Tecnologa del ADN recombinante y sus aplicaciones en la Medicina.

Objetivos de aprendizaje

-Conocer y familiarizarse con los principios bsicos de la biologa molecular.

-Aprender fundamentos de las tcnicas de rutina de biologa molecular.
-Estudiar la secuenciacin de ADN y su aplicacin en el diagnstico clnico.
-Comprender la tcnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma.
-Conocer y comprender algunas aplicaciones mdicas de la investigacin de genes, estudio de
enfermedades hereditarias, huella gentica, protenas recombinantes, animales transgnicos,
terapia gnica.

Los instrumentos bsicos de la investigacin de genes.

En las ltimas dcadas la tecnologa de recombinacin del ADN tambin conocida como ingeniera
gentica, o ms acertadamente recombinacin gentica in vitro, ha revolucionado la biologa. El campo de la
salud es uno de los ms beneficiados con el desarrollo de esta tecnologa. Las investigaciones que se
realizan en este rea estn enfocadas al diagnstico oportuno de enfermedades, as como su posible
tratamiento a travs de la terapia con molculas recombinantes e introduccin de genes. Adems, la
manipulacin de genes proporcionar en el futuro una herramienta fundamental para la eliminacin de
enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta til que el mdico est familiarizado con
conceptos bsicos sobre biologa molecular, su aplicacin en la investigacin biomdica, y en especial con
sus posibles aplicaciones clnicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la
literatura biomdica, tanto bsica como clnica.
El rpido progreso de la biotecnologa y, de hecho, su propia existencia, es el resultado de utilizar
unas pocas tcnicas que se describen a continuacin.

Enzimas de restriccin

El descubrimiento de las enzimas de restriccin ha permitido a los investigadores manipular segmentos

especficos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta molcula de gran tamao.
Las enzimas de restriccin, o endonucleasas de restriccin, reconocen secuencias de bases
especficas en el ADN doble hlice y cortan en lugares concretos ambas hebras del dplex que contienen las
secuencias reconocidas. Las enzimas de restriccin fueron obtenidas a partir de una gran variedad de
procariontes. Su funcin biolgica en estos organismos consiste en eliminar mediante su actividad de
endonucleasa ADN forneo que pudiera ingresar en una bacteria. El ADN del propio microorganismo no se
destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restriccin se encuentran metilados.
Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas en el ADN de entre 4 a 8 pares de
bases e hidrolizan un enlace fosfodister en cada hebra de la regin reconocida. Una caracterstica notable

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de estos sitios de corte es que casi siempre son palndromos, o una repeticin invertida, y los puntos de corte
estn dispuestos simtricamente (Figura 1).

Figura 1: Los puntos de corte estn indicados por las flechas. El corte con Bam HI (izquierda) produce extremos simple
cadena o adhesivos y el corte con AluI (derecha) produce extremos doble cadena o romos. En cada hebra, la enzima
hidroliza el enlace fosfodister en el lado 3 del eje de simetra.

Se han purificado y caracterizado ms de 100 enzimas de restriccin. Se nombran con una

abreviatura de tres letras que se refiere al organismo hospedador, por ej. Eco de Escherichia coli, Hin de
Haemophilus influenzae, Hae de Haemophilus aegyptius, seguida, en su caso, de una indicacin de la cepa
en cuestin y de un nmero romano (en el caso que se haya identificado ms de una enzima de restriccin de
la misma cepa). Los cortes de estas enzimas pueden ocurrir en el centro mismo de la secuencia dejando lo
que se conoce como extremos romos con ADN doble cadena, o extremos adhesivos si el corte ocurre
corrido en una hebra y en la otra del ADN, dejando en este caso una porcin de hebra simple cadena. Las
enzimas de restriccin se utilizan para cortar molculas de ADN y proporcionar fragmentos especficos que se
pueden analizar y manipular con ms facilidad que la molcula original. Adems, la cantidad de los
fragmentos de ADN obtenidos luego del corte con una enzima de restriccin depender de la frecuencia de
corte de dicha enzima ya que si su secuencia de reconocimiento se encuentra muchas veces repetida en el
ADN, se generarn muchos fragmentos de restriccin de diferentes tamaos. Es importante destacar que a
medida que el sitio de restriccin de una enzima tenga mayor nmero de pares de bases, la frecuencia de
corte ser menor, ya que es menos probable que se combinen dichas pares de bases para formar la
secuencia de reconocimiento y encontrarla en el ADN.

Tcnicas de transferencia o blotting

Las tcnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN
respectivamente. La tcnica de Southern blot fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por
analoga la separacin de ARN se denomin Northern blot y la transferencia de protenas se denomin
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Western blot.
En todas estas tcnicas se realiza primero una electroforesis en gel con el objetivo de separar las
molculas por su tamao y carga, posteriormente la transferencia a una membrana para finalmente identificar
un fragmento especfico de ADN, una molcula de ARN particular o una protena de inters mediante la unin
especfica de otra molcula de cido nucleico (sonda) para ADN o ARN o de un anticuerpo en el caso de las
protenas.
La electroforesis en gel es una tcnica en la que se aplica un campo elctrico para separar molculas
en base a su tamao y a su carga como ya fue explicado en la clase de separacin de protenas. Debido a
que los cidos nucleicos contienen grupos fosfatos cargados negativamente, migran hacia el electrodo
positivo (nodo) en un campo elctrico. El ADN cortado previamente por una o ms enzimas de restriccin o
el ARN es sembrado en un gel y al aplicarse el campo elctrico los fragmentos se separan por tamao. Luego
pueden ser visualizados, detectndose hasta pequeas diferencias de peso molecular. Se utilizan dos tipos
de geles: de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos miles de pares de bases y geles de
agarosa, ms porosos, para separar mezclas de fragmentos de hasta 20.000 bases (20 kilobases (kb)),
utilizados para Southern blot. Una caracterstica importante de estos polmeros es su alta capacidad de
resolucin, por ejemplo utilizando geles de poliacrilamida se pueden distinguir entre cientos de fragmentos de
ADN que difieren en longitud por un nico nucletido (se utilizan para secuenciar ADN) mientras que los geles
de agarosa sirven para separar fragmentos con mayores diferencias de tamao entre s. Luego de la corrida
electrofortica, los fragmentos de cidos nucleicos no se visualizan directamente sino que debe teirse el gel
con un agente que se intercala entre las bases de la doble hlice y que fluoresce al ser irradiado con luz
ultravioleta (como el bromuro de etidio. De esta manera se observan los fragmentos de ADN de una intensa
fluorescencia anaranjada cuando se expone el gel a luz ultravioleta. (Figura 2).

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Figura 2: Electroforesis de cidos nucleicos en gel de agarosa, y tincin con Bromuro de Etidio de los fragmentos
separados.

La transferencia consiste en el pasaje de los cidos nucleicos desde el gel donde se han separado por
electroforesis hacia un papel o membrana de nylon. Esta transferencia ocurre por capilaridad donde el
movimiento del buffer que embebe el gel transfiere las molculas de cido nucleico a la membrana. Es
importante destacar que la posicin de los fragmentos de ADN o ARN en el gel se conserva en la membrana.
En el caso de Southern blot, las membranas deben ser luego sometidas a condiciones alcalinas para
desnaturalizar las dos hebras y dejar al ADN como simple cadena. En el caso del Northern blot no es
necesario este paso ya que el ARN es simple cadena.
Un paso de gran importancia en estas tcnicas, al igual que en la tcnica de Western blot, es el
bloqueo previo de la membrana de manera de evitar hibridaciones inespecficas producto de la gran afinidad
de la membrana por los cidos nucleicos. Con este fin, en general se utiliza ADN de esperma de salmn o
arenque.
Cmo identificar especficamente un fragmento de inters en la membrana? Mediante el uso de sondas
especficas.
SONDAS: Una sonda es un fragmento de tamao variable (de pocos nucletidos como 50 pb hasta 2 kb) que
puede ser ADN o ARN que se une especficamente por complementariedad de bases a la secuencia que se
encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos ms. Este evento de unin por bases
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complementarias se conoce como hibridacin. Se dice que la sonda hibrida con el fragmento especfico.
Una caracterstica fundamental de la sonda es que lleva alguna marca para que pueda detectarse la unin y
por ende, identificar la secuencia de inters a la cual se uni. Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas
para marcar la sonda es la incorporacin de un nucletido radioactivo. Existen nucletidos comerciales
marcados con fsforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes tcnicas le otorga la
capacidad de ser detectada mediante la exposicin de la membrana a una placa autorradiogrfica (como la
de rayos X). En la placa se observan especficamente el o los fragmentos donde hibrid la sonda ya que la
radiacin emitida en ese sitio vela la placa autorradiogrfica. Un concepto importante es que la sonda no tiene
que ser necesariamente del mismo tamao del fragmento de inters, es suficiente que la sonda reconozca
especficamente una porcin del fragmento de inters. Luego que la sonda ha hibridado con el fragmento de
inters, debe lavarse la membrana para eliminar el exceso de sonda que no se hubiera unido especficamente
y luego se visualiza la sonda por autorradiografa (Figura 3). Existen otras formas de deteccin de las sondas
que no son radioactivas, algunas se marcan con grupos qumicos que luego se observan por fluorescencia.

Figura 3: Un fragmento de ADN o una molcula de ARN que contiene una determinada secuencia puede identificarse si
se separan por electroforesis una mezcla de fragmentos, se transfieren a nylon, y se hibridan con una sonda marcada
con 32P (fsforo radioactivo), complementaria a la secuencia que se busca. El fragmento que contiene la secuencia
buscada se visualiza despus por autorradiografa. Recordar: si se realiza un Southern blot, deben separarse las dos
cadenas de ADN en un medio alcalino (NaOH) para que la sonda hibride con la secuencia complementaria a una de las
cadenas (figura modificada de Griffiths et al., 2000).

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 Blotting
Tipo de blot Southern Northern Western
Analiza ADN ARN Protenas
Procedimiento
1) Preparacin de la muestra Se corta en fragmentos Nada Nada

2) Separacin por electroforesis Tamao Tamao Tamao o carga

3) Tratamiento del gel Desnaturalizar el ADN Nada Nada

con lcali
4)Transferir a una membrana Por capilaridad Por capilaridad Campo elctrico

5) Identificar molculas de Sonda de RNA radioac- Sonda de RNA Anticuerpos marcados

inters tiva o ADN simple radioactiva o fluorescente o ra-
cadena ADNsc dioactivamente

Secuenciacin de ADN

La secuenciacin de ADN se realiza mediante mtodos cuya finalidad es la determinacin del orden
de los nucletidos (A, C, G y T) en una molcula de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin
gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos (bacterias), la mitocondria y cloroplastos (en plantas) que
forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN
es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos
aplicados, como el diagnstico de enfermedades hereditarias y la investigacin forense. El desarrollo de la
secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa.
Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran impor-
tancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano.
Los mtodos de secuenciacin actuales se basaron en el mtodo de terminacin de la cadena des-
arrollado por Sanger en el ao 1977. Describiremos el mtodo de terminacin de la cadena, que es el
actualmente utilizado. Se basa en el principio de que molculas de ADN simple cadena que difieren en
longitud en apenas un nucletido pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel de poliacrilamida.
Esto significa que es posible separar una familia de molculas, en representacin de todas las longitudes de
10 a 1500 nucletidos, en una serie de bandas. El principio clave del mtodo de Sanger es el uso de dideoxi-
nucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos dideoxinucletidos terminan
la elongacin de la cadena al carecer del grupo 3'-OH que se necesita para la formacin del enlace fosfodis-
ter entre dos nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN.
El mtodo clsico de terminacin de la cadena o mtodo de Sanger requiere una hebra molde de ADN
simple cadena, un primer de ADN, una ADN polimerasa, nucletidos marcados radiactivamente o mediante

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fluorescencia y nucletidos modificados que terminan la elongacin de la cadena de ADN. La muestra de
ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los cuatro deoxinucletidos
estndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada mezcla de reaccin se aade solo
uno de los cuatro didesoxinucletidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). La incorporacin de un dideoxinu-
cletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que produce varios fragmentos de ADN de
longitud variable. Los dideoxinucletidos se aaden en concentraciones lo suficientemente bajas como para
que se generen fragmentos de todas los posibles tamaos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la
secuenciacin.
Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados son desnaturalizados por calor y separados por ta-
mao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada
una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) de acuerdo al
dideoxinucletido aadido y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografa o luz ultravioleta, y la
secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel.

A B

En la imagen A, la pelcula de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras
corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un
fragmento de ADN que es el resultado de una terminacin de la cadena tras la incorporacin de un dideoxinu-
cletido (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). El nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo al
dideoxinucletido que se aadi en la mezcla de reaccin que di lugar a esa banda. Las posiciones relativas
entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.

Como se muestra en el panel B, actualmente la alternativa es el marcado de los terminadores de la

cadena, un mtodo conocido como "secuenciacin por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este
mtodo es que la secuenciacin se puede llevar a cabo en una sola reaccin, en lugar de en cuatro reaccio-
nes como en el mtodo del cebador marcado. En una secuenciacin por terminador fluorescente se marcan
cada uno de los cuatro dideoxinucletidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente,
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con fluorecen a diferentes longitudes de onda. Este mtodo es atractivo por su gran capacidad y rapidez y
actualmente es el mtodo de referencia en la secuenciacin automatizada con analizadores de secuencia
controlados por computadora

ADN producido por transcripcin reversa

Los ARN mensajeros (ARNm) transcriptos en un tejido determinado pueden ser usados como molde o
templado por la enzima transcriptasa reversa, la cual produce una copia de ADN (ADNc) a partir del ARN. A
diferencia de los fragmentos de ADN clivados a partir del genoma por enzimas de restriccin, el ADN
producido por la transcriptasa reversa, debido a que usa ARNm maduro como templado, no contiene intrones.
La transcriptasa reversa cataliza la sntesis en direccin 5' a 3' a partir de oligo-dT como primer o iniciador.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

TCNICA
En 1984, Kary Mullis ide un ingenioso mtodo para amplificar secuencias especficas de ADN que se
denomina Reaccin en Cadena de la Polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Mediante esta tcnica se
puede amplificar un segmento especfico de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro, si se
conocen las secuencias colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco.
La PCR se llevar a cabo agregando a un tubo a) una solucin que contenga molculas de ADN que
contengan la secuencia a amplificar, b) oligonucletidos (de entre 20 y 30 nucletidos) que actuarn como
cebadores (o primers) unindose especficamente a la secuencias colindantes con la secuencia blanco, c) los
cuatro desoxirribonucletidos (dNTPs), d) un buffer de pH en el rango de 7,4 y e) una ADN polimerasa estable
al calor. Cada ciclo de replicacin consiste en tres pasos:
a) Separacin de las hebras: Desnaturalizacin de la doble hlice de ADN. Las dos hebras de la molcula de
ADN original se separan mediante calentamiento de la solucin a 95C durante 15 segundos.
b) Hibridacin de los cebadores: La solucin se enfra rpidamente a una temperatura entre 50 y 60C que
es generalmente la temperatura a la cual cada cebador se une con una hebra de ADN desapareada. Un
cebador hibrida con el extremo 3 de la secuencia blanco en una hebra y el otro cebador hibrida con el
extremo 3 de la secuencia en la hebra complementaria. No se formar nuevamente el ADN doble hebra
inicial porque los cebadores estn presentes en exceso.
c) Sntesis de ADN: A continuacin la mezcla se calienta a 72C. La ADN polimerasa termoestable (Taq
polimerasa) que se utiliza proviene de una bacteria termfila (Thermus aquaticus) y su temperatura ptima
de accin es alrededor de 70C. La Taq polimerasa cataliza la elongacin de ambos cebadores copiando
la secuencia blanco. La Taq polimerasa puede ser activa an a temperaturas tan extremas como 95C
que es la temperatura del primer paso del ciclo de PCR lo cual permite que se puedan realizar hasta 35
ciclos consecutivos de calentamiento y enfriamiento, sin necesidad de reponer la polimerasa luego de este
paso. Qu pasara si se usase una ADN polimerasa humana? Todos los componentes de la PCR se
agregan por nica vez al inicio de la reaccin.
Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR y se pueden llevar a cabo repetidas y consecutivas
veces modificando nicamente la temperatura de la reaccin. Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de

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 ADN, por lo que finalmente se produce un aumento de 2n de la cantidad de ADN original siendo n el
nmero de ciclos que se llevan a cabo. La amplificacin es de un milln de veces despus de 20 ciclos y
de mil millones de veces despus de 30 ciclos, los cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora
(Figura 4).

Caractersticas importantes de la tcnica

No es necesario conocer toda la secuencia a amplificar, nicamente hay que conocer las secuencias
que flanquean el fragmento de ADN inters.
La regin a amplificar puede ser mucho mayor que los cebadores. Por PCR se pueden amplificar
fragmentos tan grandes como 10 kb.
No es necesario que los cebadores se ajusten perfectamente a las secuencias que flanquean el
fragmento a amplificar. El uso de cebadores derivados de un gen de secuencia conocida hace posible la
bsqueda de variaciones sobre el tema. Esta caracterstica es muy importante porque as se han descubierto
por PCR familias de genes y relaciones evolutivas entre organismos.
La PCR puede ser muy especfica en amplificar un nico fragmento de inters, y no otros, debido al
rigor de la hibridacin de los cebadores a temperatura muy elevada (50-60C). Sin embargo, modificando la
temperatura y concentraciones salinas del buffer se puede controlar el rigor de la amplificacin. La
temperatura y las concentraciones salinas pueden determinar la especificidad de unin de los cebadores a
sus secuencias complementarias. A altas temperaturas y altas concentraciones salinas (condiciones de alta
rigurosidad) los cebadores solamente hibridan con secuencias totalmente complementarias y se amplifica un
nico fragmento; si disminuye la temperatura o las concentraciones salinas (condiciones de baja rigurosidad),
los cebadores comienzan a hibridar con secuencias que no son totalmente complementarias sino que tienen
variaciones de algunas pares de bases.

APLICACIONES
La PCR permite amplificar una secuencia que constituye menos de la millonsima parte del ADN total
de un organismo superior. Es una tcnica sumamente sensible, se puede amplificar y detectar una nica
molcula de ADN.

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Figura 4: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

La PCR puede aportar una informacin muy valiosa en medicina

Deteccin de bacterias y virus utilizando cebadores especficos. Por ejemplo, la PCR puede descubrir la
presencia de virus latentes como los de la hepatitis B y C y el de inmunodeficiencia humano (HIV) en el
genoma de los individuos infectados que no han desarrollado respuesta inmune a dichos patgenos, por
lo cuales no puede ser detectado por ensayos con anticuerpos. La bsqueda de bacilos en muestras de
tejido puede ser muy lenta y laboriosa pero con la PCR se pueden detectar con la presencia de solo 10 de
estos microorganismos por cada milln de clulas humanas.
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 Colaboracin con la medicina forense en la identificacin de personas permitiendo el reconocimiento de
cadveres, parentescos biolgicos en casos de disputa de paternidad.
Establecer grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando secuencias de los HLA del donante y
receptor para determinar compatibilidades.
Deteccin de organismos transgnicos, por ejemplo productos de agricultura como soja o maz, para su
comercializacin.
Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos ya que bajo ciertas circunstancias el ADN puede
mantenerse intacto durante miles de aos o incluso ms tiempo.

PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del ingls quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiem-
po real (del ingls real time PCR) es una variante de la PCR utilizada para amplificar y simultneamente
cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificacin de ADN.
La PCR cuantitativa es la metodologa ms moderna para el estudio de la expresin gnica. Podemos
clasificar las tcnicas de PCR en tiempo real segn el empleo de fluorocromos o bien de sondas moleculares
dependientes de la secuencia.
En las tcnicas basadas en fluorocromos se detecta la generacin exponencial de ADN de doble ca-
dena empleando un fluorocromo que se une intercalndose a la molcula doble cadena y al estar unido
produce fluorescencia. A medida que se amplifican las molculas de ADN aumenta el nmero de molculas
del fluorocromo unidas. Un ejemplo de fluorocromo que permite esta deteccin es el SYBR Green, que,
excitado mediante luz azul (max = 488 nm) emite luz verde (max = 522 nm). Posee la ventaja de requerir
slo un par de cebadores para efectuar la amplificacin, lo que abarata su coste; sin embargo, slo es posible
amplificar un producto en cada reaccin.
La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada
muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el
fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rpidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y las enzimti-
cas de la ADN polimerasa.
La PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la
amplificacin mediante la seal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores
de fluorescencia se expresan en forma logartmica a fin de estudiar fcilmente la fase exponencial de amplifi-
cacin (que aparece como una lnea recta al representar grficamente el logaritmo de la fluorescencia frente
al nmero de ciclo). Este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN
inicial.
Cuantificacin y genotipado en clnica
Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patgenos concretos o a coin-
fecciones, y este hecho no slo puede dificultar el diagnstico mediante las tcnicas clsicas, sino que puede
redundar en un distinto pronstico y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la
PCR en tiempo real posibilita tanto la cuantificacin como el genotipado (caracterizacin de la cepa) de virus

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como el HBV (virus de la hepatitis B). El grado de infeccin, cuantificado como las copias de genoma viral por
unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del
herpes simple de tipo 1 se reactive est relacionada con el nmero de neuronas infectadas en los ganglios.
Esta cuantificacin se realiza mediante retrotranscripcin o sin ella, en el caso de que los virus se integren en
el genoma humano en algn momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano),
alguna de cuyas variantes est asociada con la aparicin de cncer de crvix.

Clonado de ADN
La primera tcnica desarrollada para amplificar ADN en cantidad es conocida como clonado. Un
fragmento de ADN obtenido a partir de un organismo (ADN forneo) es insertado en un vector (o
transportador) compuesto de ADN, y la quimera as obtenida (ADN recombinante) es usada para transformar
clulas hospedadoras. A medida que la clula hospedadora se divide, adems de replicar su propio ADN, ella
tambin replica el ADN del vector, el cual incluye el ADN forneo. Subsecuentemente, se podran aislar
cantidades relativamente grandes del ADN forneo.
Si las clulas hospedadoras son bacterias, el primer paso en el procedimiento de clonado es insertar
el ADN forneo dentro de un vector que pueda transportar este ADN dentro de la bacteria. Los vectores son
unidades de ADN que pueden replicarse en forma autnoma y dentro de los cuales pueden insertarse otros
fragmentos de ADN. Los vectores ms comnmente usados son plsmidos que son molculas de ADN
circular doble cadena extracromosomal que se encuentran en bacterias en forma natural. Los plsmidos
naturales tienen la capacidad de replicarse autnomamente y nicamente dentro de la clula hospedadora
adecuada. Estos vectores poseen un tamao pequeo que facilita su entrada a la bacteria y adems,
habitualmente portan genes que le confieren al la misma resistencia a antibiticos como ampicilina.
Estos plsmidos han sido modificados mediante ingeniera gentica y actualmente existen
comercialmente una gran variedad de los mismos para distintos propsitos. Los vectores de clonado poseen
una regin denominada sitio de clonado multiple que contiene sitios de corte de distintas enzimas de
restriccin que permite la insercin del ADN forneo en esa regin del plsmido.
Para insercin de un segmento de ADN forneo a un vector de clonado, dicho segmento de ADN y el
plsmido deben ser clivados con la misma enzima de restriccin. En el proceso ms simple se usa una
enzima de restriccin que produce extremos adhesivos tanto en el ADN forneo como en el vector. Estas
regiones de ADN simple cadena complementarias pueden aparearse entre si. Una vez producido el
apareamiento entre las bases se pueden unir ambas molculas covalentemente por la accin de la enzima
ADN-ligasa.
La nueva molcula de ADN producto de la unin de dos molculas de ADN de diferente origen se
denomina ADN recombinante. Una vez obtenidas estas nuevas molculas para lograr su amplificacin, es
decir obtener un mayor nmero de copias, se deben introducir a una clula hospedadora. El proceso
mediante el cual se introduce un vector a una bacteria se denomina transformacin. Si se introduce un vector
a una clula eucarionte este proceso es denominado transfeccin.

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Figura 5: Vector plasmdico de clonado de ADN circular, con sus componentes bsicos; AmpR, resistencia a ampicilina
para seleccin; Insert, sitio de clonado mltiple, con sitios de restriccin para varias enzimas de restriccin diferentes
donde se inserta el fragmento de ADN de inters; T7, promotor que reconoce la ARN polimerasa II de Escherichia coli,
EcoRI y PstI, sitios de corte para las respectivas enzimas de restriccin.

MARCADO DE LOCI EN CROMOSOMAS ESPECFICOS

Varios mtodos son tiles para asignar genes o marcadores a los cromosomas individuales, uno de
ellos es la hibridacin in situ. Si el gen est clonado y est disponible, se puede utilizar para realizar una
sonda marcada para la hibridacin in situ. Si los cromosomas individuales del set genmico son identificables
mediante su patrn de bandas, tamao, relacin de los brazos, o alguna otra caracterstica citolgica, puede
ser localizado el nuevo gen en un cromosoma si hibrida con el.
Las sondas ms comnmente utilizadas son radioactivas o fluorescentes. En la tcnica de hibridacin
in situ fluorescente (FISH; fluorescent in situ hibridization), la sonda complementaria al gen en estudio se
marca con un reactivo fluorescente y una preparacin de cromosomas parcialmente desnaturalizados se
incuba con la sonda. La sonda se une al cromosoma in situ y la localizacin del fragmento clonado se revela
como una seal fluorescente (Figura 6).

Figura 6: Anlisis de FISH de cromosomas de tres especies diferentes de plantas. Las sondas usadas eran
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complementarias a regiones codificantes para ARN ribosomal en azul (para el 5S), en rosa (para el 18S, 5,8S y 26S) y
en verde una secuencia especfica de las dos especias de arriba.

POLIMORFISMOS DEL ADN

Los polimorfismos en el genoma sirven como base para el uso de tcnicas de ADN recombinante en el
diagnstico de enfermedades. Los polimorfismos son variaciones en las secuencias de ADN. En el genoma
humano pueden encontrarse millones de diferentes polimorfismos. Los primeros en ser identificados
involucraban mutaciones puntuales, la sustitucin de una base por otra pero tambin pueden ser deleciones e
inserciones. Algunos polimorfismos, que ocurren dentro de la regin codificante de genes y otros que se
encuentran en regiones no codificantes estrechamente relacionadas a genes, estn involucrados en la
etiologa (causa) de enfermedades heredables.
El anlisis de ADN hace posible examinar variaciones en la secuencia de ADN entre individuos y entre
especies. Se pueden realizar estos estudios a dos niveles: estudiar la variacin en sitios reconocidos por
enzimas de restriccin (por RFLP, tcnica que est en desuso actualmente) y en un nivel ms preciso,
mtodos de secuenciacin del ADN que permiten analizar la variacin del ADN base por base. La
secuenciacin es el mtodo de eleccin en la actualidad para analizar regiones del ADN, zonas de genes,
regiones no codificantes, vectores etc.

Aplicaciones de las tcnicas de secuenciacin en el diagnstico de enfermedades hereditarias

La Poliposis adenomatosa familiar (PAF) es una enfermedad autosmica dominante, que se

caracteriza clsicamente por el desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto durante
la segunda dcada de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8,300 nacimientos, y se manifiesta por
igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan cncer colorrectal (CCR) si no se identifi-
can y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es causada por mutaciones en un gen
supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21.
El gen APC codifica para una protena de 2843 aminocidos y produce un ARNm de 8,9 Kb divi-
dido en 15 exones. La protena APC tiene mltiples dominios que median tanto la oligomerizacin como
la unin a una variedad de protenas intracelulares, las cuales tienen importantes roles en la adhesin
celular, la transduccin de seales, y la activacin de la transcripcin. Otras caractersticas son: 1) Las
mutaciones pueden ocurrir en varias localizaciones dentro del gen APC. 2) Las dos mutaciones ms
comunes son en los codones 1061 y 1309, se describe un nuevo sitio con alta probabilidad de mutacio-
nes en la ubicacin 1465. 3) Las mutaciones del APC patognicas resultan en un codn stop prematuro
por alguno de estos mecanismos: sustitucin, delecin o insercin de nucletido.
Hoy en da, una serie de pruebas genticas estn disponibles para analizar las mutaciones en el
gen APC. El mtodo ms utilizado actualmente es la secuenciacin directa del gen APC. Cuando se
identifica una mutacin especfica causante de la enfermedad, se debe realizar la prueba gentica a
todos los parientes de primer grado. Miembros de la familia con un resultado negativo para la mutacin
detectada en el paciente no necesitan ms investigacin y su seguimiento es el mismo de la poblacin

14
en general.
La informacin gentica no es solo relevante para el paciente afectado, sino tambin para la
familia inmediata y sus futuros descendientes. La prevencin del cncer y el mantener una buena
calidad de vida de estos pacientes son los objetivos principales. Por eso el diagnstico precoz a travs
del anlisis de la secuencia del gen logr extender y mejorar la calidad de vida de estos pacientes.
Tambin es relevante el conocimiento de que tipo de mutacin presentan los pacientes ya que
ayuda a predecir la severidad de la enfermedad, dado que la ubicacin de la mutacin puede afectar la
funcin de la protena de diferente manera.

Farmacogentica

Es la ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la respuesta a frmacos.
Explora como estas variaciones se pueden utilizar para predecir si un paciente tendr una buena, mala o
ninguna respuesta a una determinada droga. Hay una diferencia entre farmacogentica y
farmacogenmica? Farmacogenmica se refiere al estudio general de diversos genes que determinan
comportamiento a una droga. La farmacogentica refiere al estudio de las diferencias heredadas
(variaciones) en el metabolismo y respuesta a una droga. La distincin entre los dos trminos se considera
arbitraria y actualmente los dos trminos se utilizan alternativamente. Para entender mejor la importancia de
esta nueva rama de la ciencia les describiremos un ejemplo.

Lucia es una nia de siete aos que padece leucemia. Su doctor quiere comenzar la quimioterapia
cuanto antes. El purinethol es un quimioterpico comn cuyo mecanismo de accin involucra su incorpora-
cin a las clulas cancerosas en activa divisin que conlleva la muerte celular. Esta droga fue utilizada por
primera vez hace 30 aos. Mientras que la mayora de los pacientes fueron beneficiados por el uso de esta
droga, los doctores saban que el tratamiento produca un riesgo de muy importante y los efectos secundarios
eran a veces fatales en ciertos pacientes. Se estudi entonces el metabolismo de la droga encontrndose que
la enzima TPMT es responsable de metabolizarla e inactivarla. Encontraron que en la poblacin variaban los
niveles de la actividad enzimtica de TPMT. Dado que se trata de una sustancia txica es importante que
permanezca solamente en el cuerpo por una cantidad de tiempo limitada y que afecte principalmente a las
clulas cancerosas y no a las clulas normales. Por lo tanto, antes de prescribir la droga, es crtico conocer si
el paciente tiene actividad de TPMT para hacer inactivo con eficacia el Purinethol. El 89% de los nios poseen
la capacidad de inactivar la droga txica eficientemente, mientras el 11% de los nios tienen una variante de

15
TPMT con menor eficiencia pudiendo sufrir efectos secundarios severos si se les administra la dosis completa
del tratamiento. Sin embargo, se beneficiarn de una dosis mucho ms baja. El 0.33% de nios tienen la
variante de menor actividad, y la sustancia txica puede persistir en el cuerpo de estos nios durante mucho
mas tiempo por lo que sufrirn efectos secundarios severos o fatales si se les administra cualquier dosis de
Purinethol. Saber qu variante gentica de TPMT posee el paciente influenciar el tratamiento enormemente.

Para determinar la dosificacin de Purinethol que Lucia necesitar se debe realizar una prueba de
diagnstico basada en el estudio de secuencias del ADN para determinar qu variante de TPMT tiene Lucia.

La historia de Lucia ilustra apenas una manera en que la farmacogentica puede ser utilizada en la
clnica. La farmacogentica tambin ayuda a elegir la droga adecuada para un determinado paciente de una
diversidad de distintos tratamientos. Por otro lado ayuda a determinar el riesgo de un paciente frente a un
determinado tratamiento y a disear en funcin de esta informacin una estrategia para tratar la enfermedad.

DETECCION DE POLIMORFISMOS QUE CONTIENEN REGIONES ALTAMENTE VARIABLES

El ADN humano contiene algunas secuencias que estn repetidas en tndem un nmero variable de
veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se llaman regiones hipervariables porque
contienen un nmero variable de repeticiones en tndem (variable number of tandem repeats, VNTRs) o bien
minisatlites de ADN. Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kpb (kilopares de bases) que
consisten en un nmero variable de unidades repetitivas de 15 a ms de 100 pb de longitud en los diferentes
genomas de los individuos. Cuando el ADN completo es cortado con enzimas de restriccin que reconocen
sitios que flanquean la regin VNTR (sin cortar dentro de los VNTRs) se obtienen fragmentos que contienen
esos loci, los cuales difieren en tamao de un individuo a otro dependiendo del nmero de repeticiones que
estn presentes. Los fragmentos de diferentes tamaos pueden ser separados por electroforesis en gel
mediante la tcnica de Southern blot. Las sondas usadas para identificar esos fragmentos de restriccin se
unen a la secuencia que est repetida o a una secuencia cercana a sta (Fig. 8).
Dada la enorme variabilidad en el nmero de repeticiones en tndem de un individuo a otro, el grupo
de fragmentos que aparece en la autorradiografa del Southern blot es altamente personalizado.
Los patrones de fragmentos de restriccin producidos a partir de esos loci pueden usarse para
identificar individuos de manera tan segura como la tradicional huella digital. En efecto, esta tcnica de
fragmentos de restriccin suele ser llamada como la huella digital de ADN (DNA fingerprint) y es
ampliamente usada en anlisis forense. Por este mtodo pueden determinarse relaciones familiares, y puede
usarse para ayudar a incriminar o no a sospechosos en casos policiales. En investigaciones criminales,
pueden usarse muestras de sangre o semen, hasta diminutas muestras de tejido como clulas del folculo
piloso en el extremo de un nico pelo. Las secuencias de VNTRs se amplifican por la tcnica de PCR.
Se realiza el DNA fingerprint y se comparan los patrones de los resultados obtenidos a partir de la
evidencia y de una muestra tomada del sospechoso. Individuos que estn estrechamente relacionados
genticamente tendrn patrones de fragmentos de restriccin que son ms similares que aquellos que estn
ms distantemente relacionados. Slo gemelos monocigticos tendrn patrones idnticos.
Una de las primeras sondas que detectaron los VNTRs humanos fue obtenida en 1985 a partir de una
16
cudruple repeticin de una secuencia de 33 pb encontrada dentro del primer intrn del gen de la mioglobina.
Una vez que los VNTRs se clonaron y secuenciaron se encontr que la razn de la hibridacin de la sonda a
los VNTRs era una secuencia central (core) de 13 pb comn a todas las repeticiones y a la sonda. Las
secuencias flanqueantes a ese core, no eran necesariamente similares.

Figura 8: Obtencin de un DNA fingerprint, utilizando una sonda para VNTR: Panel a). La sonda utilizada reconoce una
secuencia interna de 13 pb presente en los VNTR Panel b): En este diagrama se observa tres cromosomas somticos
homlogos conteniendo VNTRs para cada individuo (I, II, III). El tamao de los fragmentos depende del nmero de
repeticiones que ellos contengan. Se realiza un Southern-blot utilizando la sonda indicada en a) y se visualizan los
fragmentos de restriccin producidos a partir del material genmico de los individuos (A, B y C).

Aplicaciones de la huella gentica

La huella gentica se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras
de sangre, cabello, saliva o semen. Tambin ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados.
Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificacin de los restos humanos, pruebas de paternidad,
la compatibilidad en la donacin de rganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el
establecimiento del origen o la composicin de alimentos. Tambin se ha utilizado para generar hiptesis
sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.

17
Muestras de referencia
Para la identificacin del ADN se debe realizar una extraccin de ADN que puede proceder de
sustancias tales como:
-Artculos personales (por ejemplo cepillo de dientes, maquina de afeitar).
-Banco de muestras (como un banco de esperma o la biopsia de un tejido).
-Parientes de sangre.
-Restos humanos previamente identificados.
-Algunas muestras de referencia son recolectadas con un hisopo bucal.

Existe otra clase de secuencias repetitivas de ADN dispersas, los microsatlites (short tandem
repeats, STRs) que contienen repeticiones ms cortas, de 2 a 5 pb. Literalmente cientos de sistemas de
STRs han sido mapeados en todo el genoma humano, varios fueron investigados para su aplicacin en tests
de identificacin de humanos. Fueron encontrados en casi todos los cromosomas en el genoma y pueden ser
amplificados usando una variedad de cebadores por el mtodo de PCR. Se analizan principalmente
repeticiones de 4 pb que son amplificadas por PCR con mayor fidelidad que las repeticiones dinucletidicas
aunque tambin se usan repticiones tri y pentanucleotdicas. Al examinar mltiples STR loci, se puede
obtener un alto grado de discriminacin entre individuos dada la enorme variedad de alelos presentes en una
poblacin.
Short Tandem Repeats (STRs)
AATG

7 repeticiones

8 repeticiones
La regin repetida es variable entre muestras mientras
que las regiones laterales donde se unen los cebadores
para la PCR son constantes.
Homocigota = Ambos alelos tienen el mismo nmero de
repeticiones
Heterocigota = Los alelos son distintos y pueden ser diferenciados

Ventajas de los STRs sobre los VNTRs

El estudio de STRs por PCR presenta varias ventajas sobre las tcnicas convencionales de Southern
blot de los VNTRs. Se pueden obtener alelos discretos de los STRs, dado su menor tamao, pudindose
diferenciar los fragmentos de ADN por una nica base. Adems puede usarse menor cantidad de ADN o
incluso ADN degradado. Por lo tanto, la integridad y cantidad de muestra es un problema menor al utilizar los
mtodos de tipificacin por basados en PCR que con los mtodos convencionales de obtencin de
fragmentos de distintos tamaos como los VNTRs.
Para revisin del uso de STRs en identidad gentica, se puede acceder a:
http://www.promega.com/pnotes/58/5189c/5189c.html.

18
 Las huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina forense. Igualmente, debe
aclararse que esta metodologa ha sido discutida en algunos mbitos por problemas en las interpretaciones
estadsticas. Es absolutamente necesario que se tengan en cuenta todos los controles, incluyendo muestras
de ADN de la vctima, no slo del sospechoso. Otro cuestionamiento a esta tcnica, es que dada la gran
amplificacin obtenida por PCR se pueden amplificar cantidades mnimas de ADN contaminante de una
fuente no relacionada con el caso. Los resultados obtenidos de las muestras tomadas de los sospechosos se
comparan con el del ADN obtenido de una muestra de sangre tomada de la vctima (Fig. 9; carril 1). Aunque
slo se obtengan pequeas cantidades de la muestra del cuerpo de la vctima, el ADN se puede amplificar
por PCR. Los resultados, usando una sonda que reconoce una de las secuencias repetitivas del ADN
humano, se muestran en la Figura 9.
1- A qu se debe que en los distintos individuos aparezcan fragmentos distintos marcados si se utiliza la
misma sonda?
2- Cul de los sospechosos le resultara culpable?
3- Por qu se analiza tambin el ADN de la vctima?

Figura 9: Anlisis de los VNTRs realizado con las distintas muestras obtenidas en la escena, el carril 1 muestra
los fragmentos de VNTRs obtenidos de la muestra de sangre tomada de la vctima. Las muestras obtenidas se
amplificaron por PCR y se sometieron a Southern blot utilizando una sonda que reconoce una secuencia de 13 pb
comn a todos los VNTRs presentes en el genoma humano.

19
 USO DE TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE PARA LA PREVENCIN Y TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES
Produccin de Protenas Teraputicas

Con el desarrollo de mtodos que permiten la transferencia de genes especficos de una clula a
otra, y la induccin de la expresin de los mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacutica ha
adquirido una gran potencialidad. Algunas compaas farmacuticas han empezado ya la produccin de
polipptidos humanos por bacterias o levaduras. Un ejemplo de estos polipptidos producidos son
hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagon, interfern, factores de la coagulacin,
factor VIII, etc. Estos productos se encuentran comnmente en venta en las farmacias y son producidos
por tcnicas de biotecnologa.
El primer paso para lograr esta produccin de protenas es el clonado de un ADNc en un vector
de expresin. Un vector de expresin es un plsmido que adems de contener las caractersticas
anteriormente mencionadas debe tener adems las secuencias que permitan la transcripcin y
traduccin del ADN insertado en dicho vector permitiendo de esta manera la expresin de la protena.
Para expresar una protena humana en una clula o sistema procarionte como la Escherichia
coli (E. coli) se necesita obtener la secuencia codificante de dicha protena. Esto se puede realizar
mediante la tcnica de RT-PCR que consiste en transcripcin reversa y PCR. Se obtiene el ADNc a
partir del ARNm correspondiente, por transcripcin reversa y mediante cebadores especficos se
amplifica por PCR la secuencia de ADN de la protena de inters. Por qu no podemos utilizar la
secuencia completa del gen de la protena? Porque las bacterias no realizan splicing y no podran
remover los intrones y empalmar los exones de un transcripto primario.
La secuencia codificante o gen de inters debe ser insertado en el vector adyacente (ro abajo) a
un promotor procarionte como puede ser el promotor T7 que ser reconocido por la ARN polimerasa T7
de la bacteria y resultar en una alta produccin de la protena de inters en la bacteria, que luego
podr ser purificada e identificada.
Cmo podemos identificar las bacterias que contienen el plsmido recombinante y expresan la
protena de inters? Podemos crecer distintas colonias de bacterias y aislar las protenas analizando la
expresin de nuestra protena de inters mediante Western blot. Una vez identificadas estas bacterias
las mismas pueden ser utilizadas para producir la protena en gran escala. La misma ser purificada del
resto de las protenas bacterianas mediante tcnicas de purificacin convencionales.

20
 La aplicacin de las tcnicas de ADN recombinante a la fabricacin de insulina ha disminuido
sustancialmente el precio de dicha hormona. La insulina que era utilizada corrientemente en la terapia
de la diabetes se extraa del pncreas de vaca o cerdo. Dicha insulina difiere ligeramente en su
secuencia de aminocidos de la insulina humana, y aunque la mayora de dichas insulinas controlan los
principales sntomas del diabtico, pueden presentarse efectos secundarios, como el deterioro renal y
de la retina; y generar alergias u otro tipo de reacciones inmunolgicas.
Esta metodologa se utiliz para la produccin de la hormona del crecimiento humana (hGH)
(Figura 10) y de interferones. La deficiencia en hormona del crecimiento hipofisaria conduce a una
forma de enanismo que puede tratarse por administracin de la hormona. Dicha hormona es
caracterstica de cada especie; la fuente de la que se la obtena anteriormente eran cadveres
humanos. Su escasa disponibilidad, an a pesar de sus muchas aplicaciones clnicas, ha constituido un
factor condicionante del desarrollo de la investigacin sobre la misma.

Primer aminocido de la Codn stop

hGH madura

Remocin de codones Corte con EcoRI

para los aminocidos
1-24

Aislar el fragmento de
ADN que codifica para
los aminocidos 24-191

Oligonucletido sinttico para

los aminocidos 1-24 Ligar

Metionina
iniciadora Corte con
HindIII

Ligar Vector de expresin

Metionina
iniciadora
Secuencia de la hGH

Promotor

E. coli transformada
La hGH se acumula
dentro de la clula
bacteriana

hGH aislada del

extracto bacteriano

Metionina iniciadora

Figura 10: Expresin de la hormona de crecimiento humana (hGH) en E.coli. La secuencia humana es removida
21
permitiendo que la protena sea producida por las clulas bacterianas. El producto contiene una metionina bacterial
extra
La hGH se utiliza en la clnica para tratamiento de desordenes de crecimiento en nios y
deficiencia en el crecimiento en adultos. En los aos recientes, las terapias de reemplazo con hGH han
mostrado efectos en pacientes deficientes incluyendo: disminucin de grasa corporal, aumento de masa
muscular, densidad sea, niveles energticos, y mejora de la funcin del sistema inmune. Aunque la
hGH se ha obtenido en cantidad, exitosamente en organismos procariontes, la bioactividad obtenida de
esta manera ha sido escasa.
Las protenas que necesitan modificaciones post-traduccionales necesarias para su actividad
biolgica (glicosilacin, fosforilacin, etc.) o alguna conformacin particular no pueden ser producidas en
bacterias, y se debe utilizar sistemas eucariontes para su produccin. Los vectores de expresin
utilizados en este caso difieren en que las secuencias promotoras que regulan la transcripcin son de
origen eucarionte. En este caso pueden utilizarse clulas de levaduras, algas, plantas, insectos,
gusanos de la seda (Bombix mori) y mamferos.
Protenas humanas ms complejas han sido producidas en clulas de mamferos en cultivo. El
gen del Factor VIII, una protena involucrada en la coagulacin de la sangre, est alterado en individuos
con hemofilia. Antes de que se dispusiera de Factor VIII por ingeniera gentica, muchos hemoflicos
murieron de SIDA o hepatitis debido a que contrajeron la enfermedad por transfusiones con sangre
contaminada o con Factor VIII aislado a partir de sangre contaminada. El activador del plasmingeno
tisular (TPA) es una proteasa presente en la sangre que convierte el plasmingeno en plasmina, una
proteasa que a su vez cliva a la fibrina, y disuelve los cogulos de sangre. El TPA recombinante,
producido en cultivos de clulas de mamfero, se administra frecuentemente durante o inmediatamente
luego de un ataque cardaco para disolver los trombos que ocluyen las arterias coronarias.

Vacunas
Antes del advenimiento de la tecnologa de ADN recombinante, las vacunas se producan a
partir de agentes infecciosos los cuales eran previamente destruidos o atenuados (alterados de tal
manera que no podan multiplicarse en un individuo inoculado). Ambos tipos de vacunas eran
potencialmente peligrosas debido a que podan estar contaminadas con el agente infeccioso vivo. En
efecto, en un pequeo numero de casos, la enfermedad fue causada por la vacunacin. Debido a que el
sistema inmunitario humano responde a protenas antignicas de la superficie del agente infeccioso, se
hizo muy atractiva la posibilidad de producir esos antgenos por tcnicas de ADN recombinante. Por
estas tcnicas, las protenas pueden producirse completamente libres del agente infeccioso y se elimina
as todo riesgo de infeccin. La primera vacuna recombinante que fue producida de forma satisfactoria
fue la vacuna contra el virus de la hepatitis B. La primera vacuna disponible contra la hepatitis B
contena virus de Hepatitis B (HBV) qumicamente inactivado. El virus haba sido obtenido de sangre de
individuos que se saba eran portadores de HBV. Ms tarde, se usaron vacunas en las que el virus
permaneca vivo pero haba sido alterado como para que no se multiplicara ms en el individuo
inoculado (atenuado). Ambas vacunas, la de virus inactivado y la de virus atenuado, son potencialmente
peligrosas porque pueden estar contaminadas con HBV infectivo.

22
 Las nuevas vacunas, comercializadas desde 1987, fueron obtenidas por tcnicas de
recombinacin de ADN. Ya que esta vacuna consiste nicamente en la protena de superficie del virus,
antgeno contra el cual responde el sistema inmune, no hay riesgo de infeccin por HBV. El virus
contiene un antgeno de superficie (HBsAg, llamado tambin antgeno australiano) cuyo ADN ha sido
aislado. Pero debido al hecho de que la protena est glicosilada, no puede ser producida en
Escherichia coli (porque las bacterias no pueden glicosilar protenas). Por lo tanto, se utiliza un sistema
de expresin en levaduras (clula eucarionte) para producir la forma glicosilada de la protena. La
protena viral, separada de una pequea cantidad de protenas de levadura, se utiliza como vacuna en
la inmunizacin contra el virus causante de la hepatitis B.

Algunas protenas obtenidas por tcnica de ADN recombinante utilizadas en la medicina:

Productos
Anticoagulantes, TPA
Factores de la coagulacin, Factor VIII
Factores estimulantes de colonias (CSF)
Eritropoyetina
Factores de crecimiento
Hormona de crecimiento humana (hGH)
Insulina humana
Interferones
Interleuquinas
Anticuerpos monoclonales (mAbs)
Superxido dismutasa (SOD)
Vacunas
Usos
Activa plasmina, una enzima involucrada en la
disolucin de los trombos, por lo tanto efectivo en
el tratamiento de pacientes con afecciones carda-
cas o circulatorias en general.
Promueve la coagulacin deficiente en pacientes
hemoflicos; su uso elimina los riesgos de infeccin
generados por mltiples transfusiones.
Son factores de crecimiento del sistema inmune
que estimulan la produccin de leucocitos, usados
para tratar deficiencias inmunolgicas y contra
infecciones.
Estimula la produccin de eritrocitos; usado para
tratar anemias en pacientes con enfermedades
hepticas.
Estimula la diferenciacin y crecimiento de varios
tipos celulares, usado para promover curacin de
heridas.
Usada para tratar el enanismo
Usada para tratar diabetes
Interfieren con la replicacin viral, usados para
tratamiento de algunos tumores.
Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos;
posibles usos en infeccin con VIH, cncer y
deficiencias inmunolgicas.
Especificidad de unin, usados en: tests diagnsti-
cos, transporte dirigido de drogas, toxinas o
compuestos radioactivos como terapia antitumoral.
Previene dao tisular de las especies reactivas del
oxgeno cuando el tejido brevemente se somete a
bajo oxgeno para luego aumentar abruptamente
como en cirugas.
Protenas derivadas de la cpside viral efectivas en
alertar al sistema inmune pero ms seguras que
las tradicionales a virus inactivado.

Tomado del Lehninger Principios de Bioqumica David L. Nelson y Michael M. Cox

23
ANIMALES TRANSGENICOS

En los organismos superiores, animales o vegetales, la informacin gentica se transmite por

mecanismos de reproduccin sexual, es lo que se conoce como transmisin gentica vertical. Sin
embargo, hace ya unos veinte aos se lograron obtener los primeros ratones transgnicos mediante
transferencia gnica por inyeccin directa de ADN extrao en un cigoto obtenido por fecundacin in vitro
(Figura 11). Es decir, se trataba de una transmisin gentica horizontal, tambin llamada transgnesis.
Dado que el cigoto se hace transgnico inicialmente, el ADN extra pasa a las clulas germinales
y luego es transferido a la progenie derivada de estas clulas comportndose como un gen nuclear
regular. Al igual que ocurre en plantas, los animales son manipulados no slo para mejorar la calidad
del animal mismo, pero tambin para ser productores convenientes de una protena particular en
granjas farmacuticas.
La generacin de animales transgnicos es esencial para el estudio in vivo de la funcin de ge-
nes durante el desarrollo, la organognesis y el envejecimiento. Tambin permite la evaluacin de
estrategias teraputicas en modelos de enfermedades humanas, as como la investigacin de la progre-
sin de la enfermedad de una manera que no sera posible en seres humanos. Dentro de las aplicacio-
nes comerciales se incluyen la preparacin de protenas recombinantes, la proteccin de animales
contra enfermedades, y la introduccin de nuevos rasgos genticos.

Plsmido portador del gen de la

hormona de crecimiento de rata

Microinyeccin en
el proncleo de
huevos fertilizados

Implantacin en madres
ratn adoptivas

Ratones de la descendencia
crecimiento

Ratones transgnicos con unas 800

veces ms hormonas de crecimiento que
sus compaeros de camada

Figura 11: Esquema de la introduccin del gen de la hormona de crecimiento de rata en ratones. Se microinyecta-
ron copias de un plsmido de ADN recombinante que contena el gen de la hormona de crecimiento de rata a
24
 vulos fertilizados de ratn, que se implantaron en madres adoptivas. Algunos de los ratones de la descendencia
contenan el gen forneo integrado en su propio genoma y expresaron una cantidad mucho mayor de lo normal de
la hormona de crecimiento razn por la cual crecieron mucho ms que sus compaeros de camada de tamao
normal.
Se han producido animales transgnicos en una gran variedad de especies. Dentro de los ver-
tebrados, se han desarrollado en especies de peces, anfibios, aves y mamferos. Algunas especies de
invertebrados incluyen algunos ampliamente utilizadas en investigacin, tales como los artrpodos
Drosophila melanogaster, y el nematodo Caenorhabditis elegans.

Objetivos y aplicaciones
La Biotecnologa incluye cualquier tcnica que utilice organismos vivos o parte de los organis-
mos para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos
para usos especficos.
La potencialidad de la biotecnologa estriba en:
Producir cantidades ilimitadas de substancias de las que nunca se haba dispuesto con anterioridad
o de productos que se obtenan en pequeas cantidades.
Abaratamiento de los costos de produccin.
Mayor seguridad en los productos obtenidos.
Nuevas materias primas, ms abundantes y menos caras.

Dentro de este contexto general, la Biotecnologa ha incorporado la transgnesis animal con

los siguientes fines:
Mejora de caracteres productivos
Resistencia a enfermedades
Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout).
Animales transgnicos como biorreactores para la sntesis de protenas de alto valor (protenas
teraputicas): Las "granjas farmacuticas" o "granjas moleculares"
Donacin de rganos: Xenotransplantes

Disrupcin o reemplazo de genes en ratones: Knockout

A partir de la disrupcin de genes en levaduras, se ha obtenido invalorable informacin sobre el
rol de genes especficos a travs de su reemplazo por una copia mutada. Estas versiones llamadas
organismos knockout pueden presentar fenotipos modificados que luego pueden ser examinados.
Por ejemplo, se han creado ratones knockout que carecen de las enzimas vitales de reparacin
del ADN con el objetivo de estudiar si este fenotipo causa un incremento en la tasa de aparicin de
tumores.
Brevemente, se prepara un vector de ADN que contenga el gen de inters clonado e interrumpi-
do por la insercin, por ejemplo, del gen para neomicina (que codifica para la resistencia al antibitico
neomicina) generndose entonces un gen mutado artificialmente. Cabe aclarar que las clulas de
mamfero no poseen el gen de resistencia a neomicina. El gen de resistencia a antibitico se usar

25
luego como marcador para indicar que el vector de ADN ha sido captado por las clulas y se ha inser-
tado en el cromosoma del hospedador. Luego se introduce el vector en clulas aisladas de un embrin
de ratn. Cuando ocurre la recombinacin homloga, las regiones que contienen el gen interrumpido
toman el lugar del gen original. Para detectar las clulas que portan el gen mutado se colocan las
clulas en un medio de cultivo conteniendo las drogas seleccionadas, por ej. en este caso, un com-
puesto anlogo a neomicina. Este compuesto es letal para las clulas que no tienen el gen de resisten-
cia a neomicina funcional y entonces se eliminan las clulas en las cuales no ha habido integracin del
vector. Las clulas seleccionadas se inyectan en un embrin temprano (blastocisto) y se implantan en
una madre sustituta. La progenie resultante ser heterocigota y luego se cruzar para la obtencin de
la segunda generacin entre los cuales habr homocigotas para el gen mutado.

Granjas farmacuticas
La Biotecnologa ha aplicado estas tcnicas experimentales de transgnesis y ya hoy se estn
estableciendo las primeras granjas farmacuticas en las que se cran ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgnicos que producen en su leche protenas teraputicas humanas. En estos casos la manipula-
cin gentica de un mamfero domstico transgnico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmen-
to de ADN que contiene el gen humano, unindolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un
elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la sntesis de una protena de la
leche (por ejemplo, la -lactoglobulina, la casena, etc.). De esta manera se asegura que el gen huma-
no slo se expresar en las clulas de las glndulas mamarias del animal transgnico (oveja, cabra,
vaca, cerdo) obtenido tras la inyeccin del ADN manipulado en el proncleo masculino de un cigoto
producido por fecundacin in vitro. (Figura 12). Se ha conseguido que la leche de las hembras transg-
nicas contenga protenas teraputicas humanas ( -1-antitripsina, protena C, factor VIII de coagula-
cin, antitrombina III, etc.) que pueden luego ser fcilmente separadas de las restantes protenas
propias del animal. Es importante sealar que el animal transgnico no se ve perjudicado en su desa-
rrollo porque el gen humano slo se expresa en las clulas de las glndulas mamarias debido al regu-
lador especfico al que se lo ha asociado y, por tanto, en las restantes clulas del animal no se sintetiza
la protena humana al estar silenciado el gen humano.
Tambin se utilizan vacas con el objetivo de obtener leche maternizada, suprimiendo mediante
la tcnica de "knockout" del gen de la -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche huma-
na que no la tiene.
En Argentina, en el ao 2002 se logr clonar por primera vez tres terneras transgnicas que
producen hormona de crecimiento humana, vital para tratar a las perso-
nas que padecen enanismo.

Figura 12: Microinyeccin de ovocitos fecundados

26
 Un animal puede llegar a producir no menos de un gramo de esa protena transgnica por litro

de leche secretada lo que equivale a cinco kilos de esta protena en su leche por ao.

Una vez que se tiene el animal transgnico, es posible obtener otros idnticos a partir de la clo-
nacin. De esta forma se puede conservar y multiplicar alguna caracterstica beneficiosa.

27
 En los prximos aos se esperan avances en estos desarrollos biotecnolgicos. En Argentina,
ya se obtuvieron descendientes de Mansa, una dinasta de animales transgnicos que integran el
"tambo farmacutico".

TERAPIA GENICA
La terapia gnica se define como la transferencia in vivo o ex vivo de una secuencia gentica
para reemplazar material gentico defectuoso o conferir una nueva actividad a la clula. Al principio se
pens que era un procedimiento apropiado slo para el tratamiento de enfermedades de origen heredi-
tario, pero actualmente est en experimentacin en enfermedades cardiovasculares, SIDA, cncer,
autoinmunidad y otras patologas.
Esta terapia ha tenido resultados buenos en animales de laboratorio, y la bioseguridad de la
transferencia gentica ha sido comprobada, dependiendo del tejido afectado. En humanos, se han
logrado algunos xitos en patologas asociadas al pulmn y a tumores de piel, pero la gran mayora de
tratamientos se encuentran en fase experimental en animales de laboratorio y en pacientes en los que
otros tratamientos no fueron efectivos. Igualmente, esta nueva terapia abre nuevos interrogantes ticos
y sociales.
Para introducir eficientemente el gen bueno dentro de las clulas, pueden usarse retrovirus
(virus con ARN) o adenovirus (virus con ADN lineal doble cadena). Se observ que las transfecciones
con adenovirus eran transitorias, por lo que se necesitaba que el paciente realice el tratamiento en
forma diaria o cada 2 o 3 das. En cambio, las transfecciones con retrovirus fueron ms permanentes,
fundamentalmente porque stos son ms hbiles para escapar a la respuesta inmune. Actualmente se
estn utilizando virus HIV como vector, sustituyendo genes infectivos y algunos genes de la cpside,
aunque en este caso las restricciones deberan ser ticas. El objetivo es liberar al marcador vrico a una
zona particular en un embrin o en una persona, infectando as un nmero limitado de clulas a partir
de la cual se obtendr un clon de clulas que contenga el marcador vrico integrado. Tambin se est
experimentando con liposomas, formados por lpidos cargados positivamente que pueden interaccionar
con las cargas negativas de la membrana celular. Se probaron diferentes sistemas de transferencia
ADN-liposomas en pacientes mediante catteres, pero se encontr que tenan baja eficiencia de
transfeccin y alta toxicidad.
Todos los sistemas enumerados hasta ahora funcionan en cualquier clula, ya que no tienen
receptores especficos. Actualmente se estn desarrollando diferentes sistemas de transferencia con
receptores, para tratar un solo tipo celular, pero como deben incorporarse diferentes seales (seal
para evadir los lisosomas despus de la entrada a la clula, seal para atravesar los poros nucleares,
etc) dentro del vector sinttico, la eficiencia de transfeccin es muy baja.
Los criterios seguidos en general pueden resumirse en:
1- las investigaciones estn restringidas a clulas somticas. De esta forma los individuos no pueden
transferir a su descendencia las modificaciones genticas adquiridas.
2- el riesgo de la aplicacin de la tcnica debe que ser largamente superado por los beneficios a
obtener. Existe la posibilidad inherente de que el ADN se integre en un gen funcional llevando a la

28
 inactivacin de dicho gen. De tratarse de un gen relacionado con la proliferacin celular podra pro-
ducirse una clula cancerosa.
3- La enfermedad en estudio debe ser el resultado de la alteracin de un nico gen.

La terapia gnica no es un campo nuevo, ya que ha venido desarrollando durante dcadas. A

pesar de los esfuerzos de los investigadores de todo el mundo, la terapia gnica ha logrado slo un
xito limitado.
La terapia gnica slo funcionar si se logra entregar un gen normal a un gran nmero de
clulas - por ejemplo, varios millones - en un tejido. Y tienen que ser las clulas correctas, en el tejido
correcto. Una vez que el gen llegue a su destino, debe ser activado, y producir la protena codificada por
el gen. La entrega y activacin del gen son los mayores obstculos que enfrentan los investigadores de
terapia gnica. La orientacin de un gen a las clulas correctas es crucial para el xito de cualquier
tratamiento de terapia gnica. Igualmente importante, sin embargo, es asegurarse de que el gen no se
incorpore a las clulas equivocadas. La entrega de un gen en otro tejido sera ineficaz y podra causar
otros problemas de salud al paciente.
Por ejemplo, la orientacin inadecuada puede incorporar el gen teraputico en la lnea germinal
de un paciente. Si esto sucede, el paciente podra transmitir el gen introducido a su descendencia. Las
consecuencias dependeran del tipo de gen introducido.
Por otro lado, los vectores utilizados deben ser capaces de escapar del sistema inmune. De lo
contrario, puede causar enfermedades graves o incluso la muerte.
La historia de Jesse Gelsinger ilustra este reto tambin. Gelsinger, que tena un trastorno
heptico raro, particip en un ensayo en 1999 en la Universidad de Pennsylvania y muri de
complicaciones de una respuesta inflamatoria poco despus de recibir una dosis de vector adenovirus
experimental. Su muerte detuvo todos los ensayos de terapia gnica en los Estados Unidos por un
tiempo y desat un debate muy necesario sobre la mejor manera de regular los ensayos
experimentales.
Tambin hay que tener en cuenta que para ser efectiva la terapia el gen debe integrarse al
genoma de las clulas en el tejido blanco, pero puede ocurrir que dicha insercin altere la expresin de
algn otro gen en forma colateral. Por ejemplo, si se inserta en un sitio y afecta la expresin de un gen
supresor de tumores, las clulas portadoras podran expresar la protena de inters pero a la vez
adquirir un fenotipo proliferativo y eventualmente tumoral.

Ejercicios

1) Dos bebs del mismo sexo (B1 y B2) nacieron el mismo da en el mismo hospital. Debido a que se
sospech que los mismos fueron accidentalmente cambiados en la nursery del hospital, se llev a cabo
un test gentico basado en fragmentos de restriccin del ADN que exhiben polimorfismo debido a que
contienen un nmero variable de tandems repetidos. Se obtuvieron muestras de sangre de los padres y
de los bebs, se extrajo el ADN y se amplific por PCR. El ADN luego fue tratado con la enzima de

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restriccin Ban I y se separaron los fragmentos obtenidos por electroforesis en gel de agarosa. Los
resultados de un Southern blot son los mostrados ms abajo. Para revelar los fragmentos se us una
sonda radioactiva que se une a una secuencia dentro de los fragmentos Ban I que exhiben
polimorfismos. Basados nicamente en este test, quines son, con mayor probabilidad, los padres del
beb B1 y quines los del beb B2? (MA es una de las madres y PA es su marido y MB es otra de las
madres y PB su marido).

MA PA B1 B2 MB PB

2) Se ha encontrado una enfermedad relacionada con el gen X que codifica para la enzima Z. La causa
de dicha enfermedad es la ausencia de la actividad de Z. Se realizaron pruebas a distintos individuos
utilizando diferentes tcnicas de biologa molecular: southern y northern blot utilizando una sonda
marcada que es el ADNc especfica para el gen X y western blot utilizando anticuerpos especficos para
la enzima Z. En el anlisis de Southern blot primero se realiz digestin del ADN con la enzima de
restriccin EcoRI. El individuo A es el control normal que no presenta la enfermedad. El individuo B no
presenta sntomas pero algunos de sus hijos presenta la enfermedad. Los individuos C y D presentan la
enfermedad.
a) Explique porqu el individuo B no presenta sntomas.
b) Sugerir posibles defectos que lleven a la enfermedad en el individuo C y D a partir de los resultados
obtenidos. Justifique su respuesta.

En el grfico se representan las autorradiografas de las distintas tcnicas. A, B, C y D

corresponde a los carriles de las muestras de los correspondientes pacientes.

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 A B C D
Peso molecular

Southern 5 Kb
blot
4 Kb
1 Kb

A B C D

Northern
blot 3 Kb

A B C D

Western
blot 43 kDa

20 kDa

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