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ARTCULO ORIGINAL
Introduccin. Las inmunoglobulinas presentes en la yema de huevo de gallina (IgY) han sido
ampliamente utilizadas en inmunologa, bioqumica, biotecnologa y salud humana y animal.
Aunque presentan una serie de ventajas frente a las IgG de mamferos, su aislamiento requiere,
por una parte, la eliminacin de los lpidos presentes en la yema del huevo sin alterar su
funcionalidad y, por otra, la utilizacin de metodologas de purificacin que permitan una
recuperacin tal que haga factible su empleo como herramientas de deteccin y purificacin a
una escala significativa.
Objetivo. Dado el inters que presenta el antgeno Tn como marcador tumoral en muchos
tipos de cncer, y la capacidad que tiene la lectina aislada de semillas de Salvia bogotensis
para reconocer especficamente este antgeno, se adelant el presente trabajo con la meta de
disponer de IgY anti-lectina para emplearla en estudios inmunohistoqumicos y de biologa
celular.
Materiales y mtodos. Se produjo IgY anti-lectina inmunizando gallinas con lectina de S.
bogotensis y se evalu la respuesta inmune en funcin de la dosis y del tiempo; se ensayaron
varios mtodos de remocin de lpidos y de extraccin y se compararon los rendimientos y la
pureza de IgY obtenidas con varios mtodos de purificacin.
Resultados. El mejor mtodo de delipidacin y extraccin de IgY requiere dilucin con agua,
acidificacin del extracto y precipitacin con (NH4)2SO4 60%s, recuperndose 43,35 mg de
protena/yema. La cromatografa tioflica permite obtener las IgY puras en buena cantidad
(10,4 mg/yema), preservando la funcionalidad y caractersticas de estos anticuerpos.
Conclusin. Se establecieron las mejores condiciones para extraer y purificar IgY funcionales
dirigidas contra la lectina de S. bogotensis.
Palabras clave: Lamiaceae, inmunoglobulinas Y, Salvia, lectina, purificacin, antgeno Tn.
Purification of IgY against Salvia bogotensis lectin
Introduction. Egg yolk immunoglobulins (IgY) have been extensively used in immunology,
biochemistry, and biotechnology in studies of human and animal health. However, their use
requires two preparatory steps: first, the egg yolk lipids must be removed without impairing the
immunoglobin functional properties, and second, the isolation methods must allow high
recoveries for further use as detection and purification tools.
Objective. Because Tn antigen presence serves as a tumoral marker and because S. bogotensis
lectin's can specifically recognize this antigen, the current study aims at making available an
anti-lectin IgY. This tool will be useful in histochemical and cellular studies involving transformed
cells.
Materials and methods. Anti-lectin IgY was produced by immunization of hens with S.
bogotensis lectin, and the effect of antigen dose on IgY levels was assesed. Several methods
for lipid removal, IgY extraction and purification were assayed, and yields and purity of IgYs
were established for each method.
Results. The best delipidation and extraction method included yolk dilution with water under
acidic conditions and (NH4) 2SO4 60%s precipitation from which 43 mg protein/yolk were
recovered. Among the chromatographic methods, thiophilic chromatography permitted the
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recovery of a substantial quantity of pure IgY (10.4 mg IgY/yolk). With this method, the function
and characteristics of IgY were preserved.
Conclusion. The best conditions for anti-S. bogotensis functional IgY extraction and purification
were established.
Key words: Lamiaceae, immunoglobulin Y, Salvia bogotensis, lectin, purification, Tn antigen.
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Entre los distintos tipos de carbohidratos soluciones con agitacin vigorosa para obtener
reconocidos por gran diversidad de lectinas buena emulsificacin; para el primer reto se us
presentes tanto en plantas como en animales, se adyuvante completo y para los refuerzos,
encuentran los antgenos T y Tn localizados en adyuvante incompleto. Un ml de la emulsin se
glicoprotenas de la membrana celular. La aplic en dos sitios del msculo pectoral de
exposicin del antgeno Tn en eritrocitos ocasiona gallinas de raza High-Line en edad de plena postura
el sndrome Tn, o sndrome de poliaglutinabilidad, (20 semanas) mantenidas en jaulas individuales
que es un trastorno caracterizado por la presencia con agua y alimento ad libitum. Se organizaron
de residuos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) cuatro grupos de tres animales cada uno, de los
en la superficie de la clula roja que, normalmente, cuales el primero correspondi al grupo control.
se encuentran enmascarados y unidos a Ser/Thr El esquema de inmunizacin fue similar al descrito
en las sialoglicoprotenas de membrana (17,18). por Gassman et al. (2), empleando dosis de 50 y
Los antgenos T y Tn tambin se han encontrado 200 g de LSB por inoculacin a los das 0, 10,
asociados a carcinomas, expuestos en la 20 y 29 y dosis de 500 g de LSB por inoculacin
membrana externa de clulas tumorales comunes a los das 0 y 20 para un total de 200, 800 y 1000
y en metstasis (19,20); la proporcin relativa de g LSB/gallina, respectivamente. Los huevos se
estos antgenos en las clulas est estrechamente recogieron desde el da 9 hasta el da 90; cada
relacionada con la agresividad con la que huevo se marc con el nmero de la gallina
evoluciona el tejido canceroso (20). correspondiente y la fecha de recoleccin. Los
Considerando lo anterior, y dado el inters de huevos se almacenaron a 4 O C hasta su
nuestro, Grupo de Investigacin en Protenas procesamiento. Se llev un registro de postura
(GRIP), en desarrollar herramientas que minucioso para cada gallina.
combinadas con las lectinas permitan la deteccin Remocin de lpidos y extraccin de IgY
del antgeno Tn en clulas tumorales, se ensay
la produccin de IgY contra la lectina de Sin romper el vitelio, las yemas fueron separadas
Salvia bogotensis (LSB); se evaluaron los cuidadosamente de las claras y se lavaron con
procedimientos de remocin de lpidos de la yema un pequeo volumen de H2O destilada, se secaron
de huevos de gallinas inmunizadas, y se sobre papel de filtro y se midieron los volmenes
ensayaron los procedimientos de purificacin para de cada una.
obtener buenos rendimientos de IgY funcionales, Se compararon distintos mtodos de delipidacin
capaces de reconocer el antgeno Tn. Los y extraccin de IgY con ensayos preliminares en
resultados obtenidos se describen en el presente pequea escala (1 a 2 yemas), para establecer
trabajo. los rendimientos de protena luego de la
deslipidacin y de la precipitacin. Se ensayaron
Materiales y mtodos
los mtodos de Polson et al. (12) y Jensenius y
Inmunizacin Koch (22), que utilizan dilucin con buffer y
Los procedimientos en animales se ajustaron al precipitacin con PEG 8000 al 3,5% o 4,4%,
protocolo para uso de animales del INS y el respectivamente; el mtodo de Jensenius et al.
proyecto de investigacin del cual hace parte este (16) precipitando con sulfato de dextrano y CaCl2;
el mtodo de Akita y Nakai (23) diluyendo con
trabajo fue avalado por el Comit de tica de la
agua sin acidificar y dos precipitaciones al 19% y
Divisin de Investigaciones de la Universidad
14% con Na2SO4, y el mtodo de Akita y Nakai
Nacional.
(24) diluyendo con agua acidificada a pH 5,0 y
Con la lectina de S. bogotensis purificada segn precipitacin con (NH 4)2SO 4 al 60% s. Para
Vega (21) se prepararon soluciones de 100 g/ determinar la heterogeneidad de los extractos se
ml, 400 g/ml y 1000 g/ml en PBS (fosfatos 20 realiz electroforesis en geles de poliacrilamida
mM , NaCl 150 mM ) pH 7,2 . A 1 ml de adyuvante (PAGE-SDS) comparando alcuotas tomadas
de Freund se agreg gota a gota 1 ml de estas despus de la delipidacin de las yemas y de la
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muestra final despus de cada precipitacin. La agua por cada 100 l de solucin de BCA. A cada
actividad de las fracciones despus del paso de pozo se agreg la solucin a cuantificar (20 l).
deslipidacin y del paso de precipitacin se Se dej incubar durante media hora a 37 C y se
determin por ensayos de ELISA. ley a 540 nm.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se utiliz Ensayos de ELISA
uno de los siguientes mtodos para la extraccin
La presencia de IgY especficas para LSB en las
de las IgY a mayor escala . Se escogieron yemas
yemas durante el curso de la inmunizacin se
de huevos de fechas cercanas a los ttulos ms
estableci sensibilizando las placas con las
altos (dosis de 200 g en la inmunizacin). Para
inmunoglobulinas deslipidadas y parcialmente
cada experimento se utilizaron 8 yemas (13 ml/
yema). Se llevaron a un volumen final de 1.040 fraccionadas segn Polson et al .(12); las
ml con 936 ml de agua destilada (dilucin 1:10) y determinaciones se hicieron sobre soluciones cuya
se extrajeron segn la metodologa que emplea concentracin de protena fuera similar para evitar
dilucin con agua sin acidificacin y precipitacin errores debidos a diferencias de recuperacin de
con Na 2SO 4 (23), o dilucin con agua con las fracciones. La incubacin en tampn de
acidificacin y precipitacin con (NH4)2SO4 (24); carbonatos 0,1 M pH 9,6 se hizo durante 3 horas
los volmenes del extracto final fueron de 43 ml a 37oC y durante la noche a 4oC, se bloque con
(1,28 mg protena/ml) y de 40 ml (0,9 mg protena/ PBS-BSA (1,3%) durante 1 hora a 37oC, se
ml), respectivamente. El ttulo en cada paso se sembraron 100 l de LSB (77 g/ml) incubando
determin por ELISA. Se tom como ttulo la durante 1 hora a 37oC y, luego, 100 l de IgG-anti-
mxima dilucin a la cual an se apreciaba LSB (generado en conejo) (21) durante 1 hora a 37oC.
actividad. Como valor mnimo de actividad se Se revel con 100 l de anti-IgG (generado en
tom tres veces el valor de absorbancia del blanco cabra,Sigma) marcado con peroxidasa e
(0,097 AU). incubando con cido 2,2-azino-bis (3-
etilbenzotiazoline)-6-sulfnico (ABTS). Se ley la
Determinacin de protena absorbancia a 405 nm en un lector de microplaca
La cantidad de protena en los extractos se BioRad Model 550. Entre cada paso se hicieron
cuantific por el mtodo de Bradford (25) utilizando tres lavados con PBS-Tween 20 al 0,1%.
un micromtodo desarrollado en el laboratorio. Los
Se evalu la actividad de cada una de las
ensayos se realizaron en placas de 96 pozos, en
fracciones obtenidas en los ensayos de remocin
los que se hizo una curva de calibracin por
de lpidos y de los pasos de extraccin por dilucin
duplicado (2,5, 10, 15 y 20 l de solucin) con
con agua a pH 5,0 y pH 6,2; las placas se
BSA (0,5 a 0,7 mg/ml). Tanto las muestras como
sensibilizaron con LSB (30 g/ml) y se sigui la
el patrn de BSA se llevaron a un volumen de 20
metodologa descrita por Vega (21) usando como
l con PBS pH 7,3 y se agregaron 200 l del
segundo anticuerpo un anti-IgY (generado en
reactivo de Bradford. Se incub durante 15
cabra, Sigma) y acoplado a peroxidasa, en una
minutos a temperatura ambiente y se ley a 595
dilucin de 1/1000 en PBS-suero fetal bovino
nm en un lector de microplaca BioRad Model 550.
(SFB) (10%).
A partir de la curva de calibracin se determin la
cantidad de protena por interpolacin. En los ensayos preliminares se emplearon las
fracciones deslipidada y final a una concentracin
Las muestras de IgY purificadas se cuantificaron
de 500 g/ml en SFB 10%. El ttulo de los
por el mtodo del cido bicinconnico (BCA) (26)
diferentes pasos de extraccin de IgY se evalu
empleando una curva de calibracin similar a la
haciendo diluciones seriadas a partir de una
descrita. A cada pozo se agregaron 100 l de buffer
solucin de 500 g/ml para un volumen final de
carbonato pH 11,4 (Na2CO3 0,25 M, NaHCO3 0,1
100 l por pozo en cada dilucin.
M) y 100 l de reactivo preparado as: a una
solucin de BCA al 1% en agua destilada se Para determinar el ttulo durante la purificacin
adicionaron 4 l de solucin de Na2SO4 al 2% en se sigui la metodologa ya descrita sensibilizando
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con la lectina (15 ug/ml) disuelta en tampn de desionizada. Luego, se lav la columna con 50
Na2C03 1 M, pH 9,6. Con las fracciones obtenidas ml de acetonitrilo (MeCN) al 70% (v/v) para
en las etapas de purificacin del anticuerpo se eliminar cualquier sustancia que hubiese
prepararon soluciones de 0,5 mg/ml y se realizaron permanecido retenida en la columna.
diluciones seriadas a un volumen final de 100 l/
Sephacryl S-200
pozo. La deteccin de la interaccin se hizo con
un Ab secundario acoplado a peroxidasa (anti-IgY Se utiliz una columna de Sephacryl S-200 (1x80
gallina, generado en cabra, Sigma). cm) sobre la cual se sembraron 3 ml (2,7 mg) de
extracto sin acidificar. La columna se eluy con
Purificacin IgY
NaCl 1%. En otras cromatografas se sembr 1
Con los extractos finales se ensay la purificacin ml de la fraccin eluida con glicina-HCl, pH 2,8,
por diversas cromatografas de columna basadas proveniente de DEAE-Sephacel (2,1 mg) o 1 ml
en diferentes principios de separacin. de extracto de IgY precipitado con (NH4)2SO4
60%s (24,5 mg). Se corri con tampn de fosfatos
DEAE-Sephacel
20 mM pH 7,3-NaCl 1 M. A cada fraccin
Se utiliz el mtodo descrito por Baines y Thorpe sembrada se agregaron 87 mg de NaCl.
(27). Del extracto sin acidificar se sembraron 9
Sephacryl S-500
ml (8,2 mg) equilibrados en tampn de fosfatos
70 mM pH 6,3 sobre una columna de DEAE- Se utiliz una columna de Sephacryl S-500 (1x92
Sephacel (1,8 x 6,5 cm). La fraccin no retenida cm) donde se sembr 1 ml (0,9 mg) de extracto
se eluy con tampn de equilibrio y el retenido se sin acidificar. La elucin se realiz con NaCl 1%.
eluy con tampn de fosfatos pH 6,3-NaCl 1 M. Cromatografa tioflica
Las fracciones retenida y no retenida se dializaron
contra NH4HCO3 20 mM y se congelaron. Se sigui la tcnica de Hansen et al. (29).Se utiliz
un soporte de Sefarosa 4B activado con
Esta cromatografa se hizo tambin bajo las divinilsulfona (DVS) al cual se acopl -
siguientes condiciones. Se sembraron 18 ml (23 mercaptoetanol (-MESH) modificando
mg) de extracto final obtenido por dilucin con parcialmente el mtodo de Hermanson et al. (30).
agua a pH 5,0 y equilibrado en tampn de fosfatos Se colocaron 2 ml de sefarosa 4B lavados con 20
pH 6,3. La fraccin no retenida se eluy con el ml de agua destilada sobre un embudo con placa
tampn de equilibrio. Luego se eluy el retenido a sinterizada y se elimin el exceso de agua; el gel
diferentes pH. La primera elucin se hizo con se resuspendi en 2 ml de Na2CO3 0,5 M, pH 11,0,
tampn de glicina 50 mM-HCl pH 2,8 neutralizando y se dej en agitacin suave. Se agregaron
cada fraccin colectada (1 ml) con 200 l de despus 200 l de DVS, gota a gota en constante
tampn Tris 200 mM-HCl pH 8,8, la segunda agitacin durante un lapso de 15 minutos y se
fraccin se eluy con tampn de fosfatos 50 mM dej ocho horas. Se lav con abundante agua
pH 7,3, la tercera fraccin con tampn de Tris 50 destilada hasta que el pH del lavado fuese neutro.
mM -HCl pH 8,8 y la ltima fraccin con tampn En este paso el gel se puede emplear para acoplar
de fosfatos pH 6,3-NaCl 1 M. Estas fracciones cualquier ligando de inters o puede ser
se dializaron contra NH 4 HCO 3 20 mM y se almacenado para su uso posterior. Para el acople
concentraron por liofilizacin. del ligando, en este caso -MESH, se tom el gel
activado y se lav en un embudo con 20 ml de
Fenil-sefarosa-4B
Na2CO3 0,5 M pH 11,0, se elimin la solucin de
Se emple el procedimiento descrito por Hassl y carbonato en un embudo y se resuspendi en 2
Aspck (28). Se tomaron 4 ml (3,6 mg) del extracto ml de Na2CO3 0,5 M. Se adicionaron 400 l de -
sin acidificar equilibrado en NaCl 1% y se MESH al 99% y se dej en agitacin permanente
sembraron sobre una columna de fenil-sefarosa durante 18 horas. Se elimin la solucin y se lav
4B (1 x 50 cm). La fraccin no retenida se eluy el gel con abundante agua y con NaCl 1 M.
con NaCl 1% y la fraccin retenida con agua Posteriormente, el soporte (T-gel) se equilibr
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en tampn de fosfatos 50 mM pH 7,3-Na2SO4 0,5 en el cual se lav cinco veces. Entre el segundo
M. Se sembraron 3 ml (2,7 mg) de extracto sin y el tercer paso no se realiz el lavado.
acidificar, al cual se agregaron 71 mg de Na2SO4
El dot-blot para determinar la funcionalidad de las
por mililitro de extracto. La elucin del no retenido
IgY se realiz as: sobre membranas de
se realiz con el tampn de equilibrio y el retenido
nitrocelulosa se colocaron 5 l de lectina pura
se eluy con tampn de fosfatos 50 mM pH 7,3.
(0,608 mg/ml) en PBS por punto durante una hora
Se realizaron ensayos anlogos con extractos
a temperatura ambiente. Se bloque agregando
acidificados.
20 ml de PBS-SFB (10%) durante una hora a
Las fracciones provenientes de las diferentes temperatura ambiente. Se incubaron las
cromatografas se recolectaron y algunas se membranas con diluciones de las IgY en PBS-
concentraron en Microsep Omega de 10 kd a 7000 SFB (10%) durante una hora a temperatura
rpm (5.857g). Las fracciones de anticuerpo puro ambiente y 12 horas a 4oC. Se incub con una
se cuantificaron por BCA. dilucin de 1/1000 de IgG anti-IgY-peroxidasa en
PBS-SFB (10%), dejando en agitacin durante una
Electroforesis en poliacrilamida (PAGE-SDS)
hora a temperatura ambiente. Se revel y lav
La preparacin de los geles de poliacrilamida se siguiendo el procedimiento anterior.
realiz segn Laemmli (31). En cada pozo se Resultados
sembraron 20 g de protena ms 5 l de tampn
muestra con reductor (-MESH). Para las Ensayos de inmunizacin
electroforesis en condiciones no reductoras se El control de postura mostr una produccin de
omiti el -mercaptoetanol. Se utilizaron geles al huevos sin cadas apreciables durante los 90 das
12% y 8% (C 2,5%). Como tampn de corrido se de la recoleccin. La produccin de IgY, obtenidas
utiliz Tris 25 mM-glicina 192 mM, pH 8,8. La segn Polson et al. (12) y evaluada por ELISA,
electroforesis se corri a 150 V durante hora y se muestra en la figura 1. Con la dosis ms baja
media. Luego del corrido, los geles se fijaron y de LSB (50 g) se observ un perodo de mxima
colorearon con solucin de Coomassie R 250 produccin entre los 26 y los 40 a 45 das,
durante tres horas. mientras que para 200 y 500 g de antgeno por
Dot-blot
Con los extractos y las fracciones retenidas en
Control
la cromatografa tioflica se realiz un dot blot
50 ug
directo para detectar la presencia de IgY y la 0,8
interaccin de las mismas con la LSB. La 200 ug
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inoculacin, el pico mximo estuvo alrededor de aunque contiene muy pocos contaminantes
los 26 das y luego comenz a declinar, cuando se evala por PAGE-SDS; sin embargo,
permaneciendo a los 60 das en niveles al agregar Na2SO4 para precipitar las protenas
significativamente mayores que los de los solubles apareci un precipitado blanco difcil de
controles. eliminar por dilisis, el cual ocasion un corrido
difuso de las muestras por electroforesis (figura
Los datos de ELISA evidenciaron cantidades
2, carril 10).
apreciables de IgY que se correlacionaron con las
dosis de antgeno aplicadas. Las determinaciones La deslipidacin por dilucin con agua sin acidificar
de ttulo (yemas de 26 a 27 das) mostraron que (23) ocasiona algunos contaminantes en la regin
las diluciones superiores a 1:200 presentaban por de alto peso molecular y en la de 45 a 50 kd que
ELISA valores constantes y muy cercanos a los no corresponden a las bandas H (70 kd) ni L (25
controles con yemas de animales no inmunizados. kd) (figura 2, carril 3; figura 3A, carril 3), y, adems,
Un comportamiento similar se observ con yemas la remocin de los lpidos de la yema es
de 40 y 65 das, corroborndose as que la incompleta. Akita y Nakai (24) mostraron que el
respuesta inmune se matena despus de varias mtodo de dilucin con agua puede optimizarse
semanas del ltimo refuerzo. disminuyendo el pH de aproximadamente 6,2 a
pH 5,0 con HCl 0,1 M; al incubar durante seis
Ensayos de deslipidacin y extraccin
horas a pH 5,0 observamos que se removi casi
Una vez realizados los diversos ensayos de toda la fraccin lipdica y se recuper una gran
remocin de lpidos y precipitacin (fraccin final) cantidad de protena (45 mg/yema); adems, la
se cuantific la protena; los resultados se acidificacin del extracto permiti eliminar gran
presentan en el cuadro 1. Se observa que la cantidad de contaminantes de alto peso molecu-
delipidacin con PEG 8000 al 3,5% o 4,4% (12,22) lar (>70 kd) (figura 3B, carril 3); en este extracto
permite recuperar cantidades importantes y fueron claramente visibles las bandas
similares de protena con pocos contaminantes correspondientes a las cadenas pesadas y livianas
como se aprecia en el perfil por PAGE-SDS, de la IgY, aunque estas ltimas presentaron una
particularmente en el caso de la precipitacin con menor intensidad de tincin con Coomasie R250,
PEG al 3,5% (figura 2, carril 5 ). lo que corrobora observaciones previas (29).
Cuando se utiliza la deslipidacin con sulfato de Las dos precipitaciones al 19% y 14% con Na2SO4
dextrano y CaCl2 (16), la cantidad de protena del mtodo sin acidificar (23) se pueden reemplazar
recuperada en el precipitado final no es muy alta por una precipitacin con (NH 4)2SO4 al 60%s,
haciendo el proceso ms rpido y prctico. En la
figura 3B (carril 4) se observa que con esta
precipitacin se eliminaron los contaminantes de
mayor peso y se concentraron algunos entre 36 y
45 kd; adems, se sorte el problema de las
temperaturas bajas a las cuales el Na 2SO 4
precipita, mientras que con el (NH4)2SO4 se puede
trabajar a 0C. Por otro lado, la cantidad de
contaminantes presentes en el precipitado con
Na2SO4 al 19% se puede reducir haciendo una
segunda precipitacin al 14% (figura 3A, carril 4).
Figura 2. Anlisis por PAGE-SDS de las fracciones Con la excepcin de los tratamientos con sulfato
delipidadas y finales. Carriles 1: patrones de peso molecular; de dextrano, los ensayos de actividad por ELISA
2: agua deslipidada; 3: agua final; 4: PEG 3,5% deslipidado;
5: PEG 3,5% final; 6: PEG 4,4% deslipidado; 7: PEG 4,4%
de las fracciones de IgY deslipidadas y finales
final; 8: dextrano deslipidado; 9: dextrano deslipidado; 10: (luego de precipitacin) mostraron, como era de
dextrano final. esperarse, mayor actividad en stas ltimas; los
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Kda Kda
205 205 Figura 3. Anlisis por PAGE-SDS
de (A) fracciones deslipidadas y
116
97 116 extradas con agua a pH 6,2.
84 97 Carriles 1: patrones de peso
84
66 molecular; 2: extracto pH 6,2; 3:
66
55 deslipidado; 4: precipitacin con
55 Na 2 SO 4 19%. (B) fracciones
45
45 deslipidadas y extradas con agua
36 36 a pH 5,0. Carriles 1: patrones de
peso molecular; 2: extracto pH 5,0;
29
29 3: deslipidado; 4: precipitacin con
24
24 (NH 4 ) 2 SO 4 60% s. Las flechas
indican la posicin de las cadenas
20 20 H y L.
extractos finales con PEG 3,5% y 4,4% mostraron Na2SO4 al 14% (ttulo 1:64 ;7,8 g/ml) y en la
actividades menores (Abs405 0,300-0,450) que los fraccin precipitada con (NH4)2SO4 al 60% (ttulo
obtenidos con agua sin acidificar (Abs405 0,650), 1:8; 62,5 g/ml). Por otra parte, aunque el extracto
probablemente debido a una desnaturalizacin acidificado tuvo un menor ttulo, la cantidad de
parcial de las IgY por la precipitacin etanlica. protena soluble fue mucho mayor, lo cual confirma
la excelente recuperacin indicada en el cuadro 1.
Como el mtodo de dilucin con agua permite la
extraccin de IgY sin afectar su actividad, se Ensayos de purificacin de IgY
decidi evaluar el anticuerpo en cada etapa de
Las fracciones recolectadas en las diferentes
extraccin. Los resultados se muestran en la figura
cromatografas fueron concentradas por
4A para el mtodo sin acidificar y en la figura 4B
liofilizacin y se cuantificaron por Bradford o por
para el mtodo acidificando a pH 5,0. En los dos
BCA. Las cantidades de protena en cada fraccin
procesos se observ que a medida que se
se presentan en el cuadro 2, as como las
progres en la obtencin de las IgY, los valores
cantidades de protena total recuperadas.
de ttulo y absorbancia (para una cantidad dada
de protena total) aumentaron, siendo bastante Del extracto delipidado sin acidificar se tomaron
significativos para la fraccin reprecipitada con 8,2 mg de protena y se aplicaron sobre una
503
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4
columna de DEAE-Sephacel. En la figura 5A se
A
muestra el perfil cromatogrfico obtenido, en el
cual se encuentra una fraccin no retenida muy
pequea y cuatro picos eludos a alta fuerza 3
Abs 280 nm
esta separacin, el extracto acidificado (23 mg de Fosfatos 70 mM
NaCl 1 M pH 6.3
protena) se eluy con un gradiente discontinuo
de pH aprovechando la experiencia obtenida en el
1
fraccionamiento de IgG de conejo contra la lectina
2,5 I II III IV V
Dilucin 1:10 0
Dilucin 1:10 delipidado A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ml
Na2SO4 19%
2,0 Na2SO4 14%
B
1,5
Abs 415 nm
Abs 280 nm
1,0
NaCl 1 M
pH 6.3
pH 8.8
pH 2.8
pH 7.3
0,5
0,4
III
0,0
0,0050,010 0,050 0100 0200 0,500 mg prot I II IV
0
0 100 200 300 400 ml
..... C .....
1:10 pH 5.0 B
1,50 3
1:10 centrifugado pH 5.0
(NH4) 2SO4 60% s
MeCN
2 NaCl 70%
100 mM
Abs 280 nm
1,00 H2O
Abs 415 nm
0,50
I II III
0
0 50 100 150 200 ml
0,00
0,01 0,05 0,10 0,20 0,50 mg prot Figura 5. Cromatografas sobre DEAE-Sephacel: (A)
extracto sin acidificar; elucin por fuerza inica. (B) extracto
Figura 4. Ensayos de ELISA de las fracciones obtenidas en acidificado; elucin por gradiente discontinuo de pH. (C)
la deslipidificacin de los extractos: (A) fracciones extracto cromatografa sobre fenil-Sepharosa 4B del extracto
a pH 6,2; (B) fracciones extracto a pH 5,0. deslipidado sin acidificar.
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tercera fraccin (III) de aspecto turbio, al pasar una alta absorbancia indicadora de una buena
MeCN sobre la columna. A las fracciones I y II se cantidad (figura 7A, fraccin II). En esta
les determin la cantidad de protena (cuadro 2); cromatografa se recuper 90% de las IgY
la electroforesis de II mostr como bandas aplicadas, puesto que al volver a someter a
predominantes las cadenas H y L de las IgY, junto cromatografa el pico I, se obtuvo un pico de IgY
con una cantidad apreciable de contaminantes bastante pequeo cuya Abs280 fue de 0,260 (0,29
(figura 6A, carril 6). mg) y por Dot-blot no se detect IgY en el pico no
retenido (figura 7B, dots 5 y 7), aun con cantidades
Cuando se aplic sobre el soporte tioflico la
6 veces mayores que las del retenido (3,2 g vs.
fraccin deslipidada con acidificacin (11,8 mg),
0,5 g, figura 7B, dots 5 y 6 ). Esta recuperacin
el perfil cromatogrfico mostr una fraccin no
coincide con la observada por otros autores (29)
retenida considerable (figura 7A, fraccin I); al
utilizando este soporte. El extracto proveniente
disminuir la fuerza inica se obtuvo un pico de
de la dilucin con agua sin acidificar (2,7 mg de
IgY, evidenciado por ELISA, bien definido y con
protena) se corri tambin sobre el soporte
Kda tioflico, observndose un perfil muy similar (datos
no mostrados) con una fraccin eluda a baja
97 fuerza inica (IgY) que, aunque menor que la no
retenida, posee una absorbancia alta.
66
Con la cromatografa tioflica se observ que a
45
partir del extracto inicial se obtenan IgY
29
prcticamente puras (figura 7C, carril 3) en un solo
19
paso cromatogrfico, ya que se eliminaron los
contaminantes presentes en el extracto inicial
15 (figura 7C, carriles 2 y 4) para, finalmente, obtener
las IgY con sus cadenas livianas y pesadas.
1 2 3 4 5 6 7 La reactividad de las IgY obtenidas por afinidad
sobre cromatografa tioflica (0,763 mg/ml) se
Kda evalu adicionalmente por ensayo de ELISA y Dot-
blot. Por Dot blot se observ reactividad hasta
97 una dilucin de 1:10000 (1,2 g de lectina por
84 punto) (figura 8A); los resultados muestran un
66 reconocimiento de la lectina por parte del Ab hasta
55
45 un valor lmite de 0,076 g/ml de anticuerpo, lo
36 cual indica una alta sensibilidad. Por ensayo de
29
ELISA se observ un incremento importante en
24
la deteccin de lectina (1,5 g) con 10 g de
anticuerpo puro (IgY) respecto al extracto crudo
20 (figura 8B), lo que indica que el grado de
purificacin del anticuerpo alcanzado con este
1 2 3 4 5 mtodo fue considerable. Con cantidades mayores
a 12 ug de IgY pura se observ una disminucin
Figura 6. Anlisis por PAGE-SDS de (A) fracciones de
extracto sin acidificar. Carriles 1: patrones de peso de la reaccin Ag-Ab (figura 8B).
molecular; 2: extracto pH 6,2; 3: fr I DEAE-Sephacel; 4: fr II
Discusin
DEAE-Sephacel; 5: fr III DEAE-Sephacel; 6: fr II Phenyl-
Sepharose; 7: fr III Sephacryl S-500. (B) fracciones por La respuesta inmune obtenida con la lectina de
DEAE-Sephacel de extracto acidificado. Carriles 1: patrones
de peso molecular; 2: extracto pH 5,0; 3: pico no retenido;
S. bogotensis, adems de mostrar la correlacin
4: pH 2,8 fraccin a; 5: pH 2,8 fraccin b. Las flechas esperada entre dosis de antgeno aplicada y
indican la posicin de las cadenas H y L. cantidad de inmunoglobulina producida, present
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A
Fosfatos
50 mM
Abs 280 nm
I II
0
0 5 10 15 20 25 30 35 ml
VVV
Kda
66
45
24
18
14
1 2 3 4
Figura 7. (A) Cromatografa tioflica del extracto deslipidado a pH 5,0. (B) Deteccin de IgY por Dot blot de las fracciones
no retenidas (dot 5: 3,2 g; dot 7: 1,85 g), retenidas (dot 3:2,7 g; dot 4: 3,6 g; dot 6: 0,5 g; dot 8: 1,45 g); control (1) y
extracto inicial (dot 2: 4,4 g). (C) PAGE-SDS de las fracciones de la cromatografa tioflica. Carriles 1: patrones de peso
molecular; 2: extracto deslipidado; 3: fraccin II; 4: fraccin I.
una persistencia superior a 70 das, lo cual implica en solucin (12); no obstante, el carcter
una cantidad considerable de material disponible potencialmente denaturante del etanol puede
para aislar las IgY. Resultados similares han sido afectar la actividad de las IgY, lo cual
obtenidos por Gassmann et al. (2), Jensenius y efectivamente se comprob en los ensayos de
Koch (22) y Chen et al. (32). actividad por ELISA.
Entre los mtodos de deslipidacin y extraccin La deslipidacin por dilucin con agua sin acidificar
de IgY, la precipitacin con PEG 8000 permite (23) es un mtodo sencillo y rpido (extracto final
una buena recuperacin de IgY con pocos en 2 a 3 das), con el cual se puede procesar un
contaminantes; sin embargo, su remocin, volumen apreciable de yemas, lo que permite la
necesaria para los anlisis posteriores, es difcil. extraccin de gran cantidad de anticuerpos en
Se ha utilizado la precipitacin de las protenas condiciones que no afectan la actividad de las
con etanol preenfriado para separarlas del PEG IgY. El gran inconveniente que presenta es la
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