Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias

Biolgicas

Qumico Bacterilogo y Parasitlogo

1) Materia: Laboratorio de Mtodos de Anlisis

2) Prctica: Separacin de una mezcla de dos aminocidos

por cromatografa por intercambio inico

3) Alumna: Romo Peralta Karol

Colaboradora: Martnez Cano Mara del Carmen

4) Grupo: 5QV1 5) Seccin: IV

6) Profesor: Arturo Rivas Farias

7) Fecha de realizacin: 10 y 15 de Marzo de 2017

8) Fecha de entrega: 22 de Marzo de 2017

9) Situacin escolar: Inscrita

 Separacin de una mezcla de dos aminocidos por
cromatografa por intercambio inico
Datos experimentales e informe
Tabla 1. Valores de absorbancia obtenidos de la separacin de Prolina e Histidina
a partir de una cromatografa por intercambio inico.
A470 A570
Volumen de
N Tubo Experimenta
elucin (mL) Experimental Ajustado* Ajustado*
l
1 3 -0.1 0 - -
2 6 -0.1 0 - -
3 9 -0.1 0 - -
4 12 -0.1 0 - -
5 15 -0.1 0 - -
6 18 -0.01 0.09 - -
7 21 0.445 0.545 - -
8 24 0.669 0.769 - -
9 27 0.538 0.638 - -
10 30 0.411 0.511 - -
11 33 0.439 0.539 - -
12 36 0.281 0.381 - -
13 39 0.212 0.312 - -
14 42 0.17 0.27 - -
15 45 0.115 0.215 - -
16 48 0.114 0.214 - -
17 51 0.071 0.171 - -
18 54 0.037 0.137 - -
19 57 0.035 0.135 - -
20 60 -0.01 0.09 - -
21 63 0.036 0.136 0.232 0.241
22 66 0.046 0.146 0.209 0.218
23 69 -0.023 0.077 0.234 0.243
24 72 0.05 0.15 0.223 0.232
25 75 0.125 0.225 0.34 0.349
26 78 - - 0.353 0.362
27 81 - - 0.212 0.221
28 84 - - 0.469 0.478
29 87 - - 0.605 0.614
30 90 - - 0.542 0.551
31 93 - - 0.121 0.13
32 96 - - 0.032 0.041
33 99 - - -0.009 0
34 102 - - 0.018 0.027
35 105 - - 0.014 0.023
 36 108 - - 0.035 0.044

Separacin de una mezcla de dos aminocidos por

cromatografa por intercambio inico
Continuacin Tabla 1.
37 111 - - 0.004 0.013
38 114 - - 0.017 0.026
39 117 - - 0 0.009
40 120 - - 0.018 0.027
(*) Nota: Significa que a los datos experimentales de absorbancia obtenidos a 470 y
570 nm, se les realiz el ajuste matemtico del blanco, respectivamente (Ver pg. 5)

N Celda
40

21

20

Figura 1. Fracciones obtenidas de la separacin de los aminocidos Prolina

(Amarillo) e Histidina (Violeta) en celdas para leer al espectrofotmetro a 470 y
570 nm, respectivamente.
 Separacin de una mezcla de dos aminocidos por
cromatografa por intercambio inico
Clculos manuscritos
 Separacin de una mezcla de dos aminocidos por
cromatografa por intercambio inico
Discusin de resultados experimentales
Se llev a cabo una cromatografa por intercambio inico, la cual consiste en la
distribucin o separacin de los analitos (Prolina e Histidina) que componen a la
mezcla, a lo largo de una columna de vidrio entre la fase estacionaria, la cual, es un
intercambiador inico (Resina) y la fase mvil (Regulador de citratos 0.1 M a pH 5.25 y
a pH 2.0) por medio de fuerzas inicas o pH del eluyente.
Cul de los aminocidos eluy primero?
De nuestra mezcla de aminocidos (Prolina e Histidina), el primero en eluir fue la
Prolina, seguido de la Histidina, los cuales fueron observados al calentar con el reactivo
de Ninhidrina
Para explicar esto, debemos de empezar con la composicin de la fase estacionaria o
intercambiador inico, el cual fue Amberlita IRC 50, siendo un intercambiador
catinico dbil, en donde su in fijo es el carboxilato (COO -) y su in mvil es un protn
(H+).
Al inicio tuvo que dejarse la resina en regulador de citratos a pH 5.25 para logar el
equilibrio de nuestra fase estacionaria o intercambiador inico con las condiciones
deseadas, enseguida aplicamos nuestra mezcla de aminocidos, adicionando nuestro
mismo regulador para que nuestros aminocidos cargados positivamente se unieran al
intercambiador.
La elucin de nuestra mezcla de aminocidos durante la cromatografa, fue provocada
por fuerzas de unin, ya que la Histidina a contener mayor densidad de cargas neta
positivas al protonarse con el regulador de citratos pH 5.25, se une provisionalmente al
in carboxilato, mientras que la Prolina, al tener su pI (pH donde su carga neta es 0) de
6.48, muy cercano al del regulador, este no puede interaccionar con el intercambiador
inico, quedando libre para eluir a travs del sistema.
De modo que, la separacin de los aminocidos se debe a la carga que cada uno
presenta

La Histidina tiene el ncleo heterocclico Imidazol, uno de cuyos nitrgenos puede

adquirir una carga positiva. El pK de ionizacin del Imidazol en la cadena de histidina es
alrededor de 6.0. Es un aminocido bsico, en donde estos son fuertemente polares.
En la Prolina el carbono y el nitrgeno unido a l, estn incluidos en un ciclo
pirrolidina. Dando un carcter aliftico. La inclusin del carbono y el N en el anillo
otorga a las uniones de esos tomo mayor rigidez.

Los aminocidos tienen propiedades elctricas particulares, en donde el grupo carboxilo

se comporta como cido (donador de protones), mientras que el grupo amina como
base (acepta protones).

En soluciones cidas fuertes, el in dipolar capta un in protn a nivel de su carboxilo,

quedando el aminocido cargado positivamente. Este grupo a pH cido se comporta
como base.

En solucin alcalina, el protn de la funcin -NH3+ reacciona con iones hidroxilo para
formar agua y el aminocido queda cargado negativamente. Este grupo a pH alcalino
se comporta como cido.

La carga elctrica del aminocido depende del pH del medio en el cual est disuelto.

Hay un calor de pH, caracterstico para cada aminocido, en el cual la disociacin de

cargas positivas y negativas se iguala y, por lo tanto, la carga total del aminocido es
nula. A este valor de pH se le denomina punto isoelctrico (pI). Debido a que no hay
carga neta en el PU, a este pH los aminocidos son menos solubles.

La Ninhidrina es un reactivo utilizado para reconocer -aminocidos. El grupo amina

da con esta sustancia un compuesto de intenso color prpura.

La prolina, en cambio da un producto color amarillo.

La carga elctrica total de una molcula protenica es nula en su pI y, en consecuencia,

la solubilidad ser mnima a ese pH.

El intercambiador inico fue Amberlita IRC-50, en donde su grupo ionizable es el cido

carboxlico (in fijo: carboxilato e in mvil: protn), siendo este un intercambiador
inico dbil.
La cromatografa de intercambio inico las separa principalmente en base a su carga
neta.

Para analizar una mezcla de aminocidos, se hace pasar la disolucin que contiene los
aminocidos por una columna rellena con una resina (polmero sinttico insoluble)
cambiadora de iones. Esta resina contiene cargas elctricas permanentes, capaces de
unirse electrostticamente a los aminocidos ionizados.

Si el pH inicial de la mezcla es el adecuado, todos los aminocidos estarn ionizados y

quedarn fijados en la resina. Por el contrario, las sustancias no inicas quedarn
eliminadas.

A continuacin se hacen pasar por la columna disoluciones amortiguadoras de

concentracin y pH conocidos, en orden y proporcin prefijados. Los aminocidos se
ven as sometidos a dos fuerzas antagnicas: retencin por la resina y arrastre por la
disolucin eluyente.

Por sus caractersticas de carga elctrica, polaridad, etc..., los aminocidos van
abandonando la columna progresivamente, arrastrados por el lquido de elucin, en un
orden determinado.

Es una cromatografa lquida, cromatografa por intercambio inico, los aminocidos se

separan sobre la base de la diferencia de sus cargas. En esta tcnica se utilizan perlas
especialmente modificadas, cuyas superficies estn cubiertas por grupos amino o
carboxilo, por lo que portan cargas postivas (NH3+) o negativas (COO-) a pH neutro.

Los aminocidos de una mezcla portan distintas cargas netas a un pH determinado.

Cuando una mezcla fluye a travs de la columna con perlas cargadas (+), slo las de
carga neta (-) (protenas cidas) se adhieren a las perlas; las neutras y las bsicas
fluyen sin impedimento a travs de la columna.

Luego las protenas cidas se eluyen selectivamente mediante el pasaje de un

gradiente de concentraciones crecientes de una sal a travs de la columna. A medida
que los iones se unen a las perlas, desplazan a los aminocidos.

A bajas concentraciones de sal, los aminocidos y las perlas son atradas por las
cargas opuestas. A concentraciones de sal ms elevadas, los iones salinos negativos
se unen a las perlas cargadas (+), por lo que los aminocidos con carga negativa se
desplazan. En un gradiente de concentracin salina creciente, las protenas cargadas
dbilmente son eluidas primero, y las que tienen cargas ms grandes pueden ser
utilizadas para retener y fraccionar protenas bsicas.

En el rango de pH de 1 a 2 y la presencia de exceso de Ninhidrina, el amoniaco se

produce casi cuantitativamente, pero no se forma color presumiblemente debido a la
Protonacin de amoniaco. Sin embargo, En solucin acuosa, los aminocidos
reaccionan en el intervalo de pH de 5 a 7 para formar el morado de Ruhemann. A este
pH, ocurre una hidrlisis insignificante de la amina intermedia que conduce al amoniaco
libre. La hidrlisis de la amina bajo ciertas circunstancias puede explicar el menor
rendimiento cuantitativo del color.

Conclusiones
La mezcla de aminocidos fue separada debido a las cargas netas que
presenta cada uno, las cuales se deben a los grupos amino, carboxilo y R de
los mismos.
Bibliografa
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 Blanco
McKee
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