Laboratorio de microbiologa 4

ANLISIS MICROBIOLGICO DE BEBIDAS

I) OBJETIVOS
- Determinar la presencia de coliformes.
- Realizar un recuento de colonias aerobias mesfilas.
II) FUNDAMENTO TERICO
Se consideran como bebidas alcohlicas o refrescantes las bebidas no
fermentadas, carbnicas
0 no, preparadas basndose en agua potable y con los ingredientes
caractersticos de esa bebida. Dichos ingredientes pueden ser: zumos de frutas,
extractos de fruta o partes de plantas comestibles, frutas, semillas y tubrculos
disgregados, esencias naturales o agentes aromatizantes, edulcorantes naturales
y cido carbnico.
Evidentemente el agua debe reunir las caractersticas organolpticas, sicas,
qumicas y microbiolgicas de mxima calidad. El anhdrido carbnico ha de tener
una pureza mnima de un 99.8% estar exento de otros gases como cidos nitroso
y sulfrico y carecer de otras impurezas como aire u oxido de carbono.
En general, para el anlisis de las aguas embotelladas se utilizan los mtodos y
los medios de cultivo estndar. Sin embargo hay algunas discrepancias en
relacin con la temperatura de incubacin y el medio de cultivo ms adecuados
para la determinacin de numero de microorganismos viables totales. Por ello
nosotros trabajaremos con una temperatura de incubacin de 37C por 48 horas.
Refrescos
Los recuentos totales deben ser bajos y estar ausentes los bacilos coliformes,
como en el agua potable. No son raras las alteraciones por levaduras y mohos y
pueden causar la elevacin del pH permitiendo se desarrollen otros grmenes
menos acido - tolerantes. En refrescos no carbnicos de frutas, no se inhiben las
levaduras por la cantidad de conservante autorizado legalmente. La alteracin se
controla generalmente mediante acidez. Tanto en stos como en los refrescos
carbnicos, el contenido microbiano disminuye con el tiempo.
Zumo de fruta
Los hongos termorresistentes pueden producir problemas en los zumos
concentrados. Se investigan mediante calentamiento a 77C durante 30 minutos.
Se enfran y se vierten con Agar al 2%. Se incuban hasta durante 30dias.
Bebidas alcohlicas
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En las industrias de las sidras de manzana y de pera pueden producir problemas

los mtodos de produccin y recoleccin. No suelen desecharse los frutos del
suelo y los podridos, lo que introduce una fuerte carga de organismos productores
de alteraciones.
La sidra, la cerveza y el vino pueden alterarse por las bacterias acticas que
convierten el etanol en cido actico.
La cerveza, especialmente sin lpulo, puede estropearse por pedicoccus,
enfermedad debida a sarcina.
La microflora de las bebidas recin preparadas es muy variada, pero con
posterioridad desaparecen numerosas especies bajo el efecto de los agentes
selectivos existentes en el medio, especialmente el pH bajo y la gran
concentracin de C02.
Los microorganismos que se pueden detectar se pueden incluir en tres grupos:
Agentes alterantes tpicos: se encuentran levaduras que producen una
fermentacin rpida en orden decreciente de importancia, estas levaduras son
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ovarum, S. microelliosoides y S.
orentinus. De fermentacin lenta Saccharomyces intemiedius, S. bisporus,
Torulospsis stellata, S. montanus y Candida parapsilopsis.
Microorganismos alterantes: pero slo bajo condiciones especficas; las
bacterias principales agentes de alteracin son los cidos Lcticas, Gram
positivas, catalasa negativas del gnero Leuconostoc que suelen soportar bien
las condiciones del entorno de las bebidas.
Cabe citar como agentes potenciales de alteracin a las levaduras tales como
Hansenula y Pichia, bacterias como Gluconobacter y Lactobacillus, y diversos
mohos como Pencillium, Aspergillus, Mucor, Fusarium y Oospora.
Microorganismos no alterantes: son aquellos microorganismos que pueden
sobrevivir A en las bebidas sin provocar efectos evidentes en ellas. Este es el
caso de levaduras aerobias como RhodotonJ/a y el de bacterias aerobias
como las de los gneros Bacillus y Acetobacter. As como microorganismos de
inters higinico como Escherichia coli y otros coliformes: Streptococos del
grupo D, incluso otros agentes como "Salmonellas, - Estalococos y
Clostridios que pueden sobrevivir durante un cierto tiempo en las bebidas.
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III) MATERIALES Y EQUIPOS

NOMBRE IMAGEN FUNCION

Esptula Sirve para coger una

cierta cantidad de
sustancia en polvo o
slida.

Se utiliza junto con

Propipeta la pipeta para
transvasar lquidos de
un recipiente a otro
evitando succionar
con la boca lquidos.

Permite medir
Pipeta la alcuota de un
lquido con bastante
precisin.

Se utiliza muy
comnmente en
Vaso el laboratorio, sobre
Precipitado todo, para preparar o
calentar sustancias y
traspasar lquidos.

Tubo de ensayo Se utiliza en los

laboratorios para
contener pequeas
muestras lquidas o
slidas.
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Mide la fuerza
necesaria para
contrarrestar la
masa que est
Balanza
siendo medida en
Analtica lugar de utilizar
masas reales.

Se utiliza para el
cultivo de bacterias
y otros M.O.,
Placas petri solindose cubrir el
fondo con distintos
medios de cultivo

se coloca dentro de
los tubos de
ensayo, muchas
veces en
Campas de
microbiologa, para
durham observar si el
microorganismo
desprende gases

dispositivo que sirve

para mantener y
hacer
Incubadora crecer cultivos
microbiolgicos ocul
tivos celulares

Se utilizan para
pescar transportar y
Asas de
sembrar el material
siembra bacteriolgico

Necesario para la
esterilizacin de
Herbidora
materiales
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Sustancia soluble
resultante de la
Agua accin de la
peptonada pepsina sobre las
protenas

Medio de cultivo es
selectivo para
caldo verde
bacterias Gram.
brilla Negativas.

EMB

Para la
Agar plate determinacin y
count recuento de
microorganismos en
alimentos
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V) RESULTADOS Y DISCUSIONES
Resultados del agar peptona

A LAS 24 HORAS A LAS 85 HORAS

IMAGEN RESULTADO IMAGEN RESULTADO
101
Regular turbidez Abundante turbidez indicando la
indicando la presencia de microorganismos
presencia de dando como resultado una
microorganismos prueba positiva.
dando como
resultado una prueba
positiva.
102
Ligera turbidez Regular turbidez indicando la
indicando la presencia de microorganismos
presencia de dando como resultado una
microorganismos prueba positiva.
dando como
resultado una prueba
positiva.
AGAR PEPTONA

103
En la parte superior hay
ligera turbidez presencia de un color azul,
indicando la turbidez indicando la presencia
presencia de de microorganismos dando
microorganismos como resultado una prueba
dando como positiva,
resultado una prueba
positiva.

104 Ligera turbidez Ligera turbidez indicando la

indicando la presencia de microorganismos
presencia de dando como resultado una
microorganismos prueba positiva.
dando como
resultado una prueba
positiva.
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De los tubos sembrados en el caldo peptona (prueba presuntiva), se obtuvo

los sgtes. resultados (a las 24 y 85 horas) para coliformes totales:
DILUCIONES
101 102 103 104
botella tubo tubo tubo

+ + + +

1 1 1 1

Los resultados que se pueden evidenciar en los tubos de caldo brilla pueden ser:
Positivo (): Turbidez y presencia de gas. Puede existir viraje de color del
medio de cultivo al color amarronado o amarillo.

Negativo (-): Ausencia de turbidez y /o gas.

Cuadro 1: Tipo de microorganismos que crecen el caldo verde brilla.

Fuente: Laboratorio Britania S.A.

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Resultados del verde brilla

A LAS 24 HORAS A LAS 85 HORAS
IMAGEN RESULTADO IMAGEN RESULTADO
101 Presencia de gas en la campana
Ligera decoloracin Durham, lo que indica que hay
Mnima presencia de presencia de microorganismos
gas en la campana de que fermentan la lactosa en esta
Durham muestra dando como resultado
una prueba positiva
CALDO LACTOSADO BILIS VERDE BRILLANTE

102 Presencia de gas en la campana

Ligera decoloracin Durham, lo que indica que hay
hay presencia de gas presencia de microorganismos
en la campana de que fermentan la lactosa en esta
Durham, indica que muestra dando como resultado
hay presencia de una prueba positiva.
microorganismos.

103 No hay Presencia de gas en la

Hay presencia de gas campana Durham, lo que indica
en la campana de que no hay presencia de
Durham, indica que microorganismos
hay presencia de
microorganismos que
fermentan la lactosa
en esta muestra
dando como
resultado una prueba
positiva.
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RECUENTO CONFIRMATIVO EN AGAR EMB

CARACTERISTICAS COLIONIAS LACTOSA + COLIONIAS LACTOSA -

COLOR Verde brillante. Trasparentes o claros.
TAMAO Pequeos. Pequeos.
ASPECTO Redondas y de forma ovoide. Redondas casi planas.

Como todos los tubos del caldo peptona salieron positivos, se sembraron en tubos con
caldo brilla.
De los tubos sembrados en el caldo Brilla (prueba presuntiva), se obtuvo los sgtes.
resultados (a las 24 y 85 horas) para coliformes totales:

DILUCIONES

101A 101B 102A 102B 103A 103B 104A 104B

+ + + + + - + -

2 2 1 1

Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms probable es

NMP(2-2-1-1)
Utilizando 4 diluciones con dos repeticiones (2 tubos) se obtuvo que 6 tubos
positivos y dos sin produccion de gas (sin presencia de microorganismos )
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Especificaciones microbiolgicas establecidas para diversos alimentos.

*NOM-093-SSA1-1994; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Lmites microbiolgicos de la

ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods).
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Resultados del caldo nutritivo

A LAS 24 HORAS A LAS 85 HORAS

IMAGEN RESULTADO IMAGEN RESULTADO
101
Abundante turbidez Abundante turbidez indicando la
indicando la presencia de microorganismos
presencia de dando como resultado una
microorganismos prueba positiva.
dando como
resultado una prueba
positiva.

102
CALDO NUTRITIVO

Regular turbidez Regular turbidez indicando la

indicando la presencia de microorganismos
presencia de dando como resultado una
microorganismos prueba positiva.
dando como
resultado una prueba
positiva.

103
Ligera turbidez
indicando la Ligera turbidez indicando la
presencia de presencia de microorganismos
microorganismos dando como resultado una
dando como prueba positiva.
resultado una prueba
positiva.
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De los tubos sembrados en el caldo nutritivo(prueba presuntiva), se obtuvo los

sgtes. resultados (a las 24 y 85 horas) para coliformes totales:

DILUCIONES
101 102 103 104
botella tubo tubo tubo

+ + + +

1 1 1 1

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey por

estria(De los tubos positivos se pas a placas), luego de la incubacin por 85
horas, se obtuvo los sgtes. resultados:

Resultados del mac conkey

Mac Conkey A LAS 85 H

101 102 103

Se observa la formacin de
colonias de color amarillenta
por toda la placa.
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RECUENTO CONFIRMATIVO EN AGAR EMB

CARACTERISTICAS COLIONIAS + COLIONIAS -

COLOR Rosadas, mbar. Trasparentes o claros.
TAMAO Medianos y Pequeos. Pequeos.
ASPECTO Redondas y de forma ovoide. Redondas casi planas.

DILUCIONES
101 102 103

+ + +

1 1 1

Para este resultado se utiliz 3 diluciones

De los resultados obtenidos se puedo identificar a Klebsiella pneumoniae.
Entonces, como Klebsiella pertenece al grupo de las coliformes fecales,
podemos decir que la muestra tratada (jugo de naranja) tena presencia de
estas en un nmero de (resultado NMP 1-1-1)

Resultados del plate count

Plate Count A LAS 24 H
101 102 103

N DE COLONIAS: >300 N DE COLONIAS: >300 N DE COLONIAS: 170

colonias colonias

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en Plate count por

incorporacin de 1ml (De los tubos positivos se pas a placas), luego de la
incubacin por 85 horas, se obtuvo los sgtes resultados:
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CONTEO
101 102 103
24 horas >300 colonias >300 colonias 170 colonias
UFC/ml 170*1000 u.f.c/g o
ml=-1.7*105

Resultado final: las placas confirman los resultados de los tubos, pues en todas
las placas hubo crecimiento de microorganismos. En algunos hay mayor formacin
de colonias como la 10-1 y 10-2 donde existen ms de 300 colonias y en 10-3 se
pudo contabilizar 170 colonias.

OBSERVACION:
En el caso del frugos analizado, sali positivo en todas las diluciones, por tanto se
puede deducir varios puntos. El primer punto es que quiz la fbrica procesadora
de este producto no realiz una buena prctica de manufactura; quizs en los
puntos de comercializacin (mercados, tiendas, etc.) que expenden estos
alimentos no hubo una buen manejo en cuanto almacenamiento y conservacin, y
la tercera deduccin seria que quiz en el momento del anlisis microbiolgico no
se cumplieron con las normas bsicas de higiene para que el resultado sea
confiable.
VI) CUESTIONARIO

3. Qu mtodos microbiolgicos se realizan en la industria de

zumos de fruta, nctares? Cul cree Uds. es el ms adecuado
fundamente su respuesta.
4. elabore un flujograma del mismo.

Los mtodos microbiolgicos que se realizan en la industria de zumos de frutas

son muy similares y tratan de enfatizar un punto en comn, que sea inocuos para
el consumo humano, pero en criterio colectivo del grupo de laboratorio
concordamos que los mtodos de recuento de mohos y levaduras, clostridium
sulfito reductor, NMP de coliformes termotolerantes y recuento de mesofilos son
los ms adecuados para ello.

Para el anlisis de mesfilos, hongos y levaduras se utiliza la tcnica de recuento

en placa en profundidad. Inicialmente se mide 11 ml de muestra y se adicionan a
99 ml de agua peptonada 0.1%, se agita para homogenizar la muestra y se deja
en reposo 2 minutos. Posteriormente se transfiere 1 mililitro de la dilucin 10-1a un
tubo con 9 ml del diluyente (agua peptonada 0.1%) para obtener la dilucin 10-2.
De la dilucin 10-2 se transfiere un mililitro a otro tubo con 9 ml del diluyente para
obtener la dilucin 10-3. Finalmente se siembra por duplicado en profundidad 1 ml
de cada una de las diluciones, se agrega agar plate count fundido para mesfilos y
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agar OGY fundido para hongos y levaduras, se homogeniza y una vez solidificado
el agar, se incuba a 25C de 3-5 das y se hace lectura.

Para el anlisis de Clostridium se hace diluciones hasta 102 estas se calentaron

a 80C por 10 minutos en bao termostatado y se enfria seguidamente con hielo,
posteriormente se siembra en profundidad 1 ml de cada una de las diluciones, y se
agrega una capa de agar SPS (sulfito, polimixina, sulfadiazina), fundido a 45C, se
homogeniza y una vez solidificado, se agrega una capa sellante de medio, se
incuba a 35C por 72 horas. Para el anlisis de coliformes totales y fecales se
utiliza la tcnica de tubos de fermentacin mltiple (dilucin en tubo) del nmero
ms probable (NMP). El mtodo se basa en que las bacterias coliformes,
fermentan la lactosa incubada a 35 1 C (coliformes totales) 44.5 C (coliformes
fecales) durante 24 a 48 h, resultando en la produccin de cidos, gas, el cual se
manifiesta en las campanas de fermentacin, y la produccin de indol mediante la
adicin del reactivo de kovacs.

METODOLOGA PARA EL ANLISIS DE JUGOS

Recuento de mohos y levaduras
Materiales
Frasco dilucin con 90 ml de agua peptonada 0.1%
2 tubos de 16 x 150 mm tapa rosca con 9 ml de agua peptonada 0.1 %
3 pipetas estriles de 1 ml
6 cajas de petri estriles
120 ml de agar OGY

PROCEDIMIENTO
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Recuento Clostridium sulfito reductor

Materiales
Frasco dilucin con 90 ml de agua peptonada 0.1%
2 tubos de 16 x 150 mm tapa rosca con 9 ml de agua
peptonada 0.1 %
3 pipetas estriles de 1 ml
6 cajas de petri estriles
120 ml de agar SPS ( sulfito, polimixina, sulfadiazina)

PROCEDIMIENTO

Recuento de mesfilos
Materiales
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Frasco dilucin con 90 ml de agua peptonada 0.1%

2 tubos de 16 x 150 mm tapa rosca con 9 ml de agua peptonada 0.1 %
3 pipetas estriles de 1 ml
6 cajas de petri estriles
120 ml de agar plate count

PROCEDIMIENTO
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Numero mas probable (NMP) de coliformes termotolerantes.

Materiales
1 frasco de dilucin con 90 ml de agua peptonada 0.1%
2 tubos de 16 x 150 tapa rosca con 9 ml de agua peptonada 0.1%
3 pipetas de 1 ml estriles
9 tubos de 150x 16 mm que contengan 10 ml de caldo bilis verde brillante con
campana de dirham
9 tubos con agua de tristona
Reactivo de kovacs
Bao termostatazo a 44.5 C
PROCEDIMIENTO
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BIBLIOGRAFA:
Laboratorio Britania S.A
http://www.bvsde.ops-oms.org