Nama : Putri Nabila A.A.

NPM : 240210120124

V. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai
katalis (senyawa yang dapat mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi)
dalam suatu reaksi kimia organik. Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan
molekul substrat untuk menghasilkan senayawa intermediet melalui suatu reaksi
kimia organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah sehingga reaksi
kimia mengalami percepatan reaksi. Kerja dari suatu enzim dipengaruhi oleh
beberapa faktor diantaranya adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan
inhibitor.
Michaelis dan Menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi tergantung
pada konsentrasi kompleks enzim-substrat (ES), sebab apabila tergantung pada
konsentrasi substrat (s), maka penambahan kecepatan reaksi apabila digambarkan
akan merupakan garis lurus. Pada praktikum kali ini, akan dilakukan penentuan
konstanta Michaelis pada hidrolisis sukrosa oleh -fruktofuranosidase dari yeast.
Invertase dikenal sebagai -fructofuranoside fructohydrolase merupakan
sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa
(gula invert). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi karbon (C) pada proses
fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk karbohidrat yang
mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al .1996).
Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan
tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak
penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir
Saccharomyces cereviceae. Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan
secara komersil banyak dijual dipasaran. Enzim invertase yang dihasilkan oleh
Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan
temperatur 30C (Bergamasco et al. 2000).
Sukrosa merupakan salah satu jenis oligosakarida. Sukrosa merupakan
gula meja yang pada umumnya dihasilkan oleh tumbuhan terutama pada
tumbuhan tebu. Sukrosa apabila dihidrolisis maka akan menghasilkan -Glukosa
dan -Fruktosa.
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

Sukrosa mengalami invertase dari D-glukosida glukohidrolase yang

mempunyai tingkat spesifik yang hampir sama dengan maltose. D-glukosida
glukohidrolase dapat memecah sukrosa dari sisi cincin glukosidik oksigen glukosa
dan -D-fruktofuranoside hidrolase yang dapat menyerang sukrosa dari bagian
ujung fruktosa. Bifidobacteria dalam yeast mempunyai enzim - fruktofuranosidase
yang mampu memecah ikatan antar -D-fruktofuranoside sehingga oligosakarida
seperti sukrosa dapat dicerna dalam tubuh (pada dasarnya oligosakarida tidak
dapat dicerna, dihidrolisa dan diserap oleh usus halus).
Praktikum kali ini diawali dengan pemurnian enzim fruktofuranosidase
kemudian hidrolisis sukrosa dengan -enzim dan uji benedict. Langkah-langkah
yang dilakukan dalam pemurnian enzim fruktofuranosidase ialah sebanyak 1 gram
yeast dihaluskan kemudian ditambahkan 100 ml buffer pH 5 kemudian dilakukan
sentrifius dan diambil filtratnya. Untuk melakukan hidrolisis sukrosa, maka
sukrosa, ditambahkan akuadest dan buffer dengan jumlah tertentu. Kemudian
campuran tersebut dipanaskan. Lalu sebanyak 4 ml suspensi yeast 1% di
tambahkan ke dalam campuran tersebut dan campuran tersebut diinkubasi pada
suhu 37C selama 6 menit. Suhu tersebut di atur agar tidak terlalu panas, karena
suhu yang terlalu panas maka mikroorganisme penghasil enzim intervase akan
mati, sehingga enzim tidak akan diperoleh. Setelah selesai masa inkubasi, larutan
tersebut ditambahkan 2 ml NaOH 1%. Pemecahan sel dilakukan setelah proses
inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase termasuk enzim yang berada di
dalam sel (intraseluler), maka perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel
untuk mengeluarkan enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih
banyak. Fungsi dari penambahan NaOH ini adalah untuk membantu proses
pemecahan sukrosa. Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan pada hukum
Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan),
maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan
sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya
yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-
mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara
lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi
oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi
tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer).
Satu unit aktivitas enzim merupakan banyaknya mol gula pereduksi yang
dihasilkan oleh 1 ml enzim pada setiap menit (Bayramolu et al., 2003). Gula
invert merupakan campuran antara glukosa dan fruktosa yang diperoleh dari hasil
hidrolisisi sukrosa. Sukrosa bukan merupakan gula pereduksi sedangkan glukosa
dan fruktosa merupakan gula pereduksi, maka dari itu pada praktikum ini
dilakukan uji benedict. Uji benedict ini digunakan untuk membedakan gula
reduksi berdasarkan ion cupri dalam suasana alkalis dengan indicator yaitu adanya
perubahan warna khususnya menjadi merah bata, bila kadar gula reduksinya lebih
rendah maka akan tampak warna biru, hijau, merah atau merah kekuningan.
Pengujian ini berdasarkan dari reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh karbohidrat yang
mempunyai gugus aldehid (-CHO) atau keton bebas (-CO-). Hal ini dilakukan
untuk mencegah terjadinya pengendapan CaCO3 dalam larutan Na-karbonat pada
larutan benedict. Pereaksi kupri sulfat, natrium sitrat, dan natrium karbonat.
Monosakarida segera mereduksi senyawa-senyawa pengoksidasi seperti
ferisianida, gen peroksida, atau ion kupri (Cu2+). Untuk melakukan uji benedict ini
maka larutan yang diperoleh dari hasil hidrolisis sukrosa tersebut ditambahkan 5
ml benedict kemudian dipanaskan pada suhu 96C selama 2 menit untuk
memperjelas warna yang menunjukkan adanya gula invert. Setelah dipanaskan
maka larutan tersebut didinginkan dengan hasil berupa larutan berwarna hijau.
Semakin tinggi konsentrasi gula invert maka warna hijau semakin dominan. Agar
absorbansinya dapat diukur oleh spektrofotometer maka larutan tersebut
diencerkan terlebih dahulu dengan cara menambahkan aquadest lalu dikocok
sehingga warna yang dihasilkan tidak terlalu pekat dan menjadi hijau muda.
Setelah itu, larutan hasil pengenceran dipindahkan ke dalam kuvet untuk
dilakukan pengukuran absorbansinya dengan menggunakan 630 nm.
Konstanta Michaelis-Menten (Km) merupakan suatu konsentrasi substrat
tertentu yang menyebabkan kecepatan reaksi oleh katalis enzim menjadi
kecepatan maksimumnya (Vm). Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan
aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva dengan parameter pentingnya yaitu
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

konsentrasi substrat [S], kecepatan awal (Vo), Vmaks, dan KM. Bentuk persamaan
Michaelis-Menten adalah sebagai berikut :
vo = Vmaks[S]
KM +[S]
Berikut merupakan tabel hasil pengamatan nilai absorbansi dan tabel hasil
perhitungan konsentrasi dan laju reaksi :
Tabel 1. Hasil Pengukuran Nilai Absorbansi
Kelompok Tabung Nilai Absorbansi (A)
6 I 1313
7 II 1570
8 III 1030
9 IV 723
10 V 887
(sumber : dokumentasi pribadi, 2013)
Tabel 2. Hasil Perhitungan Konsentrasi dan Laju Reaksi
Tabung Konsentrasi Nilai Absorbansi Laju Reaksi 1/[S] 1/[v] (y)
[S] (A/1000) [V] (x)
I 0,525 1,313 3,65 x 10-3 1,905 273,973
II 0,42 1,570 4,36 x 10-3 2,381 229,358
III 0,315 1,030 2,86 x 10-3 3,175 349,650
IV 0,21 0,723 2,00 x 10-3 4,762 500
V 0,105 0,887 2,45 x 10-3 9,524 408,163
(sumber : dokumentasi pribadi, 2013)

Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi atau A untuk
setiap tabung berbeda. Sebagian besar menyatakan bahwa semakin rendah nilai S
maka semakin tinggi nilai A dan semakin tinggi pula nilai V. Setiap enzim
mempunyai nilai tetapan Michaelis- Menten tertentu, dimana nilai Km dapat
digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat yang diperlukan agar reaksi
enzimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim,
maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai
biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju reaksi meningkat
saat suhu mencapai nilai optimum dan berkurang saat suhunya maksimum.
Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan meningkatnya kadar substrat
(Lehinger 1982).
Jika dibuat hubungan antara laju (V) dengan konsentrasi substrat (S) maka
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi dikarenakan

aktivitas enzim invertase semakin besar. Akan tetapi pada batas konsentrasi
tertentu tidak akan terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi
substrat diperbesar dikarenakan enzim sudah jenuh dengan substratnya. Atau
dengan kata lain tidak terdapat lagi sisi aktif enzim karena hampir semua enzim
telah membentuk kompleks enzim-substrat [ES]. Harga Vm dan Km dapat
ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk (Lehninger, 1997).
Penentuan kinetika enzim intervase (Vmax dan Km) didasarkan pada plot
grafik hubungan antara konsentrasi enzim dan substrat (Fayyaz et al. 1995; Dinu,
2001). Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversikan menjadi 1/V dan 1/
[S] seperti pada tabel 1 dan 2 di atas. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang
didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver Burk.
Berdasarkan persamaan Lineweaver Burk dan dengan menggunakan data
yang diperoleh dari praktikum maka diperoleh kurva standar untuk larutan
glukosa dengan perlakuan benedict sebagai berikut:

Gambar 1. Hubungan antara 1/[S] dan 1/[v]

(sumber : dokumentasi pribadi, 2013)

Berdasarkan kurva hubungan 1/V dengan 1/[S] untuk larutan glukosa

dengan perlakuan reagen benedict di atas, maka diperoleh intersep sebesar
263,836 dan nilai slope sebesar 20,577 sehingga diperoleh persamaan regresi
y=20,577x + 262,836, dengan demikian diperoleh nilai Vmax sebesar 0,0038
mol/ml.menit dan nilai Km sebesar 0,022. Aktivitas enzim invertase yang mula-
mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi
substrat, tetapi tidak signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

ini terjadi karena suatu reaksi enzimatisakan meningkat dengan bertambahnya

konsentrasi substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan
sampai pada kecepatan yang tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi
enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan
maksimum (Vmaks) (Wiesman, 1989).
Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat
kinetika enzim lain, Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi
aktifnya telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah
dari kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten).
Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan
tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz (1995)
menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas
enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menjadi
rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan
lingkungan dan kekuatan ion. Pada percobaan kali ini didapat Vmax mendekati
nol artinya reaksi berjalan sangat lambat. Serta didapatkan Km bernilai kecil
artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai Vmax sangat
sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan sangat lambat.

VI. KESIMPULAN

1. Invertase dikenal sebagai -fructofuranoside fructohydrolase merupakan

sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

glukosa (gula invert), ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae.
2. Untuk menentukan konstanta Michaelis-Menten (Km) maka dilakukan
pemurnian enzim fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan
-enzim dan uji benedict.
3. Dari hasil praktikum diperoleh nilai Vmax sebesar 0,0038 mol/ml.menit
dan nilai Km sebesar 0,022.
4. Vmax mendekati nol artinya reaksi berjalan sangat lambat.
5. Km bernilai kecil artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk
mencapai Vmax sangat sedikit sekali karena reaksi yang terjadi
berjalan sangat lambat.

DAFTAR PUSTAKA

Bayramolu, G., Akgol, S., bulut, A., Denizli, A. And Yakup, A.M. (2003),
Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2-
hydroxyethyl methacrylate and glicidyl methacrylate, Biochemical
Engineering Journal, 14: 117-126
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, ZaninGM. 2000. Characterization of free
andimmobilized invertase regarding activity andenergy of activation.
Brazilian Journal of Chemical Engineering: 873-880
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at
the cell andtissue leve1 is coordinated with sucrose sink-tosource
transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acidand pectins by
polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :397-
402
Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB,Jinap S. 1995. Kinetics of papaya
pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 :129-135
Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.Amaize vacuolar invertase ,
IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity anddiurnal
modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilidke-1. Maggy Thenawidjaja;
penerjemah.Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.Erlangga:Jakarta
Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New
York: EllisHoward.

JAWABAN PERTANYAAN

1. Bila diperoleh data sebagai berikut, tentukanlah nilai Vmaks dan Km bagi
reaksi suatu enzim
[S], M [V], mol/L menit
 Nama : Putri Nabila A.A.
NPM : 240210120124

2,5 x 10-6 28
4,0 x 10-6 40
1,0 x 10-5 70
2,0 x 10-5 95
4,0 x 10-5 112
1,0 x 10-4 128
2,0 x 10-3 139
1,0 x 10-2 140
Jawab:
[V], mol/L 1/[S] 1/[v]
[S], M
menit (x) (y)
-6
2,5 x 10 28 400000 0,03571
-6
4,0 x 10 40 250000 0,025
1,0 x 10-5 70 100000 0,01428
-5
2,0 x 10 95 50000 0,01052
4,0 x 10-5 112 25000 0,00892
1,0 x 10-4 128 10000 0,00781
-3
2,0 x 10 139 500 0,00719
1,0 x 10-2 140 100 0,00714
Hasil perhitungan regresi:
Y= 7,152 x 10-8X + 7,1 x 10-3
A= 7,1 x 10-3
B= 7,152 x 10-8

mol/L menit