Mdulo de Cultivo in vitro

LABORATORIO AVANZADO
DE FISIOLOGA VEGETAL
Curso 2006-2007

MDULO DE CULTIVO IN VITRO

Comisin Docente de Fisiologa Vegetal

Departamento de Biologa
Universidad Autnoma de Madrid

Francisca F. del Campo

Soledad Sanz Alfrez
Luis E. Hernndez

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CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS DE TABACO.

ANLISIS DE TRANSGENICIDAD

Introduccin

Diversas plantas de inters agroalimentario, ornamental o manipuladas genticamente,

han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso
emplear tcnicas de propagacin vegetativa para erradicar infecciones por virus y para
introducir variaciones genotpicas que aumenten la calidad de los productos. Estas
tcnicas se conocen genricamente como cultivo in vitro.

Para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos hay una serie de factores que hay que
tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las
clulas vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgnicas, una fuente de
carbono en el caso de no poder realizar fotosntesis, vitaminas en algunos casos y
fitohormonas.

El medio inorgnico ms empleado es la mezcla de sales diseada por Murashige y

Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o
citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y clulas.

En la prctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtencin de callos de

explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones
de auxina/citoquinina que determinan, segn los casos, mayor desarrollo de la parte
area o mayor desarrollo de la raz.

Fig. 1. Diferenciacin de explantos en funcin de distintas concentraciones de auxina y citoquinina

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Kinetina Zeatina BAP: bencilaminopurina

Fig. 2. Estructuras moleculares de diversas auxinas y citoquininas empleadas para la preparacin de
medios de cultivo in vitro.

Una de las aplicaciones del cultivo in vitro, como se ha indicado, es la regeneracin de

plantas trasngnicas. Dado que los eventos de transformacin gentica solo afectan a
unas pocas clulas del material vegetal manipulado, es preciso incluir un GEN DE
SELECCIN. Esto es: un gen que codifica una enzima capaz de detoxificar una
sustancia letal para las clulas vegetales. As, muchas plantas transgnicas portan como
gen de seleccin el gen de resistencia a los antibiticos kanamicina y neomicina
(neomicina fosfotransferasa, nptII). La presencia de este gen de seleccin o resistencia se
puede detectar en las plantas de tabaco cultivadas mediante dos experimentos: i)
propagacin del material vegetal en un medio de cultivo in vitro suplementado con
kanamicina, y ii) deteccin del transgen mediante PCR a partir de DNA genmico.

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NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminacin de los medios de cultivo por bacterias u
hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.

Se trabajar muy cerca de la llama del mechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY
LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse
bien las manos con jabn y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.

SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO

EXPERIMENTO TOTALMENTE INFECTADO POR ORGANISMOS
INDESEABLES!!!!

Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el material vegetal que se va a

cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guin de
prcticas y las recomendaciones que hagan los profesores.

1 PARTE: Propagacin de plantas de tabaco tipo silvestre y

transgnicas en medio con kanamicina

1.1. Material para el cultivo in vitro

Material vegetal
Plantas cultivadas en un substrato orgnico. Se emplearn plantas que han sido
previamente cultivadas en nuestro laboratorio de tabaco (Nicotiana tabacum), de las que
disponemos una lnea silvestre (no manipulada genticamente) y otra transgnica (que
sobreexpresa un gen que codifica MnSOD). Estas plantas se crecieron en un substrato de
turba ms perlita durante mes y medio.

Disoluciones para esterilizar los tejidos

De lavado: etanol 70%
Esterilizadora: hipoclorito sdico 20%, Tween-20 0.2 mlL-1

Medio de cultivo bsico

Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas sales mezcladas y listas
para ser disueltas en medio lquido. Cuando se disuelven en la cantidad
adecuada, la concentracin final de los distintos nutrientes minerales es
la mostrada en la Tabla 1.
Tabla 1. Concentracin de sales minerales de la disolucin nutritiva diseda por Murashige-Skoog

Sales de macronutrientes (mgL-1) Sales de micronutrientes (mgL-1)

NH4NO3 1650 KI 0.83
KNO3 1900 H3BO3 6.2
CaCl22H2O 440 MnSO44H2O 22.3
MgSO47H2O 370 ZnSO47H2O 8.6
KH2PO4 170 Na2MoO42H2O 0.25
CuSO45H2O 0.025
CoCl26H2O 0.025
Na2EDTA 37.3
FeSO47H2O 27.8

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Dicho medio bsico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas
estn preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolbiles, se
esterilizan por filtracin:

Vitaminas (termolbiles, STOCK 1000 v.c.):

1. cido nicotnico 5 mgL-1
2. Tiamina hidrocloruro 5 mgL-1
3. Piridoxina hidrocloruro 1 mgL-1

Mio-inositol 1 gL-1
Sacarosa 3 %
Para medio slido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %

Medio de cultivo con fitohormonas y kanamicina

Para comprobar el efecto de una aplicacin exgena de hormonas sobre el desarrollo del
explanto vamos a preparar distintos medios de cultivo, donde la concentracin de
fitohormonas ser distinta, siguiendo el esquema de la Tabla 2. Se parte de disoluciones
stock concentradas, que se aadirn para preparar 500 mL de medio por grupo. Este
volumen de medio es suficiente para preparar al menos 20 placas Petri por grupo.

Auxina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): cido naftalnactico (NAA) 3 gL-1

Citoquinina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): bencilaminopurina (BAP) 1 gL-1
Kanamicina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): 50 g L-1

Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variar la
proporcin de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volmenes de los stock de
fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.

Conc. final (mgL-1)

Medio Kan NAA BAP Kan Grupo
auxina:citoquinina
(mg L-1) (L)
Alta auxina 50
NO 3.0 : 0.0 0 0 1
(AA) 0
Media aux. 25
NO 1.5 : 0.5 250 0 2
(MA) 0
150
Baja aux. (BA) NO 0.5 : 3.0 85 0 3
0
AA + 50 50
50 3.0 : 0.0 0 4
kanamicina 0 0
MA + 25 50
50 1.5 : 0.5 250 5
kanamicina 0 0
BA + 150 50
50 0.5 : 3.0 85 6
kanamicina 0 0

Aparatos, instrumental y material vario

Autoclave Pinzas y bistures Balanza
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Placas Petri estriles Pipetas automticas Pulgas magnticas

Fitotrn (22C-17C, 16h Puntas pipetas estriles Agitador magntico
luz-8h oscuridad) pHmetro Tubos Falcon
Tijeras Mechero Bunsen Frascos ISO de 1 L

1.2. Metodologa cultivo in vitro

DIA 1
Se prepararn las placas con medio de cultivo slido. En primer lugar se proceder a la
preparacin de 500 mL de medio de cultivo lquido MS por grupo (Cada mesa tendr los
cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgnicas (macronutrientes y micronutrientes)
vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un vaso de
precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H2O desionizada, se disuelven
2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se aaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de
mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolucin se ajusta a pH 6.0 y se enrasa
el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapn azul) se echan 4 g de
Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se
autoclavan en ciclo corto 121C a 105 kPa durante 20 min.

Una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60C. Esta
temperatura permite coger los matraces con la mano, NO TIENEN QUE QUEMAR
AL TACTO. Cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adicin de
los componentes termolbiles que han sido esterilizados previamente por filtracin. Se
aaden los correspondientes volmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 mL,
fitohormonas o kanamicina segn se indica en la Tabla 2. SIEMPRE CUIDANDO DE
TRABAJAR MUY CERCA DEL MECHERO ENCENDIDO, MANTENIENDO
LA BOCA DE LA BOTELLA CERCA DE LA LLAMA, Y SIEMPRE TRABAJAR
CON LA MAYOR PRESTEZA POSIBLE.

Una vez aadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotacin para
homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se
solidifique el agar.

Se prepararn 15-20 placas Petri con los 500 mL de medio de cultivo estrilizado . HAY
QUE EVITAR DEJAR LAS PLACAS ABIERTAS. CUANTO MS CUIDADO SE
PONGA EN ESTE PASO, MENOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIN
HABR.

Las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de Prafilm y ya estarn listas para el
da siguiente.

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DIA 2
Se proceder a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y
transgnico. Se cortarn secciones de tallo y hojas con bistur, que seguidamente se
transferirn a tubos Falcon de 50 mL para su esterilizacin.

Esterilizacin
Se aade 15-20 mL de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. Se enjuaga el
tejido con agua estril y se lava el tejido con otros 15-20 mL de la disolucin
esterilizadora durante 5 min. Para eliminar la leja, se lava el tejido con tres volmenes
de H2O desionizada estril, TRABAJANDO SIEMPRE CERCA DEL MECHERO.

MUCHO, MUCHO CUIDADO CON EL ETANOL Y EL MECHERO.

ES ALTAMENTE INFLAMABLE Y NO QUEREMOS TENER
BAJAS EN LA TROPA!!
Una vez esterilizado el tejido, y TRABAJANDO CON PRESTEZA Y MUCHO
CUIDADO, se cortarn ms finamente los tallos en secciones de aproximadamente 0,5
cm de espesor. Seguidamente, se transfieren a las placas Petri con unas pinzas que hayan
sido flameadas, apoyando los sectores sobre el agar. Finalmente, las placas hay que
sellarlas con Parafilm.

POR FAVOR, INSISTIMOS EN EL CUIDADO QUE DEBEIS TENER

PARA QUE SE TRABAJE CON LA MAYOR LIMPIEZA Y
ESTERILIDAD POSIBLES
Dejaremos el material en el Fitotrn. Cada 5-7 das se observar el progreso del
experimento, y cuando pasen 3-4 semanas podremos observar el desarrollo final de los
explantos, a los que se tomarn fotografas.

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2 PARTE: Deteccin de transgenes de resistencia a kanamicina

mediante PCR en plantas transgnicas de tabaco
2.1. Fundamento del experimento
De las diversas tcnicas disponibles para detectar la presencia de un transgen hemos
optado por emplear la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por ser una de las ms
sencillas. No obstante, se ha de disponer de informacin previa sobre la secuencia del
gen o genes que se han incluido en el genoma de la planta para poder disear los
cebadores especficos correspondientes (ver anexo con las secuencias).

Fig. 3. Esquema de amplificacin de un fragmento de DNA genmico utilizando la reaccin en cadena

de la polimerasa (PCR).

El procedimiento consiste en la extraccin de DNA de hojas de plantas de tabaco, tipo

silvestre o NO transgnicas (WT), y de plantas transgnicas (MnSOD) que portan un gen
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de seleccin de kanamicina (nptII). Para ello se utilizar el kit comercial Nucleon

Phytopure (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Reino Unido). El DNA obtenido se
utilizar como molde de reacciones de PCR que se prepararn con cebadores especficos
mostrados en la Tabla 3. Tras realizar la reaccin de PCR en un termociclador, los
productos de amplificacin se visualizarn mediante una electroforesis en gel de agarosa
y con tincin de bromuro de etidio (SUBSTANCIA CARCINOGNICA QUE HAY
QUE MANIPULAR CORRECTAMENTE).
2.2. Metodologa PCR de DNA genmico

DIA 1
Extraccin de DNA
Cada grupo coge hojas de un solo tipo de plantas: grupos impares (1, 3 y 5) de las
plantas silvestres (WT); y grupos pares (2, 4 y 6) de las plantas transgnicas
(MnSOD). Las hojas se congelan y homogeneizan con ayuda de un mortero en nitrgeno
lquido (N2(l)). Ser suficiente con coger 4 o 5 trozos grandes de hoja. Una vez
obtenido un polvo congelado homogneo, se transfieren 0,1 g a un tubo Eppendorf de
1.5 mL estril, que previamente contiene 600 L del tampn de homogeneizacin o
REAGENT 1 (Nucleon Phytopure, Amersham Biosciences). Se mezcla bien con varias
inversiones del tubo y se aaden 200 L del tampn de dilucin o REAGENT 2. Se
invierte el tubo nuevamente varias veces hasta obtener una mezcla homognea.
Seguidamente se incuba a 65C durante 10 min con varias agitaciones manuales. Ubicar
el tubo en un bao de hielo durante 20 min.
Para eliminar el DNA de impurezas se aaden 500 L de cloroformo y 100 L de la
Resina de Extraccin Nucleon. ESTA LTIMA, SER DISPENSADA POR LOS
PROFESORES. Se mantienen los tubos a temperatura ambiente durante 10 min, y con
agitacin suave peridica. Seguidamente se centrifugan los tubos a 12000 g, 4C durante
5 min. Se toman 600 L del sobrenadante SIN REMOVER LA INTERFASE CON LA
RESINA. Es MUY importante que los tubos una vez centrifugados se manipulen con
SUAVIDAD, para no volver a mezclar las fases y la resina.
Por ltimo, se procede a precipitar el DNA purificado aadiendo 1 volumen (600 L)
de isopropanol fro (estar almacenado a -20C), invirtiendo suavemente el tubo hasta
que el DNA precipita. A continuacin se centrifugan el tubo a 12000 g durante 5 min
para sedimentar el DNA. Se elimina con cuidado el sobrenadante y el precipitado de
DNA se lava dos veces con 300 L de etanol 70% fro (mantenido en bao de hielo).
Para evitar que flote el precipitado de DNA hay que centrifugar a 12000 g durante 2 min
entre lavados. Para no perder el DNA, lavar el precipitado y eliminar los sobrenadantes
con las pipetas de 200 L (puntas amarillas). Dejar secar el DNA al aire, y cuando est
seco (esperar 10-15 min) se redisuelve el DNA en 25 L de agua MiliRO estril.
Previamente a la realizacin de la reaccin de PCR, se diluye el DNA 1/5 (10 L de la
muestra ms 40 L de H2O) para tener la muestra molde preparada.

Tabla 3. Cebadores especficos diseados para amplificar distintos fragmentos de DNA,

junto con el tamao esperado del fragmento y la temperatura de anillamiento.

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Cebadores especficos utilizados

Fragmento Cebador positivo Cebador negativo T ani.

Rubisco tccctgtttcaaggaagc gtcgcataaaattgaaggag

59
(349 pb) Rbcs01F Rbcs02R

nptII gaagagcatcaggggctc gaagaactcgtcaagaaggc

59
(317 pb) nptII01F nptII02R

35S tgccatcattgcgataaagg cctctccaaatgaaatgaac

59
(234 pb) 35S01F 35S02R

Nos term gaatcctgttgccggtcttgcg gcgggactctaatcataaaaac

62
(127 pb) nos01F nos02R

Reaccin de PCR
Los profesores elaborarn una mezcla maestra (tubo MM) que contendr todos los
componentes de la mezcla de reaccin de la PCR excepto el molde de DNA (obtenido
por cada grupo) y los cebadores especficos de cada fragmento a amplificar. Para cada
tubo de PCR (utilizar los tubos especiales de 200 L de pared fina estriles), se deben
poner los siguientes componentes en la MM para un volumen de reaccin final de 50 L:
tampn de polimerasa 10X (ya contiene Mg 2+), 5 L; 1 unidad de Taq polimerasa (5
U/L), 0,2 L; dNTPs 10 mM (conc. final 200 M), 2 L; H2O, 27,8 L. A los 35 L
de MM hay que aadir 5 L de cada cebador (total 10 L para la pareja) y 5 L del
molde de DNA. En la Tabla 4 se describen los componentes que hay que aadir en cada
uno de los 8 tubos de PCR que cada grupo ha de preparar.
Dado que cada grupo ha extrado DNA de una sola planta, se compartir por mesa
ambos moldes para que TODOS LOS GRUPOS ENSAYEN TODAS LAS
COMBINACIONES (Tabla 4).
Una vez mezclados los componentes de la reaccin de PCR se introducen los tubos en el
termociclador y se someten al siguiente programa:

Temperatura (C) Tiempo

Desnaturalizacin 94 5 min

40 ciclos
Desnaturalizacin 94 1 min
Anillamiento 59 45 s
Extensin 74 45 s

Extensin final 74 5 min

Final reaccin 10 Hasta el siguiente da

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Tabla 4. Componentes de la mezcla de reaccin para la amplificacin de fragmentos de

DNA genmico mediante PCR.
Combinacin de componentes del medio de reaccin de PCR genmico

CEBADOR 10 M (L) Molde de DNA (L)

Componente Rubisco nptII 35S Nos termin WT MnSOD
Rbcs01F 5
Rbcs02R 5
Rubisco

Molde de DNA 5 5

Tubos N 1 2
nptII01F 5
nptII02R 5
nptII

Molde de DNA 5 5

Tubos N 3 4
35S01F 5
35S02R 5
35S

Molde de DNA 5 5

Tubos N 5 6
nos01F 5
Nos termin

nos02R 5

Molde de DNA 5 5

Tubos N 7 8
Mezcla Maestra (L) 35 35 35 35 35 35

TOTAL (L) 50 50 50 50 50 50

DIA 2
Anlisis de la PCR: separacin de los fragmentos en gel de agarosa
Los nucletidos se separarn mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de
agarosa 2% en tampn TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las bandas
correspondientes al cDNA amplificado se visualizarn en un transiluminador con luz
ultravioleta teidos con bromuro de etidio (BrEt).

Reactivos para la electroforesis de DNA

Tampn TAE. Madre 50x Volumen de 1 L
Tris base 242 g
cido actico glacial 57.1 mL

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Disolucin 0.5 M EDTA pH 8.0 100 mL

Tampn TAE de trabajo Dilucin 1/50 del anterior
Disolucin de carga de muestras, preparada en H2O miliRO
Bromofenol azul 0.25%
Xilencianol 0.25%
Glicerol 30%

Disolucin madre de BrEt 10 mg/mL

Escalera de DNA de 100 pb, preparada directamente para cargar

En un matraz cnico de 250 mL limpio se pesan 2 g de agarosa y se aaden 100 mL del

tampn TAE. Se pone a calentar en un horno microondas hasta conseguir la disolucin
de todo el agarosa, agitando suavemente hasta que desaparezcan los grumos.
PRECAUCIN: el agarosa fundido puede estar a muy alta temperatura. Se ruega trabar
con extremo cuidado para evitar quemaduras.
Cuando la agarosa no queme al tacto (el calor soportable normal es aproximadamente de
60C), se aaden 4 L de la disolucin madre de BrEt. Temperaturas superiores pueden
hacer que se degrade, y posteriormente no veramos nada. PRECAUCIN: el bromuro
de etidio es altamente carcinognico. HAY QUE MANIPULARLO CON MUCHO
CUIDADO, siempre usando guantes, y desprendindose de los residuos (puntas de
pipeta, cintas, guantes, etc.) en el contenedor destinado a ello. NO TIRAR NADA
CONTAMINADO A LA BASURA NORMAL.
Una vez que el gel se ha solidificado se pone en la cubeta de electroforesis, se cubre
suficientemente con TAE y se cargan las muestras. Para ello, se usan 15 L del medio de
reaccin de PCR a los que se ha aadido 2 L de disolucin de carga. CON CUIDADO
DE NO PERFORAR EL POCILLO DE AGAROSA, se transfieren 15 L a cada pocillo.
Finalizado el proceso de carga, se conectan los cables a la fuente de electroforesis. Se
enciende el equipo, se ponen a correr a 70 V y se espera aproximadamente 30 min para
que se separen los colorantes aadidos a la muestra.
Por ltimo, se visualiza el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y, si ha habido
reaccin de PCR se toma una foto con la cmara digital. El resultado ser, esperemos,
similar a lo mostrado en la Fig. 4.

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Fig. 4. Amplificacin por PCR de diversos fragmentos de DNA, utilizando como molde DNA genmico
obtenido de plantas no transgnicas (WT) y plantas transgnicas (MS) de tabaco. Se muestran los
resultados empleando cebadores contra la subunidad pequea de Rubisco (control positivo) y el de dos
componentes de un transgen: gen de resistencia a kanamicina (nptII) y contra el promotor CaMV35S
(utilizado para conseguir un nivel constante de expresin de un gen). En el carril L se muestra la
escalera de DNA de100 pb, que permite determinar el tamao de los fragmentos amplificados (L).

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