Tema 2

EZ DNA Methylation Kit

D5001 & D5002

Introduo Metilao do ADN

A metilao do DNA um evento que ocorre naturalmente em organismos

procariotas e eucariotas. Nos procariotas, a metilao protege o DNA hospedeiro da
digesto por endonucleases de restrio e em eucariotas superiores, a metilao de
DNA tem funes na regulao/controlo da expresso gnica.
Foi j demonstrado que a metilao aberrante de DNA um fenmeno
recorrente no cancro e poder ser uma das modificaes mais precoces a ocorrer
durante a oncognese.
A metilao do DNA tambm tem um papel central no imprinting gentico,
desenvolvimento embrionrio, silenciamento de genes no cromossoma X e na regulao
do ciclo celular. Em muitas plantas e animais, a metilao do DNA consiste na adio de
um grupo metilo ao carbono que se encontra na 5 posio do anel citosina pirimidina
travs da enzima metiltransferase. A maioria da metilao do DNA em mamferos ocorre
em dinucletidos 5-CpG-3 mas existem outros padres de metilao. De facto, cerca de
80% de todos os dinucletidos 5-CpG-3 em genomas de mamferos esto metilados,
sendo que a maioria dos restantes 20% que permanecem no-metilados, esto em
promotores ou nos primeiros exes dos genes.
A capacidade para detetar e quantificar eficientemente e com exactido a
metilao do DNA, tornou-se essencial no estudo do cancro, expresso dos genes,
doenas genticas, assim como vrios outros aspetos importantes da Biologia.
Atualmente, existem vrios mtodos que detetam/quantificam a metilao do DNA
incluindo electroforese capilar de elevada performance e PCR sensvel metilao.
Contudo, a tcnica mais comum usada hoje em dia o mtodo de converso pelo
bissulfito. Esta tcnica envolve o tratamento do DNA metilado com bissulfito, que
converte as citosinas no metiladas em uracilo. As citosinas metiladas no sofrem
alteraes durante o tratamento. Aps a converso, o perfil de metilao do DNA pode
ser determinado por amplificao por PCR e sequenciao do DNA.

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Resultados da sequenciao de DNA aps tratamento com bissulfito: DNA com C pG
metilados na posio nucleotdica #5 foi processado com EZ DNA Methylation Kit. O DNA foi
depois amplificado por PCR e sequenciado diretamente. A citosina metilada na posio #5 continuou
intacta enquanto que as citosinas no-metiladas nas posies #7, 9, 11, 14 e 15 foram
completamente convertidas em uracilo aps o tratamento com bissulfito e detectadas como timinas
aps o PCR.

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Propriedade de Lus Cirnes
 Descrio do produto:

O EZ DNA MethylationTM Kit apresenta um procedimento bastante

simplificado da converso do DNA pelo mtodo do bissulfito. O kit baseado
numa reao de trs passos que ocorre entre a citosina e o bissulfito de sdio,
onde a citosina convertida em uracilo. O kit est desenhado para reduzir a
degradao da amostra, minimizar a perda de DNA durante o tratamento e
purificao, enquanto garante a converso total do DNA. O DNA purificado e
convertido ideal para amplificao por PCR e processos de anlises
subsequentes, incluindo digesto por endonucleases, sequenciao,
microarrays, etc.

Especificaes:

* Quantidade de DNA inicial: amostras com 500pg-2 g de DNA. Para

melhores resultados, a quantidade de DNA inicial dever estar entre 200 a 500ng.
* Eficincia de converso: >99% de citosinas no-metiladas so convertidas em
uracilo; >99% de proteo nas citosinas metiladas.
* DNA final: >80%

Preparao de Reagentes:

Preparao de CT Conversion Reagent

O CT Conversion Reagent includo neste kit uma mistura slida e deve

ser preparado antes da primeira utilizao:

1. Adicione 900 l de gua, 300 l de M-Dilution Buffer e 50 ul M-

Dissolving Buffer a um tubo de CT Conversion Reagent.

2. Misture temperature ambiente vortexando ou agitando durante 10

minutos.

Nota: normal existirem vestgios do reagent no dissolvido no CT Conversion Reagent.

Cada tubo de CT Conversion Reagent est preparado para 10 tratamentos de DNA
independents.
Armazenamento: O CT Conversion Reagent sensvel luz, minimize a sua exposio.
Para melhores resultados, o CT Conversion Reagent deve ser usado imediatamente aps a
preparao. Se no for usado imediatamente, a soluo CT Conversion Reagent pode ser
armazenada overnight temperature ambiente, uma semana a 4C, ou at um ms a -20C. A
soluo preparada armazenada de CT Conversion Reagent deve ser aquecida a 37C, e
depois vortexar antes de usar.

Preparao de M-Wash Buffer

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Propriedade de Lus Cirnes
 Aicione 24 ml de 100% ethanol ao M-Wash Buffer concentrado de 6ml
(D5001) ou 96 ml de 100% ethanol ao M-Wash Buffer concentrado de 24ml
(D5002) antes do uso.

Protocolo:

1. Adicionar 130 l de CT Conversion Reagent a 20 ul de DNA e ajustar o

volume total para 150 l com gua. Misture a amostra agitando o tubo ou
pipetando a mistura.

Example: para 14 l de uma amostra de DNA, adicione 5 l de M-Dilution Buffer e 31 l de gua.

2. Incubar no termociclador.

98C 10 min.
64C 2.5 horas
4C - >oo

3. Adicionar 600 l de M-Binding Buffer a uma coluna Zymo-Spin IC Column

e colocar a coluna num dos Collection Tube includos no kit.

4. Dispensar a amostra obtida no passo 2 na coluna Zymo-Spin IC Column com

o M-Binding Buffer. Fechar a tampa e misturar invertendo a coluna vrias vezes.

5. Centrifugar na velocidade mxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.

Descartar o lquido que ficou no tubo de recolha.

6. Adicionar 100 l de M-Wash Buffer coluna. Centrifugar na velocidade

mxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.

7. Adicionar 200 l de M-Desulphonation Buffer coluna e deixar incubar

temperatura ambiente (20-30C) durante 15-20 minutos. Aps a incubao,
centrifugar na velocidade mxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.

8. Adicionar 200 l de M-Wash Buffer coluna. Centrifugar na velocidade

mxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.
Adicionar novamente 200 l de M-Wash Buffer e centrifugar na velocidade
mxima durante mais 30 segundos.

9. Colocar a coluna num tubo de 1.5ml. Adicionar 10 l de M-Elution Buffer

diretamente na matriz da coluna. Centrifugar na velocidade mxima (>10,000 x g)
durante 30 segundos para eluir o DNA.

O DNA est pronto para anlise ou poder ser armazenado a ou menos de

20C para uso posterior. Para longos perodos de armazenamento, guardar a -70C.
recomendado usar 1-4 l do DNA eludo para cada PCR. Contudo, poder ser
usado at 10 l se necessrio. O volume de eluio pode ser > 10 l dependendo
das necessidades experimentais, mas volumes de eluio menores resultam em
amostras de DNA mais concentradas.

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Propriedade de Lus Cirnes