, como control de carga se utiliz la protena GAPDH. B.
Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y
ausencia de Andrograflido. Finalizado el protocolo se evalu mediante ensayos de
western blot los niveles de fibronectina y colgeno tipo III, como control de carga
se utiliz la protena GAPDH.
B
12
Veces de induccin C olgeno

D68
tipo
I
A
12 10
10 8
8 6
6
4
2
4
2
0
12
10
8
6
4
2
Vehculo
D
12
12
Veces de induccin C D 206
Veces de induccin C D68
TGF-
+
BSA
TGF-
BSA ++
TGFb
+ Vehiculo
TGFb ++
Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
+
BSA BSA
+ Vehiculo
TGF-
+ +
BSA
+ +
BSA
+ +
TGF-
+ +
Adv
GFP
Adv
GFP
Adv
C TGF
Adv
C TGF
Vehculo
0
Andrograflido Vehculo
Andrograflido
TGF- +
BSA +
+
TGF- +
TGFb BSA
+ Vehiculo
TGFb +
TGFb
+ Vehiculo
TGFb +
Andrograflido
Andrograflido
10
8
6
4
2
10
8
6
4
2
0
TGF- +
BSA +
TGF- +
TGFb +
TGFb
+ Vehiculo
TGFb +
Andrograflido
+
TGFb BSA
+ Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF-
+
BSA
TGF-
TGFb ++
TGFb
+ Vehiculo
TGFb ++
Andrograflido
+
TGFb BSA
+ Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
Figura 21. El andrograflido inhibe la inflamacin inducida por TGF- en el

msculo esqueltico. Msculos tibialis anterior de ratones C57 BL/10 tratados o no
con andrograflido, fueron inyectados con TGF-b1, para evaluar mediante RT-PCR
en tiempo real, los niveles de expresin de molculas relacionadas con fibrosis
como es CD68 (C) y de macrfagos M2 como CD 206 (D).
TGF- (1ng/ml)
Andrograflido(50M)
-
-
- +
+ -
+
p-smad3
smad3
Figura 22. El Andrograflido no afecta la fosforilacin de smad-3 inducida por

durante 30 min. con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar
mediante ensayos de western blot la fosforilacin de la protena smad-3. Como
control se determinaron los niveles de la protena smad-3 total.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + PARACTIN
Figura 23. El Andrograflido no afecta la translocacin nuclear de smad-3

inducida por TGF- en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron
incubadas durante 1 hora con TGF-, en presencia y ausencia de Andrograflido y
PARACTIN, para evaluar mediante inmunofluorescencia la translocacin nuclear
de la protena smad-3 fosforilada (verde).
Veces de induccin reportero p3Tp-Luc
25
20
15
10
5
0
control
TGF-b
andrograflido andrograflido
+ TGF-b
Figura 24. El andrograflido no afecta la induccin del reportero especifico para

TGF-, p3Tp-Luc en mioblastos C2C12. Mioblastos C2C12 fueron transfectadas
transitoriamente con el reportero especifico para TGF-, p3Tp-Luc, para luego ser
estimuladas durante 48 horas con 10ng/ml de TGF-1 en presencia y ausencia de 50
M de andrograflido. Finalizado el protocolo se determin la actividad de la enzima
luciferasa.
TGF-
(1ng/ml)
TGF-PARACTIN

Andrograflido
(TGF-
50M)
Andrograflido
-
+ +
--
+
+ ++
+
+
+ - -- +++
- -
-
- -
P-P-IB
IB
IB
IB total
IB total
B
60
60
60 3360
-
-
PARACTIN
TGF-
--
P-IB
(1ng/ml)
TGF-TGF-
(1 ng/ml)

IB
-
+ +
+ -
+
Veces de induccin gen
reportero NFB
Figura 25. TGF- es capaz de activar la ruta de activacin cannica de NFB

en clulas musculares C2C12. A) Clulas musculares C2C12 fueron incubadas
durante 30 min. con TGF-b en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar
mediante western blot la fosforilacin de la protena IB, como control positivo se
utiliz TNF-. B) Clulas musculares C2C12 fueron incubadas con TGF- durante
60 y 360 min. en presencia y ausencia de Andrograflido para evaluar mediante
western blot los niveles de la protena IB, como control positivo se utiliz TNF-.
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Andrograflido (50 M)
PARACTIN
H2O2
TGF- (10 ng/ml)
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
Figura 26. TGF- induce la actividad de un reportero para NFB en clulas

musculares C2C12. Clulas musculares C2C12 fueron transfectadas con un
reportero especfico para NFB y posteriormente fueron incubadas durante 24 horas
con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido y/o PARACTIN. Como
control positivo de la induccin del reportero se utiliz H2O2 (200 M).
Control
Andrograflido
CTGF
CTGF + Andrograflido
Figura 27. El andrograflido inhibe la formacin de fibras de estrs inducida

por CTGF en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron preincubadas durante 2 horas con andrograflido para luego ser co-incubadas con
CTGF durante 1 hora. Al finalizar la incubacin las muestras fueron estudiadas
mediante inmunofluorescencia utilizando la toxina faloidina acoplada a FITC
(verde).
Adv CTGF + PBS
100 m
Figura 28. El andrograflido inhibe el aumento de colgeno tipo III inducido

por CTGF en el msculo esqueltico. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el
msculo Tibialis Anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante
para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrograflido durante 2
das previos a la inyeccin y durante los 5 das posteriores a la inyeccin. Se evalu
mediante inmunohistoqumica la protena de MEC colgeno tipo III.
B
12
12
Veces de induccin Colgeno tipo I
A
10
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
Adv
+
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
BSA
+ VGFP
ehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
+
BSA
+ PGFP
ARACTIN
Andrograflido
TGFb
Vehiculo
Adv+CTGF
+
Vehculo
Adv+ CTGF
+
TGFb
PARACTIN
Andrograflido
D
12
Veces de induccin CD 206
12
Veces de induccin CD68
10
10
8
6
4
10
8
6
4
2
0
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
+
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
Adv
Adv GFP
GFP ++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
GFP GFP
+ Vehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
Adv CTGF
CTGF + +
Adv CTGF
CTGF + +
Adv
Andrograflido
Vehiculo
PARACTIN
Vehculo

andrograflido es capaz de inhibir estos efectos. Msculos tibialis anterior de
ratones C57BL/10 tratados o no con andrograflido, fueron inyectados con un
adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF, para evaluar mediante
real time RT-PCR, los niveles de expresin de molculas relacionadas con fibrosis
como es CD68 (C) y de macrfagos M2 CD206 (D).
A
Adv CTGF + PBS
50 m
50 m
Figura 30. CTGF induce un aumento en la infiltracin de macrofgos en el

musculo esqueletico y el andrograflido inhibe este efecto. Ratones C57BL/10
fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la
secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con
andrograflido durante 2 das previos a la inyeccin y durante los 5 das posteriores
a la inyeccin. A) Se evalu mediante inmunofluorescencia utilizando los
anticuerpos anti F4/80 (verde) y CD206 (rojo) para determinar los tipos de
poblaciones presentes en el tejido. Los macrofagos del tipo M1 (F4/80 positivos y
CD206 negativos) se observan en verde, mientras los macrfagos del tipo M2
(F4/80 positivos y CD206 positivos). Se observan en color amarillo. (B) Para
determinar de forma ms especfica la presencia de macrfagos M1, determinamos
mediante inmunohistoqumica la presencia de estos utilizando el anticuerpo anti
CD68.
B
2000
1600
1400
1200
1000
800
600
400
Macrfagos M2
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
200
Adv CTGF + Vehculo
Adv CTGF + Vehculo
100
% de Macrfagos M1 o M2/
Macrfagos totales
2000
Macrfagos M1
1800
90
80
70
60
50
Macrfagos M1
40
Macrfagos M2
30
20
10
0
Adv CTGF + Vehculo
Figura 31. El andrograflido disminuye principalmente el nmero de

Macrfagos M1 inducidos por CTGF en el msculo esqueltico. Ratones
C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que
contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente, los ratones fueron
tratados con andrograflido durante 2 das previos a la inyeccin y durante los 5
das posteriores a la inyeccin. A) Cuantificacin del nmero de macrfagos M1
por unidad de rea, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y
CD206 negativos). B) Cuantificacin del nmero de macrfagos M2, evaluados
mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 positivos) por unidad de
rea. C) Porcentaje del nmero de macrfagos M1 y M2 versus el nmero total de
Macrfagos.
mdx ejercitado + Andrograflido
mdx ejercitado+ Andrograflido
30
25
20
15
10
5
0
Ejercicio
Andrograflido
- 1
-
+ 2
-
- 3
+
4
+
+
Figure 32. La fibrosis inhibe la migracin celular y el andrograflido revierte este efecto.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrograflido y adems
ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedi a inyectar 5 millones de
clulas migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis
Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyeccin se cuantific el nmero de clulas
encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyeccin en relacin al numero total de clulas
encontradas por seccin. En verde se muestra la protena colgeno tipo III teida mediante
inmunofluorescencia. B. Cuantificacin del porcentaje de clulas encontradas en zonas
alejadas al sitio de la inyeccin (mayor a 1 mm de distancia).
% de celulas migratorias
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
% de colgeno 6po III
Figura 33. Las clulas migratorias se encuentran preferentemente en areas

con bajo contenido de Colgeno tipo III. Msculos tibialis anterior de animales
mdx tratados o no con andrograflido, fueron inyectado con 5 millones de clulas
migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo). Luego de un mes se
procedi a realizar cortes histolgicos y del msculo para determinar el nmero de
clulas migratorias en diferentes zonas con diferentes niveles de colgeno tipo III
(verde). El contenido se colgeno se cuantifico de forma indirecta, mediante el
software image J (NIH/USA), determinando el area de la imagen ocupada por
colgeno.
Vehculo
Andrograflido
# Fibras distrona (+) / Tibialis

Anterior
200
160
120
80
40
0
mdx + Vehculo
mdx + PARACTIN

celular. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados durante 2 meses con
andrograflido. Finalizado este tratamiento se esperaron 2 semanas para luego trasplantar
mioblastos de musculo control en el musculo Tibialis Anterior de estos ratones. A) Al cabo
de 1 mes se procedi a analizar los msculos mediante inmunofluorecencia indirecta para
determinar el numero de fibras capaces de expresar distrofina (rojo). Para demostrar que los
msculos provenientes de ratones mdx tratados con andrograflido presentan menos
fibrosis, realizamos inmunofluorescencia para la protena de MEC (colgeno tipo III)
mostrada en color verde, en azul se muestran los ncleos celulares teidos con Hoechst. B)
cuantificacin del numero de fibras musculares positivas para distrofina.
35
30
mN/mm2
25
20
* *
C57
+ Vehculo
C57 BL/10
+ Vehculo
C57
+ Andrograflido
C57 BL/10
+ PARACTIN
mdx
+ Andrograflido
mdx BL/10
+ PARACTIN
15
mdx
+ Vehculo
mdx BL/10
+ Vehculo
10
5
0
0
20
40
60
Frecuencia (pps)
80
100

distrficos. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrograflido a partir
evaluar mediante electrofisiologa la fuerza inmediata (sacudida) a diferentes
frecuencias.
30
25
mN/mm2
20
15
10
5
0
C57Bl/10 +
mdx +
Andrograflido

distrfico. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrograflido a partir
evaluar mediante electrofisiologa la fuerza tetnica producida a la mnima
frecuencia que produjo la mayor fuerza inmediata (sacudida).
30
mN/mm2
#Retrocesos
25
35
30
20
25
15
20
10
15
105
5
00
C57Bl/10 +
mdx +
C57 + Vehculo
C57 +
mdx + Vehculo
mdx +
Andrograflido
PARACTIN
PARACTIN
Figura 37. El andrograflido mejora el performance de los animales distrficos

frente al ejercicio. A. Ratones mdx y control fueron tratados o no con
andrograflido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. A partir del 6
semanas de edad comenzaron a ser entrenados en una cinta trotadora durante los
siguientes 3 meses. Luego fueron desafiados un protocolo de ejercicio extenuante
durante 5 minutos y se evalu el nmero de veces en que estos paraban y
retrocedan en la cinta trotadora, cruzando la zona demarcada con la lnea roja. B.
Cuantificacin de un promedio de 5 mediciones de 8 animales distintos para cada
tratamiento.

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

Facultad de Ciencias Biolgicas

IMPACTO DE LA FIBROSIS EN LA FISIOLOGA

DANIEL ALEJANDRO CABRERA GARCA

Memoria de investigacin entregada a la Facultad de Ciencias Biolgicas de la

INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ 5

2.2. Determinar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido aumenta el

Cepas de Bacterias ...................................................................................... 37

Vectores y plasmidios. ................................................................................ 37

Lneas Celulares Eucariticas ..................................................................... 38

Animales de Experimentacin .................................................................... 39

Partidores para RT-PCR en tiempo real ............................................................. 41

Material Anestsico y Quirrgico ...................................................................... 42

Material de Cultivo Celular ................................................................................ 42

Reactivos Generales ........................................................................................... 44

Reactivos para Histologa e Inmunofluorescencia ............................................. 44

Reactivos de Biologa Molecular ....................................................................... 45

Marcadores de Masa Molecular ......................................................................... 45

Enzimas Comerciales ......................................................................................... 46

Sistemas Comerciales ......................................................................................... 46

Medios de Cultivo Celular ................................................................................. 47

Cultivo Celular ................................................................................................... 48

Mantencin de Lneas Celulares ................................................................. 48

Diferenciacin de clulas C2C12................................................................ 48

Transfeccin Transiente en Clulas Eucariontes ........................................ 49

Ensayos enzimticos .......................................................................................... 50

Ensayo de luciferasa ................................................................................... 50

3.2.2.. -galactosidasa ............................................................................................ 50

Ensayo de Northern ............................................................................................ 51

3.3.1. Electroforesis de RNA en geles de agarosa y transferencia a membranas de

Marcacin radioactiva de la sonda de DNA ............................................... 52

Hibridacin y lavados ................................................................................. 52

Amplificacin y Purificacin de Adenovirus Recombinantes ........................... 53

Preparacin de Lisados Celulares ...................................................................... 54

Genotipificacin Ratones mdx ........................................................................... 54

Infeccin de Animales con Adenovirus Recombinantes.................................... 55

Inyeccin intramuscular de TGF ................................................................... 55

Tratamiento con andrograflido y PARACTIN. ................................................ 56

Inyeccin intramuscular de fibroblastos. ........................................................ 56

3.11. Induccin de fibrosis por ejercicio en ratones mdx .............................................. 57

Trasplante intramuscular de miobloastos ....................................................... 58

Ciruga y Toma de Muestras .......................................................................... 62

Obtencin de Homogenizado Total de Msculo ............................................ 62

3.15. Determinacin de Protenas en Lisados Celulares y en Homogenizados de

Hibridacin tipo Western Blot ........................................................................ 63

Extraccin de RNA en msculo esqueltico y sntesis de cDNA .................. 64

RT-PCR en tiempo real .................................................................................. 65

Ensayos de electrofisiologa ........................................................................... 66

Ensayos de Inmunofluorescencia ................................................................... 67

Ensayos de Inmunohistoqumica .................................................................... 68

Tinciones histolgicas .................................................................................... 68

Tincin de Hematoxilina y Eosina .......................................................... 68

Tincin de Rojo de Picrosirio.................................................................. 69

1.1. Evaluar el efecto del andrograflido sobre la expresin de CTGF y TGF en

Figura 16. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF por TGF.

Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizados...40

Tabla 2. Lista de partidores utilizados para la expresin de genes a travs de RT-PCR en

5-bromo-4-cloro-3-indolil-1-fosfato/azul nitro tetrazolium

Factor de crecimiento de tejido conectivo

Medio Eagle modificado por Dulbecco

Factor nuclear kappa B

Acido etiln-diamino tetra-actico

Quinasa de adhesin focal

Tetrametil-fluoresceina isotiocianato cristalina