ADN

Existen dos tipos de cidos nucleicos: El ADN (cido desoxirribonucleico) y el

ARN (cido ribonucleico).
Los cidos nucleicos tienen carga negativa debido al grupo fosfato, son
biomolculas polares, por lo tanto, son solubles en agua e insolubles en
solventes orgnicos como el cloroformo, etanol, fenol, entre otros.
El estudio de estas molculas permiti el entendimiento del cdigo gentico,
la determinacin, funcin e importancia de la sntesis de protenas, adems
del conocimiento del proceso de transmisin de la informacin gentica de
las clulas madre a las hijas durante la divisin celular.
Los cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de molculas
llamadas nucletidos. Cada nucletido est formado a su vez por:
-Un azcar (pentosa): Desoxirribosa (en el caso del ADN) y ribosa (en el caso
del ARN).
-Un grupo fosfato (PO4).
-Una base nitrogenada (pricas y pirimdicas) Para el ADN: Adenina (A) y
Guanina (G) (pricas), Timina (T) y Citosina (C) (pirimdicas). Para el ARN:
Adenina (A) y Guanina (G) (pricas), Uracilo (U) y Citosina (C) (pirimdicas).
El ADN es la molcula base de la vida, con capacidad de autorreplicarse.
El ADN se compone de dos cadenas que son complementarias y
antiparalelas (se refiere al sentido en la que cada cadena se dirige, una de
ellas tiene la direccin 5 3 mientras que la otra cadena se dirige de 3
5).
Adopta una forma de doble hlice (modelo de Watson-Crick) como una
escalera de caracol, donde los lados son cadenas de azcar y fosfatos,
mientras que los peldaos son las bases nitrogenadas. Las cadenas se unen
mediante la complementariedad de bases y establecen puentes de
hidrgeno entre ellas:
-La Adenina forma dos puentes de hidrgeno con la Timina y viceversa.
-La Citosina forma tres puentes de hidrgeno con la Guanina y viceversa.
El ADN se encuentra presente en todos los seres vivos. Por ejemplo, en la
clula eucariota, la molcula de ADN se asocia a protenas llamadas
histonas, y se encuentra muy enrollada y compactada para formas los
cromosomas. Cuando la clula no se encuentra en divisin celular, el ADN
est organizado como una red de fibrillas llamada cromatina.

Breve historia del ADN

-1866: Gregor Mendel publica su trabajo sobre las leyes de la herencia.
-1944: Los experimentos de Oswald y sus colaboradores muestra evidencia
de que el ADN es el portador de la informacin gentica.
-1951: Es secuenciada por primera vez una protena: la insulina.
-1952: Rosalind Franklin y Maurice Wilkins obtienen imgenes, por difraccin
de rayos X, del ADN.
1953: James Watson y Francis Crick determinan y publican un artculo
acerca de la estructura de la doble hlice del ADN.
-1961: Marshall Nirenberg descifra el cdigo gentico.
-1970: Stanley Cohen y Hebert Boyer desarrollan la tecnologa del ADN
recombinante.
-1976: Khorane y sus compaeros de investigacin publican el proyecto de
la sntesis del primer gen sinttico.
-1977: Federic Sanger desarrollo el mtodo Sanger para secuenciar el
ADN.
-1983: Kary Mullis inventa la tcnica de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR).
-1984: Alec Jeffreys desarrolla las tcnicas de la huella gentica y del perfil
de ADN.
-1990: Inicia el proyecto del Genoma Humano (PGH) financiado por el
gobierno de los Estados Unidos que lider Francis Collins.
-1995: Inicia el proyecto Genoma Humano (PGH) a cargo de la empresa
Cellera Genomics de Craig Venter.
-1999: Se secuencia completo, por primera vez, el cromosoma nmero 22.
-2002: Gene Script se convierte en la primera compaa en comercializar
genes sintticos.
-2002-2003: Se completa el proyecto del Genoma Humano.
-2007: Se termina el Proyecto Piloto de la Enciclopedia de los Elementos del
ADN (ENCODE).
La Hemogentica Forense nace a principios de siglo XX, cuando Karl
Landsteiner describe el sistema ABO de los hemates y Von Durgen y
Hirschfeld descubren su transmisin hereditaria. Su objetivo era la
identificacin gentica tanto en casos de investigacin criminal como en
estudios biolgicos de la paternidad.
Gracias al descubrimiento del ADN surge la Gentica Forense, la cual
estudia bsicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad
entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones polimrficas del
ADN. As, analizando un determinado nmero de regiones polimrficas, la
probabilidad de que dos individuos sean genticamente iguales es
prcticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos o
monocigticos).

Extraccin y purificacin de ADN

Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN
mediante un procedimiento qumico son:

Sangre (Salting-out):
Material:
Micro pipetas.
Puntas estriles.
Vortex.
Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de
1.5 mL.
Guantes.
Agua desionizada estril.
Bao de agua a 37 C.
Isopropanol.
Etanol 70%.
Cloruro de amonio.
Bicarbonato de potasio.
EDTA.
SDS.
Acetato de amonio.
Reactivos:
-Buffer de lisis de glbulos rojos (100 mL): 0.83 g de Cloruro de Amonio, 0.1
g de Bicarbonato de Potasio, 0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0, 80 mL de agua
destilada estril.
Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenizacin completa.
Completar a 100 ml con agua destilada estril). Autoclavar y almacenar a
4C.
-Buffer de lisis celular (100 mL): 5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0, 20 ml de SDS
10%, 60 ml de agua destilada estril.
Mezclar cuidadosamente (evitando la formacin de espuma) en un
Erlenmeyer hasta homogenizacin completa. Completar a 100 ml en una
probeta con agua destilada estril. No Autoclavar. Almacenar a temperatura
ambiente.
-Solucin precipitante de protenas (50 mL): 38,54 g de Acetato de Amonio,
10 ml de agua destilada estril.
Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa
homogenizacin. Puede requerir calentamiento ligero. Completar a 50 ml
con agua destilada estril. Autoclavar. Almacenar a 4C.
-Solucin de rehidratacin 10 ml TE (Tris-HCL 10 mM y EDTA 1mM).
Procedimiento:
1.- En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de Buffer de lisis de glbulos rojos y
sobre este adicionar con una pipeta de Pasteur 2 mL de sangre. Con la
misma pipeta mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una
completa homogenizacin.
2.- Agitar por inversin muy suavemente durante 7 minutos a temperatura
ambiente.
3.- Centrifugar a 3000 r. p. m. durante 8 minutos.
4.- Retirar el sobrenadante y conservar el pellet o precipitado.
5.- Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el pellet o precipitado
en el lquido residual.
6.- Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta
homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este
paso se puede suspender el procedimiento, incluso hasta el da siguiente,
dejando los tubos a 4C).
7.- Adicionar 800 l de solucin precipitante de protenas. Mezclar fuerte,
hasta observar grumos de las protenas precipitadas.
8.- Centrifugar a 4000 r. p. m. durante 10 minutos.
9.- Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga 2,4
mL de isopropanol fro y dejar en reposo al menos unos 5 minutos.
10.- Mezclar cuidadosamente por inversin hasta precipitar el ADN.
11.- Extraer el ADN en una pipeta y pasarlo rpidamente por etanol al 70%
fro. Dejar secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer
TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 l, dependiendo de la cantidad
de ADN recuperado.
Nota: El ADN se puede recuperar tomndolo con pipeta Pasteur y
centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 l etanol al 70%.

Semen
De una muestra de semen se extraen los espermatozoides mediante
centrifugacin, los espermatozoides se encontrarn en el precipitado. En
caso de muestras pequeas de semen se agrega proteinasa K, SDS y TE, se
incuba por dos horas a 56 C y despus se centrifuga a 12000 r. p. m. por 10
minutos.
Luego se resuspende nuevamente en proteinasa K, SDS y TE y se agregan
10 l de ditioteitrol, un agente que permeabiliza la cabeza del
espermatozoide. Finalmente, se incuba a 56 C durante 12 horas.

Saliva
Mtodo casero:
-Se aade 1.5 gramos de sal en un vaso de precipitado y luego se aade 5
mililitros de lquido lavaplatos.
-Se aaden 2 ml. de saliva en cuestin en un tubo de ensaye.
-Se juntan en un vaso de precipitado los 2 ml. de saliva y 2.5 ml de la
solucin de sal y lavaplatos. Se mezclan suavemente sin formar espuma.
-Se aade alcohol del 96 pipeteado (aproximadamente 15 ml.) y de forma
que resbale lentamente por las paredes del vaso.
-Poco a poco se observarn capas de sustancias y entre ellas unos
filamentos blanquecinos.

Mtodo Chelex:
1.- Agregar 2 mililitros de saliva en un tubo de ensaye (hisopado).
2. Agregar 200 l de resina Chelex al 5% en TE y agua destilada a la
muestra. (La resina Chelex previene la degradacin del ADN por quelacin
de iones metlicos por ebullicin).
3. Agitar los tubos vigorosamente durante 10 segundos.
4. Incubar a 56C por 30 minutos.
5. Agitar vigorosamente (vrtex) durante 10 minutos.
6. Incubar en un bao de agua hirviendo durante 8 minutos.
7. Agitar vigorosamente 10 segundos.
8. Centrifugar a mxima velocidad por 3 minutos.

Nota: Se puede proceder con PCR pero no con RFLP.

Cabello
En nuestros de cabello, este debe portar consigo el folculo, de lo contrario,
la extraccin de ADN no sera un xito.
El procedimiento inicia lisando el cabello con una solucin de EDTA, SDS y
DTT pH 8 en un tubo de ensaye. Se incuba a 56 C por 2 horas y luego se
centrifuga a 12000 r. p. m. por 10 minutos.

Uas
Se sumergen en etanol al 70% por 10 minutos. Se extraen y se suspenden
en una solucin de lisis con EDTA 0.5 M pH 8.0, proteinasa K y solucin al
10% de SDS y se incuba a 56C por 72 horas. Finalmente se centrifuga a
12000 r. p. m. por 10 minutos.
 Huella Gentica
El trmino huella digital gentica fue acuado por Alec Jeffrys en Inglaterra.
Este investigador descubri que en ciertas regiones del ADN haba
pequeos fragmentos que llaman minisatelites, que solo se repiten cierto
nmero de veces diferentes siempre en cada individuo. Adems desarrollo
una tcnica para analizar estas repeticiones de minisatelites en las
personas. As gracias a esta tcnica se produce en cada individuo un cdigo
de barras igual que una huella digital.
La tcnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su
secuencia de ADN en comn y para distinguir a dos individuos se puede
explotar la repeticin de secuencias altamente variables llamadas
minisatlites o satlites. Dos seres humanos no emparentados ser poco
factible que tengan el mismo nmero de minisatlites o satlites.

RFLP
A continuacin se siguen estos pasos:
1.- Digestin del ADN con enzimas de restriccin, las cuales cortarn la
cadena de ADN en RFLPs (Fragmentos de Restriccin de Longitud
Polifrmica). Se aade a un tubo Eppendorf.
2.- Se le aade colorante azul (que sirve como punto de referencia en la
electroforesis) al tubo y se carga en un gel de agarosa para realizar la
electroforesis.
3.- Cada fragmento de ADN viaja a travs del gel impulsado por la corriente
elctrica, a una velocidad constante que depende inversamente de su
tamao (el fragmento ms pequeo viaja ms rpido a travs del gel y
viceversa).
4.- El ADN se puede teir con bromuro de etidio u otro compuesto
intercalante, de modo que al iluminar el gel con luz ultravioleta se ve la
posicin de las molculas de ADN; todos los fragmentos de un mismo
tamao estarn juntos formando una banda en el gel.
5.- Se transfieren las cadenas a una membrana de nylon o nitrocelulosa y se
fijan por medio de calor a 80C.
6.- Se realiza la hibridacin de la sonda marcada y desnaturalizada con los
fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para
eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.
7.- Finalmente se revela en placa radiogrfica, se fija fotogrficamente y se
interpretan los resultados.
El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:
Sondas Mono-locus o Uni-locus (SLP): Son especficas para una regin
de un determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucletidos
y presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado
se observan una o dos bandas por individuo, segn sea homocigoto o
heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con estas sondas se denomina
perfil unilocus de ADN o DNA profiling
Sondas Multi-locus (MLP): Hibridan con secuencias presentes en varios
loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucletidos que se
repiten mltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas
por persona. Este patrn de mltiples bandas se conoce como huella
gentica multilocus o DNA fingerprint.
 Sonda uni-locus. Sonda multi-locus.

Diferencias entre PCR y RFLP.

La PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa), permite amplificar ms de
un milln de veces un ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del
genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de
nucletidos.
Para la PCR se utilizan dos primers (oligonucletidos sintticos de unos 15-
20 nucletidos). Estos actan como cebadores para la sntesis in vitro de
ADN la cual est habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq
polimerasa. Dicha enzima se asla de una bacteria termfila,
denominada Thermus Aquticus, que es capaz de crecer a temperaturas
elevadas (79C-85C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de
mantener una media de extensin de ms de 60 nucletidos por segundo
en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura ptima a la que acta
la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unin de
los primers y para su extensin.
Componentes:
-Buffer de amplificacin, los cuales contienen KCl, Tris y MgCl 2.
-Primers (comprendidos de 18 a 24 bases, 1:1 purinas y pirimdicas (como
mximo 40%:60%), deben empezar y terminar con 1 a 2 bases pricas y
deben tener una Tm (temperatura de fusin de 5C).
-Desoxidonucletidos trifosfatos (dNTPs).
-Enzima Taq polimerasa.
-ADN molde o template. Es aquel que la Taq polimerasa utiliza como
molde para la sntesis de nuevas cadenas polinucleotdicas.

Proceso:
1.-DESNATURALIZACIN: Para que comience la reaccin es necesario que el
ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue
aplicando temperaturas de 90 a 95C que producen la rotura de los puentes
de hidrgeno y por lo tanto la separacin de ambas cadenas. Para conseguir
la completa separacin de las hebras de toda la muestra debe mantenerse
dicha temperatura unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza
parcialmente ste tender a renaturalizarse rpidamente, evitando as una
eficiente hibridacin de los primers y una posterior extensin.
2.- HIBRIDACIN: Esta fase se denomina tambin fase de annealing o de
emparejamiento. Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40C y los 60C para
que se pueda producir la unin de los primers a las secuencias laterales o
flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusin
o annealing (Tm, melting temperature) depende de varios factores y es
relativamente especfica para cada primer. La longitud de los primers y la
secuencia son crticas en la designacin de los parmetros de una
amplificacin. Una frmula simple para calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para
determinar su temperatura de annealing especfica ya que si la temperatura
es muy baja la unin se har de forma inespecfica y si es muy alta no se
producir una unin completa.
3.- EXTENSIN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucletidos
en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN
previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este
paso suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Taq
polimerasa alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20
segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb (pares de
bases), y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2 kb (mil pares de
bases).

REFERENCIAS:

1.- Buenrostro Buenrostro J. A., Cano Gonzlez M. E., Crdova Prez I.,
Jimnez Snchez N. G., Osorno Resndiz C. M., Prez Campos J., Valdez
Omaa M. T. y Palmern Martnez M. A. Biologa Celular: Manual de Prcticas.
IPN. Mxico. 2013. pp. 20-25.
2.- Entrala C. Tcnicas de Anlisis del ADN en Gentica Forense. Espaa.
2000. URL: http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/forensetec.htm
3.- Rodrguez Gonzlez N. 60 aos del ADN. UNAM. Mxico. 2014. URL:
http://www.dgdc.unam.mx/assets/publicaciones/cuadernos-de-periodismo-
cientifico/cpc_01.pdf
4.- Marn Rojas L. La Huella Gentica (La tecnologa del ADN). Revista de
Medicina Legal. Costa Rica. Diciembre 1993-Mayo 1994.
URL: http://www.binasss.sa.cr/revistas/mlcr/v10n2v11n1/art16.pdf
5.- Penacino G. A. Tesis: Investigacin e Implementacin de sistemas de
identificacin de individuos por tcnicas de biologa molecular, con especial
referencia a los estudios post-mrtem. Argentina. URL:
http://www.wwiecorp.com/tesis.html
6.- E. G. M. Biologa Celular y Molecular. Prctica 2: Extraccin de ADN. URL:
https://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/laboratorio
-no-2-extraccion-de-adn.pdf
7.- Cervantes Gonzlez J. L. Obtencin de cido desoxirribonucleico (ADN)
til para anlisis gentico, a partir de uas recortadas. Revista Mdica
Hered. Volumen 14. No. 4. Per. 2003. URL:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=s1018-
130x2003000400014&script=sci_arttext
8.- Crevoisier F., Lalinde C., Rapsch S y Wirthlin R. Extraccin del ADN del
tejido epitelial humano. Taller de Biologa del Colegio Suizo de Madrid.
URL: http://www.madrimasd.org/cienciaysociedad/taller/biologia/extraccion-
adn/
9.- Hernndez L. Extraccin del ADN de la saliva. 2007.
URL: http://www.cienciaonline.com/2007/03/10/extraccion-del-adn-de-la-
saliva/
10.- Prez A. Huella gentica. Veracruz, Mxico. 2014.
URL: http://es.slideshare.net/PriinCzitaH/huella-gentica
11.- Herrez H. Plsmidos en electroforesis. Espaa. 2011.
URL: http://biomodel.uah.es/an/plasmido/inicio.htm