Introduccin al mtodo de

Membrana Filtrante
para anlisis bacteriolgico en
muestras de agua
Actualizacin de Norma Argentina
IRAM 29107-1:2015
Capacitacin Mayo 2016
Direccin Tcnica y Desarrollo Tecnolgico
Laboratorio Central
Area Microbilogia

aysa
 NORMA ARGENTINA
IRAM 29107-1:2015

Calidad ambiental calidad de agua

Deteccin y recuento de bacterias coliformes y de
Escherichia coli

Parte 1- Mtodo de filtracin por membrana para

agua con bajo contenido de flora bacteriana

Este mtodo se basa en un procedimiento de filtracin a travs

de una membrana, el posterior cultivo en un medio
cromognico y el recuento de organismos presentes en la
muestra

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 NORMA ARGENTINA
IRAM 29107-1:2015
DOCUMENTOS NORMATIVOS
IRAM 29104 - Calidad del agua - Evaluacin de membranas filtrantes
utilizadas para anlisis microbiolgicos.
ISO 11133:2014 Microbiologa de los alimentos, piensos y agua.

DOCUMENTOS BIBLIOGRAFICOS
IRAM 29107 -1:2006 Calidad ambiental calidad de agua
Deteccin y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli
Parte 1- Mtodo de filtracin por membrana para agua con bajo
contenido de flora bacteriana
ISO 9308-1: 2014 Calidad de agua- Enumeracin de Escherichia coli y
bacterias coliformes.
Standard Methods for the examination of water and Wastewater- 22nd
edition, 2012.
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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 NORMA ARGENTINA
IRAM 29107-1:2015

www.iram.org.ar
Instituto Argentino de Normalizacin y certificacin
Centro de documentacin
Catlogo de normas
NORMAS ARGENTINAS IRAM
Bsqueda de Normas
Titulo Bactrias coliformes

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 Correciones a la norma iram 29107-1

En punto 8.2 cambia a (21 a 24hs)

Salmon cambia a rosa.
Violeta cambia a azul oscuro.
En tabla 1 se cambia idem 8.2
En punto 12 cambia asimilable domiciliario
por segn legislacin vigente .
En A.2.1 reactivo de Kovacs se elimina de la
norma.

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Control de calidad Microbiolgicos

Controles Ambientales
Control de materiales
Controles medios de cultivo
Controles de Temperatura
Envases para toma de muestra
Controles de esterilizacin

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 Instrumental y Equipos
SM Tabla 9020 B:I
IRAM 29107-1(normativo)

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 Medios de cultivo
correctamente preparados , acondicionados, refrigerados 4 2
rotulados, fecha preparacin , fecha de vencimiento

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o Sector / Fecha
 Preparacin y Fraccionamiento
(autoclave de medios de cultivo hasta 9 litros)

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o Sector / Fecha
 Medios de cultivo y su preparacin
Respetar y cumplir con las recomendaciones especificadas
en el rotulo del envase por el fabricante.
pH, esterilizacin, conservacin, vencimiento , etc
AGAR ENDO LES (99C , 1, no autoclavar , plaqueado
conservar mximo hasta 15 das a 4 2C).
AGAR NUTRITIVO (MUG) (121C , 15 minutos ).
ACC (AGAR CROMOGENICO COLIFORMES(99C ,1 no
autoclavar y agregar el suplemento selectivo cuando la
temperatura descienda a los 50C, plaqueado conservar
hasta 1 mes a 4 2C ).
Suplemento selectivo E.Coli/Coliformes
Vancomicina 5 mg/L(inhibe el crecimiento de bacterias Gram-
positivas)
Cefsulodina 5 mg/L (suprime el crecimiento de Pseudomonas spp y
Aeromonas spp
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o Sector / Fecha
Componentes de ACC

Promotores de crecimiento( an clulas injuriadas)

Peptonas
Piruvato
Sorbitol
Buffer fosfatos
Inhibidores(Gram+ y gram no coliformes)
Tergitol 7
Sustratos cromognicos
Salmon Gal
X-Glucuronido

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 CHROMOCULT COLIFORM AGAR
(E.coli /Coliformes suplemento selectivo
Sustrato + Enzimas Producto

Sustrato Sustrato
Cromognico Cromognico Color

Salmon- X-Glucuronide
GAL
Coliformes totales Rosa- Roja
-D-galactosidasa + -
Escherichia coli
-D-glucuronidasa + + Azul

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 Autoclave
realizar control biolgico de esterilizacin
(Esporas de Bacilo Stearothermophilus)

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 Sondas registradoras
monitoreo del
ciclo completo de esterilizacin

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 Informe control esterilizacin

Cuanto tiempo deben

permanecer los caldos con
Carbohidratos?(SM 9020 B 4)

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 Registradores de ciclo de esterilizacin

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 Material acondicionado para su esterilizacin
cintas indicadoras, papel no txico
Rampa de filtracin acero Inoxidable

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 FILTROS PLASTICOS
autoclavables

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o Sector / Fecha
 Equipo de filtracin
acero inoxidable

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o Sector / Fecha
 EQUIPOS DE FILTRACIN CON SENSORES TCTILES

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o Sector / Fecha
CONTROLES DE CALIDAD EN SIEMBRA:

Sistema de filtracin: cada 6/12 filtrar 100 ml de

agua desionizada estril y sembrar en el agar en
estudio(alfa,beta,gama). La frecuencia de estos
controles las establece el propio laboratorio.
Aplicando este tratamiento se realizan blancos de
mtodo para control de esterilidad de las placas de
petri , medios de cultivo y membranas al mismo
tiempo.
Control Ambiental :
control en superficie para mesadas
control en aire del ambiente de trabajo
control de envases para la toma de muestra
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o Sector / Fecha
 controles ambientales del ensayo

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 Buffer de Lavado
Standard Methods 9050 C
se utiliza para el lavado de filtros
Sn stock de Buffer fosfato: (disolver 34,0 g de fosfato monobsico
de potasio en 500 ml de agua desionizada).Ajustar el pH a 7,2 0,5
con soluciones de HCl 1N o NaH0 1N utilizando pHmetro y llevar a
1000 ml con agua desionizada
Sn de Cloruro de magnesio: (disolver 81,1 g de cloruro de
magnesio-hexahidrato en 1 litro de agua desionizada).

Solucin Buffer de Lavado: medir con pipeta 1,25 ml de solucin

buffer fosfato y 5 ml de solucin de Cloruro de magnesio y llevar a
un volumen de 1000 ml con agua desionizada.
Fraccionar en pisetas autoclavables de 1000 ml.
Esterilizar por autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Mantener en cmara fra a una temperatura de 4 2C por un
perodo no mayor a 15 das.

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 ENSAYO

Etapa 1: Filtracin
Etapa 2: Incubacin
Etapa 3: Lectura (recuento)
Confirmacin
Confirmacin Colonias Coliformes Totales (ENDO)
Confirmacin Colonias Escherichia Coli
Pasaje NA-MUG (ENDO)

Test de oxidasa(ACC)
Etapa 4 : Informe de ensayo
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Mtodo filtracin por membrana

Se hace pasar un volumen determinado de

muestra a travs de una membrana filtrante de
un poro tal que retenga los microorganismos en
estudio ; la membrana luego se transfiere con una
pinza colocando el frente de la misma hacia arriba
sobre la superficie de un medio slido , evitando la
formacin de burbujas entre ambas.(para ciertos
microorganismos la membrana se coloca en forma
invertida)
Se requiere de un equipo de filtracin y una
bomba de vacio para acelerar el proceso.

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 Esquema tipo de filtracin
Muestra

Embudo

bomba de vacio
Membrana

marriot
placa petri medio slido
colector

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Direccin
Ttulo de tcnica/ Direccin
la presentacin y Desarrollo Tecnolgico
Gerencia o Sector // Lab.
FechaCentral / Area Microbiologa
Aplicacin:

Adecuada para muestras de agua que contengan

bajo contenido de materias en suspensin por
ejemplo:
Agua potabilizada de toma superficial
Agua potabilizada de toma subterrnea
Agua cruda de toma subterrnea
Agua en sistema de distribucin
Rango de la determinacin :<1 a >100 ufc/100ml.

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Microorganismos :

Grupo Coliformes totales

Genero klebsiella spp Kp
Genero Escherichia spp Ec
Genero Enterobacter spp Ea
Genero citrobacter spp
Enterococcus faecalis Ef
Pseudomonas aeruginosa Ps

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 Abreviaturas y definiciones
ANEXO B (informativo)
UFC: unidad formadora de colonias.(considerando que cada colonia
fue generada por un microorganismo).
ATCC: American type coulter colleccion.
Coliformes Totales: microorganismos perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae que expresan la enzma -galactosidasa .Baclos
Gram negativos (G-), anaerobios facultativos , no esporulados
,citocromo oxidasa negativos , capaces de fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas. En el medio de agar M-Endo-Les,
fermentan la lactosa produciendo aldehdos y cidos que junto con la
fucsina ,recubren la superficie de las colonias con un caracterstico
brillo metlico en un tiempo no mayor a 24 hs a 35(0,5)C.
Escherichia coli :microorganismo perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae que expresa las enzimas galactosidasa y -
glucuronidasa .Capaz de escindir el sustrato MUG, formando 4-
metilumbeliferona, que se caracteriza por ser fluorescente a la luz
ultravioleta. Pertenece al grupo de coliformes fecales.
MUG: 4-metilumbeliferil--D-glucurnido.

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 Etapa N1
Siembra
Flujo Laminar

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 Siembra BHV 36C /Agar Endo Les
Agar Cetrimide

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 Capacitacin RELAS Mayo 2016
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 Capacitacin RELAS Mayo 2016
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 Capacitacin RELAS Mayo 2016
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 Capacitacin RELAS Mayo 2016
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 Etapa N 2
INCUBACIN
Coliformes Totales, E. coli
Agar Endo Les Incubar 22 a 24 hs a 35+/- 0.5C
Agar Coliformes Incubar 21+/- 3 hs a 36C +/- 2C

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 Capacitacin RELAS Mayo 2016
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 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS
DE CULTIVO
ISO 11133:2014
Contar con un cepario para evaluar todos los
medios de cultivo producidos
Realizar controles con organismos target y
organismos no target
IPR (Agar evaluado/Agar referencia) 70%
Selectividad. Inhibicin total del crecimiento de una cepa de
referencia no target en el medio de cultivo selectivo, bajo
condiciones definidas.
Especificidad. Demostracin de las caractersticas visuales
especficas de los microorganismos target pero no de los no target,
bajo condiciones definidas.

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 Control calidad Agar
ENDO LES/COLIFORMES/BRILLANCE
Escherichia coli ATCC 25922

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 Control calidad Agar
ENDO LES/ COLIFORMES/ BRILLANCE
klebsiella pneumoniae ATCC 13883

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 Aseguramiento de la calidad
IRAM 29107-1:2015

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Direccin tcnica y Desarrollo / Lab. Central / Area Microbiologa
o Sector / Fecha
 Control calidad Agar coliformes
I Productividad
IRAM 29107-1:2015

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 Enterobacter aerogenes Escherichia coli
ATCC 13048 ATCC 25922
rosa azul

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o Sector / Fecha
 Control calidad Agar coliformes
IRAM 29107-1:2015

Especificidad - Selectividad

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 MIX CONTROL 3 CEPAS(Ec-Kp-Sal)

AGAR M-ENDO LES CHROMOCULT COLIFORM AGAR

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 Etapa N3
Lectura y confirmacin
Realizar lectura de las placas una por una diferenciando el o
los tipos de colonias presentes en la membrana.
Diagnostico presuntivo: AGAR ENDO LES
Coliformes: Colonias tpicas con brillo metlico.
Colonias atpicas(rojas oscuras)
No Coliformes ( transparentes , rosa claro)
Diagnstico definitivo : confirmar las colonias de coliformes en
caldo LST 48 hs y caldo VB 48 hs (del LST)
n 5 picar 5 n 6 a 25 picar 5
n >25 siguiente formula n (redondear al entero superior)
Ejemplo: 32 ufc 32= 5, 6 picar 6 colonias.
Ejemplo: 61 ufc 61= 7,. 8 picar 8 colonias.

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 Confirmacin
Repicar las colonias presuntivas de coliformes
totales (Agar Endo LES)
Caldo LST incubar por 24 a 48hs a 35 0,5 C.
Repicar los tubos LST positivos a caldo VB, incubar
por 24 a 48 hs a 35 0,5 C.
Traspasar membrana al Agar Nutritivo + MUG
incubar por 4 hs a 35 0,5 C leer bajo lampara
UV
Realizar test de oxidasa del PCA ansa de plstica o
platino. (Agar Cromognicos; Agar Endo LES)
Realizar api test (opcional).
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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 Confirmacin
Agar ENDO Agar CROMOGENICO
Repicar las colonias presuntivas de coliformes totales

1)Test oxidasa
1)Test de oxidasa

2) Caldo LST

24 a 48hs a 35 0,5 C.
Repicar los tubos LST positivos

3) Caldo VB

24 a 48 hs a 35 0,5 C.

4)Traspasar membrana al Agar

Nutritivo + MUG

4 hs a 35 0,5 C

leer bajo lampara UV

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Ttulo de laDireccin
presentacin / Direccin
tcnica Gerencia
y Desarrollo o Sector / Fecha
Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
 Lectura Agar Endo LES
presuntivo

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 Lectura Agar Endo LES
Agua cruda subterrnea
presuntivo

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
Repique a Caldo Lauryl sulfato triptosa

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 MUESTRAS CLIENTE EXTERNO

AGAR M-ENDO LES CHROMOCULT COLIFORM AGAR

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 Lectura Agar Coliformes
Agua cruda subterrnea

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 MUESTRA CLIENTE EXTERNO
Medio ACC

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 Lectura Agar Coliformes
Agua cruda subterrnea

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 MUESTRAS CLIENTE EXTERNO
Medio ACC

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 Lectura Agar Coliformes
muestras particulares

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 Confirmacin Test oxidasa

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Mtodo de particin (SM-9222-G)

Traspasar la membrana a un agar nutritivo

conteniendo sustrato MUG (4-metil-umbeliferyl--
D-Glucurnido).
Incubar por 4 hs .
observar bajo lampara de luz UV.
la presencia de halo azul fluorescente. (E. coli).
(se puede recomfirmar en caldo EC/triptofano,44,5
0,2 C,24 hs incubacin,reactivo kovacs).

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 Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Medio NA-MUG

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 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
M. CROMOGNICOS MEDIO ENDO LES

PROTECCIN
AL PERSONAL

PROTECCIN
MEDIO AMBIENTE

COLONIAS 21 +/-3 hs + 24HS 24 hs+96 hs

COLIFORMES TOTALES

COLONIAS 21+/-3hs 48 hs
E.COLI

BENEFICIOS/COSTOS

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 control de Agar cetrimida cepa ATCC 27853
Pseudomonas aeruginosa

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Enterococcus faecalis ATCC 29212 en medio
Agar de Slanetz-Bartley.

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 Calidad de agua para ensayos
microbiolgicos
(SM tabla 9020:II)
(Anexo D informativo)

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 EQUIPO SELLADOR TERMICO
MPN (Colilert)

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 -D galactosidasa
hidroliza el sustrato cromognico ONPG
(orto-nitrofenil-B-D-galactopiransido)

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Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector //Fecha
Lab. Central / Area Microbiologa
 -D-glucuronidasa
hidroliza sustrato fluorognico MUG
(4-metil-umbeliferil-B-D-glucurnido)
bajo accin luz UV

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Incubacin y lectura colilert ventaja y
desventaja
Rpido diagnostico 20 a 24 hs.

Se puede detectar presencia/ausencia (sin

el uso de la bandeja cuadriculada ni el
sellador trmico)

Costo muy elevado.

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Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
Colilert falsos positivos

Coliformes totales :Bacterias no coliformes como

Aeromonas y/o Pseudomonas pueden producir
pequeas cantidades de B-D-galactosidasa pero
son suprimidas

E.coli Algunas cepas de Shigella sp poseen enzima

B-D-glucuronidasa (pero por tratarse de un
patogeno humano , fuera del huesped permanece
poco en medio ambiente).

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 Ventajas MF
Tcnica ampliamente reproducible, puede ser utilizada para estudios
con gran cantidad de muestras.
Mayor Volmen de filtrado.
Produce resultados numricos mas rpido que el procedimiento de
MPN.
Extremadamente til para monitoreo de aguas de red de distribucin
y otras variedades de aguas naturales.
Requiere poco espacio para muchas muestras.
Facilita el alerta Temprano de riesgo sanitario por su menor tiempo
incubacin.
Cuando la tcnica de MF no ha sido utilizada previamente en un
laboratorio , se recomienda trabajar en paralelo con el mtodo
utilizado hasta el momento ,para demostrar su aplicabilidad y
comparabilidad .(9222 A. introduccin SM)
Se puede aplicar aguas salinas.
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 Desventajas MF

Limitaciones:
No para aguas con alta turbiedad o con alto
contenido de bacterias no coliformes (efecto
Background )
No recomendable para aguas servidas
No aguas cloacales con tratamiento primario
( pueden contener sustancias txicas tales como
metales pesados y/o compuestos orgnicos tales
como fenoles).

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Ventajas y desventajas NMP
Adecuado mtodo para muestras con alta carga bacteriana
til para muestras con alta turbiedad
Moderado a bajo costo?
Mayor espacio para moderado numero de muestras
No es tan fcilmente reproducible como MF
No siempre se procesa un volumen representativo de la muestra
Mayor tiempo de incubacin
Demora mucho mas tiempo en dar aviso el alerta por riesgo
sanitario
Mayor volumen de Material utilizado previo al ensayo
(acondicionamiento vidrio) y posterior (descontaminacin)

Capacitacin RELAS Mayo 2016

Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 Desventaja NMP espacio tiempo material

Capacitacin RELAS Mayo 2016

Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
Desventaja (tiempo incubacin)

Capacitacin RELAS Mayo 2016

Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 LOGRAR DISMINUIR TIEMPO DE
DIAGNOSTICO DEFINITIVO

Capacitacin RELAS Mayo 2016

Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha
 Muchas gracias

Capacitacin RELAS Mayo 2016

Direccin tcnica y Desarrollo Tecnolgico / Lab. Central / Area Microbiologa
Ttulo de la presentacin / Direccin Gerencia o Sector / Fecha