UNIVERSIDAD TECNOLGICA EQUINOCCIAL

Facultad de Ciencias de la Ingeniera e Industrias

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Prctica N 3

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A

ALIMENTOS (E. coli y B. cereus)

CADA GRUPO DEBE TRAER LAS SIGUIENTES MUESTRAS (VER EN TABLA EL

GRUPO CORRESPONDIENTE): Las muestras deben ser tradas en un recipiente
con control de temperatura - coolers a temperatura de refrigeracin en frascos
estriles (frascos de vidrio -gatorade- limpios y sometidos a un proceso de
desinfeccin por ebullicin que se puede hacer en casa).

GRUPO Muestra para E. coli Muestra para B.cereus

(platos preparados -
restaurante Chino)
1, 5 Papas con librillo Chaulafn
2, 6 Motes con chicharrn Tallarn
3, 7 Cevichochos Chaulafn
4, 8 Agrio de hornado Tallarn

LOS ALIMENTOS NO DEBEN SER COMPRADOS EN SUPERMERCADOS O

RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDAD, SINO DEBEN
CONSEGUIRSE EN MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DE ALIMENTOS EN
FORMA ARTESANAL

TRAER UNA NORMA REFERENCIAL DE REQUISITOS MICROBIOLGICOS PARA

LOS ALIMENTOS DESIGNADOS A CADA GRUPO (PARA LOS ALIMENTOS QUE
HAYA DISPONIBLE)

TEMA: MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A

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ALIMENTOS (E. coli y B. cereus)

1. OBJETIVOS:

Realizar el recuento aislamiento e identificacin de E. coli y B. cereus en diferentes

muestras de alimentos
Comparar los resultados obtenidos con las normas de requisitos microbiolgicos
respectivos.

2. INTRODUCCIN

Las Enfermedades transmitidas por Alimentos (ETAS) se definen como cualquier

enfermedad causada por la ingestin de un alimento contaminado que produce efectos
nocivos en la salud del consumidor. Estos trastornos fsicos son provocados por el consumo
de alimentos y de agua contaminados con clulas de bacterias patgenas viables (o esporas)
o de alimentos que contienen toxinas producidas por bacterias y mohos toxignicos.

El control de alimentos y bebidas se basa en dos pilares: la inspeccin y el anlisis de

laboratorio. El anlisis microbiolgico, se utiliza para establecer si el agua o alimento es
inocuo y tomar decisiones acertadas para proteger la salud pblica; hacindose necesaria una
adecuada interpretacin y anlisis de resultados, para poder brindar soluciones frente a
determinados problemas de la industria y ofrecer seguridad al productor y consumidor final.

Indicadores microbiolgicos: Coliformes

Las bacterias coliformes son aerobias o facultativas anaerobias, gram negativas, no

formadoras de esporas, tienen forma bacilar y fermentan la lactosa con la produccin de cido
y gas en 48 horas a 35 grados centgrados.

Las reacciones bioqumicas y la morfologa de las clulas es similar a la de Escherichia coli

para todos los miembros de este grupo.

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Se diferencian de otros grupos de microorganismos por su capacidad de crecer en medios

que contienen sales biliares (o agentes selectivos equivalentes) y por la utilizacin de la
lactosa como fuente de carbono con la produccin de cido y gas en 48 horas a 35 grados
celsius. La fermentacin de la lactosa se da independientemente de la presencia o ausencia
de sales biliares que son usadas para inhibir el crecimiento de microorganismos no entricos.

Coliformes fecales: coliformes de origen fecal que pertenecen al grupo anterior y que, adems
son capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44C en un tiempo
mximo de veinticuatro horas.

Escherichia coli: bacterias coliformes generalmente indol positivas, citrato negativas, rojo de
metilo positivas, no producen acetilmetilcarbinol y son capaces de fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas entre 37C y 44C en un tiempo mximo de veinticuatro horas.

El hallazgo de gran nmero de organismos en los alimentos y en el agua indica la polucin o

contaminacin fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de
carcter intestinal, la presencia de polucin indica la posibilidad de que existan agentes
etiolgicos productores de estas enfermedades.

Los coliformes comprenden tres gneros: Escherichia, Klebsiella y Enterobacter. Son

habitantes comunes del tracto intestinal por lo que su presencia en los alimentos puede
indicar una contaminacin fecal, suelen ser considerados microorganismos indicadores. Sin
embargo los coliformes que se encuentran en los alimentos pueden tener un origen fecal o no
por lo que el recuento de coliformes debe interpretarse con mucha cautela. La presencia de
coliformes no tiene necesariamente relacin con una contaminacin de origen fecal y
consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos
de procedencia entrica, sino que es slo una indicacin de deficiencias o fallos en el
tratamiento industrial de los alimentos.

Se utiliza a veces tambin la denominacin "coliformes fecales" refirindose a los

microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene

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sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44 - 45.5 C.

Hay tres fases para el anlisis de coliformes en agua y alimentos:

a) Prueba presuntiva: Estima el recuento presuntivo de coliformes ya que pueden

enumerarse tambin las colonias que son similares a las de coliformes. Si un recuento
presuntivo de coliformes es bajo, el analista puede considerar que el producto es
aceptable en relacin con esta prueba y puede decidir no realizar ms anlisis. En
caso de recuentos elevados debe pasar al segundo nivel analtico
b) Prueba confirmativa: Se realiza para confirmar el recuento obtenido en el test
presuntivo. Si la prueba presuntiva se bas en la deteccin del gas producido por las
bacterias fermentadoras de lactosa, la prueba confirmatoria puede implicar la
deteccin de la formacin de cido en condiciones ms selectivas
c) Prueba concluyente complementaria: puede estar destinada a comprobar si los
coliformes encontrados son o no de origen fecal o para comprobar que E. coli est
representado entre los microorganismos del recuento confirmado de coliformes

Contaminacin del agua

La contaminacin es un proceso de alteracin o de modificacin ms o menos importante de

los equilibrios fsicos, qumicos o biolgicos del agua que son responsables de su calidad y la
hacen inadecuada para sus numerosos usos y aplicaciones. Dicha contaminacin puede tener
dos orgenes: qumico o microbiolgico. El agua natural constituye un reservorio de
microorganismos autctonos (Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus) o exgenos (Escherichia
coli, Enterococcus). El agua recibe y arrastra partculas cargadas de bacterias, por lo que en
cercanas de las grandes poblaciones incluso el agua de lluvia es portadora de un elevado
nmero de microorganismos.

El anlisis microbiolgico por recuento de bacterias indicadoras de contaminacin fecal en

aguas es de suma importancia al evaluar el estado sanitario del sistema en estudio. Debido a
que la concentracin de microorganismos en el agua habitualmente es baja, su deteccin
directa es complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son de
fcil deteccin y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia que excede al

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de los patgenos en ese ambiente.

Dentro de los mtodos de recuento de bacterias se encuentran dos que son los ms
ampliamente utilizados: la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP) y la tcnica de recuento
en placa. Con la primera slo se obtiene una estimacin de la poblacin de microorganismos
contenidos en una muestra, no proporcionando una enumeracin precisa. Cuando la
poblacin es muy elevada, el recuento en placa supera en precisin a este mtodo. Por el
contrario en poblaciones bajas (menos de 10 clulas por mL) es ms eficaz la tcnica de NMP
porque permite la utilizacin de muestras de mayor tamao.

Procedimiento de muestreo para anlisis microbiolgico de agua:

Para tomar muestras para un anlisis microbiolgico de agua se debe contar con los
siguientes materiales:

1. Alcohol 70

2. Guantes

3. Botella estril (*)

4. Gel-pack o hielo (cooler, hielera)

(*) Si no se cuenta con botella estril, se pueden esterilizar las botellas con tapas en un
recipiente con agua hirviendo durante 20 minutos a bao trmico.

Procedimiento de toma de muestra:

1. Se procede a rociar con abundante cantidad de alcohol la llave de la cual se va a tomar la

muestra. Si es una manguera, el alcohol se roca desde la punta hacia dentro de la
manguera. Si la muestra es de un estanque, laguna, ro o mar, se omite este procedimiento.

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2. Se rocan las manos con guantes con gran cantidad de alcohol.

3. Se abre la llave y se deja correr gran cantidad de agua por lo menos por 30 segundos.

4. Se abre la tapa de la botella estril y se llena la botella con la muestra de agua a analizar.
No se debe rebalsar de agua la botella de muestreo.

5. Se tapa rpidamente la botella.

6. Se refrigera la muestra entre 2 a 6C o se almacena en cooler con gel-pack o hielo, por no

ms de 24 horas antes del anlisis.

Rotulado de la muestra:
Cada frasco llevar un rtulo donde se har constar el Nombre del establecimiento, No. de
grifo dentro del plano presentado; lugar de toma de muestra, fecha, hora, responsable de la
extraccin y todo otro dato importante para su identificacin.

Acondicionado y Transporte de la Muestra:

La muestra debe estar debidamente acondicionada con hielo o conservadores de fro y se
realizar lo ms rpido posible su anlisis. Se recuerda que con una adecuada refrigeracin
se evita la reproduccin de bacterias, de all su importancia.
No se debe congelar la muestra.
Chequear la debida identificacin de todos los envases antes de analizarlos.
La muestra debe llegar al Laboratorio lo antes posible (menos de 1 (un) da a partir del
muestreo).

Bacillus cereus

Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su

hbitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas
pasteurizadas y especias, entre otros alimentos.

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La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas por
alimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios ms difundidos en la
actualidad. Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados o
contaminados por este microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que son
perfectamente evitables; la primera descripcin de un brote de gastroenteritis data de
principios de 1900.

Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la toxina

diarreica y la toxina emtica que dan lugar a dos formas clnicas distintas de intoxicacin
alimentaria. Los sntomas de la toxicoinfeccin tienen dos formas de presentacin con
presencia de diarrea, dolores abdominales y vmitos. Su perodo de incubacin vara de 4 a
16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.

La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua

vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicacin, si las
medidas higinico sanitarias y de elaboracin no son las adecuadas.

La intoxicacin alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidos
sin la adecuada refrigeracin durante horas antes de ser servidos. El consumo de alimentos
que contienen 105 B.cereus/g o ms puede provocarla. Los alimentos vinculados a brotes han
sido carne y verduras cocidas, arroz frito o hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes de
vegetales crudos.

El sndrome emtico est producido por una toxina preformada y termoestable, al igual que la
de S. aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado, tiene un perodo de
incubacin corto, habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los sntomas gastrointestinales
altos manifestados por nuseas y vmitos. Este hecho ha llevado a confundir la intoxicacin
por B. cereu y atribuirla a S. aureus. El sndrome diarreico por el contrario, est producido por
la ingestin de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin del
organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada y
termolbil tiene un perodo de incubacin ms largo que promedia entre 10 y 12 horas y las

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manifestaciones se relacionan con la afectacin gastrointestinal baja similar a la intoxicacin

por Clostridium perfringens

Los sntomas son dolor abdominal, diarrea acuosa profusa, tenesmo y nauseas que
generalmente duran 12-24 horas y en algunos pacientes pueden durar ms tiempo, de 2 a 10
das. La intoxicacin alimentaria por Bacillus cereus es autolimitada y no requiere tratamiento
antimicrobiano, el tratamiento es sintomtico y ocasionalmente es necesario rehidratacin.

3. DEFINICIN
Bacterias patgenas: Son aquellas que causan enfermedades infecciosas en los
seres humanos.
Reacciones bioqumicas: Proceso qumico en el que dos sustancias o ms
(reactivos) por accin de un factor energtico se convierte en un producto.
Sales biliares: Forma en la que el cuerpo guarda los cidos libres en la vescula biliar
y son secretados al intestino para la digestin de lpidos.
Agente etiolgico: Entidad biolgica, fsica o qumica capaz de causar enfermedad.

4. EQUIPOS Y MATERIALES

Materiales
tubos para diluciones (con diluyente)
pipetas estriles
tubos con BGBL con campana de Durham
pera
gradilla
BGBL
EMB
Pruebas bioqumicas: RM, VP, Indol y Citrato
Asas y agujas de inoculacin
Caldo lactosado
Frasco y tubos con diluyente
Agar MYP

Equipos:
Vortex
Balanza
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incubadora

5. NORMAS DE SEGURIDAD

5.1 Nunca comience el trabajo en el laboratorio sin el permiso previo del instructor o
supervisor.
5.2 Al iniciar y finalizar la prctica el estudiante lavar sus manos escrupulosamente
con agua y jabn.Se usarn guantes protectores apropiados para todos los
procedimientos, una vez utilizados, los guantes se retirarn de forma asptica y a
continuacin se lavarn las manos.
5.3 Emplee los equipos segn las instrucciones o procedimientos operativos.
5.4 Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al
mnimo la formacin de aerosoles y gotculas.
5.5 Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales
infecciosos se comunicarn al encargado del laboratorio.
5.6 Estar estrictamente prohibido pipetear con la boca. No se colocar ningn
material en la boca.
5.7 Las puertas y ventanas del laboratorio se mantendrn cerradas durante la prctica.
5.8 El uso de celulares est estrictamente prohibido durante la prctica.

6. MTODO
Preparacin de diluciones

- Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente

- Preparar diluciones, 10-1, 10 -2 y 10-3 utilizando los tubos con 9 ml de diluyente

Recuento de bacterias del grupo coliforme segn la tcnica de NMP

I) COLIMETRA PRESUNTIVA
1- Disponer de 1 serie de tres tubos con 9mL cada uno de Caldo BGBL (Bilis Lactosa
Verde Brillante). Todos deben poseer en su interior una campana de Durham.
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2- Realizar tres diluciones sucesivas de la muestra.

3- Sembrar 1mL de la muestra en cada uno de los tubos.
4- Incubar los tubos durante 24 horas a 37C.
5- Contar los tubos que posean gas en el interior de la campana de Durham. Dichos
tubos sern considerados positivos.
6- Buscar en la tabla el NMP de bacterias coliformes totales/100mL de muestra.
En caso de NO encontrar tubos positivos dejar las muestras 24 horas ms de
incubacin.

II) COLIMETRA CONFIRMATIVA

1. De los tubos positivos de la colimetra presuntiva sembrar por estriado en Agar EMB.
2. Incubar 24 horas a 37C.
3. Ver colonias aisladas y sospechosas de E. coli.
4. Realizar una tincin Gram de estas colonias.

III) COLIMETRA COMPLEMETARIA

1. A las colonias aisladas y sospechosas de E. coli resembrar en agar Mac Conkey e
incubar a 37C durante 24 horas.
2. De estas ltimas realizar las pruebas de IMViC: Indol, Rojo Metilo, Voges-Proskauer,
Simmons Citrato. Para ello preparar tubo de Caldo nutritivo, RM-VP y Simmons citrato.
3. Incubar 24 horas a 37C.
4. Leer resultados.

Bacillus cereus

RECUENTO

1. Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente

2. Hacer diluciones, 10-1, 10 -2 y 10-3
3. Inocular por la tcnica de EXTENSION 0,1 ml de cada dilucin en las placas Petri con
agar MYP.
4. Incubar 24h 37C
5. Contar las colonias tpicas de B. cereus
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IDENTIFICACIN

1. Realizar tincin coloracin Gram.

2. Realizar tincin de esporas.
3. Resistencia al NaCl y consumo de manitol: resembrar en Agar Sal y Manitol, incubar
24H/37C. Leer los resultados.
4. Licuefaccin de la gelatina: sembrar por picadura en agar gelatina, incubar 24H/37C,
retirar de la incubadora y colocar 30 minutos en la heladera. Si el medio se mantiene
lquido el resultado es positivo, caso contrario es negativa la licuefaccin de la gelatina.
5. Hidrlisis del almidn: hacer una estra en una placa con agar almidn, incubar
24H/37C. aadir unas gotas de lugol para revelar la presencia de almidn alrededor
de la estra, si se tie de color morado alrededor de la estra es un resultado negativo
debido a que la bacteria no consumi el almidn.

7.CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
1. Cmo se prepara el agar MYP y Baird Parker?
2. Describir las colonias tpicas de B. cereus en MYP
3. Cul es la importancia de E. coli como indicador microbiolgico en alimentos?
4. Qu significado tiene la H y la O de la clasificacin bacteriana?

8. BIBLIOGRAFA
- Apella y Araujo (sin fecha). Solar safe water. Microbiologa del agua. Conceptos
bsicos. En lnea: www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm
- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas.
Laboratorio Microbiologa General. Departamento de Biotecnologa. Universidad
Autnoma Metropolitana.
- Annimo. (sin fecha). Manual de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y
Gentica. Universidad de Salamanca.

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9. REGISTRO DE DATOS

E. coli

Descripcin de la muestra

DATOS GENERALES
Muestra
Condiciones de conservacin
Nombre y lugar del expendedor
Fecha y hora de toma de la
muestra.
Responsable de muestreo
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS
Consistencia
Olor
Color
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Congelada _______ Refrigerada ________ T ambiente ______
Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta
el anlisis:
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA
Proceso tecnolgico al que fue
sometido
ANALISIS REALIZADO

COLIMETRA PRESUNTIVA (NMP):

Combinacin de tubos positivos
NMP =
COLIMETRA CONFIRMATIVA:
Caractersticas de las colonias (Agar Mac Conkey):

COLIMETRA COMPLEMENTARIA:

PRUEBA RESULTADO
Produccin de Indol
Uso del citrato

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Rojo metilo
Voges Proskauer

Bacillus cereus
Descripcin de la muestra
DATOS GENERALES
Muestra
Condiciones de conservacin
Nombre y lugar del expendedor
Fecha y hora de toma de la
muestra.
Responsable de muestreo
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS
Consistencia
Olor
Color
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Congelada _______ Refrigerada ________ T ambiente ______
Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta
el anlisis:
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA
Proceso tecnolgico al que fue
sometido
ANALISIS REALIZADO

Recuento
DILUCION No. colonias Resultado

PROMEDIO
RESULTADO No. UFC / g de muestra

REPORTE GENERAL DE RESULTADOS

ANLISIS MUESTRA MTODO RESULTADO VALORES NORMA

SOLICITADO DE REFERENCIALES
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ANLISIS

Coliformes
totales
Coliformes
fecales
E. coli
B. cereus

*Metodo de anlisis: el nombre del mtodo aplicado

*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES
*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES
*Norma: nombre o nmero de la norma.

Docente Responsable: Dra. Mara Fernanda Mera

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