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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Salomon Huancahuire Vega

Miotoxinas PLA2 isoladas de veneno de Porthidium hyoprora:

Modificaes qumicas e avaliao do efeito cataltico e das atividades
miotxica, neurotxica citotxica e inflamatria.

Exame de qualificao

Orientador: Prof. Dr. Sergio Marangoni

Campinas, 2012
 ii

ndice
Pg
Lista de abreviaes.................................................................................................................................. v
Lista de Figuras......................................................................................................................................... vi
Lista de tabelas.......................................................................................................................................... viii
Resumo..................................................................................................................................................... ix
Abstract..................................................................................................................................................... xi
1. INTRODUO........................................................................................................................................ 01
1.1 Veneno de serpentes....................................................................................................................... 01
1.2 O veneno botrpico......................................................................................................................... 02
1.2.1 Atividade hemorrgica........................................................................................................ 02
1.2.2 Atividade coagulante e agregao plaquetria.................................................................... 02
1.2.3 Atividade inflamatria........................................................................................................ 03
1.2.4 Atividade miotxica............................................................................................................ 03
1.2.5 Atividade neurotxica......................................................................................................... 04
1.3 Fosfolipases A2 (PLA2)................................................................................................................... 04
1.4 Estrutura e funo das PLA2........................................................................................................... 06
1.5 Ao biolgica das PLA2................................................................................................................ 10
1.6 Miotoxinas PLA2............................................................................................................................ 11
1.7 Neurotoxinas PLA2......................................................................................................................... 12
1.8 Modificaes qumicas das PLA2................................................................................................... 13
1.9 Ferramentas moleculares................................................................................................................ 14
1.10 Porthidium hyoprora...................................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS............................................................................................................................................. 16
2.1 Objetivo geral................................................................................................................................. 16
2.2 Objetivos especficos...................................................................................................................... 16
3. MATERIAIS E MTODOS..................................................................................................................... 17
3.1 Veneno e reagentes......................................................................................................................... 17
3.2 Animais........................................................................................................................................... 17
3.3 Purificao das PLA2 em HPLC de fase reversa............................................................................ 17
3.4 Eletroforese em SDS-PAGE........................................................................................................... 17
3.5 Atividade fosfolipsica A2.............................................................................................................. 18
3.6 Estudos cinticos............................................................................................................................ 18
3.6.1 Efeito do pH na atividade PLA2............................................................................................ 18
3.6.2 Efeito da temperatura na atividade PLA2.............................................................................. 18
3.6.3 Efeito da concentrao do substrato na atividade PLA2...................................................... 19
3.6.4 Efeito de ons divalentes na atividade PLA2......................................................................... 19
3.6.5 Estudos de inibio enzimtica.............................................................................................. 19
3.7 Anlise de aminocidos.................................................................................................................. 19
3.8 Determinao da massa molecular por espectrometria de massas Maldi-tof................................. 19
3.9 Determinao da estrutura primria................................................................................................ 20
3.9.1 Reduo e alquilao............................................................................................................. 20
3.9.2 Hidrlise enzimtica.............................................................................................................. 20
3.9.3 Espectrometria de massas em tandem................................................................................... 20
3.9.4 Sequenciamento de novo dos peptidios trpticos............................................................... 20

3.10 Modificaes qumicas da PLA2 PhTX-I....................................................................................... 21

 iii

3.10.1 Alquilao de histina com 2,4-Dibromoacetophenone (BPB).......................................... 21

3.10.2 Acetilao de lisina com anidro actico (AA).................................................................... 21
3.10.3 Sulfonilao de tirosina com 4-Nitrobenzenesulfonil fluoride (NBSF)............................. 21
3.10.4 Sulfonilao de triptofano com 2-Nitrobenzenesulfonil cloride (NPSC)........................... 22
3.11 Determinao da massa molecular das protenas modificadas por espectrometria de massas
Electrospray (ESI).......................................................................................................................... 22
3.12 Espectropolarimetria de dicrosmo circular (CD)........................................................................... 22
3.13 Espectros de dicrosmo circular...................................................................................................... 23
3.14 Determinao das atividades farmacolgicas................................................................................. 23
3.14.1 Medida da atividade neurotxica em msculo biventer cervicis de pintainho................... 23
3.14.2 Determinao dos nveis de CK plasmticos em camundongos....................................... 24
3.14.3 Determinao da atividade edematognica (edema de pata).............................................. 25
3.14.4 Quantificao de Interleucina 6 (IL-6)............................................................................... 25
3.14.5 Atividade citotxica sobre cultura celular de mioblastos e miotubos................................ 25
3.14.6 Atividade citotxica sobre cultura celular NG97 e NCIH-3T3.......................................... 27
3.15 Anlise estatstica........................................................................................................................... 27
4. RESULTADOS......................................................................................................................................... 28
4.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................... 28
4.1.1 Purificao das fraes PhTX-I e PhTX-II a partir do veneno total de P. hyoprora.......... 28
4.1.2 Determinao do grau de pureza, recuperao e atividade especfica de PhTX-I e II........ 29
4.1.3 Anlise de composio de aminocidos das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II................................ 30
4.1.4 Determinao da massa molecular por espectrometria de massas Maldi-tof...................... 31
4.1.5 Caracterizao da estrutura primria da PLA 2 PhTX-I....................................................... 33
4.1.6 Caracterizao da estrutura primria da PLA 2 PhTX-II...................................................... 35
4.1.7 Dicrosmo circular das PLA2 PhTX-I e PhTX-II................................................................. 37
4.1.8 Estudos da cintica enzimtica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II............................................. 38
4.2 Caracterizao farmacolgica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................................... 40
4.2.1 Determinao da atividade neurotxica ex vivo do VT e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II..... 40
4.2.2 Atividade miotxica local in vivo do VT e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II........................... 42
4.2.3 Atividade miotxica sistmica in vivo do VT e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.................... 42
4.2.4 Determinao da atividade edematognica do VT e das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II............. 43
4.2.5 Determinao dos nveis de IL-6 aps injeo intramuscular do VT e PhTX-I ................. 44
4.2.6 Determinao do efeito citotxico do VT e PhTX-I sobre mioblastos e miotubos............. 44
4.2.7 Atividade citotxica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II sobre clulas NIH-3T3 e NG97........... 45
4.3 Modificaes qumicas na PLA2 PhTX-I....................................................................................... 46
4.3.1 Eletroforese em SDS-PAGE da PLA2 PhTX-I nativa e das modificadas............................ 46
4.3.2 Determinao da massa intacta das protenas modificadas por MS ESI............................. 46
4.3.3 Anlise de composio de aminocidos das formas modificadas....................................... 47
4.3.4 Dicrosmo circular............................................................................................................... 48
4.3.5 Determinao da atividade PLA2 de PhTX-I e das formas modificadas............................. 49
4.3.6 Determinao da atividade neurotxica ex vivo.................................................................. 50
4.3.7 Atividade miotxica local in vivo........................................................................................ 52
4.3.8 Determinao da atividade edematognica.......................................................................... 53
4.3.9 Determinao da atividade citotxica.................................................................................. 54

5. DISCUSSO............................................................................................................................................ 55
5.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................... 55
5.2 Caracterizao farmacolgica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................................... 63
 iv

5.3Modificaes qumicas na miotoxina PhTX-I e seus efeitos sobre suas atividades enzimtica,
farmacolgicas e estruturais........................................................................................................... 70
6. DISCUSSO GERAL.............................................................................................................................. 79
7. CONCLUSSES...................................................................................................................................... 81
8. BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................................... 83

Lista de Abreviaes

TFA cido trifluoractico

PLA2 Fosfolipase A2
 v

HPLC-FR Cromatografia de alta definio de fase reversa

SDS-PAGE Eletroforese em Gel de poliacrilamida - Dodecil Sulfato de Sdio
BPB 2,4-Dibromoacetophenone
AA Anidro actico
NBSF 4-Nitrobenzenesulfonil fluoride
NPSC 2-Nitrobenzenesulfonil cloride
ESI Espectrometria de massas Electrospray
Maldi-tof Matriz Assistida Laser Desoro Ionizao Tempo de Vo
CD Dicrosmo circular
CK Creatino kinase
IL-6 Interleucina 6
NG97 Linhagem celular de fibroblastos
NCIH-3T3 Linhagem celular derivada de astrocitoma humano grado III
ACh Acetilcolina
C2C12 Linhagem celular de mioblastos e miotubos murinos
PhTX-I Toxina PLA2 I de P. hyoprora
PhTX-II Toxina PLA2 II de P. hyoprora
ESI-QTOF-MS/MS Espectrometria de massa em tandem quadrupole-tempo de vo
EDTA cido etilenodiamino tetractico
LDH Lactato Desidrogenase
PBS Tampo Fosfato Salina
DTT Ditiotreitol
YM-3 Membrana Amicom com poros de 3000 Daltons
-Bondapak C18 Coluna de HPLC com n-octadecyl como base da fase estacionria
NOAB Substrato cromognico cido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzico

Lista de Figuras
Pg
Figura 1 Hiptese sobre o desenvolvimento dos efeitos locais induzidos por venenos botrpicos........ 5
 vi

Figura 2. Representao em fita de uma 7

PLA2........................................................................................
Figura 3: Representao esquemtica da ala de ligao do on clcio................................................... 8
Figura 4. Representao esquemtica do mecanismo cataltico da PLA 2............................................... 9
Figura 5 Hiptese sobre o mecanismo de ao das PLA 2 miotxicas do veneno de Bothrops sp........... 12
Figura 6. Perfil cromatogrfico do veneno total de P. hyoprora em HPLC de fase reversa................... 28

Figura 7. Re-cromatografia das fraes PhTX-I e PhTX-II em HPLC de fase reversa.......................... 29

Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) SDS-PAGE.................................................... 30
Figura 9. Determinao da massa molecular das PLA2 PhTX-I e PhTX-II por MS Maldi-tof......... 32
Figura 10. Espectro ESI-QTOF-MS/MS do peptdeo trptico de 1312.38 Da de PhTX-I ..................... 34
Figura 11. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PhTX-I com outras PLA 2.............. 35
Figura 12. . Espectro ESI-QTOF-MS/MS mostrando as series de ons y de PhTX-II............................ 36
Figura 13. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PhTX-II com outras PLA 2............ 37
Figura 14. Espectros de CD no UV-distante das PLA2 PhTX-I e PhTX-II............................................. 38
Figura 15. Atividade enzimtica do veneno total de P. hyoprora, e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II......... 39
Figura 16. Representao grfica do bloqueio neuromuscular do VT, PhTX-I e PhTX-II..................... 40

Figura 17. Registros miogrficos da resposta muscular em presena do VT, PhTX-I e PhTX-II.......... 41
Figura 18. Porcentagem de bloqueio da contratura em resposta ACh e K do VT, PhTX-I e PhTX-II 41
Figura 19. Representao grfica da atividade miotxica local do VT, PhTX-I e PhTX-II................... 42
Figura 20. Representao grfica da atividade miotxica sistmica do VT, PhTX-I e PhTX-II............ 43
Figura 21. Atividade edematognica do VT, PhTX-I e PhTX-II............................................................ 43
Figura 22. Nveis de Interleucina (IL-6) plasmtica induzida por VT e PhTX-I.................................... 44
Figura 23. Atividade citotxica do VT e da PhTX-I sobre cultura de mioblastos e miotubos............... 45
Figura 24. Atividade citotxica de PhTX-I e PhTX-II sobre clulas NCIH-3T3 e NG97...................... 45
Figura 25. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%). SDS-PAGE PLA 2 modificadas.................. 46
Figura 26. Espectros de massa ESI da PhTX-I modificada com BPB, AA, NPSC e NBSF................... 47
Figura 27. Espectros de CD no UV-distante. PhTX-I nativa e as formas modificadas........................... 49
Figura 28. Atividade PLA2 da PhTX-I nativa e das formas modificadas ............................................... 50
Figura 29. Representao grfica do bloqueio neuromuscular dasPhTX-I modificadas......................... 50

Figura 30. Registros miogrficos da resposta muscular em presena de PhTX-I modificadas............... 51

Figura 31. Representao grfica da atividade miotxica local da PhTX-I nativa e modificadas ......... 52
Figura 32 Atividade edematognica da PLA2 PhTX-I e das formas modificadas................................... 53
Figura 33. Atividade citotxica da PhTX-I nativa e modificadas sobre cultura NCIH-3T3 e NG97..... 54
 vii

Lista de Tabelas
Pg
Tabela 1. Fosfolipases A2 secretrias (sPLA2)........................................................................................ 6
 viii

Tabela 2. Estratgias para modificaes qumicas de aminocidos em PLA 2......................................... 14

Tabela 3 Tabela de recuperao e clculo de atividade especfica das fraes PhTX-I e PhTX-II......... 30
Tabela 4. Composio de aminocidos das PLA2 PhTX-I e PhTX-II..................................................... 31
Tabela 5. Massas e sequencias de aminocidos ESI-MS/MS dos peptideos trpticos de PhTX-I........... 33
Tabela 6. Massas e sequencias de aminocidos ESI-MS/MS dos peptideos trpticos de PhTX-II.......... 36

Tabela 7. Composio de aminocidos da PLA2 PhTX-I nativa e modificadas...................................... 48

Resumo
No presente trabalho, apartir do veneno de P. hyoprora, foram purificadas duas PLA2
miotxicas, denominadas PhTX-I e PhTX-II, determinadas suas sequencias primrias e
 ix

caracterizadas biquimica e farmacologicamente. Ambas as protenas foram purificadas numa

nica etapa cromatogrfica (HPLC-FR), sendo obtidas homogneas e com alto grau de
pureza, que foi confirmada por SDS-PAGE, anlise de aminocidos e espectrometria de
massas.
PhTX-I e PhTX-II esto constituidas de uma nica cadeia polipetidica e possuem
massas moleculares de 14.249 e 14.149 Da, respectivamente. A sequencia de aminocidos foi
determinada via espectrometria de massas ESI-MS/MS, encontrando-se que pertencem
familia das PLA2 D49 e mostrando uma alta identidade (44-90%) com outras PLA2
miotxicas de venenos de serpentes. O espectro de CD indica que a estrutura secundria
predominante destas PLA2 consiste de -hlices. Sequencias de aminocidos que fazem parte
de alguns domnios estruturais comuns entre as PLA2 foram conservados nas PLA2 em estudo,
incluindo o sistema cataltico, a ala de ligao ao clcio e o stio de reconhecimento
interfacial. Esta caracterstica se viu refletida na sua alta atividade cataltica.
Atividade enzimtica mxima foi alcanada em pH 8 e entre 3545 oC. Ambas
enzimas mostram-se completamente dependente de Ca2+, j que na presena de outros ctions
(Mg2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+ ), a atividade enzimtica foi reduzida notavelmente. O Ca 2+ direciona
o posicionamento do substrato no stio ativo da enzima sugerindo que esse arranjo do stio
cataltico apresenta uma estrutura exclusiva para o Ca 2+. A inibio quase completa da
atividade cataltica aps incubao com EDTA, confirmou a obrigatoriedade do Ca 2+.
Crotapotinas de C.d. collilineatus reduziram a atividade cataltica destas enzimas em mais do
50%.
Veneno total de P. hyoprora e a PhTX-I induziram bloqueio da transmisso
neuromuscular na preparao ex vivo de biventer cervicis de pintainho, o efeito da PhTX-I foi
de maneira similar a outras PLA2 de veneno botrpico. In vivo, tanto o veneno como a PhTX-I
induziram elevada miotoxicidade local e liberao de IL-6 aps injeo intramuscular em
camundongos, ambos induziram tambm atividade edematognica. In vitro, PhTX-I foi
citotxica sobre cultura cellular de miotubos, entretanto teve pouco efeito citoltico sobre
mioblastos de msculo esqueltico. PhTX-I tambm foi citotxica, de maneira dose-
dependente, para a linhagem celular de fibroblastos NIH-3T3 e em menor grau para a
linhagem NG97 derivada de astrocitoma humano grado III.
PhTX-II por sua vez induz os diversos efeitos farmacolgicos exibidos pela PhTX-I,
como neurotoxicidade ex vivo, miotoxicidade local e edema in vivo e citotoxicidade in vitro
sobre linhagem celular de fibroblastos NIH-3T3. Estes efeitos farmacolgicos foram
induzidos pelas toxinas PhTX-I e II, em maior magnitude do que o veneno total, mostrando a
 x

contribuio importante destas toxinas na toxicidade total do veneno. Mas, outros

componentes do veneno tais como a peptidios, e enzimas proteolticas, podem contribuir
tambm para as propriedades txicas do veneno.
Com o objetivo de entender as relaes estrutura-funo da PhTX-I, foram feitos
modificaoes qumicas em resduos de aminocidos especficos e avaliadas as atividades
farmacolgicas da toxina aps as modificaes. Atraves da determinao da massa molecular
(espectrometria de massas ESI) e da anlise de aminocidos das protenas modificadas se
determinou a modificao de um resduo de Hys, quatro de Tyr, sete Lys e um Trp por BPB,
NBSF, AA e NPSC, respectivamente. Anlise das protenas modificadas por dicrosmo
circular demonstrou que a estrutura secundria das protenas no foi alterada
significativamente.
Nossos resultados indicam um papel crtico desempenhado pelos aminocidos Lys e
Tyr na miotoxicidade, neurotoxicidade e principalmente na citotoxicidade induzida por PhTX-
I. O resduo de His do stio ativo, e, por conseguinte, a atividade cataltica da PhTX-I
relevante para os efeitos edematognico, neurotxico e miotxico, mas no para a sua
actividade citotxica, j que este ltimo efeito foi completamente independente da atividade
cataltica de PhTX-I, evidenciando a existencia de regies moleculares, diferentes a do stio
cataltico, as quais podem ser responsveis por pelo menos algumas das propriedades
farmacolgicas da PhTX-I . Observamos que aparentemente a atividade cataltica da toxina
estaria potencializando os efeitos neurotxico e miotxico. Podemos concluir, que apesar de
ser demonstrada uma dissociao parcial, tanto o stio cataltico como os stios
farmacolgicos hipotticos so relevantes para o perfil farmacolgico de PhTX-I.

Abstract
In this work, were purified two myotoxics PLA 2, called PhTX-I and PhTX-II, from P.
hyoprora snake venom, determined their primary sequences and characterized their
pharmacological and biochemical activities. Both were purified in a single chromatographic
 xi

step (FR-HPLC) and obtained with homogeneous and high purity, which was confirmed by
SDS-PAGE, amino acid analysis and mass spectrometry.
PhTX-I and PhTX-II are constituted of a single chain polipetidica and have molecular
mass of 14.249 and 14.149 Da, respectively. The amino acid sequence was determined by
ESI-MS/MS mass spectrometry; both belong to the family of PLA 2 D49 and show high
identity (44-90%) with other myotoxics PLA2 of snake venoms. The CD spectrum indicates
that the predominant secondary structure of these enzymes consists of -helix. Amino acid
sequences which are part of some common structural domains between the PLA 2, were
conserved by PhTX-I and II, including the catalytic system, the calcium-binding loop and the
interfacial recognition site. This feature was reflected in its high catalytic activity.
Maximum enzyme activity was achieved at pH 8 and between 35-45 oC. Both enzymes
appear to be completely dependent on Ca2+, since in the presence of other cations (Mg2+, Mn2+,
Cd2+ and Zn2+), reduced notably the enzymatic activity, suggesting that the arrangement of the
catalytic site presents an exclusive structure for Ca 2+. The almost complete inhibition of
catalytic activity after incubation with EDTA confirmed the requirement of Ca 2+. Crotapotins
of C.d. collilineatus reduced catalytic activity of these enzymes in over 50%.
Ex vivo, whole venom and PhTX-I PLA2 caused blockade of the neuromuscular
transmission in young chick biventer cervicis preparations similar to other isolated snake
venom toxins from Bothrops genus. In vivo, both induced local myotoxicity and systemic
interleukin-6 response upon intramuscular injection, additionally, induced moderate footpad
edema. In vitro, PhTX-I induced low cytotoxicity in skeletal muscle myoblasts, however was
able to lyse myotubes. PhTX-I was also cytotoxic on fibroblast cell line NIH-3T3 and to a
lesser extent on the cell line NG97 derived from human astrocytoma III.
PhTX-II in turn induce the various pharmacological effects exhibited by PhTX-I, such
as neurotoxicity ex vivo, myotoxicity local and edema in vivo and cytotoxicity in vitro on cell
line fibroblasts NIH-3T3. These pharmacological effects induced by purified PhTX-I and II
toxins, were to a greater magnitude than the whole venom, showing the significant
contribution of these toxins on the overall toxicity of venom. However, other components
such as peptides and proteolytic enzymes may also contribute to the toxic properties of this
venom.
In order to understand the structure-function relationships of PhTX-I, were made
modificaoes chemical specific amino acid residues and evaluated the pharmacological
activities of the toxin after modifications. By determining the molecular mass (ESI mass
spectrometry) and amino acid analysis of modified proteins was determined the modification
 xii

of one Hys, four Tyr, seven Lys and one Trp residues by BPB, NBSF, AA and NPSC,
respectively. Analysis by circular dichroism demonstrated that secondary structure of protein
remains practically unchanged.
Our results indicate a critical role of Lys and Tyr amino acid at myotoxicity,
neurotoxicity, and especially cytotoxicity induced by PhTX-I. The His residue of the active
site, and therefore, the catalytic activity of PhTX-I is relevant to the edematogenic effects,
neurotoxic and myotoxic, but not for their cytotoxic activity, since this latter effect is
completely independent of the catalytic activity of PhTX-I, demonstrating the existence of
molecular regions, different from the catalytic site, which may be responsible for at least
some of the pharmacological properties of PhTX-I. We observed that apparently the catalytic
activity of the toxin would be potentiating the neurotoxic and myotoxic effects. We conclude
that both the catalytic site and the hypothetical pharmacological site(s) are apparently relevant
for the pharmacological profile of PhTX-I, although a partial dissociation between these
activities has been demonstrated.
 1

1. INTRODUO.
Envenenamento por mordedura de serpente um problema de sade pblica de grande
importncia em muitas regies do mundo, particularmente na frica, sia, Amrica Latina e
Papua Nova Guin. Recentemente a Organizao Mundial da Sade (OMS) tem incorporado
o envenenamento por mordedura de serpente em sua lista de doenas negligenciadas
(Gutirrez et al., 2010).
A estimativa global de acidentes ofdicos de 5,5 milhes de casos por ano, o que
resulta em aproximadamente 400,000 amputaes e entre 20,000 e 125,000 mortes
(Kasturiratne, et al., 2008). Atualmente o nico tratamento especfico nos casos de
envenenamento ocasionados por mordedura de serpente a administrao do soro antiofdico
que, embora tenha reduzido a mortalidade devido neutralizao das toxinas que agem
sistemicamente, muitas vezes ineficiente na reverso dos danos tissulares locais. A eficcia
do soro antiofdico tambm restringida a uma rea geogrfica e biolgica limitadas, devido
ampla diversidade imunoqumica do veneno (Gutirrez et al., 2006).
A fauna ofdica de interesse mdico no Brasil est representada pelos gneros
Bothrops (incluindo Bothriopsis e Porthidium), Crotalus, Lachesis e Micrurus (Cardoso et al.,
2003).

1.1 Veneno de Serpentes.

O veneno das serpentes composto de uma complexa mistura de molculas de
natureza qumica diversa como protenas, nucleotdeos e ons inorgnicos. Entre os compostos
inorgnicos esto o clcio, cobre, ferro, potssio, magnsio, mangans, sdio, fsforo, cobalto
e zinco; outros componentes presentes no veneno incluem carboidratos (glicoprotenas),
lipdeos (fosfolipdios), aminas biognicas, aminocidos e nucleotdeos (Kini, 2003).
Entretanto, a maior parte dos compostos presentes no veneno de serpente (90%) formada
por peptdeos e protenas que so responsveis pela ampla variedade de propriedades txicas
do veneno (Koh et al., 2006).
Entre as protenas de veneno esto as chamadas proteases, que apresentam atividade
enzimtica, tendo as protenas da pressa como substrato. Os principais exemplos de proteases
presentes nos venenos so as metaloproteases e as serinoproteases. Entretanto, vrios outros
tipos de protenas so encontrados nos venenos como: fosfolipases A2, fosfodiesterases,
colinesterases, aminotransferases, L-amino oxidases, catalases, ATPases, hialuronidases, NAD
nucleosidases, e L-glicosaminidases (Matsui et al., 2000). Esta combinao peptdeos e
polipeptdios fazem com que o veneno apresente diferentes propriedades txicas.
 2

1.2 O veneno botrpico.

Os envenenamentos por espcies botrpicas (Bothrops sp.), caracterizam-se por uma
fisiopatologia complexa, que inclui principalmente efeitos locais (neurotoxicidade,
miotoxicidade, dermonecrose, hemorragia, edema e dor) e, em casos moderados e severos,
alteraes sistmicas como coagulopatias, sangria, choque cardiovascular e insuficincia renal
aguda (Ponce-Soto et al., 2007). Evidentemente essas atividades so extremamente
complexas e podem, usualmente, ser atribudas a componentes especficos. No entanto,
diferentes toxinas podem atuar de forma complementar ou sinrgica (Montecucco et al.,
2008), para induzir um determinado efeito, assim como tambm uma nica toxina pode ter
vrias atividades farmacolgicas(Ponce-Soto et al., 2006).
A hiperalgesia uma caracterstica do envenenamento botrpico. Este efeito tem sido
estudado experimentalmente em ratos com veneno de Bothrops jararaca (Teixeira et al.,
2003), demonstrando-se que mediado principalmente por prostaglandinas, leucotrienos e
fator ativador de plaquetas (PAF). Em seguida descrevemos as atividades mais importantes do
envenenamento botrpico:

1.2.1 Atividade hemorrgica.

causada por toxinas denominadas hemorraginas que so enzimas do tipo
metaloprotease, j que sua atividade enzimtica depende da presena de um tomo de zinco
no seu sitio ativo (Fox e Serrano, 2009). As hemorraginas podem romper a integridade do
endotlio vascular e tem atividade desintegrina, alm de serem potentes inibidoras da
agregao plaquetria. J foram descritos e estudados os efeitos hemorrgicos de vrias
metaloproteases de espcies botrpicas, como caso da BaP1, metaloprotease isolada de
veneno de Bothrops asper (Rucavado et al., 1995), BjussuMP-I, isolada de veneno de
Bothrops jararacussu (Mazzi et al., 2004), a jararagina, isolada de Bothrops jararaca
(Kamiguiti et al., 1994), HFBm metaloprotease de B.marajoensis (Torres-Huaco et al., 2010),
entre outras.

1.2.2 Atividade coagulante e agregao plaquetria.

O veneno botrpico possui capacidade de ativar fatores da coagulao sangunea,
ocasionado consumo de fibrinognio e formao de fibrina intravascular, induzindo
 3

freqentemente incoagulabilidade sangunea, alm de ativar a protrombina da cascata de

coagulao sangunea. A frao do veneno que possui esta ao coagulante atua de maneira
diferente da trombina fisiolgica, pois, no neutralizada pela heparina (Kini, 2005). A
batroxobina uma enzima trombina like isolada de veneno de Bothrops atrox que tem a
capacidade de ativar o fator XIII da cascata de coagulao, imitando os efeitos da trombina
(Marckland, 1998).

1.2.3 Atividade inflamatria.

causada por diversas fraes do veneno botrpico, por exemplo, aminas biognicas,
pr-formadas do tipo histamina, protenas como PLA 2, esterases, proteases, enzimas
liberadoras de cininas e lectinas. A atividade edematgena muito potente, evidenciada nos
casos clnicos e nos modelos experimentais (Teixeira et al., 2003). Nesses ltimos, as doses
de veneno ou fraes requeridas para induzir um efeito significativo variam de uns poucos
microgramas a dcimos de microgramas (Teixeira, et al., 2003). Nos estudos experimentais
com a BaTX, uma PLA2 homloga K49 isolada de Bothrops alternatus, verificou-se que uma
dose de 2,5 g capaz de produzir edema no modelo coxim plantar de camundongo (Ponce-
Soto et al., 2007); por outro lado, 0,9 g de veneno de Bothrops asper no mesmo modelo
capaz de induzir edema imediato e transitrio na extremidade injetada (Lomonte et al., 1994).
Resultados similares foram observados para os venenos B. jararacussu, B. moojeni, B. brazili,
B. marajoensis e as PLA2 isoladas de cada um desses venenos (Bonfim et al., 2006;
Calgarotto et al., 2008; Huancahuire-Vega et al., 2009; Ponce-Soto et al., 2010).

1.2.4 Atividade miotxica.

A mionecrose induzida por esses venenos tem dois mecanismos fundamentais: (1) ao
direta de toxinas denominadas miotoxinas, sobre as clulas musculares, originando leso, e
(2) isquemia que se desencadeia no tecido como conseqncia do sangramento, compresso
tissular e outras alteraes inflamatrias, que tambm contribuem para a mionecrose. Todas as
miotoxinas isoladas at o momento so protenas bsicas, com pesos moleculares ao redor de
~14kDa, cujas propriedades estruturais permitem classific-las como fosfolipases A2.
Algumas delas apresentam atividade enzimtica, (PLA 2 D49) enquanto outras, apesar de
apresentar estrutura molecular de fosfolipase, carecem dessa atividade (PLA 2 K49). Ambos os
tipos de fosfolipases A2 bsicas induzem mionecrose quando injetadas em animais de
laboratrio (Ponce-Soto et al., 2007; Lomonte, et al., 2003; Gutirrez e Ownby, 2003 e
Gutirrez, et al., 2008). Alm de induzir necrose muscular algumas destas miotoxinas
 4

apresentam outras atividades farmacolgicas, causando edema e ao anticoagulante. As

miotoxinas que foram mais bem caracterizadas so as dos venenos de Bothrops asper, B.
jararacussu, B. jararaca, B. newidi, B. pirajai, B. moojeni, B. marajoensis, B, pauloensis, B.
alternatus, B. brazili, conhecendo-se a seqncia de aminocidos de algumas delas, assim
como a sua estrutura cristalina (Kaiser et al., 1990; Cintra et al., 1993; Ponce-Soto et al.,
2007; Randazzo Moura et al., 2008; Calgarotto et al., 2008; Huancahuire-Vega et al., 2009).

1.2.5 Atividade neurotxica.

Estudos tm demonstrado que a peonha de veneno Botrpico pode apresentar efeitos
especficos sobre preparaes neuromusculares isoladas, induzindo bloqueio da resposta
muscular evocada, ou ainda produzir sinais de neurotoxicidade em preparao neuromuscular
biventer cervicis de pintainhos ex vivo.
Esses efeitos passaram a ser descritos a partir do estudo do veneno de Bothrops
jararacussu em preparaes neuromusculares de r (Rodrigues-Simioni et al., 1983)
revelando valiosas informaes a respeito de sua ao neurotxica. Isso se revelou, atravs de
estudos miogrficos e de eletrofisiologia sendo atribudo o efeito neurotxico PLA 2 K49
denominada Bothropstoxina I (BthTX-I). Atualmente tm sido reportadas vrias PLA2 de
diversas serpentes Botrpicas e Crotlicas com este tipo de efeito biolgico. Assim temos:
Ponce-Soto et al., (2007), Randazzo-Moura et al., (2008), Calgarotto et al., (2008).
As investigaes em relao aos efeitos locais do veneno botrpico demonstram
claramente que se trata de um quadro muito complexo em que participa e interage uma srie
de toxinas e onde se desencadeiam mecanismos endgenos. A figura 1 resume o exposto
anteriormente. Sem dvida, permanece um grande nmero de incgnitas em relao
patognese destes efeitos, o que constitui um desafio para a investigao toxinolgica.

1.3 Fosfolipases A2 (PLA2).

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) so enzimas que catalisam especificamente a hidrlise
da ligao acil-ster na posio sn-2 do 1,2 - diacil-3-sn fosfoglicerdeo em uma reao
dependente de clcio. (Magro et al., 2009).
As PLA2 tm papel fundamental no metabolismo de lipdeos e esto intimamente
relacionadas com a liberao de cido araquidnico, que um precursor de lipdeos bioativos
tais como prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, sendo que h evidncias de que estas
enzimas poderiam tambm atuar em respostas imunolgicas, inflamao, proliferao celular,
vasoconstrio (Hanada et al., 1995).
 5

Figura 1 Hiptese sobre o desenvolvimento dos efeitos locais induzidos por venenos botrpicos
(Gutirrez e Lomonte, 2003).

A superfamlia de enzima PLA2 atualmente compreende um nmero grande de

protenas diferentes, que podem ser divididas em cinco tipos principais de enzimas,
denominadas: PLA2 secretrias (sPLA2), PLA2 citoslicas (cPLA2), PLA2 Ca2+-independentes
(iPLA2), acetilhidrolases ativadoras de plaquetas (PAF-AH) e as PLA 2 lisossomais. A
atribuio das enzimas a um determinado grupo baseado no mecanismo cataltico
(His/Asp, Ser/Asp ou Ser/His/Asp hidrolase), assim como as suas
caractersticas funcionais e estruturais (Schaloske e Dennis, 2006).
As PLA2 secretrias (sPLA2) (Tabela 1), aonde esto classificadas as PLA 2 de veneno
de serpentes, so protenas pequenas (13-15 kDa), usualmente contm 7 pontes dissulfeto.
Este grupo de enzimas tem um resduo de histidina no stio ativo e requerem
indispensavelmente de Ca2+ (concentrao M) para a catlise. Na proximidade da histidina
cataltica tem um resduo de aspartato conservado. As PLA 2 de serpentes da famlia Viperidae
encontram-se classificadas no grupo IIA e esto subdivididas em dois subgrupos principais:
(1) PLA2 D49, as quais possuem um resduo de Aspartato na posio 49, tem alta atividade
cataltica e (2) PLA2 K49, com um resduo de Lisina na posio 49, so protenas com pouca
ou nenhuma atividade cataltica (Selistre de Arajo et al., 1996; Ownby et al., 1999; Six e
Dennis 2000).
 6

Ambos os tipos de protenas mostram similaridade significante em sua estrutura

tridimensional embora exibam propriedades farmacolgicas diferentes, o que as torna alvos
interessantes para muitas pesquisas (Magro et al., 2009).

Massa
Grupo Origem molecular Pontes
(kDa) dissulfeto
IA Corais verdadeiros 13-15 7
IB Pncreas humano/porcino 13-15 7
IIA Cascavis, sinovial humano 13-15 7
IIB Vboras Gaboon 13-15 6
IIC Testculo rato/murino 15 8
IID Bao/pncreas humano/murino 14-15 7
IIE tero/corao/crebro humano/murino 14-15 7
IIF Embrio/testculo humano/murino 16-17 6
III Humano/murino/lagartixa/abelha 15-18 8
V Macrfago/pulmo humano/murino 14 6
IX Veneno de aranha (conodipine-M) 14 6
X Leuccito/timo/bao humano 14 8
XII Murino/humano 19 7
XIII Parvovirus <10 0
XIV Bactrias/fungos simbiontes 13-19 2

Tabela 1. Fosfolipases A2 secretrias (sPLA2). Esta tabela tem sido adaptada de Six e Dennis, 2000.

1.4 Estrutura e funo das PLA2.

Sendo isoladas e sequenciadas mais de 100 PLA2 de veneno de serpentes, com umas
poucas excees, estas protenas so muito homlogas e contm desde 119 ate 130 resduos
de aminocidos. A maioria dos resduos conservados participa diretamente na catlise ou
ocupam posies sensveis estruturalmente. Os 14 resduos de cistena conservados formam
uma rede rgida de pontes dissulfeto que estabilizam a estrutura terciria (Magro et al., 2009).
A estrutura terciria das PLA2 de veneno de serpente altamente conservada (Fig. 2).
Est constituda por trs segmentos em alfa hlice (hlices 1, 2 e 3), alas e folhas beta. Os
resduos polares do stio cataltico (His48, Asp49, Asp99 e Tyr52) esto situados no interior de
duas -hlices (2 e 3). As PLA2 esto constitudas tambm por uma regio N-terminal,
representada pela -hlice 1 (resduos 1 12), em seguida est localizada uma curta hlice
(resduos 18 23). Entre os resduos 25 34 est o ala de ligao ao Ca 2+, seguido pela -
hlice 2 (resduos 40 55) a qual se liga folha -antiparalela (resduos 75 77 e 82 84).
 7

Finalmente est a -hlice 3 (resduos 90 107) que se liga regio ala C-terminal (resduos
108 113), que bastante flexvel. A presena de 7 pontes dissulfeto caracterstica das
PLA2 do grupo IIA (Magro et al., 2009).

-hlice curta
-hlice 1
N-terminal
Ala de
ligao ao
clcio

Ca2+ Duas folhas

-pregueadas

Ala C-
terminal
Stio
ativo

-hlice 3
-hlice 2

Figura 2. Representao em fita de uma PLA2 (isoforma CB1 da crotoxina B do veneno de

Crotalus durissus terrificus (PDB id: 2QOG) programa PyMol (DeLano, 2002). O on
Ca2+ representado como uma grande esfera preta.

Trs regies demonstram particularmente um alto grau de homologia na sequncia de

aminocidos, estas regies contribuem para a formao dos elementos estruturais secundrios
e tercirios: Hlice N-terminal (hlice 1), regio de ligao ao clcio e canal hidrofbico
(formado pelas hlices 2, 3 e pelo stio cataltico). Esta ltima regio se liga s caudas dos
cidos graxos dos fosfolipdios. As regies que mostram um menor grau de homologia
correspondem aos elementos estruturais menos restritos e provavelmente so as regies
responsveis pelos diversos efeitos farmacolgicos das PLA2 e venenos (Kini, 2003).
O maior aspecto estrutural das PLA2 uma plataforma definida por duas - hlices
longas e antiparalelas ligadas por duas pontes dissulfeto (canal hidrofbico). Estas duas
hlices no mostram um carter anfiptico claro, tendo as cadeias laterais dos aminocidos
hidroflicos geralmente expostos ao solvente e os aminocidos hidrofbicos apontando para o
ncleo da protena. Excees importantes incluem os aminocidos que formam a rede
cataltica (His-48, Asp-99 e Tyr-52) que esto situados nestas duas hlices.
 8

O clcio um cofator essencial na catlise e sua substituio por outros ons

bivalentes, resulta na perda desta atividade (Yu et al., 1993; Bonfim et al., 2006). A figura 3
ilustra o stio de unio a clcio, no qual o ction coordenado pelos tomos de oxignio do
carboxilato de Asp-99 e trs tomos de oxignio da cadeia principal, esta regio denomina-se
ala de ligao ao clcio (regio 25-33). Duas molculas de gua completam a esfera de
coordenao do on clcio formando uma bipiramide pentagonal. Uma ponte dissulfeto
(Cys27-Cys-44) segura correta orientao relativa da ala de unio a clcio em relao aos
aminocidos que formam a rede cataltica.

Figura 3: Representao esquemtica da ala de ligao do on clcio. (a) PLA 2 D49 cataliticamente
ativa; o on clcio mostrado com suas sete coordenaes. (b) Regio anloga na PLA 2 K49,
cataliticamente inativa, o tomo N da Lys49 ocupa a posio do on clcio formando duas pontes com
os tomos de oxignio da cadeia principal e uma ponte com uma nica molcula de gua (Ward et.al.,
1998).

Homlogos das PLA2 que ocorrem na natureza onde o resduo Asp49 (D49)
trocado por Lys (K49) (Maraganore et al., 1984; Francis et al., 1991; Ward et al., 1995), Ser
(Krizaj et al., 1991) ou Ala (Liu et al., 1991) no so cataliticamente ativos. A figura 3b
mostra a representao esquemtica do homlogo de PLA2 com Lys49 revelando que o seu
tomo N ocupa a posio do on clcio nas PLA 2 com Asp49 (Holland et al., 1990; Scott et
al., 1992; Arni et al., 1995; Ward et al., 1998).
O stio cataltico das PLA2 compreende os resduos His48, Tyr52, Asp99 e uma
molcula de gua. No mecanismo de catlise proposto (Fig. 4), O tomo N1 do resduo
His48 est estabilizado por uma ligao com o oxignio do resduo Asp99, que por sua vez
est ligada ao oxignio do resduo Tyr52; esta ligao esta totalmente conservada. O tomo
N1 do resduo His48 se comporta como uma base polarizando e retirando um prton da
molcula de gua, estruturalmente conservada, que participa da formao de um intermedirio
tetradrico. A molcula de gua promove o ataque nucleoflico ao carbono do grupo ster do
substrato Subseqentemente hidrlise da ligao acil-ster na posio sn-2 do
 9

fosfoglicerdeo (substrato), o prton doado pelo anel imidazlico para o oxignio que forma
ento o grupo lcool do lisofosfolipdeo a ser liberado e trs molculas de gua se deslocam
para dentro do sitio ativo (Verheij et al., 1980).

Figura 4. Representao esquemtica do mecanismo cataltico da PLA 2 (Janssen et. al. 1999).

O on clcio cataliticamente importante est ligado pelos oxignios da Tyr-28, Gly-30,

Gly-32 e pelo oxignio da cadeia lateral do Asp-49. No mecanismo da catlise, o clcio tem
dupla funo, fixar o fosfato e estabilizar a carga negativa do oxignio do grupo carbonil da
ligao ster da posio sn-2 do substrato (Yang, 1994).
Nas PLA2 K49 a substituio do resduo D49 por K49 afeta drasticamente a ligao do
Ca2+ s PLA2, justificando sua baixa ou inexistente atividade cataltica. Apesar da inatividade
cataltica as PLA2 K49 demonstram atividade ltica sobre membranas dependente de outros
mecanismos independentes da liberao do cido araquidnico (Selistre de Arajo et al.,
1996; Ownby et al., 1999; Magro et al., 2009).
At o presente um grande nmero de PLA 2 D49 e PLA2 homlogas K49 procedentes do
gnero Bothrops e Crotalus, tem sido reportadas. Embora exista muita semelhana entre esta
famlia de protenas; as diferencias em alguns resduos de aminocidos ao longo da cadeia
polipeptdica estabelecem a diferencia que torna a cada uma delas extremamente importante
pela particularidade estrutural que se v refletida na funo farmacolgica de cada uma
(Ponce-Soto et al., 2007; Calgarotto et al., 2008; Randazo-Moura et al., 2008; Gutirrez et
al., 2008; Huancahuire-Vega et al., 2009; Pereaez et al., 2009).

1.5 Ao biolgica das PLA2.

 10

As PLA2 de serpentes desencadeiam vrios efeitos farmacolgicos tais como:

neurotoxicidade pr e ps sinptica, miotoxicidade, atividade anticoagulante, hipotensiva,
hemoltica, hemorrgica, edematognica, entre outras (Kini, 2003: Gutierrez et al., 2008).
Esta diversidade de aes farmacolgicas deriva de um processo micro-evolutivo acelerado, a
travs do qual ocorre substituio de aminocidos nas regies moleculares localizadas
principalmente na superfcie destas molculas (Ponce-Soto et al., 2007; Randazo-Moura et
al., 2008).
Nas PLA2 D49, a maioria dos efeitos farmacolgicos produto da atividade
enzimtica, modificao dos resduos catalticos diminui tais efeitos, porm outras atividades
so mantidas, o que indica a existncia de regies diferentes ao stio cataltico, as quais
determinam suas atividades txicas e farmacolgicas (Soares et al., 2001a).
Nas PLA2 K49 homlogas, a substituio do resduo D49 por K49 afeta drasticamente
a ligao do Ca2+, justificando sua baixa ou inexistente atividade cataltica. Apesar da
inatividade cataltica as PLA2 K49 homlogas demonstram atividade ltica sobre membranas
dependente de outros mecanismos independentes da liberao do cido araquidnico (Selistre
de Arajo et al., 1996; Ownby et al., 1999; Magro et al., 2009).
Segundo Lomonte et al., (2003) estas PLA2 K49 homlogas poderiam se ligar a
determinados stios com uma carga parcial negativa que poderia servir de ancoragem para as
PLA2. Unidas assim membrana celular, poderiam gerar uma desorganizao da membrana
levando alterao na permeabilidade e consequente destruio celular devido
preferencialmente desorganizao celular mais do que pela toxicidade da PLA2.
Kini, (2003) afirma que as PLA2 procedentes de veneno de serpentes possuem uma
habilidade de se unir a um stio especfico, devido sua alta afinidade de se ligar a
protenas especficas que atuam como receptores. Essa ligao especfica de PLA2 se dispe
pela presena de um stio farmacolgico em sua superfcie, que independente do stio
cataltico.
A interao da alta afinidade da PLA2 com seu receptor (protena alvo) deve-se
provavelmente complementaridade de carga, hidrofobicidade e foras de Van der Walls, que
se d entre o stio farmacolgico e o stio alvo na superfcie do receptor protico. A
identificao dos stios farmacolgicos tem o potencial para a explorao no desenvolvimento
de novos sistemas teis, devido ao amplo espectro de especificidade em tecidos e rgos, para
o direcionamento de protenas especficas a um tecido alvo particular ou rgo (Ponce-Soto
et al., 2007; Randazo Moura et al., 2008).
 11

1.6 Miotoxinas PLA2.

As miotoxinas PLA2 so os componentes txicos principais e mais abundantes nos
venenos de serpentes da famlia Viperidae. O modo de ao das PLA 2 miotxicas K49 e as
D49 no msculo ocorrem por vias diferentes, mas no geral podem causar lise rpida do
sarcolema e um rpido estado de mionecrose (Fletcher et al., 1996). Essas miotoxinas PLA2
tambm se caracterizam pelo seu forte carter associativo em dmeros, que a forma mais
comum de polimerizao encontrada para as PLA2 miotxicas e, eventualmente, em
tetrmeros. Estas associaes so principalmente dependentes de resduos de tirosina (Y)
(Arni e Ward, 1996; Bonfim et al, 2006).
As miotoxinas PLA2 isoladas at o presente momento so molculas compactas,
estveis s variaes de temperatura, pH, concentrao salina alta e na presena de solventes
orgnicos. Devido a estas caractersticas, no se desnaturam em condies usuais de trabalho,
durante os processos de purificao e testes biolgicos (Gutierrez e Lomonte, 1995). Estas
caractersticas so acentuadas principalmente quando as PLA 2 se encontram associadas, por
exemplo, em dmeros, o que comum com as PLA2 K49 homlogas.
As PLA2 miotoxicas que foram caracterizadas so as dos venenos de Bothrops asper,
B. jararacussu, B. jararaca, B. newidi, B. pirajai, B. moojeni, B. marajoensis, B, pauloensis,
B. alternatus, Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus, Crotalus durissus
ruruima, etc. conhecendo-se a sequncia de aminocidos de algumas delas, assim como a sua
estrutura cristalina (Kaiser et al., 1990; Cintra et al., 1993; Ponce-Soto et al., 2007; Calgarotto
et al., 2008; Randazzo Moura et al., 2008).
A pesar de suas diferenas na atividade enzimtica, PLA2 D49 e K49 so miotxicas,
implicando dois mecanismos de ao diferentes. Miotoxinas PLA2 D49 dependem de sua
habilidade cataltica para produzir necrose nas fibras musculares (Gutirrez e Ownby, 2003).
Em contraste, as PLA2 K49 miotxicas, catalticamente inativas, utilizam como principal
determinante de toxicidade um stio que abrange os resduos 115-129 na regio C-terminal, o
qual inclui uma combinao varivel de resduos catinicos e aromticos/hidrofbicos
(Lomonte et al., 2003). Existem evidencias de que ambos os tipos de miotoxinas alteram a
permeabilidade da membrana plasmtica e iniciam uma srie de eventos degenerativos cujos
mecanismos moleculares envolvidos ainda esto pobremente caracterizados (Montecucco et
al., 2008).
Uma vez produzida a leso da membrana plasmtica, ocorre uma entrada macia de
clcio, o que gera pequenas alteraes na membrana plasmtica, denominadas leses delta,
hipercontrao dos miofilamentos, alteraes mitocondriais, ruptura das membranas e
 12

formao de densidades floculentas que resultam da aglomerao de protenas da membrana

interna da mitocndria. (Gutirrez e Ownby, 2003). O desarranjo dos componentes
fosfolipdicos ocasiona severas alteraes na integridade estrutural e funcional das
membranas plasmticas, com conseqente influxo de ons Ca2+, acarretando a liberao de
proteases dependentes de Ca2+, ativao de PLA2 endgenas e o colapso mitocondrial. A
somatria de todas essas alteraes poderia resultar em morte celular. As diferentes
miotoxinas PLA2 induzem um padro similar de alteraes morfolgicas, independentemente
de apresentarem atividade enzimtica (Gutirrez e Ownby, 2003). A Figura 5 mostra um
resumo da hiptese para o mecanismo de ao celular das miotoxinas PLA2.

Figura 5 Hiptese sobre o mecanismo de ao das fosfolipases A2 miotxicas do veneno de Bothrops

sp. (Gutierrez e Lomonte, 2003).

1.7 Neurotoxinas PLA2.

As neurotoxinas PLA2 so neurotoxinas pr-sinpticas ( neurotoxinas), as quais
inibem o processo de liberao da acetilcolina. As neurotoxinas PLA2 so caracterizadas pela
presena da atividade PLA2 e tem sido encontradas nos venenos de serpentes das famlias
Elapidae, Crotalidae e Viperidae, como exemplo, MiDCA1 uma neurotoxina PLA2 isolada
de veneno de Micrurus dumerilii carinicauda que produz bloqueio neuromuscular em
preparaes neuromusculares de vertebrados. (Dal Belo et al., 2005).
Interessantemente, existem algumas neurotoxinas pr-sinpticas com estrutura de
PLA2, mas desprovidas de atividade enzimtica. o caso da BaTX, uma PLA 2 K49 isolada de
veneno de B. alternatus caracterizada como uma neurotoxina pr-sinptica em preparaes
 13

neuromusculares ex vivo, cuja atividade neurotxica no esta diretamente correlacionada a sua

atividade enzimtica e a subseqente hidrlise de fosfolipdios de membrana (Ponce-Soto et
al., 2007; 2009). De maneira similar comportam-se varias outras PLA 2 K49 homlogas
isoladas de venenos botropicos (Gallacci e Cavalcante, 2010).
Estudo dos detalhes da estrutura qumica tem revelado uma inesperada interrelao
entre estrutura e funo. O bloqueio do processo fisiolgico uma situao vital a ser
abordada assim como o conhecimento do sitio responsvel e o mecanismo de ao a nvel
molecular. Assim, a ao neurotxica no s se confina no nervo motor terminal, pois as
pesquisas recentes tm mostrado esta ao em diferentes preparaes nervosas (Gallacci e
Cavalcante, 2010). Na conduo axnica, as neurotoxinas podem bloquear
canais, alterando o movimento de ons, principalmente ons Na + e K+. Na
transmisso sinptica, as neurotoxinas podem tambm agir, impedindo a
liberao do neurotransmissor ou ligando-se aos receptores nicotnicos e,
dessa forma, impedindo a ao da acetilcolina (ACh), sobre os receptores
nicotnicos da placa motora (Pungercar e Krizaj, 2007).

1. 8 Modificaes qumicas das PLA2.

As relaes estrutura-funo de vrias PLA2 provenientes de venenos de serpente tm
sido pesquisadas extensamente. Com objetivo de elucidar estruturalmente os stios
responsveis da toxicidade tem-se utilizado vrias metodologias, tais como modificaes
qumicas, mutaes sitio-dirigidas, tcnicas cristalogrficas, espectrofotomtricas e
fluoromtricas, assim como ressonncia magntica nuclear e estudos da ao de inibidores e
substratos naturais ou artificiais (Soares e Giglio, 2003). As modificaes qumicas
tradicionais tm sido uma das principais estratgias usadas para estudar suas relaes
estrutura-funo (Tabela 2).
A contribuio de uma variedade de reagentes muito especficos tem sido usados para
modificar quase todos os grupos funcionais presentes nas PLAs, obviamente o fim principal
destes estudos apontar com preciso aos resduos do sitio ativo para obter uma viso do
mecanismo de ao da PLA2.

Resduo de Reagente/reao
aminocido
His p-Bromophenacil bromide (BPB)/alquilao
Metil-p-nitrobenzenosulfonato/metilao
Lys Cianeto de potssio/carbamilao
 14

o-Metilisoureia/guanidinao
Acido actico anidro/acetilao
Trinitrobenzenosulfonato (TNBS)/trinitrofenilao
Tyr Nitrobenzeno sulfonil fluoride (NBSF)/sulfonao
Trp Nitrofenil sulfonil cloride (NPSC)/sulfonao
2-Hidroxi-5-nitrobenzil bromide/alquilao
Met Cloramina T/oxidao
Acido iodoactico/carboximetilao

Tabela 2. Estratgias para modificaes qumicas de resduos de aminocidos especficos em PLA 2

miotxicas de venenos de serpentes.

um fato comum que as PLA2 de veneno de serpente mostraram uma ampla

variedade de atividades farmacolgicas, tal diversidade funcional dentro desse grupo de
protenas estruturalmente similares cria interrogaes concernentes relao entre sua
estrutura e sua funo. Uma aproximao para esclarecer a relao entre a atividade
enzimtica e toxicidade atravs dos estudos de modificao seletiva ou preferencial dos
grupos de cadeia lateral de aminocidos na molcula de enzima PLA 2 e tambm comparar os
efeitos farmacolgicos destas modificaes (Verheij, 1981; Yang, 1997).

1.9 Ferramentas moleculares.

O isolamento e estudo dos componentes individuais de veneno de serpentes preparam
o caminho para compreender melhor a patofisiologia do envenenamento, contribuindo
potencialmente para melhorar as modalidades teraputicas na clnica e tambm abre
possibilidades para a descoberta de toxinas modernas que poderiam ser teis como
ferramentas em processos moleculares de importncia biomdica, assim como a descoberta de
novos frmacos de uso clnico (ngulo e Lomonte, 2009).
O veneno de serpente uma fonte rica de componentes naturais com alta afinidade e
seletividade para um mbito diverso de alvos biolgicos, especialmente protenas de
membrana como canais de ons, receptores e transportadores (Lewis e Garcia, 2003). A alta
potencia e especificidade de muitas protenas derivadas de veneno, assim como a facilidade
de sua sntese qumica e/ou produo recombinante e a resistncia degradao proteoltica,
so atributos que fazem destas protenas atrativas para o desenvolvimento de frmacos
modernos (Harvey, 1995).
J na dcada de 1970 o frmaco anti-hipertensivo captopril foi desenvolvido a partir
de um peptdeo isolado da serpente brasileira B. jararaca (Cushman e Ondetti, 1991).
 15

Recentemente vrios novos frmacos tm surgido a partir da descoberta de toxinas de veneno

de serpentes como a integrilina, isolada de Sistrurus miliarus barbouri, a qual inibe a
agregao plaquetria sendo usada na angioplastia coronria; a defibrase, isolada de B.
moojeni, inibe a ao da trombina e protrombina, usada no infarto cerebral agudo e na
angina peitoral; a hemocoagulase, isolada de B. atrox, utilizada na preveno e tratamento da
hemorragia; a reptilase, isolada de B jararaca, usada no diagnstico de desordens da
coagulao sangunea (Fox e Serrano, 2008). Estes e vrios outros frmacos encontram-se em
diferentes etapas de desenvolvimento pr-clnico ou clnico.

1.10 Porthidium hyoprora.

De um modo geral, pouco conhecido da serpente P. hyoprora, inicialmente descrita
por Amaral (1935), espcie venenosa que pertence famlia Viperidae, amplamente espalhada
na regio da Amaznia de Brasil, Equador, Peru e Colmbia (Campell e Lamar 2004).
Reportes clnicos e epidemiolgicos de envenenamento pelos gneros Bothrops,
Porthidium e Botriechis mostraram que as atividades edematognicas,
hemorrgicas e miotxicas do veneno de P. hyoprora foram similares s
espcies Bothrops (Campos et al., 1999; Otero et al., 2002). Alguns
pesquisadores preferem usar o termo envenenamento botrpico devido
a que as manifestaes clnicas produzidas pelos venenos destas espcies
so similares.
A caracterizao bioqumica e farmacolgica de muitas PLA 2 de venenos botrpicos e
crotlicos tem sido documentada, entretanto, no existe informao acerca de PLA2 do veneno
de P. hyoprora. Assim, estudos farmacolgicos envolvendo PLA 2 purificadas a
partir do veneno de P. hyoprora so necessrios, uma vez, que estas
toxinas so os principais componentes do veneno responsveis pela
necrose muscular e respostas inflamatrias nos envenenamentos
(Gutirrez e Lomonte, 1997; Kini, 2003).

2. OBJETIVOS.
2.1 Objetivo geral.
O objetivo geral deste projeto foi purificar, caracterizar bioqumica e
farmacologicamente as PLA2 PhTX-I e PhTX-II apartir do veneno de P. hyoprora. Entender
 16

as relaes estrutura-funo da PLA2 PhTX-I, atravs de modificaes qumicas de resduos

de aminocidos especficos.

2.2 Objetivos especficos.

Purificar as PLA2 PhTX-I e PhTX-II a partir do veneno de P. hyoprora a travs de
cromatografia de alta eficincia (HPLC) de fase reversa.
Caracterizar bioqumicamente as PLA2 PhTX-I e PhTX-II a travs de:
- Eletroforese em SDS-PAGE
- Atividade Fosfolipsica A2 e cintica enzimtica.
- Anlise de composio de aminocidos.
- Determinao da massa molecular por espectrometria de massas Maldi-tof e
electrospray (ESI).
- Anlise da estrutura secundria por espectropolarimetria de dicrosmo circular (CD).
- Determinar a estrutura primria atravs de espectrometria de massas em tandem ESI-
CID-MS/MS.
Caracterizar biologicamente o veneno total e as PLA2 PhTX-I e PhTX-II a travs de:
- Neurotxicidade ex vivo na preparao neuromuscular biventer cervicis de pintainho.
- Miotoxicidade local e sistmica in vivo em camundongos a travs dos nveis sricos
de CK plasmticos.
- Atividade edematognica in vivo em camundongos a traves da avaliao do aumento
do volume da pata inoculada com as PLA2 em comparao com um controle.
- Determinao da atividade citotxica in vitro sobre cultura celular de mioblastos e
miotubos C2C12.
- Avaliao do efeito sistmico in vivo sobre a concentrao de interleucina 6 (IL-6)
plasmtica.
Realizar modificaes qumicas nos resduos His, Lys Tyr e Trp na PLA 2 PhTX-I e
avaliar os efeitos de tais modificaes sobre as suas propriedades enzimticas,
farmacolgicas e estruturais.

3. MATERIAIS E MTODOS.
3.1 Veneno e reagentes.
O veneno foi gentilmente cedido pela professora Corina Vera Gonzles, do Instituto de
Biomedicina y Biotecnologia de Arequipa Per. Todos os solventes, produtos qumicos e
 17

reagentes utilizados so de grau HPLC, grau seqncia ou de alto grau de pureza, obtidos da
Sigma, Aldrich Chemicals, Merk e Bio Rad.

3.2 Animais.
Para os ensaios biolgicos, foram utilizados camundongos machos Swiss (18 a 20g) e
pintainhos HY-Line W36 de 4 a 8 dias, obtidos do Biotrio Central da Unicamp, mantidos a
24-28oC com alimentos e gua ad libitum. Todos os ensaios biolgicos foram feitos com
autorizao da Comisso de tica para a Experimentao Animal (CEEA-IB-UNICAMP
protocolo no 1860-1).

3.3 Purificao das PLA2 em HPLC de fase reversa.

O sistema cromatogrfico usado foi o HPLC - PDA 991 (Waters), equipado com duas
bombas Waters modelo 510/B, um injetor automtico de amostras U6K com um loop de
200L e uma coluna -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Waters), previamente equilibrada com
cido trifluoroactico 0,1%, (v/v) (tampo A) pH 3,5. Brevemente, 5mg de veneno total foram
dissolvidas em 200l de TFA 0,1%, a soluo obtida foi centrifugada para clarificao e o
sobrenadante aplicado na coluna. As protenas foram eludas usando-se uma gradiente linear
contnua (0-100%) do tampo B (acetonitrila 66,5%, TFA 0,1%). O fluxo foi mantido
constante a 1ml/min e monitorado a 280nm. As fraes obtidas foram liofilizadas e
armazenadas a -20oC.

3.4 Eletroforese em SDS-PAGE.

A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada seguindo-se a metodologia
descrita por Laemmli (1970). As placas de poliacrilamida foram feitas de modo descontnuo
apresentam um gel de concentrao de 5% e um gel de corrida de 12,5%. As placas foram
preparadas utilizando-se uma soluo de acrilamida estoque. O gel de concentrao a 5% foi
preparado utilizando-se o tampo Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 e o gel de corrida foi feito
utilizando-se o tampo Tris-HCl 1,0M, pH 8,8. Em ambos os gis foram acrescentados 0,1%
(v/v) de SDS 20%.
A eletroforese PAGE-SDS foi realizada em um sistema duplo de mini placas SE 250
Mighty Small II (Hoefer Scientific Instruments). As amostras e os marcadores de massa
molecular foram dissolvidos em tampo de amostra (Tris-HCl, 0,075M, pH 6,8; 10% de
glicerol; 4% de SDS; 0,001% de bromofenol). A corrida eletrofortica foi realizada a 30 mA.
 18

Os gis foram corados com soluo de Coomassie Blue 0,05% a 37C, o excesso de corante
removido em cido actico 7%.

3.5 Atividade Fosfolipsica A2.

A determinao da atividade PLA2 foi realizada segundo o mtodo descrito por Cho e
Kzdy (1991), Holzer e Mackessy (1996) e adaptado para microplaca (Ponce-Soto et al,
2007).
A mistura para o ensaio conteve 200l de tampo (Tris-HCl 10mM, CaCl 2 10mM e
NaCl 100mM pH 8), 20l do substrato cromognico cido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzico
(NOAB), 20 l de gua ou 20l de amostra (PLA 2), em volume final de 260l. Aps a adio
de 20l das PLA2 em teste, a mistura foi incubada por 40 minutos a 37oC e as absorbncias
foram lidas a intervalos de 10 minutos. A atividade enzimtica expressa como a velocidade
inicial da reao (Vo) foi calculada baseada no aumento da absorbncia aps 20 minutos. O
ensaio foi realizado em triplicata, monitorando a formao do produto cido 4-nitro-(3
hidroxi) benzico (cromforo), lendo-se a absorvncia a 425nm em um VERSA Max
microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Uma unidade enzimtica (UE) foi
definida como a quantidade de enzima necessria para formar 1nmol de produto por minuto.

3.6 Estudos cinticos.

3.6.1 Efeito do pH na atividade PLA2.
Os ensaios do efeito do pH sobre a atividade PLA 2 foram realizados em meios de
reao preparados com diferentes valores de pH (4-10). Para cada pH foi feito um controle e a
determinao da atividade PLA2 foi feita conforme ao item 3.5. Os tampes utilizados nos
experimentos foram: tampo Citrato de sdio pHs 4, 5 e 6, tampo Tris-HCl pHs 7 e 8,
tampo Glicina pHs 9 e 10.

3.6.2 Efeito da temperatura na atividade PLA2.

Para determinao da temperatura tima, estudamos a atividade PLA2 em meios de
reao de 25, 30, 35 37, 40 e 45oC. A atividade enzimtica foi determinada conforme ao item
3.5.
 19

3.6.3 Efeito da concentrao do substrato na atividade PLA2.

Este ensaio foi feito variando-se a concentrao do substrato cromognico NOAB. As
concentraes utilizadas so: 40, 20, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,2 e 0,1mM. A metodologia utilizada
foi conforme ao item 3.5.

3.6.4 Efeito de ons divalentes na atividade PLA2.

A atividade das PLA2 foi estudada na presena dos ons divalentes: Mg +2, Mn+2, Cd+2 e
Zn+2. Para a preparao dos tampes, foram usados sais dos respectivos metais e a
determinao da atividade PLA2 foi feita conforme ao item 3.5.

3.6.5 Estudos de inibio enzimtica.

Foi avaliado o efeito inibitrio da heparina de porco (Mr 6,000) e EDTA sobre a
atividade enzimtica das PLA2. Os ensaios foram realizados incubando a heparina com as
toxinas em proporo molar de 2:1 ou com EDTA 1mM durante 30 min a 37C, a
determinao da atividade PLA2 foi feita conforme ao item 3.5.

3.7 Anlise de aminocidos.

A anlise de aminocidos das PLA2 foi realizada no analisador automtico de
aminocidos PICO TAG (Sistema Waters) seguindo a metodologia descrita por Henrikson e
Meredith (1984). Os aminocidos derivatizados (PTC aminocidos) das amostras foram
identificados, em uma coluna de fase reversa, de acordo com o tempo de reteno dos PTC-
aminocido padro. Para estimativa da composio global, a anlise de composio de
aminocidos foi realizada de acordo com mtodo descrito por Ponce-Soto, et al., (2007).

3.8 Determinao da massa molecular por espectrometria de massas Maldi-tof

A massa molecular das PLA2 nativas e alquiladas foi analisada por espectrometria de
massas utilizando-se um Voyager DE PRO MALDI TOF mass spectrometry (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), equipado com um laser de nitrognio (337nm, pulso 4
ns). Em seguida, 1 l das amostras em TFA 0,1% foi misturada em 2 l da matriz de cido
sinapnico (cido 3, 5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic). A matriz foi preparada com 30% de
acetonitrila e 0,1% de TFA. As massas foram analisadas sob as seguintes condies:
acelerao de voltagem 25 kV o laser ajustado a 2890 mJ/com 2 em 300 ns e modo de analise
linear (Ponce-Soto et al., 2006).
 20

3.9 Determinao da estrutura primria.

3.9.1 Reduo e alquilao.

As protenas (PLA2) liofilizadas purificadas em HPLC de fase reversa foram re-

suspendida em ureia 8M contendo DTT 10mM a pH 8 e incubada a 37 oC por duas horas para
reduo das pontes dissulfeto. Iodoacetamida foi utilizada para alquilar o grupo tiol livre a
partir dos resduos de cistena reduzidos. Apoiados em experimentos prvios foi escolhido um
excesso molar em 30% de iodoacetamida em relao ao nmero total de tiis. A mistura foi
incubada por 1,5 horas a 37oC em escurido. A reao foi parada injetando a mistura em uma
coluna de HPLC de fase reversa seguida de liofilizao dos picos coletados.

3.9.2 Hidrlise enzimtica.

As protenas purificadas foram hidrolisadas com tripsina pancretica bovina de grau
sequencia em bicarbonato de amnio 0,4% pH 8,5 durante 4 horas a 37 oC em uma proporo
enzima: substrato de 1:100 (v/v). A reao foi parada por liofilizao.

3.9.3 Espectrometria de massas em tandem.

Espectrometria de massa em tandem ESI-CID-MS/MS foi realizada usando um
espectrmetro de massas hbrido quadrupole-time of flight (Q-TOF, Micromass Manchester,
UK), equipado com uma fonte de nano spray operando em modo de ionizao positivo. As
condies de ionizao foram: voltagem capilar de 2,3kV, um cone voltagem e lentes RF1 de
30 e 100V, respectivamente, e uma energia de coliso de 10eV. A temperatura da fonte foi
70oC e o cone do gs foi N 2 a um fluxo de 80 l/h; no foi utilizado gs nebulizador para obter
o spray. Gs argnio foi utilizado para fragmentao de ons. Foi realizada calibrao externa
com iodeto sdico em uma faixa de massas a partir de 50 at 3000 m/z. Todos os espectros
foram adquiridos com o analisador TOF em modo Vmode (TOF kV=9,1) e voltagem MCP
a 2150V.

3.9.4 Sequenciamento de novo dos peptdeos trpticos.

Peptdeos trpticos alquilados a partir das PLA 2 foram separados em HPLC de fase
reversa , coletados manualmente, liofilizados e re-suspendidos em 20% de acetonitrila e 0,1%
de TFA.
Cada peptdeo foi introduzido por separado na fonte do espectrmetro de massa com
uma seringa a um fluxo de 500 nl/min-1. Ante de realizar os espectros de massa em tandem foi
 21

adquirido um espectro ESI/MS (modo TOF MS) para cada pico obtido do HPLC de fase
reversa na faixa de 4002000 m/z para selecionar os ons de interesse. Posteriormente esses
ons foram fragmentados em uma clula de coliso (modo TOF MS/MS). Diferentes energias
de coliso foram utilizadas dependendo do estado de carga e massa dos ons. Os espectros
resultantes foram adquiridos no analisador TOF e resolvidos usando o software MassLynx-
MaxEnt 3 algorithm. Espectros com uma carga s foram processados manualmente usando o
aplicativo PepSeq includo no MassLynnx.

3.10 Modificaes qumicas da PLA2 PhTX-I.

3.10.1 Alquilao de histina com 2,4-Dibromoacetophenone (BPB).
A modificao qumica no resduo de Histidina com BPB foi executada usando
tampo Tris-HCl. Brevemente, 3mg da toxina foi dissolvida em 1 ml de tampo Tris-HCl 0.1
M pH 8.0 contendo 0.7 mM de EDTA e 150l de BPB (1,5 mg/ml em etanol). A mistura foi
incubada por 24 h a 25 C. A protena foi separada do reagente por ultrafiltrao atravs de
uma membrana Amicom YM-3 e lavada com gua ou bicarbonato de amnio 0.05 M pH 8.0,
seguido por liofilizao (Diaz-Oreiro e Gutirrez, 1997).

3.10.2 Acetilao de lisina com anidro actico (AA).

A modificao qumica de resduos de lisina foi executada a uma relao molar
protena:reagente de 1:50. A protena (3 mg) foi dissolvida em 1.5 ml de Tris-HCl 0.2 M, pH
8.0, e adicionado 10 l de anidro actico (Merck, U.S.A.). O pH foi ajustado novamente
para pH 8.0 com NaOH aps a adio do anidro actico. Depois de 1 h de incubao a 25 C,
a protena foi separada do reagente por ultrafiltrao atravs de uma membrana Amicom YM-
3 e lavada com gua ou bicarbonato de amnio 0.05 M pH 8.0, seguido por liofilizao (Diaz-
Oreiro e Gutirrez, 1997).

3.10.3 Sulfonilao de tirosina com 4-Nitrobenzenesulfonil fluoride (NBSF).

Os resduos de tirosina foram modificados com NBSF essencialmente de acordo com
o procedimento descrito por Liao et al. 1982. Um micromol de enzima PLA 2 em 14 ml de
tampo Tris-HCL 0.1 M pH 8.0 foi incubado com 9 mol de NBSF. A reao foi realizada a
25 C por 1 h e a mistura foi rapidamente separada, tirando o excesso de reagente por
ultrafiltrao atravs de uma membrana Amicom YM-3 e lavada com gua ou bicarbonato de
amnio 0.05 M pH 8.0, seguido por liofilizao.
 22

3.10.4 Sulfonilao de triptofano com 2-Nitrobenzenesulfonil cloride (NPSC).

Modificao de resduos de triptofano foi realizada segundo Takasaki et al. 1990.
Brevemente, 9 mg de protena foram dissolvidos em 4 ml de cido actico 50% contendo 1
mg de NPSC e incubados por 1 h a 25 oC. A mistura foi rapidamente separada, tirando o
excesso de reagente por ultrafiltrao atravs de uma membrana Amicom YM-3 e lavada com
gua ou bicarbonato de amnio 0.05 M pH 8.0, seguido por liofilizao.

3.11 Determinao da massa molecular das protenas modificadas por espectrometria

de massas Electrospray (ESI).
Uma aliquota de cada proteina (4.5 l) foi injetada em uma coluna C18 UPLC de fase
reversa (nanoAcquity UPLC, Waters) acoplada com um sistema de espectrometria de massas
em tndem nano-electrospray em um espectrmetro de massa Q-Tof Ultima API
(MicroMass/Waters) a um fluxo de 600nl/min. A gradiente foi de 0-50% de acetonitrila em
acido frmico 0.1% durante 45 min. O instrumento foi operado em modo MS contnuo e a
aquisio de dados foi de 100-3000 m/z a velocidade de 1s e um delay de 0,1s. Os espectros
foram acumulados cerca de 300 scans e os mltiplos dados carregados produzidos pelo
espectrmetro de massa na escala m/z foram convertidos para escala de massa (massa
molecular) usando o software Maxium Entropy fornecido com o pacote Masslynx 4.1. Os
parmetros de processamento foram: faixa de massa de sada 6000-20000 Da com resoluo
de 0.1 Da/canal; a proporo de intensidade mnima entre picos sucessivos 20% (esquerdo e
direito). O espectro deconvolucionado foi ento suavizado (canais 2x3, Savitzky Golay
smooth) e os valores de massa obtidos usando o 80% do topo do pico e a largura mnima do
pico a meia altura de quatro canais.

3.12 Espectropolarimetria de dicrosmo circular (CD).

Os experimentos de CD foram realizados em um espectropolarmetro J-720 (JASCO),
acoplado a um sistema interno de controle de temperatura (Peltier Type Control System PFD
425 JASCO) e controlador externo de temperatura (NESLAB RTE Series NESLAB). As
cubetas de quartzo usadas possuiram caminho tico de 1mm ou 0,1mm e as protenas
suficientemente para fornecer um sinal em 222nm entre -20 e -40 mDeg. A determinao da
concentrao de protenas foi realizada pelo mtodo de Edelhock (1967). Os programas
utilizados para o registro e tratamento dos dados so o Spectra Manager (JASCO) e o
 23

Origin (Microacl) respectivamente. Os espectros CD foram normalizados em elipticidade

molar residual (EMR) ou [] pela aplicao da seguinte equao:
EMR= x MM
10 x C x l x n
Onde a elipticidade (mDeg), MM a massa molecular (g/mol), C a concentrao da
protena (mg/ml), l o comprimento de caminho tico (cm) e n o nmero de resduos de
aminocidos da protena. Os dados de EMR so representados em funo de (nm).

3.13 Espectros de dicrosmo circular

Os espectros de CD foram coletados em temperatura ambiente. Os espectros de CD
em ultravioleta distante iniciavam em 260nm e cobrem at a banda na qual a voltagem do
detector atingisse o limite de 700 Volts. Bandas com voltagens superiores, porventura
coletadas, ocasionadas por sal ou excesso da protena foram descartados dos espectros
analisados. Espectros cumulativos de 20 coletas (velocidade de coleta = 100nm/min e tempo
de resposta do detector de 1 segundo) foram analisados como descrito acima, aps subtrao
do espectro do respectivo tampo (Fosfato de sdio 10mM, pH 8) acumulado 10 vezes. A
porcentagem de estrutura secundria do tipo -hlice, folha -pregueada e estrutura
randmica foi calculada com o auxilio do programa CDNN Deconvolution (Verso 2
Bioinformatik.biochemtech.uni-halle.dee/cdnn). Este programa compara o espectro de CD
normalizado em EMR com um banco de dado de 13, 23 ou 33 espectros em EMR de
protenas cuja estrutura em alta resoluo determinada (Corra et al., 2009).

3.14 Determinao das atividades farmacolgicas.

3.14.1 Medida da atividade neurotxica em msculo biventer cervicis de pintainho.
Os animais foram anestesiados com alotane e sacrificados por desangramiento. O
msculo biventer cervicis foi removido e montado sob uma tenso de 0,5 g em 5 ml de banho
rgo (Automatic organ multiple-bath LE01 Letica Scientific Instruments. Barcelona, Spain)
a 37 0C contendo soluo Krebs (pH 7.5) areada (95% O2 - 5% CO2) da seguinte composio
(em mM): NaCl 118.7, KCl 4.7, CaCl2 1.88, KH2PO4 1.17, MgSO4 1.17, NaHCO3 25.0 e
glucose 11.65.
 24

Para a contratura foi aplicada exogenamente Acetilcolina (ACh; 110 M por 60s) e
KCl (20 mM por 130s), foi obtido na ausncia da estimulao de campo, antes da adio das
toxinas PLA2 nas concentrao finais de 0,7 e 1,4M e do veneno total (20g/ml).
Um eletrodo bipolar de anel de platino foi colocado ao redor do tendo o qual recorre
o msculo inervado. Estimulao indireta realizada com um Estimulador (MAIN BOX LE
12404 Panlab s.l. Powerlab AD Instruments Barcelona, Spain) sob as seguintes condies: 0.1
Hz, 0.2 ms, 3-4 V.
Contraes musculares e contraturas foram registradas isometricamente por
trasductores de fora (Modelo MLT0201 Force transducer 5mg-25g Panlab s.l. AD
Instruments Pty Ltd. Spain) ligado a um PowerLab/4SP (OUAD Bridge AD Instruments,
Barcelona, Spain) Ponce-Soto et al., (2007).

3.14.2 Determinao dos nveis de CK plasmticos em camundongos inoculados por via

intramuscular (miotoxicidade local) e intravenosa (miotoxicidade sistmica).
Para a determinao das atividades miotxica local e sistmica induzidas a partir da
exposio s PLA2 e ao veneno total, grupos de 4 camundongos (18 a 20g) receberam
injees intramusculares (msculo gastrocnmio) e intravenosas (veia da cauda)
respectivamente, de quantidades variadas das PLA2 e do veneno total dissolvidas em 50l de
tampo PBS, sendo que o grupo controle recebe apenas PBS.
Aps a aplicao das toxinas, em intervalos de tempo (1, 3, 6, 9 e 24 horas), amostras
de sangue foram coletadas da cauda em capilares heparinizados e o plasma removido para a
determinao dos nveis plasmticos de creatina-quinase (CK) (Gutirrez et al., 2008).
Esta atividade enzimtica foi medida atravs do ensaio cintico utilizando o kit CK
NAC UV unitest (Wiener lab.), assim, 200 l do substrato reconstitudo foram pr-incubados
por 4 minutos a 37oC, logo foram acrescentados 5 l de plasma obtido por centrifugao do
sangrado da cauda do camundongo. A mistura foi incubada por 6 minutos, registrando as
leituras dos minutos 3, 4, 5 e 6. A diferena mdia de absorbncia por minuto (A/min) foi
determinada, diminuindo-se cada leitura da anterior e tirando-se a mdia dos valores. A mdia
foi multiplicada pelo fator 8095 (Kit de CK Winer lab). As leituras foram feitas a 340 nm,
monitorando a formao do produto NADPH (A atividade da CK monitorada atravs de 3
reaes acopladas onde o produto final o NADPH). A atividade foi expressa em U/L,
definida como a fosforilao de 1 mmol de creatina/min a 25oC.
 25

3.14.3 Determinao da atividade edematognica (edema de pata).

Para a determinao da atividade edematognica ocasionada pelas toxinas PLA 2 e pelo
veneno total, grupos de 4 camundongos (18-20 g) receberam injees subcutneas na pata
direita. Veneno total (1g) e as PLA2 (1g) foram dissolvidos em 50 l de tampo PBS e
inoculados no coxim plantar da pata direita do camundongo; a pata esquerda recebeu 50 l de
PBS como controle.
O volume de pata foi avaliado com um Pleistmetro (Modelo 7140 Plethysmometer
Ugo Basile, E.U.A.), imediatamente antes da injeo (basal) e aps intervalos de tempo (0.5,
1, 3, 6, e 24h). A atividade edematognica foi expressa como porcentagem do aumento de
volume da pata direita em comparao pata esquerda (controle). A frmula para calcular a
porcentagem de edema foi =[(Tx x 100)/To - 100], onde Tx o edema (volume) medido a
cada intervalo de tempo e To o volume da pata antes de injeo das toxinas (Damico et al,
2008).

3.14.4 Quantificao de Interleucina 6 (IL-6)

Grupos de 5 camundongos (Swiss 1820 g) receberam uma injeo de veneno total de
P. hyoprora e da toxina PhTX-I no msculo tibial anterior direito. A dose inoculada foi de
10g em um volume de 50l. Um grupo controle recebeu 50l de soluo salina. Aps a
aplicao das toxinas, em intervalos de tempo (1, 3, 6 e 9 horas), amostras de sangue foram
coletadas da cauda em capilares heparinizados e o plasma removido para a determinao dos
nveis plasmticos de interleucina 6 (IL-6).
Brevemente, uma micro-placa de 96 poos foi carregada com 100 L do primeiro
anticorpo monoclonal anti-IL-6 e incubado por duas horas a 37oC. Foram registradas
absorbncias a 450nm e concentraes de IL-6 foram estimadas a partir de uma curva
preparada com IL-6 recombinante.
3.14.5 Atividade citotoxica sobre cultura celular de mioblastos e miotubos.
As linhagems celulares utilizada no estudo so clulas de mioblastos murinos C2C12
(ATCC CRL-1772) os quais podem fusionar-se e diferenciar-se em miotubos. A cultura
celular C2C12 cresse em um meio DMEN (Sigma D-5796) suplementado com 10% de soro
fetal bovino (FCS; Sigma F-2442), glutamina 2mM, cido pirvico 1mM, penicilina (100
U/ml) estreptomicina (0,1mg/ml) e anfotericina B (0,25 g/ml) em uma atmosfera
umidificada com CO2 7% a 37C.
 26

Clulas foram recolhidas a partir de monocapas subconfluentes em crescimento as

quais foram mantidas em garrafas de 25 cm2. A dissociao foi feita tratando a cultura com
tripsina (1500 U/mL), contendo EDTA 5,3mM por 5min a 37oC. As clulas re-suspendidas
foram semeadas em uma micro-placa de 96 poos a uma densidade aproximada de 1-4x104
clulas/poo, no mesmo meio de cultura. Aps atingir uma confluncia similar o meio de
crescimento foi mudado para um meio de diferenciao, o qual consiste de meio DMEM
suplementado com 1% de soro fetal bovino (Ebisui et al., 1995). Aps 4-6 dias de cultura,
quando uma vasta proporo de miotubos grandes multinucleados foi observada, a cultura
celular foi utilizada nos ensaios de citotoxicidade.
Para medir a atividade citotxica uma micro-placa de 96 poos foi utilizada como
desenho experimental, escolhendo-se um n de 3, correspondente a 3 poos previamente
preenchidos com uma cultura celular de mioblastos C2C12, em um meio DMEN com 10% de
soro fetal bovino a 37C e CO 2 7% (50 L) previamente incubado em uma estufa de cultura
celular.
A citotoxicidade foi determinada seguindo a metodologia descrita por Lomonte et al.,
(1999). O veneno total de P. hyoprora e a toxina PhTX-I previamente dissolvidos no meio de
ensaio da cultura celular, contendo as seguintes concentraes: 5, 10, 20 e 40g foram
acrescentadas no meio de cultura celular em um volume total de 150 l/poo. Consideram-se
dois tipos de controles: positivo em presena de Triton X-100 (+) e negativo s na presena de
meio de cultura de DMEN contendo soro fetal bovino a 1% (-), a fim de poder estabelecer
parmetros percentuais (%) de 0 a 100% de quantificao de lactato desidrogenasse (LDH).
Depois de 3 horas, retirou-se, de cada poo, 100 l do sobrenadante, sendo estimada a
liberao da enzima lactato desidrogenasse (LDH), liberada como resultado da lise celular por
ao da toxina. O meio de reao contve 1ml do substrato preparado de acordo com o
indicado pelo kit do fabricante (LDH-P UV Mtodo UV otimizado SFBC Lab. Wiener),
previamente incubado por dois minutos a 30C. Logo se acrescenteu 80 L do sobrenadante,
depois incubado por 3 minutos aproximadamente e, em seguida, lu-se a absorbncia a 340
nm.
Posteriormente ao valor obtido como negativo, transformou-se em simples positivo e
multiplicou-se por 1000. O valor obtido foi convertido em valor porcentual (%), em relao
ao controle positivo mximo encontrado com o Triton X-100.

3.14.6 Atividade citotoxica sobre cultura celular NG97 e NCIH-3T3.

 27

A atividade citotxica tambm foi avaliada nas linhagens celulares NG97 e NCIH-
3T3, as quais foram mantidas em frascos plsticos (25cm2) com meio RPMI 1640 (Cultilab,
Campinas, SP, Brazil), suplementado com L-glutamina 2%, garamicina 120 g/mL e soro
fetal bovino inativado 13% (meio completo). As culturas foram incubadas a 37 oC numa
atmsfera contendo 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 48 h e quando a cultura atingiu
confluncia, a subcultura foi realizada por tratamento com tripsina e versene (Adolfo Lutz,
So Paulo, SP, Brazil). Quantidades variveis das toxinas PLA 2 ou seus derivados
modificados quimicamente foram diludos no meio de ensaio e adicionados s clulas em
placas de 96 poos. Os experimentos foram realizados em triplicata.
A viabilidade celular foi avaliada pelo mtodo do vermelho neutro, realizados segundo
a metodologia descrita por Borenfreund e Borrero (1984). Aps uma incubao de 4 h com
meio isento de soro contendo 50 g de vermelho neutro/ml, as clulas foram lavadas
rapidamente com PBS e em seguida 0,1 ml de uma soluo de cido actico 1% (v/v):etanol
50% (v/v), foi adicionado a cada poo para extrair o corante. Aps agitao durante 10
minutos em um agitador de placa de microtitulao a absorvncia foi lida a 540 nm. A
viabilidade celular foi determinada em comparao com a DO obtida a partir de clulas no
tratadas.

3.15 Anlise Estatstica.

Os resultados so reportados como a mdia erro padro. A significncia foi obtida
atravs do teste t-student quando vrios grupos experimentais so comparados entre eles e
com o grupo controle. O limite de confiana de p<0,05.

4. RESULTADOS.
4.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
4.1.1 Purificao das fraes PhTX-I e PhTX-II a partir do veneno total de P. hyoprora.
O veneno total foi submetido a uma etapa cromatogrfica em HPLC de fase reversa, a
corrida foi realizada em uma coluna analtica -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm Waters),
acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, possibilitando o monitoramento do perfil de
 28

atividades biolgicas como miotoxicidade e bloqueio neuromuscular, assim como a atividade

enzimtica PLA2.

O fracionamento do veneno total resultou em 20 picos (Fig. 6), dos quais os de

nmeros 10, 12 e 15 induzem miotoxicidade local em doses de 5 a 20g em msculo
gastrocnmio de camundongo. Adicionalmente, os picos 10 e 12 foram capazes de produzir
bloqueio neuromuscular na preparao biventer cervicis de pintainho e evidenciaram alta
atividade enzimtica PLA2 (14,5 e 12,5nmoles/min/mg, respectivamente). Este picos
denominados PhTX-I e PhTX-II, respectivamente, foram selecionados para sua caracterizao
bioqumica e farmacolgica.

Figura 6. Perfil cromatogrfico do veneno total de P. hyoprora em HPLC de fase reversa usando uma
coluna -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Waters). A eluio das amostras foi realizada usando-se uma
gradiente linear contnua (0-100%) de concentrao do tampo B. O fluxo foi mantido constante a
1ml/min e monitorado a 280 nm. Fraes PhTX-I (*) e PhTX-II (**) indicadas pelas reas
sombreadas.
4.1.2 Determinao do grau de pureza, recuperao e atividade especfica das PLA 2
PhTX-I e PhTX-II.

Com a finalidade de verificar o grau de pureza, as fraes correspondentes s PLA 2

PhTX-I e II obtidas anteriormente, em um nico passo cromatogrfico, foram repassada em
um sistema de HPLC utilizando as mesmas condies de purificao descritas. O perfil
cromatogrfico mostra a presena de apenas um pico protico, para ambas as fraes,
evidenciando alto grau de pureza, conforme mostrado na figura 7. A frao PhTX-I foi eluda
 29

aos 35,5 1,1 minutos, em concentrao de 53,5 0,3% de tampo B (Fig 7A), por outro
lado a frao PhTX-II foi eluda aos 36,8 0,8 minutos e em concentrao do tampo B de
55,3 0,2% (Fig. 7B).

Figura 7. Re-cromatografia das fraes PhTX-I (A) e PhTX-II (B) em HPLC de fase reversa usando
uma coluna -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Waters). A eluio foi realizada usando-se uma gradiente
linear contnua (0-100%) de concentrao do tampo B. O fluxo foi mantido constante a 1ml/min e
monitorado a 280 nm.
As fraes PhTX-I e II foram purificada 1361,7 e 679,1 vezes, com rendimento de
13,39 e 4,08%, respectivamente, em relao ao veneno total. A Tabela 3 exibe um resumo das
etapas do processo de purificao, assim como o clculo da atividade especfica e a
recuperao.

Etapa Vol. Protena Atividade Atividade Atividade Recup. Purif.

(ml) (mg/ml) (U/ml) total (U.T) especfica (U/mg) (%) (vezes)
Veneno total (VT) 20 0,9154 274,5 5490 299,87 100 1
HPLC-FR (PhTX-I) 1 0,0018 735 735 408333,33 13,39 1361,71
 30

HPLC-FR (PhTX-II) 1 0,0011 224 224 203636,36 4,08 679,08

Tabela 3 Tabela de recuperao e clculo de atividade especfica das fraes PhTX-I e II isoladas a
partir do veneno de P. hyoprora.

A figura 8 mostra os perfis de massa molecular em SDS PAGE, das fraes PhTX-I e
II em condies nativas e reduzidas com DTT. Nas duas condies, tanto a PhTX-I (pistas 2 e
3) como a PhTX-II (pistas 4 e 5) mostram a presena de uma nica banda eletrofortica com
massa molecular relativa em torno de ~15 kDa em relao aos marcadores de massa
molecular (pista 1), alm de confirmar o alto grau de homogeneidade das fraes proteicas.

Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) SDS-PAGE, corado com comassie blue. Pista
1: marcadores de massa molecular (Mm); Pista 2: PhTX-I nativa; Pista 3: PhTX-I(r) reduzida com
DTT; Pista 4: PhTX-II nativa; Pista 5: PhTX-II(r) reduzida com DTT.

4.1.3 Anlise de composio de aminocidos das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.

As PLA2 PhTX-I e II apresentaram 125 e 121 resduos de aminocidos,
respectivamente (tabela 4), com presena de 14 resduos de cistenas em ambas proteinas, o
que evidencia a presena de 7 pontes dissulfeto intracadeia, caracterstica molecular desta
famlia de protenas. PhTX-I e II apresentam alto contedo dos aminocidos Lys, Tyr, Gli e
Cys tpicos das PLA2 bsicas. O ponto isoeltrico terico de 8,4 e 7.35 respectivamente. A
massa molecular calculada baseada na anlise de composio de aminocidos 14088,57 Da
para a PhTX-I e 13511.07 Da para a PhTX-II.

PhTX-I PhTX-II
AA % Massa Nmero % Massa Nmero
Asp 8,99 1266,21 11 9.09 1266,21 11
Glu 8,25 1162,17 9 9.09 1420.43 11
 31

Ser 4,33 609,63 7 4.13 435.45 5

Gly 4,46 627,77 11 9.09 627,77 11
His 2,92 411,48 3 1.65 274.32 2
Arg 11,09 1562,1 10 5.79 1093.47 7
Thr 7,1 1000,08 9 4.96 666.72 6
Ala 2,52 355,45 5 4.96 426.54 6
Pro 2,76 388,52 4 3.31 388,52 4
Tyr 8,91 1255,65 11 8.26 1141.5 10
Val 4,63 652,6 4 1.65 326.3 2
Met 2,79 393,63 3 1.65 262.42 2
Cys 10,6 1493,96 14 11.57 1443,96 14
Ile 3,66 515,85 5 4.96 619.02 6
Leu 5,62 792,19 7 4.96 679.02 6
Phe 5,22 735,95 5 4.96 883.14 6
Lys 6,37 897,33 7 9.92 1538.28 12
Trp ND ND
Total 100 14088,57 125 100 13511.07 121

Tabela 4. Composio de aminocidos das PLA2 PhTX-I e PhTX-II isoladas do veneno de P.

hyoprora. Os valores so expressos em mol de aminocidos por mol de protena. (ND) no
determinado.

4.1.4 Determinao da massa molecular por Espectrometria de Massas (Maldi-Tof).

A anlise de PhTX-I e II por espectrometria de massas Maldi-tof confirmou a

homogeneidade das protenas e determinou os seus valores de massa molecular exata. A
massa da PhTX-I foi de 14249,22 Da, como mostrado na figura 9A onde se apresenta o
espectro da PhTX-I com os valores de massa (m/z) da protena ionizada (MH +), assim como
rastos de ons moleculares duplamente carregados (MH2+), aproximadamente na metade do
valor m/z e rastos de espcies dimricas (2MH +), aproximadamente duas vezes o valor de
m/z. A massa da PhTX-I aps ser reduzida e alquilada foi de 15061.2 Da (inserto na figura
9A). O incremento de massa de 812 Da indica a presena de 14 resduos modificados de Cys-
CAM.
A figura 9B mostra o espectro da PhTX-II com os valores de massa (m/z) da protena
ionizada (MH+), assim como rastos de ons moleculares duplamente carregados (MH 2+). A
massa da PhTX-II foi de 14149.08 Da.
 32

Figura 9. Determinao da massa molecular das PLA2 PhTX-I (A) e PhTX-II (B) por
espectrometria de massas MALDI-TOF. Os ons moleculares MH+, MH2++ e 2MH+ so mostrados no
espectro. Inserto na figura A: espectro de massa MALDI-TOF da PLA 2 PhTX-I reduzida e alquilada
mostrando os mltiplos canais de alquilao.

4.1.5 Caracterizao da estrutura primria da PLA2 PhTX-I.

A PLA2 PhTX-I foi digerida com tripsina bovina e os peptdeos trpticos resultantes
foram separados em HPLC de fase reversa. Foram obtidos 18 picos (dados no mostrados),
cada pico foi coletado manualmente e liofilizado. O sequenciamento de novo de cada
peptdeo foi feito por espectrometria de massas em tndem ESI-Q-TOF/MS/MS. Os dados
obtidos foram processados usando o software Mascot MS/MS Ion Search (www.
matrixscience.com). A tabela 5 mostra as massas medidas e a sequencia deduzida de cada um
dos peptdeos obtidos a partir da clivagem trptica da PLA2 PhTX-I.
 33

Frao Massa Sequencia de aminocidos

HPLC medida (Da)
1 1312.38 ENI/LGTYNK/QK/QYR
2 1547.52 GAYGCYCGWGGRGK
3 1763.75 DPCK/QEI/LCECDK/QAAAV
4 503.18 MI/LI/LK
5 2102.91 KI/LTGCPK/QTNDRYSYSWK
6 671.28 GK/QPK/QDK
7 918.39 MI/LI/LK/QETGK
8 1384.54 CCFVHDCCR
9 2042.64 DK/QTDDRCCFVHDCCR
10 797.19 NPFPYY
11 1840.82 AAAVCFRENI/LGTYNK/QK
12 884.41 GRGK/QPK/QDK
13 1204.55 SI/LCK/QK/QADK/QPC
14 893.32 DI/LWEFGK
15 1883.76 ETGK/QNPFPYYGAYGCY
16 1650.77 K/QYRYHI/LRSI/LCK/QK
17 1160.44 I/LTGCPK/QTNDR
18 2793.06 TNDRYSYSWK/QDI/LTI/LVCGEDDPCK

Tabela 5. Massas moleculares e sequencias de aminocidos obtidas por espectrometria de massas ESI-
MS/MS dos peptideos trpticos de PhTX-I. Os peptdeos foram separados por HPLC de fase reversa.
C = cisteina alquilada, Os resduos de lisina mostrados em negrito foram deduzidos da clivagem pela
tripsina. Todas as massas moleculares so reportadas como monoisotpicas.

No foram discriminados os resduos de lisina e isoleucine em nenhuma das

sequencias reportadas devido a que no so indistinguveis no espectro CID (do ingls
dissociao induzida por coliso) de baixa energia. Devido calibrao externa aplicada a
todos os espectros no foi possvel resolver a diferena de 0,036 Da entre resduos de
glutamina e lisina, exceto para as lisinas que foram deduzias em base clivagem da tripsina
(Tripsina cliva no extremo carboxi terminal de lisina ou arginina). Cada peptdeo sequenciado
de novo foi submetido base de dados NCBI usando o programa BLAST-p protein search
com uma procura restrita a protenas bsicas com atividade fosfolipase A2.
O espectro de massa contendo a serie de ons y do peptdeo eluido na frao 8 do
HPLC de fase reversa mostrado na figura 10. O peptidio tem a sequencia C C F V H D C C
R, contendo um resduo de acido asprtico que corresponde posio 49 na sequencia
completa de aminocidos, por tanto, nos permite classificar a PhTX-I como parte da famlia
das PLA2 D49.
 34

Figura 10. Espectro ESI-QTOF-MS/MS do peptdeo trptico de 1312.38 Da. Series de ons y do
peptdeo (contendo 9 resduos de aminocidos) eluido no pico 8 do HPLC de fase reversa da PhTX-I
alquilada e contendo um resduo de acido asprtico que corresponde posio 49 na sequencia
completa de aminocidos.

O resultado da anlise da estrutura primria mostra que a PhTX-I esta composta de

123 resduos de aminocidos, compartilhando as sequencias conservadas de domnios comuns
ao grupo das PLA2 D49, incluindo as 14 cisteinas, a ala de ligao ao clcio localizada em
(Y)27, (G)29, (G)31, (G)32, o stio cataltico formado por (H)48, (D)49, (Y)52 e (D)89.
PhTX-I revela a mudana de alguns aminocidos importantes como: (S)1(D)1; (Q)4(E)4;
(Q)7(K)7; (R)34(G)34; (R)70(W)70; I(86)(L)86; (D)118(A)118.
Comparao da sequencia da PhTX-I mostra uma alta homologia entre 44% a 90%
(em caixa), com outras PLA2 D49 miotxicas pertencentes famlia Viperidae (Fig. 11).
Os traos (-) correspondem aos gerados pelo software usado no alinhamento. As
posies dos resduos de cistena se encontram em posies idnticas com as outras PLA2,
pelo que se trata de protenas muito relacionadas, mantendo os mesmos motivos estruturais.
 35

Figura 11. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PLA 2 PhTX-I com outras PLA2
D49 da famlia Viperidae. BbTX-III (Brazilitoxin III) de B. brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009);
6_1 e 6_2 de B. jararacussu (Ponce-Soto et al., 2006); BmTX-I de B. moojeni (Calgarotto et al.,
2008); BmjeTX-I e BmjeTX-II de B. marajoensis (Ponce-Soto et al., 2010); LmTX-I de L. m. muta
(Damico et al., 2005).

4.1.6 Caracterizao da estrutura primria da PLA2 PhTX-II.

A protena PhTX-II tambm foi digerida com tripsina bovina e os peptdeos trpticos
resultantes foram sequenciados por espectrometria de massas em tndem ESI-Q-
TOF/MS/MS. A tabela 6 mostra a massa observada dos peptidios trpticos, a massa esperada e
a massa calculada, assim como a sequencia de aminocidos de cada peptidio obtido de PhTX-
II e sua posio na sequencia primria da protena.
Os espectros de massa contendo a serie de ons y do terceiro e quarto peptdeos, e as
sequencias de aminocidos nas posies 16 - 33 e 43 - 53, respectivamente, so mostrados na
figura 12. O quarto peptidio (Fig. 12A) tem a sequencia C C F V H D C C Y G K mostrando
um resduo de Asp na posio 49 da estrutura primria da protena, sugerindo que esta
protena tambm pertence famlia das PLA2 D49, cataliticamente ativas.

Inicio Final Observada Mr (expt) Mr (cal) Delta Sequencia de aminocidos

1 7 438,7318 875,4491 875,4865 -0,0374 NLLQFNK(M)
8 15 468,2504 934,4862 934,5157 -0,0295 (K)MILKETGK(N)a
16 33 1079,9679 2157,9212 2157,9189 0,0023 (K)NAIPFYAFYGCYCGWGGR(G)
43 53 753,2472 1504,4798 1504,5356 -0,0559 (R)CCFVHDCCYGK(L)
61 69 592,8006 1183,5866 1183,5913 -0,0047 (K)WDIYPYSLK(S)
70 77 443,1818 884,349 884,4062 -0,0572 (K)SGYITCGK(G)
78 90 871,8063 1741,5981 1741,6494 -0,0514 (K)GTWCEEQICECDR(A)
91 97 404,7131 807,4116 807,4061 0,0055 (R)AAAICFR(E)
98 105 498,7416 995,4686 995,456 0,0126 (R)ENLDTYNK(Y)
106 115 649,7614 1297,5083 1297,5437 -0,0355 (K)YGYMFYPDSR(C)
116 123 483,1726 964,3306 964,3743 -0,0436 (R)CKGPSEQC-

Tabela 6. Sequencia de aminocidos dos peptidios obtidos por hidrlise trptica a partir da PLA 2
PhTX-II. aMet foi modificada por oxidao.
 36

Figura 12. Espectro ESI-QTOF-MS/MS mostrando as series de ons y e as sequencias de aminocidos

do quarto peptidio (A) (posies 43 - 53) e do terceiro peptidio (B) (posies 16 - 34).
O terceiro peptidio (Fig. 12B) traz a sequencia N A I P F Y A F Y G C Y C G W G G
R, evidenciando os aminocidos nas posies (G25), (Y)27, (G)29, (G)31, (G)32 os quais
fazem parte da ala de ligao ao clcio, domnio altamente conservado nas PLA 2 D49 e cuja
presena necessria para a atividade cataltica.
A seqncia de aminocidos da PLA2 PhTX-II foi comparada com outras miotoxinas
PLA2 de seqncias j determinadas e registradas no banco de dados (Fig 13). Por homologia
a PhTX-II est composta de 123 resduos de aminocidos, compartilhando as sequencias
conservadas de domnios comuns ao grupo das PLA 2. Os traos (-) observados correspondem
aos gerados pelo software usado no alinhamento
 37

Figura 13. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PLA 2 PhTX-II com outras PLA2
D49 da famlia Viperidae: Mojave toxin de C. s. scutulatus (Aird et al., 1990); LmTX-I de L. muta
muta (Damico et al., 2005); Piratoxina III de B. pirajai (Rigden et al., 2003); PhTX-I de P. hyoprora
(Huancahuire-Vega et al., 2011); BmTX-I de B. moojeni (Calgarotto et al., 2008); BbTX-III de B.
brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009).

4.1.7 Dicrosmo circular das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.

Aps determinao da estrutura primria as protenas foram analisadas por CD para

verificao do estado enovelado das mesmas atravs da quantificao da estrutura secundria.
A figura 14 mostra o espectro CD das PLA2 PhTX-I e II as quais apresentam duas bandas
negativas de magnitude similar (-11,000, -10,500 deg.cm2.dmol-1para PhTX-I e -10,000, 9,500
deg.cm2.dmol-1para PhTX-II) a 208 e 222 nm, respectivamente e uma positiva a 190 nm
(dados no mostrados) para ambas protenas, indicando alto contedo de estrutura -hlice. A
anlise do espectro da PhTX-I nativa mostra contedo de -helices, folhas- e -turns de
31.9%, 17.9% e 17.1%, respectivamente. A anlise do espectro da PLA 2 PhTX-II mostra um
intervalo de sinal indicativo de porcentagem de hlice- da ordem de 30,5 %, folhas- de
18,2% e -turns de 16,9%. Os valores indicativos de porcentagem foram obtidos aps
deconvoluo dos espectros de CD da protena pelo programa CDNN.
 38

Figura 14. Espectros de CD no UV-distante das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II. Medidas de CD realizadas a
25C, em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 8.

4.1.8 Estudos da cintica enzimtica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.

A atividade enzimtica PLA2 foi examinada usando o substrato cromognico NOAB
[cido 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzico], seguino a metodologia de Cho e Kzdy (1991),
Holzer e Mackessey (1996) e adaptado para micro-placa por Ponce-Soto et al (2006). A
atividade PLA2 expressa como velocidade inicial de reao (Vo). Os valores de atividade
para o veneno total e para as PLA 2 PhTX-I e II, na concentrao de substrato 10mM, foram
5,49 0,71, 14,7 0,19, e 9,65 0,65 nmoles/min, respectivamente, (Fig. 15A).

O efeito da concentrao do substrato (NOAB) na atividade PLA 2 de PhTX-I e II

apresenta cintica sigmoidal, principalmente em baixas concentraes do substrato, indicativo
de um comportamento tipo alostrico (Fig. 15B). Os valores de pH e temperatura timos para
as duas enzimas foram 8 e 37 oC, respectivamente (Figs 15C e D), entretanto, aos 40 e 45 oC
PhTX-II ainda mantm uma alta atividade enzimtica. Ambas as enzimas mostram completa
dependncia de clcio para exibir sua atividade enzimtica tima, adio de ons Mg 2+, Mn2+,
Cd2+ e Zn2+ (10mM) na ausncia ou presena de baixas concentraes de clcio (1mM),
diminui significativamente a atividade PLA2 tanto da PhTX-I (Fig. 15E) como da PhTX-II
(Fig. 15F).
 39

Figura 15. (A) Atividade enzimtica PLA2 do veneno total de P. hyoprora (VT), e das PLA2 PhTX-I e
PhTX-II, (B) Efeito da concentrao do substrato. Inserto: detalhes em baixas concentraes, (C)
Efeito do pH, (D) Efeito da temperatura, (E e F) Efeito dos ons sobre PhTX-I e PhTX-II. Os
experimentos foram realizados em triplicata e as barras representam o desvio padro (p<0.05).
4.2 Caracterizao farmacolgica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
4.2.1 Determinao da atividade neurotxica ex vivo do veneno total e das PLA2 PhTX-
I e PhTX-II.
Para este experimento foram testadas, na preparao neuromuscular biventer cervicis
de pintainho, doses de 20g/ml do veneno total de P. hyoprora e concentraes finais de 0,7 e
1,4 M das PLA2 PhTX-I e II. As toxinas produziram bloqueio neuromuscular irreversvel
sob estmulo eltrico indireto, em todas as concentraes testadas, a 37C (Fig. 16). O tempo
necessrio para obter um bloqueio de 50% da resposta contrtil do msculo na dose de 20
g/ml do veneno total foi de 81 5,4 min. As PLA2 PhTX-I e II precisaram de 28 3,9 e 20
3,1 min para 0,7M e 19 2,7 e 18 2,8min para 1,4M, respectivamente.
Neste modelo de preparao muscular as PLA 2 PhTX-I e II se mostram como potentes
bloqueadores da transmisso nervosa na juno neuromuscular, o bloqueio foi irreversvel na
pslavagem em todas as concentraes tal como se mostra no registro miogrfico da figura
 40

17, assim como as contraturas em resposta acetilcolina (ACh) e ao potssio na forma de

KCl.

Figura 16. Representao grfica do bloqueio dose-dependente da resposta contrtil na transmisso

neuromuscular, em preparao biventer cervicis de pintainho (estmulo indireto), por ao do veneno
total de P. hyoprora, (20g/ml) e por ao das PLA2 PhTX-I e PhTX-II nas concentraes finais de 0,7
e 1,4M. Cada ponto corresponde media erro padro de 5 experimentos.
 41

Figura 17. Registros miogrficos da resposta muscular na preparao de biventer cervicis de pintainho
em presena do controle (A), veneno total 20ug/ml (B), PLA 2 PhTX-I 1,4M (C) e PLA 2 PhTX-II
1,4M (D). A contratura em resposta acetilcolina (ACh 110M; ) e ao KCl (20mM; ) foi obtida
antes e depois da adio da toxina.

As respostas ACh exgena (110 M) e ao KCl (20 mM) foram obtidas antes e aps a
adio das toxinas. Aps 120 min de incubao o veneno (20g/ml) alterou
significativamente as contraturas induzidas pela ACh (110 M) e pelo KCl (20mM), da
mesma forma que as PLA2 PhTX-I e II na concentrao de 1,4M, por outro lado, em
concentraes menores (0,7 M ) ambas PLA2 no tiveram diferena significativa em relao
com o controle (Fig. 18).

Figura 18. Porcentagem de bloqueio da contratura em resposta acetilcolina (ACh) e ao potssio

(KCl), do veneno total (20 g/ml) e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II (0,7 e 1,4 M) (p<0,05).
4.2.2 Atividade miotxica local in vivo do veneno total e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
Os estudos realizados para determinar o efeito miotxico local do veneno total e das
PLA2 PhTX-I e PhTX-II in vivo foram feitos em camundongos inoculados com as toxinas por
via intramuscular. O dano muscular foi avaliado pelo incremento dos nveis de CK
plasmtico.
Os resultados mostram que os nveis de CK plasmticos aumentam drasticamente nas
primeiras 3 a 6 horas do tratamento, atingindo at 1037,83 103,02, 1290,41 140,23 e 1216
45,1U/L de CK para o veneno total e as toxinas PhTX-I e PhTX-II, respectivamente.
Posteriormente os nveis de CK plasmtico voltaram a nveis normais, aps 9 horas (Fig. 19).
 42

Figura 19. Representao grfica da atividade miotxica local do veneno total e das toxinas PhTX-I e
PhTX-II de P. hyoprora inoculados em camundongo. Mostra-se os valores de de creatino quinase (CK)
plasmtico, incrementados ao longo do tempo, aps a administrao intramuscular do veneno e das
toxinas PhTX-I e PhTX-II (20g) (n=5).

4.2.3 Atividade miotxica sistmica in vivo do veneno total e das PLA 2 PhTX-I e PhTX-
II.
In vivo, o veneno total e as PLA2 PhTX-I e PhTX-II de P. hyoprora inoculados por via
intravenosa no induziram efeito miotxico sistmico, j que os nveis de CK plasmtico ao
longo do tempo no tiveram incremento significativo em relao ao controle, que recebeu
PBS (Fig. 20), o mximo valor atingido foi 290U/L de CK pela PhTX-I 3 hors aps a
inoculao da toxina. Por outro lado, na miotoxicidade local, as toxinas induziram elevao
dos nveis de CK acima de 1000U/L.

Figura 20. Representao grfica da atividade miotxica sistmica do veneno e das toxinas PhTX-I e
PhTX-II (5 g) de P. hyoprora inoculados em camundongo. Mostram-se os valores de de CK
plasmtico ao longo do tempo, aps administrao intravenosa (n=5).
 43

4.2.4 Determinao da atividade edematognica do veneno total e das PLA2 PhTX-I e

PhTX-II.
Para o estudo da atividade inflamatria, verificou-se um dos eventos que ocorre neste
processo, a formao de edema. Para isto, veneno total e as PLA 2 PhTX-I e II (1g) foram
dissolvidas em 50l de PBS, e aplicadas sob a regio intraplantar da pata direita de
camundongos. A pata esquerda recebeu 50l de PBS como controle. O edema expresso
como o porcentual de aumento em volume da pata direita com relao pata esquerda. A
figura 21 mostra que tanto o veneno total assim como as toxinas PLA 2 induzem edema
moderado uma hora aps o tratamento.

Figura 21. Atividade edematognica do veneno total e das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II de P. hyoprora em
camundongos (18-20g). Cada ponto representa a mdia o desvio-padro de 5 animais.
4.2.5 Determinao dos nveis de interleucina 6 (IL-6) aps injeo intramuscular do
veneno total e PhTX-I.
10g de veneno total e da PLA2 PhTX-I foram injetados no musculo tibial anterior
direito de camundongos e a concentrao de IL-6 no plasma foram medidos. Tanto o veneno
total assim como a PhTX-I causaram incremento significativo nos nveis plasmticos de IL-6,
quando comparadas ao controle, atingindo o incremento mximo 3 horas aps a aplicao
(71,2 5,4pg/ml e 96,4 4,9pg/ml para o veneno total e a PhTX-I respectivamente). Seis
horas aps a injeo a concentrao de IL-6 diminui, alcanando os nveis plasmticos
normais aps 9 horas (Fig. 22).
 44

Figura 22. Nveis de concentrao de Interleucina (IL-6) plasmtica induzida por 10g de veneno
total de P. hyoprora e da PLA2 PhTX-I em camundongos. Concentrao de IL-6 plasmtica foi
determinada em diferentes horas aps aplicao das toxinas.

4.2.6 Determinao do efeito citotxico do veneno total e PhTX-I sobre mioblastos e

miotubos (C2C12).
Doses de 5 e 10g/150l do veneno total e da PLA 2 PhTX-I evidenciaram um ligeiro
efeito citotxico quando foram testados em mioblastos C2C12 (Fig. 23A). A toxina PhTX-I
foi citotxica sobre miotubos, com doses a partir de 5 - 40g/poo, j o veneno total induz o
mesmo efeito com doses de 10 - 40 g/poo. Esta toxicidade foi evidenciada pelo aumento
significativo nos nveis de LDH depois de acrescentada a toxina (Fig. 23B).

Figura 23. Atividade citotxica in vitro do veneno total de P. hyoprora e PLA2 PhTX-I sobre cultura
celular de mioblastos (A) e miotubos (B). Lise celular foi estimada pela liberao de desidrogenasse
lctica (LDH) no sobrenadante aps 3 horas de exposio toxina em um volume de 150 L/poo.

4.2.7 Atividade citotxica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II sobre clulas NIH-3T3 e NG97.
 45

PhTX-I e PhTX-II foram citotxicas, de maneira dose-dependente, sobre a linhagem

celular de fibroblastos NIH-3T3. Como mostrado na figura 24A, PhTX-II se mostrou mais
citotxica do que PhTX-I, j que, a partir de 12,5 g esta toxina capaz de provocar o 50% de
morte celular, PhTX-I, por sua vez, precisou de 100 g para atingir o 50% de morte celular.
PhTX-I tambm foi citotxica, de maneira dose-dependente e em menor grau para a
linhagem NG97 derivada de astrocitoma humano grado III (Fig. 24B).

Figura 24. Atividade citotxica in vitro das PLA2 PhTX-I e PhTX-II sobre cultura celular de
fibroblastos NCIH-3T3 (A) e astrocitoma humano NG97 (B). A lise celular foi estimada pelo teste de
vermelho neutro. A viabilidade celular foi determinada comparando a DO apartir das clulas controle
(no tratadas). Os ensaios foram feitos em triplicata. *(p<0.05).
4.3 Modificaes qumicas na miotoxina PLA2 PhTX-I.
Uma estratgia utilizada para elucidar a relao entre atividade cataltica e efeitos
farmacolgicos das PLA2 baseia-se na modificao qumica de resduos especficos nestas
enzimas (Soares e Giglio, 2003). A continuao descrevemos as modificaes qumicas na
PhTX-I nos resduos de aminocidos His, Tyr, Trp, Lys e os efeitos de tais modificaes sobre
as suas propriedades enzimticas, farmacolgicas e estruturais.

4.3.1 Eletroforese em SDS-PAGE da PLA2 PhTX-I nativa e derivados modificados.

A figura 25 mostra os perfis de massa molecular em SDS PAGE, da PLA 2 PhTX-I
nativa (pista 2) e das protenas modificadas com AA, NPSC, NBSF e BPB, nos resduos Lys,
Tyr, Trp e His (pistas 3, 4, 5 e 6, respectivamente). Todas as amostras foram reduzidas com
DTT, mostrando para cada amostra a presena de uma nica banda eletrofortica com massa
molecular relativa em torno de 15 kDa, em relao aos marcadores de massa molecular (pista
1).
 46

Figura 25. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%). SDS-PAGE, corado com comassie blue.
Pista 1: marcadores de massa molecular (Mm), Pista 2: PhTX-I nativa; Pista 3: PhTX-I + AA, Pista 4:
PhTX-I + NPSC, Pista 5: PhTX-I + NBSF, Pista 6: PhTX-I + BPB. Todas as amostras foram reduzidas
com DTT.

4.3.2 Determinao da massa intacta das protenas modificadas por Espectrometria de

Massas Electrospray (ESI).

A anlise de massa intacta dos derivados modificados quimicamente da PhTX-I foi

determinada por espectrometria de massas Electrospray (ESI). Os resultados mostram massa
moleculares de 14440.70 Da (PhTX-I + BPB), 14537.90 Da (PhTX-I + AA), 14470.61 Da
(PhTX-I + NPSC) e 15068.96 Da (PhTX-I + NBSF) (Fig. 26A, B; C e D respectivamente).
 47

Figura 26. Espectros de massa crus e deconvoluco dos espectros (insertos) da PLA 2 PhTX-I
modificada com BPB (A), AA (B), NPSC (C) e NBSF (D) por espectrometria de massas Electrospray
(ESI)

4.3.3 Anlise de composio de aminocidos das formas modificadas.

A tabela 7 apresenta o resultado da anlise de composio de aminocidos nas formas
modificadas da PLA2 PhTX-I comparadas com a sequencia de aminocidos da PhTX-I nativa.
Modificaes feitas nos resduos de Lys (AA) demonstra a modificao em 7 resduos, NBSF
(modifica Tyr) modificou 4 resduos de Tyr, BPB (modifica His) modificou 1 resduo de His.
Com a metodologia empregada no foi possvel determinar as modificaes nos resduos de
Trp.

PhTX-I PhTX-I PhTX-I PhTX-I PhTX-I

Aminocidos nativaa + AAb + NPSCc + NBSFd + p-BPBe
Asp 11 10.92 (11) 10.9 (11) 10.72 (11) 10.56 (11)
Glu 6 5.98 (6) 6.12 (6) 5.92 (6) 6.37 (6)
Ser 3 3.37 (3) 3.15 (3) 3.21 (3) 3.03 (3)
Gly 11 11.43 (11) 11.25 (11) 11.39 (11) 11.13 (11)
His 2 1.74 (2) 1.94 (2) 1.6 (2) 0.85 (1)
Arg 6 6.34 (6) 6.09 (6) 6.35 (6) 6. 34 (6)
Thr 7 7.62 (7) 6.56 (7) 7.15 (7) 7.42 (7)
Ala 5 4.81 (5) 5.29 (5) 5.34 (5) 5.44 (5)
Pro 6 5.82 (6) 6.01 (6) 6.05 (6) 5.74 (6)
Tyr 10 10.24 (10) 9.79 (10) 5.94 (6) 10.21 (10)
Val 3 3.33 (3) 3.34 (3) 3.49 (3) 3.49 (3)
Met 1 1.47 (1) 1.17 (1) 1.18 (1) 1.45 (1)
Cys 14 13.96 (14) 13.98 (14) 13.74 (14) 13.69 (14)
Ile 2 2.47 (2) 2.35 (2) 2.27 (2) 2.22 (2)
Leu 8 8.29 (8) 8.44 (8) 8.12 (8) 8.01 (8)
Phe 4 3.58 (4) 4.49 (4) 4.74 (4) 4.21 (4)
Lys 17 10.02 (10) 16.93 (17) 17.35 (17) 17.2 (17)
 48

Trp 3 ND ND ND ND

Tabela 7. Composio de aminocidos da PLA2 PhTX-I nativa e modificadas do veneno de P.

hyoprora. Os valores so expressos em mol de aminocidos por mol de protena. aSequncia de
aminocidos. b, c, d ,eAnlise de aminocidos. (ND) no determinado.

4.3.4 Dicrosmo circular.

Para determinar se as modificaes qumicas realizadas na PhTX-I causaram

mudanas na estrutura secundria da protena foi utilizada a tcnica de dicrosmo circular. A
figura 27 mostra o espectro CD da PhTX-I nativa e seus derivados modificados os quais
apresentaranm duas bandas negativas de magnitude similar (-11,000, -10,500 deg.cm 2.dmol-1)
a 208 e 222 nm e uma positiva a 190 nm (dados no mostrados), indicando alto contedo de
estrutura -hlice. A anlise do espectro da PhTX-I nativa mostra contedo de -helices,
folhas- e -turns de 31.9%, 17.9% e 17.1%, respectivamente. O contedo da estrutura
secundria das protenas modificadas quimicamente por BPB, NPSC e AA foram muito
similares PhTX-I nativa, sem causar mudanas significativas no espectro CD. J a PhTX-I
tratada com NBSF indica alteraes significativas na elipticidade molar da banda negativa a
222 nm (-10,500 para -9,000 deg.cm2.dmol-1), a anlise pelo software indica um contedo
alterado de -helices, folhas- e -turns (29.8%, 19.2% e 17.7%, respectivamente).
 49

Figura 27. Espectros de CD no UV-distante. PhTX-I nativa e as formas modificadas (AA, BPB,
NBSF e NPSC). Medidas de CD realizadas a 25C, em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 8.

4.3.5 Determinao da atividade PLA2 das formas modificadas da PhTX-I e inibio.

A figura 28 mostra a atividade enzimtica em porcentagem considerando como 100%
a atividade enzimtica da PhTX-I nativa. A atividade cataltica da PhTX-I foi quase
completamente abolida aps modificao com BPB, modificao dos respiduos Tyr ou Lys
reduziu em mais do 50% a atividade, j o NPSC no causou diminuio significativa da
atividade cataltica (Fig. 28). O valor de Vo para a PhTX-I nativa foi 13,49 0,29 nmoles/min,
das formas modificadas os valores foram: 0,68 0,21 (BPB), 3,78 0,76 (AA), 5,1 1,22
(NBSF) e 11,77 0,06 (NPSC) nmoles/min respectivamente.

Foi avaliado tambm o efeito inibitrio da Heparina, EDTA, e as crotapotinas F2 e F3

sobre a atividade PLA2 da PhTX-I. A PhTX-I sob o efeito da heparina teve Vo de 10,1 0,36
nmoles/min, mostrando uma diminuio de 24,87% de atividade em relao a atividade da
PhTX-I nativa. Com as crotapotinas F2 e F3 de C. d. collilinetaus obtiveram-se Vo de 5,03
0,2 e 5,4 0,18 nmoles/min, respectivamente, ambas inibindo mais de 50% da atividade
enzimtica da PhTX-I. J o EDTA mostrou maior efeito inibitrio diminuindo em 89,92% a
atividade de PhTX-I (Vo de 1,35 0,25 nmoles/min).

Figura 28. Atividade PLA2 proveniente da PhTX-I nativa e das formas modificadas (BPB, AA, NBSF,
NPSC), e efeito inibitrio de Heparina (Hep), EDTA, crotapotinas de C. d. collilinetaus (F2 e F3)
sobre a atividade PLA2 da PhTX-I (n=3) *(p<0.05).

4.3.6 Determinao da atividade neurotxica ex vivo.

 50

A figura 29 mostra a representao grfica do bloqueio da resposta contrtil na

transmisso neuromuscular na preparao biventer cervicis de pintainho da PhTX-I nativa e
das suas formas modificadas (1,4 M). A PhTX-I nativa e a forma modificada com NPSC
bloquearam a resposta contrtil de maneira similar, atingindo o 50% de bloqueio em torno de
20 min. As formas modificadas com BPB, NBSF e AA o bloqueio da resposta contrtil no
alcanou o 50% durante os 120 min que durou o experimento.

Figura 29. Representao grfica do bloqueio da resposta contrtil na transmisso neuromuscular, em

preparao biventer cervicis de pintainho (estmulo indireto), por ao de PhTX-I nativa, NPSC, AA,
BPB, e NBSF (1.4M). Cada ponto corresponde media erro padro de 5 experimentos. *(p<0.05).
A figura 30 mostra os registros miogrficos da resposta contrtil sob a ao da PhTX-I
nativa e das suas formas modificadas, evidenciando a falta de bloqueio na transmisso
neuromuscular das formas modificadas com BPB, NBSF e AA, bem como as contraturas em
resposta acetilcolina (ACh) e ao potssio na forma de KCl, na preparao biventer cervicis
de pintainho.
 51

Figura 30. Registros miogrficos da resposta muscular na preparao de biventer cervicis de pintainho
em presena de PhTX-I e as suas formas modificadas. a) controle, b) PhTX-I 1,4 M, c) NPSC
1.4M, d) AA 1.4M, e) BPB 1.4M, f) NBSF 1.4M. A contratura em resposta acetilcolina
(ACh 110M; ) e ao KCl (20mM; ) foi obtida antes e depois da adio das protenas.
4.3.7 Atividade miotxica local in vivo.
Os estudos realizados para determinar o efeito miotxico local das formas modificadas
da PhTX-I in vivo foram feitos em camundongos, inoculando as protenas por via
intramuscular. Resultados anteriores mostraram que PhTX-I nativa incrementa os nveis de
CK plasmticos drasticamente nas primeiras 3 a 6 horas do tratamento, atingindo at nveis de
1423.37 52.89 U/L de CK, para posteriormente voltar a nveis normais, aps 9 horas
(Fig.19). A figura 31 mostra o efeito miotxico induzido pela PhTX-I nativa e as formas
modificadas. Comparando os nveis de CK 3 horas aps iniciado o tratamento, a
miotoxicidade local induzida por PhTX-I foi reduzida em 85% por tratamento com anhidrido
actico (acetilao de Lys), 80% por alquilao com BPB, 72% aps modificao de Tyr
(NBSF) e 20% aps modificao de Trp (NPSC).
Foi investigado tambm o efeito de inibidores sobre a atividade miotxica de PhTX-I.
Os resultados evidenciam que a heparina inibe o efeito miotxico da PhTX-I em 47%, j que
o mximo nvel de CK liberado de 725.94 137.25 U/L s 3 horas de exposio toxina em
 52

comparao a PhTX-I nativa. O EDTA tem maior efeito inibitrio da atividade miotxica da
PhTX-I, reduzindo em 74% esta atividade 3 horas aps a aplicao da toxina.

Figura 31. Representao grfica da atividade miotxica local da PhTX-I nativa e das suas formas
modificadas (AA, NBSF, BPB e NPSC) e incubadas com Heparina (Hep) e EDTA. Mostra-se os nveis
de creatino quinase (CK), incrementados aps 3 horas da administrao intramuscular das protenas
(20 g), (n=5).

4.3.8 Determinao da atividade edematognica.

Para o estudo do efeito das modificaes qumicas da PhTX-I sobre a atividade
inflamatria, verificou-se um dos eventos que ocorre neste processo, a formao de edema.
Para isto PhTX-I e as suas formas modificadas com NPSC, NBSF, AA e BPB, todas na dose
de 1g foram dissolvidas em 50l de PBS, e aplicadas sob a regio intraplantar da pata direita
de camundongos (18 20 g). A pata esquerda recebeu 50l de PBS como controle. As
medidas foram feitas aps 1 hora de aplicao das toxinas.
O edema expresso como o porcentual de aumento em volume da pata direita com
relao pata esquerda. O efeito edematognico induzido pela PhTX-I foi marcadamente
reduzido aps alquilao da His com BPB e acetilao de Lys com anidrido actico (edema
inibido em 70% e 55%, respectivamente). Este efeito foi parcialmente reduzido pela
modificao de resduos de Tyr pelo NBSF (40%). A modificao dos resduos de Trp no
mostrou reduo significativa no efeito edematognico (6%). As comparaes so realizadas
uma hora aps o inico do tratamento (Fig. 32).
 53

Foi avaliado tambm o efeito de inibidores sobre a atividade inflamatria de PhTX-I.

Os resultados evidenciam que a heparina inibe o efeito edematognico da PhTX-I em 32%,
aps uma hora de exposio toxina, j o EDTA teve um maior efeito inibitrio, diminuindo
43% do efeito edematognico induzido pela PhTX-I nativa.

Figura 32 Atividade edematognica da PLA2 PhTX-I, das formas modificadas com NPSC, NBSF, AA
BPB e da inibio com Heparina (Hep) e EDTA em camundongos (18-20g). A medida foi feita 1 hora
aps aplicao das toxinas. Cada ponto representa a mdia o desvio-padro de um grupo de 5
animais.
4.3.9 Determinao da atividade citotxica.
Foi avaliada a atividade citotxica da PhTX-I nativa e as formas modificadas
quimicamente sobre as linhagens celulares NG97 e NCIH-3T3. Foram utilizadas vrias
concentraes da PhTX-I e 200 ou 300g das formas modificadas. A viabilidade celular foi
avaliada pelo mtodo do vermelho neutro, comparando as absorvncias dos tratamentos com
as do controle (clulas no tratadas).
PhTX-I nativa foi citotxica, de maneira dose-dependente, para a linhagem celular de
fibroblastos NIH-3T3 e em menor grau para a linhagem NG97 derivada de astrocitoma
humano grado III (Figs. 33A e B respectivamente). A atividade citotxica da PhTX-I foi
independente da atividade enzimtica devido a que PhTX-I alquilada com BPB (desprovida
de atividade cataltica) induz o efeito citotxico em ambos os tipos celulares. O tratamento
com NPSC no alterou significativamente a atividade citotxica da PhTX-I. Por outro lado,
acetilao e sulfonao dos resduos de Lys e Tyr (PhTX-I tratadas com AA e NBSF,
respectivamente), reduz fortemente a atividade citotxica da PhTX-I em ambos os tipos
celulares.
 54

Figura 33. Atividade citotxica in vitro da PhTX-I nativa e seus derivados modificados quimicamente
com BPB, AA, NBSF, NPSC sobre cultura celular de fibroblastos NCIH-3T3 (A) e cultura celular
NG97 de astrocitoma humano (B). A lise celular foi estimada pelo teste de vermelho neutro. A
viabilidade celular foi determinada comparando a DO apartir das clulas controle (no tratadas),
consideradas como 100% viavis. Os ensaios foram feitos em triplicata. *(p<0.05).

5. DISCUSSO.
5.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
No estado da Amazonia (Brasil) os envenenamentos por picada de serpentes ocorrem
por pelo menos sete serpentes da famlia Viperidae: Bothriopsis bilineata, Bothriopsis
taeniata, Bothrops atrox, Bothrops brazili, Crotalus durissus, Lachesis muta muta e
Porthidium hyoprora (Campos et al., 1999; Otero et al., 2002; Campbell et al., 2004).
Numerosas PLA2 tm sido identificadas e caracterizadas apartir desses venenos (Gutirrez et
al., 1995; Damico et al., 2005; Porto et al., 2007; Huancahuire-Vega et al., 2009; Pereaez et
al., 2009), entretanto, informao respeito a atividades txicas de PLA2 apartir do veneno de
P. hyoprora ainda escassa.
De acordo com ngulo e Lomonte (2009) o isolamento e caracterizao de
componentes individuais do veneno constitui o suporte da Toxinologia, como uma estratgia
fundamental para analisar e entender a srie complexa de eventos envolvidos no
envenenamento.
PLA2 so protenas pequenas, amplamente espalhadas na natureza. Sabe-se que o
veneno de serpentes uma fonte rica de PLA2 e estas enzimas exibem atividades txicas e/ou
 55

farmacolgicas como: mionecrose, anticoagulante, inibio da agregao plaquetria,

cardiotoxicidade, neurotoxicidade, atividade edematognica, citotoxicidade, hipotensiva,
antitumoral, bactericida, etc. (Kini, 2003; Costa et al., 2008; Gutirrez et al., 2009; Pereaez
et al., 2008; Huancahuire-Vega et al., 2009). Entender as bases estruturais para essas diversas
atividades txicas uma tarefa desafiante. No presente trabalho descrevemos a purificao,
caracterizao bioqumica/farmacolgica e a sequencia de aminocidos de duas PLA 2
denominadas PhTX-I e PhTX-II, isoladas a partir do veneno de P. hyoprora, com o objetivo
de entender sua participao nos eventos patofisiolgicos ocasionados pelo envenenamento
desta serpente.
As PLA2 de veneno de serpente tm sido exaustivamente purificadas usando
combinao de mtodos cromatogrficos como excluso molecular, troca inica, HPLC de
fase reversa e afinidade usando inibidores naturais, anticorpos e heparina. (Ownby et al, 1999;
Andrio-Escarso et al, 2002; Bonfim et al., 2006; Ponce-Soto et al., 2007; Pereaez et al.,
2009;). O grupo de trabalho tem otimizado e padronizado a metodologia de purificao de
PLA2 de veneno de serpentes em um nico passo cromatogrfico, utilizando um sistema de
HPLC em coluna C18 de fase reversa. Nestaa cromatografia a separao ocorre com base no
carter hidrofbico da protena de interesse, a qual se liga a uma molcula hidrofbica na fase
estacionria (resina C18) e posteriormente separada dos outros componentes da mistura
original, sendo eluida junto fase mvel sob uma gradiente linear crescente de
hidrofobicidade (Handbook GE). Como resultado do mtodo proposto, vrias toxinas PLA 2
(BmTX-I, Bp-12, BbTX-II, BbTX-III, Cdc-9, Cdc-10, BmjeTX-I, BmjeTX-II, BaSPIIRP4,
Anch TX-I e Anch TX-II) tm sido eficientemente purificadas (Calgarotto et al., 2008;
Randazzo-Moura et al., 2008; Huancahuire-Vega et al., 2009; Romero-Vargas et al., 2010;
Ponce-Soto et al., 2010; Garcia Dengri et al., 2010; Landucci et al., 2012).
O mtodo proposto mostra-se adequado para a purificao das PLA2 PhTX-I e PhTX-
II a partir do veneno de P. hyoprora, pois foi possvel, isolar as protenas em um nico passo
cromatogrfico (HPLC de fase reversa). A figura 6 apresenta o fracionamento do veneno total
resultando em 20 picos, dos quais os picos 10 e 12, denominados PhTX-I e PhTX-II,
respectivamente, mostraram alta atividade PLA2, miotxica e neurotxica e foram selecionado
para realizar sua caracterizao bioqumica e farmacolgica.
Para verificar a homogeneidade das amostras as fraes PhTX-I e II foram re-
purificada em HPLC de fase reversa nas mesmas condies. O perfil cromatogrfico mostra a
presena de um nico pico de eluio para ambas as fraes. (Fig. 7), confirmando o alto grau
de homogeneidade molecular das protenas. A PLA2 PhTX-I, mostra alta atividade especfica
 56

(408333U/mg), ao redor de 1361 vezes mais do que o veneno total (tabela 3), o rendimento
neste processo foi de 13%. PhTX-II uma frao menor, foi purificada 679 vezes com um
rendimento de 4%. Estes valores so maiores do que o obtido por Fuly et al, (2000) (atividade
especfica 1428U/mg, rendimento 1,42%), que purificaram a PLA 2 denominada LM-PLA2-II
em duas etapas (filtrao gel e HPLC-FR), a partir do veneno de Lachesis muta. Esses dados
confirmam a eficincia de utilizar uma etapa de purificao resultando em um melhor
rendimento, alm disso, confirma-se o alto grau de pureza da protena, proporcionando um
grande aumento na atividade especfica em funo da reduo na concentrao de protena,
assim como preservao da seletividade, da capacidade de resoluo e da atividade biolgica.
Vrias PLA2 isoladas a partir de venenos botrpicos so oligmeros contituidos por
duas ou mais subunidades (Magro et al., 2009), entretanto, o perfil eletrofortico em SDS-
PAGE (Fig. 8), revela que a tanto a PhTX-I como a PhTX-II em condies reduzidas e no
reduzidas apresentam uma nica banda eletrofortica com massa molecular relativa em torno
de ~15 kDa, sendo portanto constitudas de uma nica cadeia polipeptdica. Brazilitoxina III
de B. brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009), blD-PLA2 de B. leucurus (Higuchi et al., 2007)
e LmTX-I de L. muta muta (Damico et al., 2005) so algumas das PLA2 de veneno de
serpente que tambm possuem estrutura monomrica.
A anlise da composio global de aminocidos das PLA2 PhTX-I e II mostra que as
protenas possuem carter bsico, apresentando um alto contedo de aminocidos tanto de
carter bsico quanto hidrofbico (tabela 4). A presena de 14 Cys sugere a presena de 7
pontes dissulfeto, caracterstica que contribui para a elevada estabilidade da estrutura terciria
das protenas, concordando com descries reportadas para miotoxinas PLA 2 isoladas de
venenos viperideos (Ponce-Soto et al, 2007; Randazzo-Moura et al., 2008; Calgarotto et al.,
2008; Romero-Vargas et al., 2010).
A massa molecular exata de PhTX-I e PhTX-II obtida por espectrometria de massas
Maldi-tof foi de 14249.22 e 14149,08Da, respectivamente (Fig. 9), mostrando que no existe
diferena significativa com os valores de massa molecular relativa (em torno de 15 KDa)
determinada por eletroforese em SDS-PAGE e a massa molecular calculada (14088.57 e
13511.07 Da) obtidas atravs da anlise de composio de aminocidos, confirmando o alto
grau de pureza e homogeneidade das protenas. Os valores de massa molecular das PLA2
PhTX-I e II so similares a outras PLA2 miotxicas isoladas de veneno de serpente (Ponce-
Soto et al., 2007, 2010; Perumal et al., 2008; Garcia et al., 2010).
Maldi (matrix-assisted laser desorption/ionization desoro e ionizao por laser
assistida por matriz) um mtodo de ionizao suave que durante o processo de desoro e
 57

ionizao so formados ons moleculares predominando geralmente ons de carga nica em

relao massa molecular. Nos espectros de PhTX-I e II mostrados na figura 9 observa-se a
presena da espcie dominante de carga nica e restos de ons moleculares duplamente
carregados e espcies dimricas. Protenas e peptdeos tm grupos funcionais que aceitam
facilmente um prton (H+), por isso a produo de ons positivos maior para muitas
protenas e peptdeos que geralmente so analisados no modo on positivo. Apesar de que
protenas e peptdeos ionizam principalmente como ons moleculares protonados de carga
nica (MH+), podem tambm ser formados pequenas quantidades de ons moleculares
emparelhadas com o sdio (M+Na+), matriz ou outros ons, assim como ons dimricos
protonados (2MH+) aproximadamente duas vezes o valor de m/z e ons moleculares
duplamente carregados (MH2+) com aproximadamente a metade do valor m/z do on
predominante (Karas et al., 2000).
O inserto na figura 9 mostra o espectro de massa Maldi-tof da protena PhTX-I aps
ser reduzida e alquilada com um valor de 15061.2 Da. O incremento de massa de 812 Da em
relao protena nativa indica a presena de 14 resduos modificados de Cys-CAM. As
cisteinas, so os stios favoritos de alquilao devido presena dos grupos SH livres em
protenas reduzidas (Galvani et al., 2001). A presena de 14 resduos de cisteina na estrutura
da protena confirma os resultados obtidos pela anlise de composio de aminocidos, assim
como sugere a presena dos sete pontes dissulfeto, caracterstica que contribui para a elevada
estabilidade da estrutura terciria desta famlia de protenas (Costa et al., 2008; Huancahuire-
Vega et al., 2011).
As protenas foram digeridas com tripsina bovina e os peptidios trpticos obtidos
foram sequenciados via espectrometria de massas. Aps digesto da PhTX-I foram obtidos 18
peptdeos. O sequenciamento de novo de cada peptdeo foi feito por espectrometria de
massas em tandem ESI-Q-TOF/MS/MS. A tabela 5 mostra as massas medidas e a sequencia
deduzida de cada um dos peptdeos obtidos a partir da clivagem trptica da PLA 2 PhTX-I. A
estrutura primria da PLA2 PhTX-I foi determinada comparando as sequencias por
sobreposio dos peptdeos trpticos. A presena de um resduo de acido asprtico na posio
49 na sequencia completa de aminocidos (Figs. 10 e 11), nos permite classificar a PhTX-I
como parte da famlia das PLA2 D49.
O resultado da anlise da estrutura primria mostra que a PhTX-I esta composta de
123 resduos de aminocidos, compartilhando as sequencias conservadas de domnios comuns
ao grupo das PLA2 D49, incluindo as 14 cisteinas, a ala de ligao ao clcio localizada em
(Y)27, (G)29, (G)31, (G)32 e o stio cataltico formado por (H)48, (D)49, (Y)52 e (D)89.
 58

PhTX-I revela a mudana de alguns aminocidos importantes como: (S)1(D)1; (Q)4(E)4;

(Q)7(K)7; (R)34(G)34; (R)70(W)70; I(86)(L)86; (D)118(A)118.
Comparao da sequencia de aminocidos da PLA2 PhTX-I mostra um alto grau de
homologia com outras PLA2 D49 miotxicas provenientes de veneno botrpico (Fig. 11).
Uma das regies altamente conservadas na sequencia de aminocidos das PLA2 a ala de
ligao ao Ca2+, segmento formado pelos aminocidos a partir da (Y)24 at (G35), que
contm quatro resduos de glicina nas posies 26, 30, 32, 33 e dois resduos de cisteina nas
posies 27 e 29. O on clcio coordenado por trs tomos de oxignio a partir dos resduos
(Y)28, (G)30, (G)32 e dois tomos de oxignio do grupo carboxilato do resduo (D)49. Duas
molculas de gua conservadas completam a esfera de coordenao do on clcio, formando
uma geometria pentagonal bipiramidal. Acredita-se que duas pontes dissulfeto (C)27(C)119
e (C)29(C)45 ajudam na orientao relativa correta da ala de ligao ao clcio em relao
aos aminocidos do stio cataltico (Scott et al., 1990). Os resduos (H)48, (Y)52 e (D)99, os
quais so responsveis pela atividade cataltica apresentam uma estereoqumica ideal com a
presena do sistema cataltico, um sistema de ligaes de pontes de hidrognio que inclui a
triada cataltica (Scott et al., 1990). Os resduos que formam a ala de ligao ao Ca 2+ assim
como o sistema cataltico da PLA2 PhTX-I exibem um alto grau de conservao, refletido no
sua alta atividade cataltica (Huancahuire-Vega et al., 2011).
A PLA2 miotxica PhTX-I mostrou tambm completa homologia com outras PLA 2
para os resduos (L)2, (W/F)3, (I)9, (Y)22, (C)29, (C)45 e (A)93, cujas cadeias laterais
hidrofbicas formam as paredes do canal hidrofbico para a ligao com o substrato. As
cadeias laterais de estes resduos so direcionadas ao interior do canal, podendo interatuar
com os fosfolipdios de membrana (Singh et al., 2001).
A regio N-terminal exibe roles importantes para a catlise assim como para algumas
atividades farmacolgicas (Qin et al., 2005) e altamente conservada nas PLA2 ativas
catalticamente. Vrios trabalhos mostram evidencias que os resduos de aminocidos nas
posies (L)2, (Y)3, (Q)4, (K)6, (I)9 (E)12 e (T)13 na regio N-terminal contribuem
funcionalmente facilitando uma orientao adequada da PLA2 na superfcie das membranas
celulares (Qin et al., 2004, 2005). A substituio de (Y)3 por (W)3 e (Q)4 por (E)4 na PLA 2
PhTX-I sugere que os resduos substitudos contribuem no mantimento da configurao do
bolso hidrofbico na regio N-terminal, j que as mudanas presentes na PhTX-I no alteram
a funo cataltica, permitindo que o substrato lipdico tenha acesso ao stio cataltico da
PLA2.
 59

A sequencia de aminocidos da PLA2 PhTX-II tambm mostrou a presena de um

resduo de Asp na posio 49 (Figs. 12A e 13), crucial para a atividade cataltica (Ward e Arni
1996, Calgarotto et al., 2008, Ponce-Soto et al., 2010, Huancahuire-Vega et al., 2009, 2011) e
colocando esta toxina na famlia das PLA2 de veneno catalticamente ativas, de maneira
similar PhTX-I e a muitas PLA 2 purificadas apartir de venenos Viperidios nas quais o Asp49
um aminocido altamente conservado (Damico et al., 2005; Pereaez et al., 2009).
As PLA2 de veneno de serpente compartem caractersticas estruturais comuns como a
o sistema cataltico, a ala de ligao ao clcio e o stio de reconhecimento interfacial (Magro
et al., 2009). Uma regio altamente conservada na sequencia de aminocidos das PLA 2 o
segmento de Tyr25 a Gly35. A presena de dois resduos de Cys e quatro resduos de Gly
sugere um esqueleto conformado especificamente e bem definido. A estrutura cage-like
com trs tomos de oxignio dos grupos carbonila dos resduos Tyr28, Gly30 e Gly32
expostos para o interior sugerem um possvel rol no sequestro do clcio. Isto implica que a
presena do clcio parece estabilizar o loop e outras partes da estrutura da protena provendo
uma forte interao coordenada com os aminocidos antes mencionados e tomos de oxignio
do Asp49 junto com dois tomos de oxignio de duas molculas de agua (Westerlund et al.,
1992; Carredano et al., 1998). O terceiro peptidio obtido aps a digesto triptica da PhTX-II
(Tabela 6 e Fig. 12B) evidencia a presena dos aminocidos envolvidos na ligao ao clcio,
fato refletido na alta atividade cataltica exibida pela toxina.
Os resduos His48, Tyr52, Asp99 e Asp49 presentes na estrutura da PhTX-II so os
responsveis diretos pela atividade cataltica da toxina, j que, como foi demonstrado nas
estruturas cristalogrficas de outras PLA2, como a PrTX-III de B. pirajai (com a qual a PhTX-
II comparte homologia), este sistema cataltico possui uma conformao estereoqumica
ideal composta de um sistema de pontes de hidrognio os quais envolvem a triada cataltica.
Adicionalmente o stio ativo inclui uma molcula nucleoflica de agua, a qual possui uma
densidade eletrnica bem definida e forma duas pontes hidrognio com His48 e Asp49
(Ridgen et al., 2003).
Foi determinada a composio da estrutura secundria das PLA2 PhTX-I e PhTX-II
atravs de dicrosmo circular. As protenas so molculas cuja estrutura permite interagir com
aluz circularmente polarizada, devido presena de dois cromforos principais: as ligaes
amdicas e as estruturas aromticas. As primeiras so responsveis pelo sinal caracterstico no
UV distante (abaixo de 250nm), sendo utilizadas como sondas para estruturas secundrias de
protenas (-hlices, folhas -pregueadas e random coil). As estruturas aromticas so
responsveis pelo sinal UV prximo (250 300nm) e so utilizadas para avaliar a estrutura
 60

terciaria de protenas. Considerando isso, a tcnica de CD utilizada para estimar a

quantidade de estrutura secundria de protenas (Kely et al., 2005).
A avaliao dos sinais caractersticos de estruturas secundrias nos espectros de CD
pode ser feita com o auxilio de programas computacionais que avaliam o espectro de CD de
uma protena. Estes programas comparam o espectro a ser analisado com um banco de dados
de espectros de CD de protenas que j possuem suas estruturas em alta resoluo
determinadas (Greenfield, 1996). CDNN Deconvolution foi o programa utilizado para
analisar os espectros CD obtidos apartir das PhTX-I e II. A anlise dos espectros (Fig. 14)
indica que a estrutura secundria predominante destas toxinas PLA2 consiste de -hlices. A
contribuio de 30% de -hlice na sua estrutura compatvel com as estruturas
cristalogrficas das PLA2 de veneno viperidio (Fig. 2) nas quais evidenciada a presena de
trs -hlices que fazem parte da regio N-terminal e o canal hidrofbico de acesso ao stio
cataltico, sendo estas regies relacionadas com funes importantes para a catlise assim
como para as atividades farmacolgicas (Kao et al., 2008, Diz Filho et al., 2009, Toyama et
al., 2011).
Estas caractersticas estruturais comuns s PLA2 foram refletidas na alta atividade
enzimtica tanto da PhTX-I como da PhTX-II, as quais apresentaram maior atividade PLA2
do que o veneno total de P. hyoprora (Fig.15A), devido maior concentrao das enzimas em
soluo do que no veneno bruto. Esses valores (10 - 14 nmoles/min) correspondem a PLA 2
com alta atividade cataltica (Pereaez et al., 2009; Calgarotto et al., 2008; Huancahuire-Vega
et al., 2009).
Breithaupt (1976) reportou que as PLA 2 de veneno apresentam comportamento
cintico Michaelis-Menten frente a substratos micelares. Entretanto, as PLA 2 PhTX-I e II
mostraram um comportamento sigmoidal principalmente em baixas concentraes de
substrato (Fig. 15B), resultados que concordam com o descrito por Pereaez et al., 2009 para
a PLA2 Cdcum6 de Crotalus durissus cumanensis e por Calgarotto et al., 2008 para a BmTX-I
de B. moojeni. Atividade enzimtica tima ocorreu em pH 8 e foi inativada a pH maiores de 9
e menores que 7 (Fig. 15C).
Tanto PhTX-I como PhTX-II so relativamente resistentes ao calor, a temperatura
tima para as duas enzimas foi ~37 oC, e a atividade enzimtica persistiu at 45 oC (Fig. 15D),
indicando que estas enzimas so relativamente estveis ao calor, similarmente a outras PLA2
(Kini, 1997; Damico et al., 2005). Devido sua natureza pecilotrmica, a variao da
temperatura corporal dos rpteis afeta muitos processos fisiolgicos e de desenvolvimento
(Peterson et al., 1993). Molculas com estruturas rgidas e estveis que possam manter a sua
 61

funcionalidade frente s variaes de temperatura do ambiente so necessrias para a

sobrevivncia das serpentes. A estrutura rgida das PLA 2, que so enzimas pequenas
estabilizadas por 7 pontes dissulfeto intracadeia importante para manter a atividade
enzimtica em um mbito maior de temperatura.
bem conhecido que o Ca2+ um cofator indispensvel para cumprir a atividade
enzimtica das PLA2 de veneno de serpente. Ento poderia esperar-se que vrios ctions
possam substituir o Ca2+ nesta ao cataltica. Para avaliar sua influencia na atividade
cataltica das PLA2 PhTx-I e PhTX-II foram usados quatro ctions divalentes (Mg2+, Mn2+,
Cd2+, Zn2+) (Fig. 15E e F, respectivamente). Os resultados mostraram que PhTX-I e II
precissam de forma obrigatria o clcio para quebrar o substrato e que a substituio do clcio
por outros ons divalentes no substituem o papel deste ction.
Isto pode ser explicado pela coordenao geomtrica adotada pelo intermediario
tetraedrico devido presena do on clcio, o qual determina o comportamento eletroflico do
stio cataltico, assim como estabiliza a ala de ligao ao clcio e parece otimizar a
conformao da protena no local de interao com o substrato (Scott et al., 1990; Yu et al.,
1993).
Sabe-se tambm que a ligao do Ca2+ s PLA2 induz mudanas sutis na configurao
do stio ativo necessrias para exercer a atividade enzimtica (Chang et al., 1996). Scott et al
(1990) descreve no sitio cataltico a presena do aminocido Asp-49 que imobiliza o on Ca 2+,
o qual interage com o fosfato e oxignio do grupo carbonil da ligao ster na posio sn-2 do
fosfolipdio. Essa interao faz com que o oxigeno que tem dupla ligao com o carbono sn-2,
fique temporalmente mais negativo (altera a distribuio de cargas eltricas do ster),
fragilizando a dupla ligao (comportando-se como uma ligao simples) induzindo que o
carbono da ligao sn-2 fique mais positivo. Essa ligao fica exposta reao cataltica que
consiste no ataque nucleoflico do oxignio (que tem carga residual negativa) pertencente a
uma molcula de gua (imobilizada pelo anel imidazlico da His 48 presente no sitio
cataltico). Portanto o on Ca2+ direciona o posicionamento do substrato no stio ativo da
enzima sugerindo que esse arranjo do stio cataltico apresenta uma conformao exclusiva
para o Ca2+, o que explicaria a diminuio da atividade enzimtica tanto da PhTX-I como da
PhTX-II na presena dos outros ctions (Fig. 15E e F, respectivamente).
Os ons Mg2+ e Sr2+ induzem configuraes no apropriadas na enzima que acabam
diminuindo a atividade PLA2 da -bungarotoxina (Chu et al., 2005). Inibio da PLA2 da
serpente chinesa Naja naja naja pelos ctions Ba2+ e Cd2+ mostram caractersticas cinticas de
inibidores competitivos convencionais que deslocariam o Ca2+ do sitio ativo (Mezna et al.,
 62

1994). Zn2+ conhecido como um forte inibidor de enzimas PLA2, mas a sua atividade
inibitria baseia-se no modelo em que a enzima ativada por dois ons Ca 2+, um essencial e
pode ser deslocado por Ba2+, o outro modula a atividade e pode ser deslocado por Zn 2+
(Mezna et al., 1994).
Os estudos cinticos das PLA2 PhTX-I e PhTX-II esto de acordo com as
caractersticas das PLA2 de veneno de serpente que incluem alta estabilidade, devido grande
quantidade de pontes dissulfeto intracadeia e a necessidade de Ca 2+ como cofator para
manuteno da atividade enzimtica.

5.2 Caracterizao farmacolgica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.

Envenenamento por picada de serpente um problema de saude pblico mundial,
particularmente em pases tropicais e subtropicais. Para entender como o veneno exerce sua
toxixicidade requere-se dados quantitativos sobre a ocorrncia de toxinas individuais e suas
atividades em determinados venenos (Calvete et al., 2009). Com essa finalidade foi
investigado um perfil de atividades txicas induzidas pelas PLA 2 PhTX-I e PhTX-II e pelo
venenototal de P. hyoprora, incluindo neurotoxicidade, miotoxicidade, atividade
edematognica e citotxica.
Algumas PLA2 agem especificamente no sistema nervoso perifrico paralisando a
vtima, como as neurotoxinas produzidas pelas serpentes Bungarus multicinctus (-
bungarotoxina), Oxyuranus scutellatus scutellatus (taipoxina) e Pseudonaja textilis
(textilotoxina) (Prasarnpun et al., 2005). Outras PLA2 afetam tanto o sistema nervoso
perifrico assim como o msculo esqueltico, como a crotoxina de C. d. terrificus (Gutirrez
et al., 2008), que alm do bloqueio neuromuscular, induzem miotoxicidade sistmica,
associado com incrementos na atividade plasmtica de enzimas derivadas de msculo como a
creatino kinase (CK) (Warrell, 1995; Gutirrez et al., 2008).
As PLA2 das serpentes da famlia Viperidae (gneros Bothrops, Porthidium,
Bothriopsis) agem principalmente no msculo produzindo mionecrosis local pronunciada
(Lomonte et al., 2003; Gutirrez et al., 2008). Embora a atividade miotxica destas PLA2
acompanhada por outros efeitos txicos como edema, hiperalgesia e liberao de citoquinas
pr-inflamatrias (Lomonte et al., 2003), no h evidencias clinicas reportadas de
neurotoxicidade. por isso que elas tm sido classificadas como miotoxinas no neurotxicas
(Lomonte et al., 2003). Porm, uma srie de estudos usando preparaes neuromusculares ex
vivo isoladas de aves e mamferos, vm mostrando que as PLA2 de espcies da famlia
 63

Viperidae induzem bloqueio da transmisso neuromuscular (Gallacci et al., 2006; Ponce-Soto

et al., 2007; 2010; Randazzo-Moura et al., 2008; Calgarotto et al., 2008; Huancahuire-Vega et
al., 2009; Romero-Vargas et al., 2010).
No presente trabalho, foi avaliada a atividade neurotxica ex vivo do veneno total de P.
hyoprora e das PLA2 PhTX-I e PhTX-II, usando a preparao biventer cervicis isolada de
pintainho, nas doses de 20g/ml de veneno total e concentraes finais de 0,7 e 1,4M de
PhTX-I e PhTX-II. O veneno total e as PLA2 PhTX-I e PhTX-II induziram bloqueio
neuromuscular irreversvel, diminuindo a resposta contrtil aps a aplicao das toxinas nas
diferentes concentraes (Fig. 16).
Abreu et al., 2007 observou que as preparaes neuromusculares de ave so mais
sensveis para os venenos botrpicos do que as preparaes de mamferos, em concordncia
com essa afirmao tanto a PhTX-I como a PhTX-II (1,4M) bloquearam o 50% da resposta
neuromuscular ao redor de 20 minutos (Fig. 17). Eficiencia similar foi observada para a
LmTX-I, uma PLA2 D49 com atividade neurotxica isolada do veneno de L. muta muta
(Damico et al., 2006).
A preparao neuromuscular biventer cervicis possui fibras musculares com
inervaes multifocais. Esta preparao pode ser estimulada indiretamente atravs de pulsos
breves no nervo motor, ou diretamente no msculo. Isto permite discriminar entre efeitos
neurotxicos e miotxicos de um veneno ou toxina. Enquanto a neurotoxicidade causa s a
inibio dos estmulos indiretos, a miotoxicidade induz inibio dos estmulos diretos e
indiretos (Harvey et al., 1994).
Uma vantagem adicional da preparao biventer cervicis de pintainho que pode
responder estimulao eltrica e aos agonistas nicotnicos exgenos. Isso permite diferenciar
entre venenos ou toxinas com efeitos pr-sinpticos ou ps-sinpticos. Uma neurotoxina pr-
sinptica inibe os estmulos indiretos sem afetar a resposta aos agonistas colinoceptores ou a
resposta ao estmulo direto no msculo por estimulao induzida pelo KCl. Neurotoxinas ps-
sinpticas inibem a resposta aos agonistas colinoceptores assim como ao estmulo indireto,
mas no afetariam s concentraes elevadas de K+ ou aos estmulos musculares diretos. A
presena de componentes miotxicos no veneno evidenciada por reduzir a resposta de um
msculo esqueltico a estmulos eltricos diretos ou exposio a concentraes elevadas de
K+ e/ou iniciar contratura muscular (Harvey et al., 1994).
O veneno total (20g/ml) produz contratura, assim como reduz a resposta ao KCl e
ACh aps incubao (Fig. 19). Tal inibio poderia envolver dano nos receptores nicotnicos
 64

ocasionados por proteases presentes no veneno assim como dano s fibras musculares (Prianti
et al., 2003) como acontece com o veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis (Rodrigues-
Simioni et al., 2004). Por outro lado o bloqueio neuromuscular produzido pelas PLA 2 PhTX-I
e PhTX-II na concentrao de 0,7M no afetou a resposta ao potssio (KCl) e a acetilcolina
(ACh) (Fig. 19), indicando que a toxina em baixas concentraes no tem ao sobre os
receptores ps-sinpticos colinrgicos e nem causou dano muscular que impedisse a
contratura em resposta ao KCl. Neurotoxinas com atividade pr-sinapticamente so capazes
de abolir a resposta contrtil sem afetar a resposta aos agonistas colinrgicos (Harvey et al.,
1994).
Entretanto concentraes maiores das PLA2 (1,4) aumentaram a linha de base no
registro miogrfico (Figs. 17C e D), com indicio de contratura muscular leve, assim como
inibio em resposta ao KCl e ACh (Fig. 19), sugerindo danos ocasionados na membrana
muscular e nos receptores nicotnicos da membrana subsinptica (Harvey et al., 1994). O fato
das PLA2 PhTX-I e PhTX-II no afetarem significantemente a resposta da ACh e KCl, a no
ser em altas concentraes, sugere sua ao pr-sinptica primordial. Resultados similares
foram encontrados para as PLA2 BmTX-I, BmjeTX-I e II, isoladas de venenos Viperidios
(Calgarotto et al., 2008, Ponce-Soto et al., 2010).
importante apontar uma clara diferena entre o efeito bloqueador neuromuscular ex
vivo de toxinas capazes de bloquear a transmisso neuromuscular em preparaes isoladas,
mas que no exercem neurotoxicidade in vivo como as PLA2 Lys 49 homlogas, e o efeito
neurotxico daquelas toxinas que exercem ao neurotxica in vivo como as tpicas
neurotoxinas pr e ps-sinpticas de serpentes Elapidios. Esta afirmao foi recentemente
remarcada direcionada principalmente s PLA2 K49 homlogas (Lomonte, 2003; Gallacci e
Cavalcante, 2010), mas que pode ser estendida tambm s PLA 2 D49 de veneno de serpentes
da famlia Viperidae, devido a que o envenenamento por estas serpentes no apresenta sinais
de neurotoxicidade ou so clinicamente irrelevantes.
O veneno de serpentes da famlia Viperidae (que inclui gneros Bothrops, Lachesis,
Porthidium, etc), induz predominantemente mionocrose local em animais de experimentao
(Gutirrez e Ownby, 2003), e necrose do tecido muscular ao redor do local da picada, de
acordo com observaes clnicas (Warrell, 2005). Esta mionecrose causada principalmente
pelas PLA2. Alm da mionocrose, as PLA 2 encontram-se consideradas entre os principais
mediadores da desgranulao de mastcitos, edema e inflamao (Texeira et al, 2003) e
miotoxicidade em mioblastos e miotubos (Angulo e Lomonte, 2005).
 65

A miotoxicidade definida como habilidade da toxina para induzir necrose na

musculatura esqueltica in vivo, a partir de injeo intramuscular ou, ex vivo, atravs da
incubao com msculos esquelticos diferenciados (Gutierrez e Ownby, 2003; Lomonte et
al, 2003) e evidenciada pela capacidade de aumentar os nveis plasmticos de CK aps a
injeo intramuscular ou intravenosa. As PLA2 miotxicas esto entre os principais fatores
responsveis pela necrose da musculatura esqueltica observada em casos de envenenamento
por serpentes e acredita-se que este evento ocorra devido ligao destas miotoxinas
membrana plasmtica das fibras musculares, levando alterao na sua permeabilidade
(Rufini et al, 1996).
Veneno total e as PLA2 PhTX-I e PhTX-II aumentaram drasticamente os nveis de CK
plasmticos aps serem inoculada no musculo gastrocnemio de camundongos (Fig. 19), este
aumento de CK evidencia dano muscular severo nas fibras musculares injetadas com a toxina,
deixando notrio seu efeito miotxico local. Contrariamente, quando administradas por via
intravenosa, os nveis de CK plasmtico tiveram valores semelhantes ao controle (Fig. 20),
evidenciando a falta de miotoxicidade sistmica.
Este tipo de miotoxicidade local caracterstica do veneno das serpentes Viperidae,
cujas PLA2 afetam predominantemente os msculos localizados na regio onde o veneno foi
injetado. (Milani et al., 1997). As miotoxinas PLA2 do veneno das espcies Viperidias
caracterizam-se por induzir dano muscular localizado, de ao rpida, e pouca miotoxicidade
adicional ocorre aps esse dano inicial. Provavelmente as PLA2 PhTX-I e PhTX-II, no tem
especificidade e se ligam s clulas musculares e no musculares no lugar da injeo. Esta
idia concorda com a hiptese de ao diferenciada para miotoxinas que agem local ou
sistemicamente proposta por Gutierrez e Ownby, (2003) e a hiptese geral proposta por Kini e
Evans, (1989), atravs da qual se explica a especificidade farmacolgica das PLA 2 de veneno.
Estas PLA2 miotxicas locais unem-se predominantemente a diferentes tipos celulares, alm
de fibras musculares, e chegam a ser rapidamente seqestradas aps injeo.
Por outro lado, as PLA2 miotxicas sistmicas como as PLA2 F6 e F6a de Crotalus
durissus collilineatus (Gutierrez et al, 2008) possuem alta seletividade para fibras musculares
esquelticas e no se unem s outras clulas. Esta especificidade permite s miotoxinas
sistmicas difundirem alm do stio de injeo, alcanando a corrente sangnea e clulas
musculares distantes, causando rabdomiolise. Gutierrez e Ownby, (2003) propem que as
PLA2 miotxicas ligam-se aos receptores da membrana plasmtica, os quais poderiam se
tratar de lipdios ou protenas, podendo diferir sua afinidade pelas PLA 2. Ao se ligar, estas
PLA2 miotxicas produzem uma destruio da membrana plasmtica atravs de mecanismos
 66

catalticos ou mecanismos independentes de atividade PLA2, provocando uma entrada de Ca2+

do fluido extracelular ao citosol, elevando rapidamente a concentrao desse ction. Tal
influxo de Ca2+ inicia uma srie de processos celulares degenerativos que levam clula a
um ponto de no retorno. As principais conseqncias do incremento de Ca 2+ so:
hipercontrao de miofilamentos, alteraes mitocondriais, ativao de PLA 2 citoslicas e
proteases Ca2+-dependentes com as calpainas, etc (Montecucco et al., 2008).
A especificidade do efeito miotxico in vivo das PLA2 de veneno tem sido atribudo
existncia de stios de ligao especficos na membrana plasmtica de clulas musculares
esquelticas, mas sua natureza exata ainda desconhecida. Algumas protenas aceptoras de
alta afinidade tm sido identificadas em tecido neuronal (Krizaj e Gubensek, 2000). Por outro
lado uma protena de membrana multidominio de 180 kDa conhecida como receptor tipo M
foi caraterizada como um stio de ligao para algumas PLA2 do grupo I em msculo
esqueltico (Lambeau et al., 1990). Entre tanto no existem evidencias do envolvimento de
receptores tipo M no efeito miotxico pelas PLA2 do grupo II.
Alternativamente miotoxinas PLA2 do grupo II poderiam atuar atravs de
reconhecimento de lipdios de membrana, tais como glicerofosfolipidios ou glicolipidios que
podem ser expressos diferencialmente, ou diferencialmente agrupados, em mioblastos e
miotubos. Varias observaes sugerem que fosfolipdios carregados negativamente (Diaz et
al., 2001) podem ser aceptores importantes para o mecanismo miotxico destas protenas
(Gutirrez e Ownby 2003).
A miotoxicidade induzida pelo veneno total pode se dever a uma ao direta das
miotoxinas sobre as membranas plasmticas das fibras musculares ou indireta como
consequncia dos danos ocasionados nos vasculatura e a isquemia cusada por hemorraginas
metaloproteases (Abreu et al., 2007; Prianti et al., 2003).
As miotoxins PLA2 de veneno alm de ocasionar necrose muscular (Gutirrez e
Ownby, 2003), causam edema e inflamao (Teixeira et al., 2003). Uma reao inflamatria
aguda o mecanismo de defesa caracterizado por exudao de fluidos e protenas plasmticas
levando formao de edema local formado por componentes leuccito-dependentes e
leuccito-indepedentes. Essas mudanas vasculares so produzidas por diferentes mediadores
os quais agem incrementando a permeabilidade microvascular, para macromolculas nas
vnulas ps-capilares aumentando dessa maneira o efluxo de protenas plasmticas (Texeira
et al, 2003).
No presente trabalho avaliamos a resposta inflamatria local produzida pelo veneno
total e as PLA2 PhTX-I e PTX-II de P. hyoprora atravs da formao de edema em pata de
 67

camundongo. Os resultados demonstram que tanto o veneno como as PLA2 PhTX-I e PhTX-II
induzem edema pronunciado em pata de camundongo (Fig. 21). Esta atividade foi tempo-
dependente e atingiu a resposta mxima nos primeiros 30 minutos.
A formao de edema induzido pelo veneno de P. hyoprora de comportamento
similar a outros venenos Viperidios incluindo B. asper (Chaves et al., 2006), B. insularis
(Barbosa et al., 2003), B. moojeni (Calgarotto et al., 2008) e Lachesis muta muta (Ferreira et
al., 2009). As PLA2 PhTX-I e II induziram edema em pata de camundongo na mesma
magnitude que o veneno total, provavelmente pelo menos parte das aes inflamatrias do
veneno total so devidas a estas miotoxinas. Porem, outros componentes do veneno tais como
serinoproteases, metaloproteases ou lectinas podem contribuir tambm para as propriedades
edematognicas do veneno total.
Sabe-se que as PLA2 possuem um papel importante nos processos inflamatrios
devido a que fornecem precursores para substancias lipdicas pro-inflamatrias como
mediadores derivados do cido araquidnico e fatores ativadores de plaquetas (Teixeira et al.,
2003), mas, os mecanismos pelos quais os venenos induzem edema no esto claros, o que
torna necessrios mais estudos para investigar com detalhes se as PLA 2 induzem edema por
produtos da via lipoxigenase ou atravs de produtos da via cicloxigenase.
Mionecrose pode ser o impulso para desencadear a atividade proinflamatoria e a
liberao sistmica da interleucina-6 (IL-6), de acordo com observaes apresentadas pela
miotoxina II (PLA2 K49) do veneno de B. asper (Nuez et al., 2004) e BmTX-I de B. moojeni
(Calgarotto et al., 2008). IL-6 a primeira citocina multifuncional envolvida na regulao da
resposta imune, hematopoese, e inflamao (Akira et al., 1990) e nveis incrementados tm
sido documentados em envenenamentos clnicos por espcies botrpicas (Barraviera et al.,
1995; Avila-Aguero et al., 2001). Foram dosados os nves de IL-6 plasmticos aps injeo
intramuscular do veneno total de P. hyoprora e da miotoxina PhTX-I. Os resultados mostram
que a PLA2 PhTX-I induz elevao sistmica dos nveis de IL-6 em camundongos, na mesma
magnitude que o veneno total (Fig. 22).
Os tecidos lesados pelas miotoxinas PLA2 que exercem ao local so rapidamente
infiltrados por leuccitos. Como em outros processos agudos, no envenenamento em modelos
animais em que se usaram venenos botrpicos, as primeiras clulas do infiltrado inflamatrio
a extravasar so os neutrfilos polimorfonucleares, sendo gradualmente substitudos pelo
aparecimento de clulas mononucleares, moncitos e linfcitos (Farsky et al., 1997). As
clulas do infiltrado so uma fonte importante de mediadores como as citocinas, produzidas
no somente pelos leuccitos do infiltrado, mas tambm pelas clulas residentes nos tecidos
 68

lesados. Uma rpida induo de IL-6, detectvel sistemicamente desde a primeira hora foi
observado ao injetar-se uma miotoxina PLA 2 purificada do veneno de B. moojeni em
camundongos, sugerindo que a produo desta citocina dependente do dano tissular, dando
inicio a uma resposta da fase aguda (Calgarotto et al., 2008). Elevao dos nveis sricos de
IL-1, IL-8, interferon-gama (IFN-), fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e xido ntrico
(NO) foram observados aps injeo intraperitoneal de veneno de B. asper, B. jararaca, B.
atrox em camundongos (Barros et al., 1998; Petricevich et al., 2000). O papel desempenhado
por estes mediadores na patognese do envenenamento no foi ainda estabelecido.
Em pacientes picados por Bothrops sp. e C. d. terrificus tem sido documentados
elevao de IL-6 srica (Avila-Aguero et al., 2001), esses achados abrem a possibilidade de
interferir na leso tissular local e nos efeitos sistmicos dos venenos, mediante no s a
tradicional soroneutralizao, mas tambm, pela modulao de alguns mediadores
inflamatrios.
Estudos usando uma variedade de linhagens celulares em cultura tem demonstrado que
as PLA2 do grupo II exercem ampla atividade citoltica a qual se correlaciona com sua
atividade miotxica in vivo (Lomonte et al., 1999). O uso de cultura de mioblastos e miotubos
como alvos para as PLA2 do grupo II tem sido proposto como um modelo in vitro til para
estudar os mecanismos miotxicos, assim como sua correlao com a atividade de leso
muscular observada in vivo (Angulo e Lomonte, 2005). Este estudo investigou se a fuso e
diferenciao de mioblastos C2C12 os torna mais susceptveis ao citoltica da miotoxina
PhTX-I do veneno de P. hyoprora.
A miotoxina PhTX-I assim como o veneno total no evidenciaram efeito citoltico em
clulas mioblastos de msculo esqueltico em doses baixas (5 10g/poo) (Fig. 23A).
Entretanto uma maior susceptibilidade de miotubos foi claramente observada usando a
miotoxina PhTX-I com doses a partir de 5g/poo (Fig. 23B). Este resultado devido
provavelmente habilidade desta toxina em desestabilizar a membrana celular que parece
envolver a expresso de um maior nmero de receptores na membrana plasmtica. A
diferenciao de mioblastos em miotubos deve levar a mudanas que favoream
especificamente a ao de miotoxinas PLA2 do grupo II, provvel que essas mudanas
envolvam a expresso de um maior nmero, ou um tipo de afinidade maior, de stios
receptores na membrana plasmtica para as PLA2 miotxicas. No entanto, a possvel
participao de processos intercelulares surgidos aps a fuso de mioblastos, como observado
causando maior dano em miotubos, no pode ser excluido (Angulo e Lomonte, 2005).
 69

Nossos resultados de citotoxicidade da PLA2 PhTX-I de P. hyoprora em mioblastos e

miotubos confirmam o proposto por Angulo e Lomonte (2005), ao mostrar um incremento dos
nveis de lactato desidrogenase (LDH) em cultura celular de miotubos, mostrando uma maior
susceptibilidade que em mioblastos C2C12. Por outro lado, doses elevadas de veneno total de
P. hyoprora ou da PLA2 PhTX-I (20, 30 e 40g/poo) causaram efeitos citolticos
significantes tanto em mioblastos como em miotubos, provavelmente devido interao com
stios no especficos da membrana celular, como resultado da alta concentrao das toxinas.
Numerosas PLA2 de veneno apresentam atividade citoltica sobre outros tipos
celulares, incluidos clulas cancerosas, como as PLA2 de B. jararacussu (Bonfim et al.,
2006), as PLA2 de N. naja (Das et al., 2011) e as PLA2 MTX-I e II de B. brazili (Costa et al.,
2008), entre outras. PhTX-I e PhTX-II foram capazes de produzir citotoxicidade em clulas
da linhagem NIH-3T3 de fibroblastos de maneira dose-dependente (Fig. 24A). PhTX-II
comparte maior grau de homologia com PLA2 que apresentam alta atividade citotxica sobre
diversas linhagens celulares, como LmTX-I e a toxina de Mojave (Fig. 13) (Ziolkowski e
Bieber, 1992; Damico et al., 2007), esta caracterstica estrutural foi refletida numa atividade
citotxica mais pronunciada do que a PhTX-I.
Adicionalmente, PhTX-I foi citotxica em altas concentraes sobre linhagem celular
NG97 derivada de astrocitoma humano grado III (Fig24B). O mecanismo molecular de ao
citotxica das PLA2 ainda desconhecido, alguns autores propuseram que a atividade
citotxica sobre clulas tumorais est associada com a induo de apoptose (Cummings et al.,
2008) e a atividade PLA2 proposta por acelerar o turnover de fosfolipdios os quais
influenciam nas mudanas na membrana que acontecem durante a apoptose (Panini et al.,
2001). Entretanto, a relao entre a eficiencia cataltica das PLA 2 e sua atividade citotxica
ainda no so claramente definidos. Algumas PLA 2 homlogas como a MTX-II exercem suas
atividades farmacolgicas, incluida a atividade citotxica independentemente da atividade
cataltica (Costa et al., 2008).

5.3 Modificaes qumicas na miotoxina PhTX-I e seus efeitos sobre suas atividades
enzimtica, farmacolgicas e estruturais.
As relaes estrutura-funo de vrias PLA 2 provenientes de venenos de serpente tm
sido pesquisadas extensamente. Com objetivo de elucidar estruturalmente os stios
responsveis da toxicidade tem-se utilizado vrias metodologias, tais como modificaes
qumicas, mutaes sitio-dirigidas, tcnicas cristalogrficas, espectrofotomtricas e
fluoromtricas, assim como ressonncia magntica nuclear e estudos da ao de inibidores e
 70

substratos naturais ou artificiais (Diaz-Oriero et al., 1997, Romero-Vargas et al., 2010, Soares
e Giglio, 2003).
Com o objetivo de entender as relaes estrutura-funo da PLA 2 PhTX-I,
descrevemos as modificaes qumicas de resduos especficos (His, Lys, Tyr, Trp), e inibio
por heparina e EDTA e os efeitos de tais modificaes sobre as suas propriedades enzimticas,
farmacolgicas e estruturais.
A PhTX-I foi submetida a modificaes qumicas nos resduos de 1) His, pelo brometo
de p-bromofenacila (BPB); 2) Tyr, pelo fluoreto 2-nitrobenzenesulfonil (NBSF); 3) Trp, pelo
cloreto de o-nitrofenilsulfenil (NPSC) e 4) Lys, pelo anidro actico (AA). O tratamento
qumico de protenas pode resultar em modificaes de resduos mltiples devido a que um
aminocido pode encontrar-se em vrias posies na protena ou podem acontecer reaes
qumicas no especficas. Alguns experimentos foram realizados para determinar se hoube
alguma alterao na estrutura da PhTX-I, assim como para avaliar o nmero e a
especificidade de resduos que foram modificados aps cada tratamento qumico.
Para verificar a homogeneidade e a integridade estrutural das protenas modificadas
foi corrido um gel SDS-PAGE, como mostrado na figura 25 tanto a PhTX-I nativa como as
formas modificadas migraram similarmente na eletroforese, evidenciando a presena de uma
nica banda eletrofortica para cada uma das protenas, demonstrando alta homogeneidade
das amostras assim como pequena ou nehuma alterao aparente da massa molecular das
formas protecas modificadas da PhTX-I.
ESI (Electrospray Ionisation) um mtodo de ionizao suave que durante o processo
as amostras so ionizadas pela adio ou remoo de um prton, com muito pouca energia
extra para causar fragmentao dos ons produzidos. Amostras com massas moleculares
superiores a 1200 Da do origem a ons multicarregados (M+nH) n+ no modo de ionizao
positivo. Ionizao positiva usada em geral para anlise de protenas e peptdeos, devido a
que tm vrios locais adequados para protonao, ja que todos os tomos de nitrognio do
esqueleto amida podem ser protonados tericamente, assim como certas cadeias laterais de
aminocidos como lisina e arginina, as quais contem uma amina primria (Karas et al., 2000).
A figuras 26 mostra os espectros de massa molecular das formas modificadas da
PhTX-I, determinadas por espectrometria de massas ESI (ionizao positiva). Cada pico
representa a molcula proteica levando um diferente nmero de cargas (prtons) (Fenn et al.,
1989). Nas figuras insertas em cada espectro, mostra-se a deconvoluo dos espectros obtidas
com ajuda do software Maxium Entropy. A forma modificada nos resduos de Trp com o
reagente NPSC, apresenta uma massa molecular intacta de 14470.61 Da, com um aumento de
 71

221.39 Da em relao massa da protena nativa PhTX-I, cuja massa molecular 14249.22
Da (Huancahuire-Vega et al., 2011). Esse valor de aumento na massa indicaria a modificao
de um nico resduo de Trp, j que muito prximo do valor de massa do reagente
incorporado (221.62). A forma modificada com anidro actico (massa molecular 14537.90
Da), evidencia que o reagente estaria acetilando 7 residuos de Lys, devido a que existe um
aumento de 288.60 Da, equivalente com sete vezes o valor da massa do radical acetil
incorporado no grupamento amino das lisinas (42 Da).
NBSF (p-Nitrobenzenesulfonil fluoride) um reagente especfico para modificao de
resduos de Tyr em protenas, como foi evidenciado em outras PLA 2 (Andrio-Escarso et al
2000; Soares et al., 2001b). A forma modificada da PhTX-I com NBSF teve uma massa
molecular de 15068.96 Da, 819.74 Da acima do valor da toxina nativa, evidenciando
modificao de minimamente 4 resduos de Tyr (aumento de 187.16 Da em cada resduo,
correspondentes poro do reagente NBS que estaria sendo incorporado). Alquilao do
resduo de His nas PLA2 com BPB vm sendo uma estrategia usada para entender as relaes
estrutura-funo desta famlia de protenas (Yang, 1997). PhTX-I alquilada com BPB teve
uma massa molecular de 14440.70 Da, o que indica a modificao de um nico resduo de
His.
Comparao da anlise de composio de aminocidos da protena PhTX-I nativa com
as formas modificadas (tabela 7), mostra que sete resduos de lisina foram modificadas,
confirmando os dados obtidos na espectrometria de massas. Acetilao de resduos de lisina
de 3 miotoxinas PLA2 bsicas botrpicas (PrTX-I, PrTX-III e BnSP-7), causaram uma perda
completa da basicidade, sendo demonstrado por anlise eletrofortica (Soares et al., 2000a;
2001a), entretanto a acetilao da PhTX-I estaria modificando menos do 50% de resduos de
lisinas, tendo a protena modificada um comportamento igual protena nativa no gel de
eletroforese.
Na -Btx a anlise de aminocidos revelou que um nico respiduo de Tyr dos catorze,
foi modificado por NBSF. Este resduo foi identificado como Tyr68 na cadeia A da -Btx
(Liao et al., 1982). Nas PLA2 de N. naja e N. nigricollis dos nove resduos de Tyr presentes
somente dois foram modificados por NBSF (Yang et al., 1985), sugerindo que os sete
resduos restantes esto enterrados no interior da molcula. Nessas enzimas a Tyr3 estaria
envolvida na ligao ao fosfolipdio (Meyer et al., 1979) e a Tyr62(63) agiria com o stio de
reconhecimento interfacial (Dam-Mieras et al., 1975). Anlises da sequencia e composio de
aminocidos da notexina de Notechis s. scutatus, revelou que trs resduos de Tyr (Tyr7, 70 e
77) so modificados por NBSF (Yang e Chang, 1991). PhTX-I modificada com NBSF mostra
 72

que quatro resduos de Tyr foram modificados, como evidenciado pela comparao da
composio de aminocidos (tabela 7), estando em concordncia com a os dados obtidos
apartir da anlise por espectrometria de massas.
His 48 um resduo de aminocido altamente conservado nas PLA 2, o qual possui um
rol relevante na catlise (Scott et al., 1992). Vrios estdios sobre modificaes das PLA2 de
veneno de serpente usando o BPB foram realizados durante os ltimos anos (Diaz-Oreiro e
Gutirrez, 1997; Andrio-Escarso et al., 2000; Bazaa et al., 2009; Romero-Vargas et al.,
2010). A composio de aminocidos (tabela 7) revela que PhTX-I modificada com BPB teria
um resduo de histina modificado, esse resduo corresponderia a His48, j que a atividade
enzimtica da protena foi quase completamente abolida aps a modificao, e sendo que a
His48 faz parte da triada cataltica desta famlia de protenas. Resultado similares foram
encontrados para as PLA2 D49 PrTX-III de B. pirajai (Soares et al., 2001a) e BthTX-II de B.
jararacussu (Andrio-Escarso et al., 2000).
A nitrofenilsulfonao dos resduos de Trp com NPSC da PLA 2 Pa-11 do veneno de P.
australis resultou na modificao de dois resduos nas posies 31 e 69. Da mesma maneira, o
tratamento de vrias PLA2 K49 com NPSC resultou na modificao de 50% dos resduos de
Trp, provavelmente afetando Trp77. Este resduo altamente conservado nas PLA 2 K49 e
geralmente ausente nas PLA2 D49 (Soares et al., 2000b, 2001a). A metodologia empregada na
anlise de composio de aminocidos no permite determinar os resduos de Trp, porem, a
sequencia de aminocidos da PhTX-I nativa mostrou que possui 3 resduos de Trp, nas
posies 3, 31 e 69 (Huancahuire-Vega et al., 2009), segundo a anlise de massas um resduo
de Trp estaria sendo modificado, o qual corresponderia ao Trp69 j que o mais exposto na
superfcie da molcula, e portanto seria mais facilmente atacado pelo NPSC (Soares e Giglio,
2003).
Com a finalidade de determinar se as modificaes qumicas realizadas na PhTX-I tm
causado mudanas na estrutura secundria da protena, foi utilizada a tcnica de
espectropolarimetria de dicrosmo circular (CD). Esta tcnica utilizada para estimar a
quantidade de estrutura secundria de protenas e avaliar as mudanas conformacionais
ocasionadas por diversos fatores como agentes desnaturantes, temperatura, etc (Kely et al.,
2005).
O espectro de CD da protena PhTX-I nativa indica que a estrutura secundria
predominante desta PLA2 consiste de -hlices (Fig. 27), fato que concorda com resultados
obtidos para outras PLA2 como as da cobra Taiwan (Kao et al., 2008), PLA2A de C. d.
ruruima (Diz Filho et al., 2009), e BnIV de B. newidii (Toyama et al., 2011). A estrutura
 73

secundria das formas modificadas quimicamente da PhTX-I no foi alterada

significativamente aps as modificaes, como evidenciado pelo espectro CD. Assim,
observamos que as modificaes qumicas, executadas nesse estudo principalmente afetaram
os resduos especficos envolvidos em tais modificaes e no resultaram em mudanas
conformacionais drsticas na molcula. Somente a toxina tratada com NBSF apresentou
certas mudanas detectables na composio da estrutura secundria.
Kini (2003) descreveu que a alquilao pelo BPB no afeta a estrutura tridimensional
das PLA2 nem sua habilidade de ligar fosfolipdeos, porm pode alterar a capacidade de
interagir com protenas especficas ou ligantes. A comparao entre as estruturas
cristalogrficas da PLA2 cida nativa e a modificada quimicamente pelo BPB de Agkistrodon
halys Pallas revelou notvel similaridade entre as estruturas (Zhao et al., 1998), por outro
lado, a mesma anlise entre as BthA-I e BthA-I-p-BPB, uma PLA2 cida do veneno de
Bothrops jararacussu (Magro et al., 2004; Magro et al., 2005) mostrou trs regies com
diferenas estruturais no loop de ligao de Ca2+, regio de -wing e loop C-terminal, j as
anlises comparativas entre os modelos cristalogrficos da PrTX-I-BPB e da PrTX-I
indicaram mudanas pouco significativas de estrutura terciria e da conformao oligomrica
(Marchi-Salvador et al., 2009). Ao existir essas mudanas pouco significativas na estrutura
terciaria das PLA2 complexadas com BPB confirmaria uma mmima alterao nas suas
estruturas secundrias, como observado no espectro de CD para PhTX-I modificada com
BPB.
A PLA2 PhTX-I uma enzima Ca2+-dependente, com mxima atividade em pH 8 e 40
o
C, alcanando Vo de 14,69 nmoles/min (Huancahuire-Vega et al., 2011). A heparina diminuiu
ligeiramente atividade enzimtica da PhTX-I (Fig. 28), de forma semelhante, este composto
polianinico resultou como modulador alostrico negativo da PLA2 de C. d. cascavella
(Beghini et al., 2000). Por outro lado, EDTA diminuiu notavelmente a atividade cataltica de
PhTX-I, similarmente bungarotoxina e notexina, que foram inibidas por EDTA, mesmo na
presena de um excesso de Ca2 + (Shina et al., 1990).
As crotapotinas so proteinas cidas no catalticas e farmacologicamente inativas que
se ligam especificamente s PLA2 de diferentes origens (pancretica, abelha, veneno
serpente), inibindo sua atividade cataltica (Landucci et al., 2000). As isoformas de
crotapotinas F2 e F3 de C. d. collilineatus inibiram significativamente a atividade enzimtica
da PhTX-I em aproximadamente 55% (Fig. 28). Nossos resultados esto de acordo com os
reportes da PLA2 BjIV de B. jararacussu, a qual foi inibida em 50% na sua atividade
cataltica pelas crotapotinas F7 de C. d. terrificus, F3 e F4 de C. d. collilineatus e C. d.
 74

cascavella (Bonfim et al., 2001). Esses resultados sugerem que as crotapotinas podem ligar-se
s PLA2 botrpicas de maneira similar que s PLA 2 crotlicas e aumentam a possibilidade de
que os venenos botrpicos podem conter crotapotionas-like as quais inibem a atividade
cataltica das PLA2 (Bonfim et al., 2001).
J se tem demonstrado que PhTX-I uma miotoxina, capaz de induzir miotoxicidade
local in vivo, assim como edema de pata em camundongos e apresenta efeito neurotxico
causando bloqueio da resposta neuromuscular ex vivo na preparao neuromuscular biventer
cervicis de pintainho (Huancahuire-Vega et al., 2011). As formas modificadas da PhTX-I nos
resduos de His, Tyr, Lys e Trp foram avaliadas atravs da comparao dos seus efeitos na
miotoxicidade local, formao de edema, neurotoxicidade e citotoxicidade, atividades
farmacolgicas apresentadas pela PhTX-I nativa. A modificao seletiva desses aminocidos
tem sido escolhida para entender a funo biolgica, j que estes resduos de aminocidos tem
participao importante na atividade cataltica e na ligao ao substrato (Verheij, 1980).
Acetilao dos resduos de Lys reduziu significantemente a atividade enzimtica de
PhTX-I, entretanto foi detectada atividade residual ao redor de 27% (Fig. 28), similarmente a
MT-III (B. asper) e MT-I (B. godmani) (Daz-Oreiro and Gutirrez, 1997). O modo especfico
de acetilao no claro, mas existem evidencias de reduo da capacidade da enzima em
ligar-se ao clcio e por tanto reduo da atividade enzimtica (Yang, 1997). Contrariamente,
os efeitos miotxico (Fig. 31) e citotxico (Fig. 33) foram completamente anulados, j o
efeito edematogico foi diminudo em menor grau (Fig. 32). Estos resultados concordam com
observaes apresentadas previamente em estudos nos quais resduos de Lys de PrTX-I,
PrTX-III e BnSP-7 PLA2, foram modificados por acetilao diminuindo drasticamente suas
atividades miotxica, edematognica e bactericida (Soares et al., 2000a, 2000b, 2001a).
Acetilao de Lys na PhTX-I diminuiu tambm seu efeito neurotxico em maior grau do que
foi afetada a atividade enzimtica (Fig. 29). Estes efeitos maiores sobre as propriedades
farmacolgicas do que sobre a atividade cataltica demonstra que existe dissociao entre as
atividades enzimtica e farmacolgicas evidenciando a existncia de regies moleculares
diferentes ao sitio cataltico, as quais seriam responsveis por pelo menos alguma atividade
farmacolgica desta toxina em concordncia com estdios prvios com outras PLA 2
(Rosenberg et al., 1989; Andrio-Escarso et al., 2000; Soares e Giglio, 2003).
Soares et al., (2001a) sugeriu que o efeito bactericida de PrTX-III e da miotoxina III
de B. pirajai e B. asper, respectivamente, pode ser relacionado basicidade da protena,
presena da hlice N-terminal, e aos resduos 115 125 da regio C-terminal, esta ltima rica
em aminocidos bsicos e aromticos, os quais tem sido identificados como determinante
 75

estrutural deste efeito (Lomonte et al., 2003). Peptidios sintticos representando a regio C-
terminal de PLA2 miotxicas mostraram atividades citotxicas e miotxicas similares s
protenas parentais embora exibam menor potencia (Lomonte et al., 2003; Angulo e Lomonte,
2005; Gebrim et al., 2009). Diminuio significativa da atividade miotxica aps incubao
com heparina confirma o envolvimento da regio C-terminal de PhTX-I no efeito miotxico,
este polinion estaria interagindo eletrostaticamente com a regio C-terminal rica em resduos
Lys (Huancahuire-Vega et al., 2011).
Nossos resultados tambem concordam com estudos prvios no qual as lisinas de vrias
PLA2 dos venenos de Naja naja atra e Naja nigricollis foram modificadas atravs de
carbamilao (Condrea et al., 1981), metilao (Ho et al. 1986), etoxiformilao e
guanidinao (Condrea et al., 1983). Estes estudos mostraram que tais modificaes tiveram
um maior efeito em algumas propriedades farmacolgicas do que na atividade enzimtica das
toxinas, uma concluso tambm alcanada por Babu e Gowda (1994) depois da guanidinao
de resduos de lisina de uma PLA 2 bsica de Vipera russelli. Assim, as lisinas parecem
desempenhar um papel crtico na toxicidade de PLA2 de veneno de cobra (Diaz-Oreiro e
Gutirrez, 1997).
His48 um aminocido altamente conservado nas PLA2, que faz parte do sistema
cataltico nestas enzimas (Scott et al., 1992). Alquilao da His por BPB vem sendo usado
amplamente para avaliar o rol da atividade enzimtica nas atividades farmacolgicas das
PLA2. Alquilao de His de PhTX-I anulou sua atividade enzimtica (Fig. 28), atividades
miotxica, neurotxica e edematognica foram drasticamente reduzidas por esta modificao
(Figs. 29, 31, 32), tratamento com EDTA tambm diminuiu a atividade miotxica e
edematognica, suportando a hiptese que a hidrlise enzimtica de fosfolipdios est
envolvido neste efeitos. Similarmente as atividades neurotxica e miotxica foram inibidas
quase completamente aps alquilao de His48 de Basp-III (B. asper), BthTX-II (B.
jararacussu), PrTX-III (B. pirajai), Cdc-9 e Cdc-10 (C d. cumanensis) (Daz-Oreiro e
Gutirrez, 1997; Andrio-Escarso et al., 2000, Soares et al., 2001a; Romero-Vargas et al.,
2010), mostrando que estes efeitos so dependentes da atividade cataltica. Soares et al.,
(2001a) sugeriu que a atividade enzimtica das PLA 2 potencializa estas atividades
farmacolgicas induzidas pelas miotoxinas botrpicas e crotlicas.
Em contraste, a atividade citotxica da PhTX-I sobre as linhagens celulares NG97 e
NCIH-3T3 no foi afetado pela modificao de His (Fig. 33), indicando que a atividade
enzimtica no requerida para a PhTX-I induzir este efeito e que outras regies da molcula
estariam envolvidas na perturbao da membrana celular. Nossos resultados esto de acordo
 76

com a atividade da MTX-I e II PLA2 de B. brazili as quais exibiram atividade citotxica sobre
clulas Jurkat independentemente da atividade cataltica (Costa et al., 2008). Alguns autores
propem que a atividade citotxica sobre linhagens celulares tumorais esto associados com
induo de apoptose, considerando que as enzimas PLA2 tem sido consideradas possuir um
rol importante na apoptose em vrios modelos incluindo linhagens celulares (Cummings et
al., 2008). A atividade fosfolipsica acelera o turnover dos fosfolipdios, o qual pode
influenciar mudanas na membrana que ocorrem durante a apoptose (Panini et al., 2001).
Sugerimos maior importancia dos resduos Lys no desenvolvimento do efeito citotxico da
PhTX-I, devido a que a PhTX-I modificada com AA anulou quase completamente esta
atividade (Fig. 33).
Vrios estudios foram direcionados tentando entender os mecanimos envolvidos na
resposta inflamatria induzida pos PLA2 miotxicas de vrios venenos de serpentes (Teixeira
et al., 2003, 2009; Zuliani et al., 2005). Entretanto, a relao entre as atividades enzimtica e
edematognica so contraditrias (Vishwanath et al., 1987). Assume-se que as atividade
edematognica e miotxica podem ser induzidas por diferentes domnios estruturais nestas
toxinas, ou que ocorre uma sobreposio destes domnios (Soares et al., 2004; Zuliani et al.,
2005).
Atividade enzimtica residual da PhTX-I aps sulfonilao dos residuos de Tyr foi
38% (Fig. 28). Os resduos Tyr52 e Tyr73 fazem parte do stio cataltico das PLA2, sendo um
suporte estrutural para estabilizar o sistema cataltico, alterao nesse sistema estaria afetando
a atividade cataltica da PhTX-I (Scott et al., 1992). PhTX-I modificada nos residuos de Tyr
diminuiu os efeitos miotxico e neurotxico mais do que a asua atividade cataltica, uma vez
mais indicando a possvel dissociao dos efeitos farmacolgicos e enzimtico. Por outro lado
a atividade citotxica de PhTX-I foi drasticamente reduzida aps modificao por NBSF (Fig.
33) sugerindo que os resduos de Tyr tambm poderiam estar envolivods neste efeito. Zhao et
al., (1998) observou que as PLA2 miotxicas de veneno de serpente apresentam alguns
resduos de Tyr localizados na regio C-terminal da molcula. Estas tirosinas podem
contribuir combinao catinica-hidrofbica proposta por ter um rol importante na
miotoxicidade e citotoxicidade (Lomonte et al., 2003; Araya e Lomonte, 2007; Cintra-
Francichinelli et al., 2010). PhTX-I apresenta um resduos de Tyr na sua regio C-terminal, a
possvel alterao deste aminocido estaria causando a reduo da sua toxicidade. Entretanto,
a influncia da alterao da estrutura secundaria induzida pelo tratamento com NBSF no
pode ser descartada.
 77

O reagente NPSC diminuiu em 20% a atividade enzimtica da PhTX-I nativa (Fig.

28), indicando que os resduos de Trp modificados no esto relacionados com o sistema
cataltico da PhTX-I. Similarmente a modificao de resduos de Trp no interferiu de
maneira significativa no efeito edematognico e citotxico da PhTX-I (Figs. 32, 33), o efeito
miotxico foi minimamente afetado (Fig. 31). Nesse sentido os resduos de Trp tm pouca ou
nehuma ao direta sobre o msculo. O efeito neurotxico tambm no foi afetado pelo
NPSC (Fig. 29). Por outro lado, a modificao de Trp afetou somente o efeito neurotxico
causado pela PLA2 MjTX-II de B. moojeni, indicando a participao relevante deste resduo
nesta atividade e sugerindo que a modificao qumica poderia estar interferindo na
estabilidade da interao entre os monmeros desta toxina dimrica, uma vez que o Trp77
ajuda a manter a interao homodimrica. Isto sugere que a mudana da forma dimrica para
monomrica desta miotoxina pode reduzir a capacidade de afetar as membranas plasmticas
(Stbeli et al., 2006). Modificao de Trp no alterou o efeito neurotxico da PhTX-I, infere-
se que devido a que PhTX-I uma enzima monomrica, a modificao do Trp no estaria
afetando as atividades farmacolgicas desta toxina.

6. DISCUSSO GERAL.
Diferentes enfoques foram utilizados para investigar as atividades das PLA 2 PhTX-I e
PhTX-II. Os mtodos e experimentos realizados durante o trabalho permitiram isolar estas
miotoxinas e estud-las nas suas caractersticas estruturais e propriedades farmacolgicas.
 78

A otimizao da metodologia de purificao permitiu separar e identificar as protenas

em uma nica etapa cromatogrfica, recuperando quantidades necessrias de protena para
realizar os experimentos biolgicos. A qualidade da preparao enzimtica essencial para
realizar os estudos de caracterizao estrutural e farmacolgica, qualquer contaminao pode
contribuir significativamente com os resultados, dados obtidos apartir destas amostras seriam
invlidos e complicariam os estudos sobre estrutura-funo e mecanismos de ao (Kini,
2003). Mtodos rigorosos devem ser considerados para determinar a homogeneidade das
PLA2, j que, o veneno de serpente frequentemente contem isoformas de PLA 2. A
homogeneidade das miotoxinas PhTX-I e PhTX-II foi verificada atravs de repurificao em
HPLC-fase reversa, SDS-PAGE, anlise de composio de aminocidos e espectrometria de
massas, demonstrando homogeneidade e alto grau de pureza das proteinas.
A sequncia de aminocidos de ao redor de 300 PLA 2 tm sido determinadas (Tan et
al., 2003; Kini, 2003). Estas protenas compartem entre 40-99% de identidade na sequencia
de aminocidos e possuem significante similaridade na sua estrutura terciria (Scott et al.,
1997). Tanto a PhTX-I como a PhTX-II apresentaram alta homologia com PLA 2 de veneno de
Viperidios, a composio das suas estruturas secundrias tambm mostrou bastante
similaridas com esta famlia de protenas. Estas caractersticas estruturais permitiram que as
enzimas em estudo apresentassem alta atividade cataltica, pois os aminocidos envolvidos na
catlise assim como regies moleculares, coadjuvantes do mecanismo cataltico (N-terminal e
ala de ligao ao clcio) foram altamente conservados.
O isolamento e a determinao da sequencia de aminocidos das toxinas apenas o
primeiro passo para entender a complexidade dos componentes do veneno, assim como as
diversas atividades farmacolgicas induzidas apartir de uma mesma arquitetura molecular. As
PLA2 de veneno apesar de possurem alto grau de homologia sequencial e estrutural
apresentam diferenas nas suas propiedades farmacolgicas (Gutirrez et al., 2008). Essas
diferenas funcionais entre as PLA2 no podem ser correlacionadas facilmente com suas
diferenas estruturais. Alm disso, a similaridade estrutural destas protenas faz com que a
relao estrutura-funo seja muito sutil, complicada e desafiante.
O veneno de P. hyoprora foi capaz de induzir diversos efeitos farmacolgicos como
neurotoxicidade ex vivo, miotoxicidade local e edema in vivo e citotoxicidade in vitro. Estes
mesmos efeitos foram induzidos pelas toxinas PhTX-I e II, em maior magnitude do que o
veneno total, mostrando a contribuio importante destas toxinas na toxicidade total do
veneno. Porem, outros componentes do veneno tais como a peptidios, proteases, lectinas,
podem contribuir tambm para as propriedades txicas do veneno. A composio dos venenos
 79

pode ser redundante, com muitas molculas semelhantes e com a mesma funo, de modo a
compensar as variaes dos mecanismos de defesa das presas.
Estudo prvios tm demonstrado que a capacidade comum compartilhada de hidrolisar
na posio sn-2 de fosfolipdios e a falta de correlao entre a atividade enzimtica e a
toxicidade letal ou potncia farmacolgica, faz intrigante os mecanismos pelos quais as PLA 2
de veneno de serpente induzem um amplo espectro de efeitos farmacolgicos (Soares et al.,
2001a). Usando a estratgia de modificao qumica de resduos especficos foi observada na
PhTX-I, uma completa dissociao dos efeitos citotxico e enzimtico. Nos efeitos
neurotxico e miotxico, a atividade cataltica da toxina estaria potencializando ambos os
efeitos. Nossos dados revelam que aminocidos bsicos como Lys e hidrofbicos como a Tyr
parecem ter maior importncia no desenvolvimento dos efeitos farmacolgicos induzidos pela
PhTX-I.
Apesar de que a modificao de aminocidos especficos, no nos ajuda a identificar a
regio da molcula da PhTX-I responsvel pelas diversas atividades farmacolgicas, os
resultados obtidos so consistentes com o conceito de regies moleculares separadas as quais
determinam as atividades catalticas e farmacolgicas. Apesar de ser demonstrada uma
dissociao parcial, tanto o stio cataltico como os stios farmacolgicos hipotticos so
relevantes para o perfil farmacolgico de PhTX-I. Como ambas as regies moleculares,
cataltica e farmacolgica, contribuem com o desenvolvimento da toxicidade desta protena,
ainda precissa ser estudado em maior detalhe.

7. CONCLUSSES.
Os resultados obtidos nos permitem afirmar que PhTX-I e PhTX-II, duas miotoxinas
bsicas isoladas do veneno de P. hyoprora, so PLA2 D49 monomricas, as quais exibem as
principais aes txicas reportadas para esta famlia de protenas, incluindo miotoxicidade
local in vivo, neurotoxicidade ex vivo, efeitos citolticos in vitro, atividades pro-inflamatrias
in vivo, possuindo provavelmente um rol principal no envenenamento por esta espcie de
 80

serpente. A elucidao das sequencias de aminocidos destas toxinas ser importante em

estudos comparativos futuros, com o objetivo de identificar determinantes moleculares das
atividades txicas para outras PLA2 miotxicas nos venenos de Viperidios.
Embora as protenas estudadas aqui sejam semelhantes em termos de estrutura-funo,
a existncia desta variabilidade mostra um alto grau de adaptao da serpente ao meio
ambiente, com o objetivo de coexistirem com os outros organismos presentes no sistema
biolgico, cumprindo uma funo no fluxo da matria e energia.
Os resultados sobre modificaes qumicas na PhTX-I indicam um rol crtico dos
resduos Lys e Tyr nas atividades miotxica, neurotxica e principalmente na citotoxicidade
induzidas por esta miotoxina. A atividade cataltica da PhTX-I relevante para os efeitos
neurotxico, miotxico e edematognico, entretanto, a citotoxicidade da PhTX-I uma
atividade completamente independente da sua atividade cataltica. Nossos resultados,
portanto, apoiam a hiptese que a atividade cataltica estaria potencializando os efeitos
neurotxico e miotxico induzidos por PLA2 de veneno. Apesar de ser demonstrada uma
dissociao parcial, tanto o stio cataltico como os stios farmacolgicos hipotticos so
relevantes para o perfil farmacolgico de PhTX-I.
Embora exista abundante informao respeito das PLA2 de veneno, ainda precisam ser
feitos considerveis esforos para entender as complexas interaes e mecanismo de ao
destes componentes do veneno. A determinao de suas estruturas e avaliaes dos seus
efeitos farmacolgicos ajuda a elucidar os possveis mecanismos destas toxinas potentes, que
so os componentes principais dos venenos Viperidios. Um estudo mais aprofundado destas
toxinas pode fornecer ferramentas de pesquisa altamente especficas ou conduzir a sntese de
compostos como agentes farmacuticos.
 81

8. BIBLIOGRAFIA.

Abreu VA, Dal Belo CA, Hernandes-Oliveira SS, Borja-Oliveira CR, Hyslop S, Furtado Mde
F, Rodrigues-Simioni L. (2007) Neuromuscular and phospholipase activities of venoms
from three subspecies of Bothrops neuwiedi (B. n. goyazensis, B. n. paranaensis and B. n.
diporus). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148: 142-9.
 82

Akira, S. Hirano, T. Taga T. Kishimoto T. (1990) Biology of multifunctional cytokines: IL 6

and related molecules (IL 1 and TNF) The FASEB Journal, 4, 2860-2867.
Andrio-Escarso SH, Soares AM, Fontes MR, Fuly AL, Corra FM, Rosa JC, Greene LJ,
Giglio JR. (2002). Structural and functional characterization of an acidic platelet
aggregation inhibitor and hypotensive phospholipase A2 from Bothrops jararacussu snake
venom. Biochem Pharmacol. 64:723-32.
Andrio-Escarso, S.H., Soares, A.M., Rodrigues, V.M., Angulo, Y., Daz-Oreiro, C., Lomonte,
B., Gutirrez, J.M., Giglio, J.R., (2000). Myotoxic phospholipases A2 in Bothrops snake
venoms: effects of chemical modifications on the enzymatic and pharmacological
properties of Bothropstoxins from Bothrops jararacussu. Biochimie 82: 755763.
Angulo Y, Lomonte B, (2005) Differential susceptibility of C2C12 myoblasts and myotubes
to group II phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms. Cell Biochem
Funct. 2005;
Angulo Y, Lomonte B, (2009) Biochemistry and toxicology of toxins purified from the venom
of the snake Bothrops asper. Toxicon 54: 94957.
Araya, C., Lomonte, B. (2007) Antitumor effects of cationic synthetic peptides derived from
Lys49 phospholipase A2 homologues of snake venoms. Cell Biol Int. 31: 263-268.
Arni, R.K.; Ward, R.J.; Gutirrez, J.M. e Tulinsky, A. (1995). Structure of a calcium-
independent Phospholipase-like Myotoxic Protein from Bothrops asper venom. Acta
Cryst, D51, 311- 317.
Arni, R.K., Ward R.J. (1996). Phospholipase A2-A structural review. Toxicon 34: 827841.
Avila-Aguero, M.L., Parys, M.M., Hu, S., Peterson, P.K., Gutirrez, J.M., Lomonte, B.,
Faingezicht, I. (2001). Systemic cytokine response in children bitten by snakes in Costa
Rica. Ped Emerg Care 17: 425429.
Babu, A. S. and Gowda, T. V. (1994) Dissociation of enzymatic activity from toxic properties
of the most basic phospholipase A2 from Vipera russelli snake venom by guanidination of
lysine residues. Toxicon 32: 749-752.
Barbosa, A.M., Amaral, R.O., Teixeira, C.F.P., Hyslop, S., Cogo, J.C. (2003).
Pharmacological characterization of mouse hind paw oedema induced by Bothrops
insularis (jararaca ilhoa) snake venom. Toxicon 42: 51523.
Barraviera B., Lomonte B., Tarkowski A. (1995). Acute phase reactions, including cytokines,
in patients bitten by Bothrops and Crotalus snakes in Brazil. J Venom Anim Toxins, 1: 11-
22.
Barros SF, Friedlanskaia I, Petricevich VL, Kipnis TL. (1998). Local inflammation, lethality
and cytokine release in mice injected with Bothrops atrox venom. Mediators Inflamm. 7:
339-46
Bazaa A, Luis J, Srairi-Abid N, Kallech-Ziri O, Kessentini-Zouari R, Defilles C, Lissitzky JC,
El Ayeb M, Marrakchi N. (2009) MVL-PLA2, a phospholipase A2 from Macrovipera
lebetina transmediterranea venom, inhibits tumor cells adhesion and migration. Matrix
Biol 28: 188-93.
Beghini D.G, Toyama M.H, Hyslop S, Sodek L.C, Novello C, Marangoni S. (2000)
Enzymatic characterization of a novel phospholipase A2 from Crotalus durissus
cascavella rattlesnake (Maracambia) venom. J Protein Chem. 19: 679-84.
 83

Bonfim V.L, Ponce-Soto L.A, Novello J.C, Marangoni S. (2006). Cytotoxic action in
myoblasts and myotubes (C2C12) and enzymatic characterization of a new phospholipase
A2 isoform (Bj-V) from Bothrops jararacussu venom. Protein Pept Lett.;13: 707-13.
Bonfim V.L, Toyama M.H, Novello J.C, Hyslop S, Oliveira C.R, Rodrigues-Simioni L,
Marangoni S. (2001) Isolation and enzymatic characterization of a basic phospholipase
A2 from Bothrops jararacussu snake venom. J Protein Chem. 20: 239-45.
Borenfreund E., Borrero O. (1984) In vitro cytotoxicity assays. Potential alternatives to the
Draize ocular allergy test. Cell Biol Toxicol. 1: 55-65.
Breithaupt H (1976) Enzymatic characteristics of crotalus phospholipase A2 and the crotoxin
complex. Toxicon 14:221-33.
Calgarotto A.K, Damico D.C, Ponce-Soto L.A, Baldasso P.A, Da Silva S.L, Souza G.H,
Eberlin M.N, Marangoni S, (2008) Biological and biochemical characterization of new
basic phospholipase A2 BmTX-I isolated from Bothrops moojeni snake venom.Toxicon 51:
1509-19.
Calvete, J.J., Sanz, L., ngulo, Y., Lomonte, B., Gutirrez, J.M. (2009). Venoms, venomics,
antivenomics. FEBS Lett. 583: 1736-1743
Campbell J, Lamar W, (2004), The Venomous Reptiles of the Western Hemisphere 898 pp.
Cornell University Press.
Campos, B.C., Sadahiro, M., dos Santos, M.C., (1999). Epidemiological and clinical aspects
of snake accidents in the municipalities of the State of Amazonas, Brazil. Rev. Soc. Bras.
Med. Trop. 32: 637646.
Cardoso J.L.C, Frana F.O.S, Wen F.H, Malaque C.M.S, Haddad J.V. (2003). Animais
peonhentos no Brasil: biologia, clnica e teraputica dos animais. Editora Sarvier 2003.
Carredano E, Westerlund B, Persson B, Saarinen M, Ramaswamy S, Eaker D, Eklund H.
(1998) The three-dimensional structures of two toxins from snake venom throw light on
the anticoagulant and neurotoxic sites of phospholipase A2. Toxicon. 36: 75-92.
Chang LS, Lin SR, Chang CC. (1996) The essentiality of calcium ion in the enzymatic
activity of Taiwan cobra phospholipase A2. J Protein Chem. 15: 701-7.
Chaves, F., Teixeira, C.F.P., Gutirrez, J.M., (2006). Role of nitric oxide in the local and
systemic pathophysiological effects induced by Bothrops asper snake venom in mice
Inflam. Res 55: 24553.
Chaves F, Leon G, Alvarado V.H, Gutirrez J.M, (1998) Pharmacological modulation of
edema induced by Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2 isolated from the venom
of the snake Bothrops asper (terciopelo) Toxicon 36: 1861-69.
Cho W. Kezdy F.J, (1991) Chromogenic substrates and assay of phospholipases A2. Methods
Enzymol. 197: 75-79.
Chu YP, Cheng YC, Yang CC, Chang LS. (2005) The structural events associated with the
binding of divalent cations to beta-bungarotoxin. Toxicon. 45: 139-45.
Cirino G, Peers S.H, Wallace J.L, Flower R.J, (1989). A study of phospholipase A 2 induced
oedema in rat paw. Eur. J. Pharmacol. 166: 50510.
Cintra A.C.O, Marangoni S, Oliveira B, Giglio J.R. (1993) Bothropstoxin-I: amino acid
sequence and function. J Protein Chem; 12(1): 57-64.
 84

Cintra-Francischinelli, M., Pizzo, P., Angulo, Y., Gutirrez, J.M., Montecucco, C., Lomonte,
B. (2010) The C-terminal region of a Lys49 myotoxin mediates Ca 2+ influx in C2C12
myotubes. Toxicon. 55: 590-596.
Cogo J.C, Prado-Franceschi J, Giglio J.R, Corrado A.P, Cruz-Hofling M.A, Donato J.L, Leite
G.B, Rodrigues-Simioni L, (1998), An unusual presynaptic action of Bothrops insularis
snake venom mediated by phospholipase A2 fraction. Toxicon; 36: 1323-32.
Condrea, E., Fletcher, J.E., Rapuano, B.E., Yang, C.C., Rosenberg, P., (1981). Dissociation of
enzymatic activity from lethality and pharmacological properties by carbamylation of
lysines in Naja nigricollis and Naja naja atra snake venom phospholipases A2. Toxicon
19: 705720.
Condrea, E., Rapuano, B.E., Fletcher, J.E., Yang, C.C., Rosenberg, P., (1983).
Ethoxyformylation and guanidination of snake venom phospholipases A2: effects on
enzymatic activity, lethality and some pharmacological properties. Toxicon 21: 209218.
Cornish-Bowden A. Cardenas M. L. (1987). Co-operativity in monomeric enzymes. J. Theor.
Biol. 124: 1-23.
Corra, D.H.A., Ramos, C.H.I. (2009) The use of circular dichroism spectroscopy to study
protein folding, form and function. Afr. J. Biochem. 3: 164-173.
Costa TR, Menaldo DL, Oliveira CZ, Santos-Filho NA, Teixeira SS, Nomizo A, Fuly AL,
Monteiro MC, de Souza BM, Palma MS, Stbeli RG, Sampaio SV, Soares AM. (2008).
Myotoxic phospholipases A2 isolated from Bothrops brazili snake venom and synthetic
peptides derived from their C-terminal region: cytotoxic effect on microorganism and
tumor cells. Peptides. 29: 1645-56.
Cummings, J., Hodgkinson, C., Odedra, R., Sini, P., Heaton, S.P., Mundt, K.E., Ward, T.H.,
Wilkinson, R.W., Growcott, J., Hughes, A., Dive, C. (2008) Preclinical evaluation of M30
and M65 ELISAs as biomarkers of drug induced tumor cell death and antitumor activity.
Mol Cancer Ther. 7: 455-463.
Cushman D.W., Ondetti M.A. (1991). History of the design of captopril and related inhibitors
of angiotensin converting enzyme. Hypertension 17: 589592.
Dal Belo C. A, Leite G.B, Toyama M.H, Marangoni S., Pinto A, Fontana M, Southana A,
Rowan E, Hyslop S, Rodrigues-Simioni L, (2005) Pharmacological and structural
characterization of a novel phospholipase A2 from Micrurus dumerilii carinicauda venom
Toxicon, 46; 736750.
Damico D.C, Lilla S, de Nucci G, Ponce-Soto LA, Winck FV, Novello JC, Marangoni S.
(2005). Biochemical and enzymatic characterization of two basic Asp49 phospholipase
A2 isoforms from Lachesis muta muta (Surucucu) venom. Biochim Biophys Acta. 1726:
75-86.
Damico D.C.S, Bueno L.G.F, Rodrigues-Simioni L, Marangoni S, Cruz-Hofling M.A,
Novello J.C, (2006) Functional characterization of a basic D49 phodpholipase A2 (LmTX-
I) from the venom of the snake Lachesis muta muta (bushmaster) Toxicon 47: 759-65.
Damico D.C, da Cruz Hofling M.A, Cintra M, Leonardo M.B, Calgarotto A.K, da Silva S.L,
Marangoni S. (2008). Pharmacological study of edema and myonecrosis in mice induced
by venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta) and its basic Asp49
phospholipase A2 (LmTX-I). Protein J. 27:384-91.
 85

Dam-Mieras, M.C., Slotboom, A.J., Pieterson, W.A., de Haas, G.H., (1975) The interaction of
phospholipase A2 with micellar interfaces. The role of the N-terminal region.
Biochemistry 14: 53875394.
Das T, Bhattacharya S, Halder B, Biswas A, Das Gupta S, Gomes A, Gomes A. (2011)
Cytotoxic and antioxidant property of a purified fraction (NN-32) of Indian Naja naja
venom on Ehrlich ascites carcinoma in BALB/c mice. Toxicon. 57: 1065-72.
Dennis, E.A., (1994). Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2.
J. Biol. Chem. 269: 1305760.
Daz C, Leon G, Rucavado A, Rojas N, Schroit AJ, Gutierrez JM. (2001). Modulation of the
susceptibility of human erythrocytes to snake venom myotoxic phospholipases A2; role
negatively charged phospholipids as potential membrane binding sites. Arch Biochem
Biophys; 391: 5664.
Daz C, Lomonte B, Zamudio F, Gutirrez JM. (1995). Purification and characterization of
myotoxin IV, a phospholipase A2 variant, from Bothrops asper snake venom. Nat Toxins.
3:26-31.
Daz-Oreiro C. and Gutirrez J.M., (1997). Chemical modification of histidine and lysine
residues of myotoxic phospholipases A2 isolated from Bothrops asper and Bothrops
godmani snake venoms: effects on enzymatic and pharmacological properties. Toxicon
35: 241252.
Diz Filho EB, Marangoni S, Toyama DO, Fagundes FH, Oliveira SC, Fonseca FV, Calgarotto
AK, Joazeiro PP, Toyama MH. (2009) Enzymatic and structural characterization of new
PLA2 isoform isolated from white venom of Crotalus durissus ruruima. Toxicon. 53:
104-14.
Edelhock H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in protein.
Biochemistry 6: 1948-1954.
Ebisui C, Tsujinaka T, Morimoto T, Fujita J, Ogawa A, Ishidoh K, Kominami E, Tanaka K,
Monden M. (1995) Changes of proteasomes and cathepsins activities and their expression
during differentiation of C2C12 myoblasts. J Biochem. 117: 1088-94.
Farsky SH, Walber J, Costa-Cruz M, Cury Y, Teixeira CF. (1997). Leukocyte response
induced by Bothrops jararaca crude venom: in vivo and in vitro studies. Toxicon. 35:
185-93.
Fenn J.B, Mann M, Meng C.K, Wong S.F, Whitehouse C.M. (1989) Electrospray ionization
for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246: 64-71.
Fernandez J, Gutirrez J.M, Angulo Y, Sanz L, Juarez P, Calvete J.J, Lomonte B. (2010).
Isolation of an acidic phospholipase A2 from the venom of the snake Bothrops asper of
Costa Rica: Biochemical and toxicological characterization. Biochimie 92: 273-83
Ferreira T, Camargo EA, Ribela MT, Damico DC, Marangoni S, Antunes E, De Nucci G,
Landucci EC. (2009) Inflammatory oedema induced by Lachesis muta muta (Surucucu)
venom and LmTX-I in the rat paw and dorsal skin. Toxicon. 53: 69-77.
Flecther J.E; Hubert M, Wieland S, Gong Q.H, Jiang M.S, (1996). Similarities and difference
in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins.Toxicon 34(11-12): 1301-
1311.
Fox J.W, Serrano S.M.T. (2008). Approaching the golden age of natural product
pharmaceuticals from venom libraries: an overview of toxins and toxins derivates
 86

currently envolved in therapeutic or diagnostic applications. Curr Pharm Des. 13: 2927-
34.
Fox JW, Serrano S.M.T. (2009). Timeline of key events in snake venom metalloproteinase
research. J Proteomics.72: 200-9.
Francis B.; Gutierrez J. M.; Lomonte B. e Kaiser I. I. (1991). Myotoxin II from Bothrops
asper (terciopelo) venom is a lysine 49 phospholipase A2. Arch. Biochem. Biophys. 284:
352-359.
Fuly A.L., Calil-Elias S., Zingali R.B., Guimares J.A., Melo P.A., (2000). Myotoxic activity
of an acidic phospholipase A2 isolated from Lachesis muta (Bushmaster) snake venom.
Toxicon 38: 961972.
Gallacci M, Oliveira M, Dal Pai-Silva M, Cavalcante WL, Spencer PJ (2006). Paralyzing and
myotoxic effects of a recombinant bothropstoxin-I (BthTX-I) on mouse neuromuscular
preparations. Exp Toxicol Pathol. 57: 239-45.
Gallacci M., Cavalcante W.L.G. (2010) Understanding the in vitro neuromuscular activity of
snake venom Lys49 phospholipase A2 homologues Toxicon 55: 111.
Galvani M, Rovatti L, Hamdan M, Herbert B, Righetti PG. (2001) Protein alkylation in the
presence/absence of thiourea in proteome analysis: a matrix assisted laser
desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry investigation. Electrophoresis. 22:
2066-74.
Garcia Denegri, M.E., Acosta, O.C., Huancahuire-Vega, S., Martins-de-Souza. D., Marangoni,
S., Maruak, S.L., Teibler, G.P., Leiva. L.C, Ponce-Soto, L.A. (2010). Isolation and
functional characterization of a new acidic PLA2 Ba SpII RP4 of the Bothrops alternatus
snake venom from Argentina. Toxicon. 56: 64-74.
Gebrim LC, Marcussi S, Menaldo DL, de Menezes CS, Nomizo A, Hamaguchi A, Silveira-
Lacerda EP, Homsi-Brandeburgo MI, Sampaio SV, Soares AM, Rodrigues VM. (2009)
Antitumor effects of snake venom chemically modified Lys49 phospholipase A2-like
BthTX-I and a synthetic peptide derived from its C-terminal region. Biologicals. 37: 222-
9.
Gutirrez J.M, Ownby C.L, (2003) Skeletal muscle degeneration induced by venom
phospholipases A2: insights into the mechanisms of local and systemic myotoxicity.
Toxicon. 42(8): 915-31.
Gutirrez J.M, Ponce-Soto L.A, Marangoni S, Lomonte B, (2008) Systemic and local
myotoxicity induced by snake venom group II Phospholipases A2: Comparison between
crotoxin, crotoxin B and a Lys49 PLA2 homologue. Toxicon 51(1) 80-92.
Gutirrez J.M, Theakston R.D.G, Warrel D.A, (2006) Confronting the neglected problem of
snake bite envenoming: The need for a global partnership. Plos Med 3(6): e150.
Gutirrez J.M, Williams D, Fan H.W, Warrell D.A, (2010). Snakebite envenoming from a
global perspective: Towards an integrated approach. Toxicon 56: 1223-35.
Gutirrez, J.M, Rucavado, A, Chaves, F, Daz, C. Escalante, T, (2009). Experimental
pathology of local tissue damage induced by Bothrops asper snake venom. Toxicon 54,
95875.
Gutierrez J.M. e Lomonte B. (1995) Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake
venoms. Toxicon 33, 1405-1424.
 87

Gutirrez J.M, Lomonte B, (2003) Efeitos Locais no Envenenamento Ofdico na America

Latina - Animais peonhentos no Brasil: Biologia, Clnica e Teraputica dos Acidentes
Ed. Sarvier, So Paulo Cap 32 pp 310-23.
Gutirrez, J.M., Lomonte, B., (1997). Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake
venoms. In: Kini, R.M., (Ed.), Venom Phospholipase A2 Enzymes: Structure, Function and
Mechanism, Wiley, Chichester, England, 32152.
Gutirrez JM, Ownby CL, Odell GV. (1984). Pathogenesis of myonecrosis induced by crude
venom and a myotoxin of Bothrops asper. Exp Mol Pathol. 40:367-79.
Hanada K, Kinoshita E, Itoh M, Hirata M, Kajiyama G, Sugiyama M. (1995). Human
pancreatic phospholipase A2 stimulates the growth of human pancreatic cancer cell line.
FEBS Lett. 373: 85-7.
Harvey A.L. (1995). From venoms to toxins to drugs. Chem Ind 22: 914916.
Harvey, A.L., Barfaraz, A., Thomson, E., Faiz, A., Preston, S., Harris, J.B., (1994). Screening
of snake venoms for neurotoxic and myotoxic effects using simple in vitro preparations
from rodents and chicks. Toxicon 32, 25765.
Heinrikson R.L, Meredith, S.C. (1984). Amino acid analysis by reverse phase high-
perfomance liquid chromatography: precolumn derivatization with phenylthiocyanate.
Analytical Biochemistry 13: p.65-72. Edman, P., Begg, G., (1967). A protein sequenator.
Eur J Biochem. 1: (1). 80-91.
Heluany N.F; Homsi-Brandeburgo M.I, Giglio J.R; Prado-Franceschi J, Rodrigues-Simioni L,
(1992) Effects induced by Bothropstoxin a component from Bothrops jararacussu snake
venom, on mouse and chick muscle preparations. Toxicon 30: 1203-1210.
Higuchi D.D, Barbosa C.M.B, Bincoletto C, Chagas J.R, Magalhes A, Richardson M,
Sanchez E.F, Pesquero J.B, Arajo R.C, Pesquero J.L, (2007) Purification and partial
characterization of two phospholipases A2 from Bothrops leucurus (white-tailed-jararaca)
snake venom. Biochimie 89: 319-328
Ho, C.L., Tsai, I.H., Lee, C.Y., (1986) The role of enzyme activity and charge properties on
the presynaptic neurotoxicity and the contracture-inducing activity of snake venom
phospholipases A2. Toxicon 24: 337345.
Holzer M, Mackessy S.P. (1996). An aqueous endpoint assay of snake venom phospholipase
A2. Toxicon 34 (10): 1149-1155.
Holland D.R.; Clancy L.L.; Muchmore S.W.; Rydel T.J.; Einspahr H. M.; Finzel B.C.;
Heinrickson R.L. e Watenpaugh K.D. (1990). The crystal structure of a Lysine 49
phospholipase A2 from the venom of the Cottonmouth snake to 2.0 resolution. J. Biol.
Chem. 266: 17649-17656.
Homsi-Brandeburgo M.I, Queiroz L.S, Santo-Neto H, Rodrigues-Simioni L, Giglio J.R.
(1988). Fractionation of Bothrops jararacussu snake venom: partial chemical
characterization and biological activity of botrhopstoxin. Toxicon 26: 613-27.
Huancahuire-Vega, S., Ponce-Soto, L.A., Martins-de-Souza, D., Marangoni, S. (2011).
Biochemical and pharmacological characterization of PhTX-I a new myotoxic
phospholipase A2 isolated from Porthidium hyoprora snake venom. Comp Biochem
Physiol C Toxicol Pharmacol. 154: 108119.
 88

Huancahuire-Vega, S., Ponce-Soto, L.A., Martins-de-Souza, D., Marangoni, S. (2009).

Structural and functional characterization of brazilitoxins II and III (BbTX-II and III), two
myotoxins from the venom of Bothrops brazili snake. Toxicon 54 818827.
Janssen M.J.W., van de Wiel W.A.E.C., Beiboer S.H.W., van Kampen M.D., Verheij H.M.
slotboom A.J. and Egmond M.R. (1999). Catalytic role of the active site histidine of
porcine pancreatic phospholipase A2 probed by the variants H48Q, H48N and H48K.
Protein Engineering 12: 497-503.
Kaiser II, Gutierrez J.M, Plummer D, Aird S.D, Odell G.V, (1990) The amino acid sequence
of a myotoxic phospholipase from the venom of Bothrops asper. Arch Biochem Biophys.
278(2): 319-25.
Kamata K., Mitsuya M., Nishimura T., Eiki J., Nagata Y. (2004). Structural basis for allosteric
regulation of the monomeric allosteric enzyme human glucokinase. Structure 12: 429-438.
Kamiguiti A.S, Slupsky J.R, Zuzel M, Hay C.R, (1994) Properties of fibrinogen cleaved by
Jararhagin, a metallopreinase from the venom of Bothrops jararaca. Throm Haemost. 72:
244-9.
Kao PH, Chen KC, Lin SR, Chang LS. (2008) The structural and functional contribution of
N-terminal region and His-47 on Taiwan cobra phospholipase A2. J Pept Sci.14: 342-8.
Karas M., Gluckmann M., Schafer J., (2000). Ionization in matrix-assisted laser
desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors. J. Mass
Spectrom. 35: 112.
Kasturiratne A, Wickremasinghe AR, de Silva N, (2008). The global burden of snakebite: a
literature analysis and modelling based on regional estimates of envenoming and deaths.
PLoS Med; 5: e218.
Kely S.M., Jess T.J., Price N.C. (2005) How to study proteins by circular dichroism. Biochim.
Biophys. Acta. 1751: 119-139.
Ketelhut D.F.J, Homem de Mello M, Veronese E.L.G, Esmeraldino L.E, Murakami M.T, Arni
R.K, Giglio J.R, Cintra A.C.O, Sampaio S.V. (2003). Isolation, characterization and
biological activity of acidic phospholipase A2 isoforms from Bothrops jararacussu snake
venom. Biochimie 85: 983-91.
Kini R.M, (2003). Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom
phospholipase A2 enzymes. Toxicon 42, 827-840.
Kini R.M, (2005) Serine proteases affecting blood coagulation and fibrinolysis from snake
venoms.Pathophysiol Haemost Thromb. 34(4-5):200-4.
Kini R.M, (1997) Phospholipase A2: a complex multifuncional protein puzzle in: R. M. Kini
(Ed), Venom Phospholipase A2 enzymes: Structure, Function and Mechanism, Wiley,
Chichester pp. 1-28.
Kini R.M, Evans H.J, (1989). A model to explain the pharmacological effects of snake venom
phospholipases A2. Toxicon 27: 61335.
Kini R.M, Chan Y.M, (1999) Accelerated evolution and molecular surface of venom
phospholipases A2 enzimes. J. Mol. Evol. 45(2) 124-132.
Koh DC, Armugam A, Jeyaseelan K. (2006). Snake venom components and their applications
in biomedicine. Cell Mol Life Sci.63(24): 3030-41.
 89

Krizaj I.; Bieber A. L.; Ritonja A. Gubensek F. (1991). The primary structure of ammodytin L,
a myotoxic phospholipase A2 homologue from Vipera ammodytes venom. Eur. J.
Biochem., 202: 1165-1168.
Krizaj I, Gubensek F. (2000) Neuronal receptors for phospholipases A(2)and beta-
neurotoxicity. Biochimie 82: 807-14;
Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227(259): 680-685.
Lambeau G, Schmid-Alliana A, Lazdunski M, Barhanin J. (1990). Identification and
purification of a very high affinity binding protein for toxic phospholipases A2 in skeletal
muscle. J Biol Chem. 265: 952632.
Landucci E.C, Toyama M, Marangoni S, Oliveira B, Cirino G, Antunes E, de Nucci G. (2000)
Effect of crotapotin and heparin on the rat paw oedema induced by different secretory
phospholipases A2. Toxicon 38: 199-208.
Lewis R.J, Garcia M.L. (2003). Therapeutic potential of venom peptides. Nat Rev Drug
Discov 2: 790802.
Liao T-H.; Ting R.S.; Yeung J.E. (1982) Reactivity of Tyrosine in Bovine Pancreatic
deoxyribonuclease with p-Nitrobenzenesulfonyl Fluoride. The Journal of biological
Chemistry 257: 5637-5644.
Liu C.S.; Chen J.M.; Chang C.H.; Chen S.W.; Teng C.M. e Tsai I.H. (1991). The amino acid
sequence and properties of edema-inducing Lys-49 phospholipase A2 homolog from the
venom of Trimeresus mucrosquamatus. Biochem. Biophys. Acta., 1077: 362-370.
Lomonte B, Angulo Y, Caldern L, (2003) An overview of Lysine-49 phospholipase A 2
myotoxins from crotalid snake venoms and their structural determinants of myotoxic
action. Toxicon 42: 885901.
Lomonte B, Moreno E, Tarkowski A, Hanson LA, Maccarana M. (1994) Neutralizing
interaction between heparins and myotoxin II, a lysine 49 phospholipase A2 from
Bothrops asper snake venom. Identification of a heparin-binding and cytolytic toxin
region by the use of synthetic peptides and molecular modeling. J Biol Chem. 269: 29867-
73.
Lomonte, B., Angulo, Y., Rufini, S., Cho, W., Giglio, J.R., Ohno, M., Daniele, J.J.,
Geoghegan, P., Gutirrez, J.M. (1999). Comparative study of the cytolytic activity of
myotoxic phospholipases A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal muscle (C2C12)
cells in vitro, Toxicon 37: 145158.
Lomonte B, Gutirrez JM. (1989). A new muscle damaging toxin, myotoxin II, from the
venom of the snake Bothrops asper (terciopelo). Toxicon. 27:725-33.
Magro A.J., Fernandes C.A.H., dos Santos J.I., Fontes M.R.M. (2009). Influence of
Quaternary Conformation on the Biological Activities of the Asp49-phospholipases A2s
from Snake Venoms. Protein Peptide Letters, 16: 852-859.
Magro, A.J.; Murakami, M.T.; Marcussi, S.; Soares, A.M.; Arni, R.K.; Fontes, M.R.M. (2004)
Crystal structure of an acidic platelet aggregation inhibitor and hypotensive
phospholipase A2 in the monomeric and dimeric states: insights into its oligomeric state.
Biochem. Biophys. Res. Commun 323: 24-31,
 90

Magro, A.J.; Takeda, A.A.S.; Soares, A.M.; Fontes, M.R.M. (2005) Crystal structure of BthA-
I complexed with p-bromophenacyl bromide: possible correlations with lack of
pharmacological activities. Acta Crystalogr. D, 61: 1670-1677.
Mancuso LC, Correa MM, Vieira CA, Cunha OA, Lachat JJ, de Araujo HS, Ownby CL,
Giglio JR. (1995). Fractionation of Bothrops pirajai snake venom: isolation and
characterization of piratoxin-I, a new myotoxic protein. Toxicon. May;33: 615-26.
Marchi-Salvador D.P, Fernandes C.A, Silveira L.B, Soares A.M, Fontes M.R. (2009) Crystal
structure of a phospholipase A(2) homologue complexed with p-bromophenacyl bromide
reveals important structural changes associated with the inhibition of myotoxic activity.
Biochim Biophys Acta. 1794: 1583-90.
Maraganore J.M.; Merutka G.; Cho W.; Welches W.; Kezdy F.J. e Heinrickson R. L. (1984). A
new class of phospholipase A2 with lysine in place of aspartate 49. J. Biol. Chem. 259,
13839-13843.
Markland F.S. (1998) Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon. 36: 1749-800.
Matsui T, Fujimura Y, Titani K, (2000) Snake venom proteases affecting hemostais and
thrombosis. Biochim. Biophys. Acta, 1477: 146-156.
Mazzi M.V, Marcussi S, Carlos G.B, Stabelic R.G, Frnco J.J, Cintra A.C.O, Franc S.C, Soares
A.M, Sampaio S.V, (2004) A new hemorrhagic metalloprotease from Bothrops
jararacussu snake venom: isolation and biochemical characterization. Toxicon, 44 215
223.
Meyer, H., Puijk, W.C., Dijkman, R., Foda-van der Hoorn, M.M., Pattus, F., Slotboom, A.J.,
de Haas, G.H., (1979) Comparative studies of tyrosine modification in pancreatic
phospholipases. 2. Properties of the nitrotyrosyl, aminotyrosyl, and dansylaminotyrosyl
derivatives of pig, horse, and ox phospholipases A2 and their zymogens. Biochemistry 18:
35893597.
Mezna M, Ahmad T, Chettibi S, Drainas D, Lawrence AJ. (1994) Zinc and barium inhibit the
phospholipase A2 from Naja naja atra by different mechanisms. Biochem J. 301: 503-8.
Milani R, Jorge M.T, Ferraz de Campos F.P, Martins F.P, Bousso A, Cardoso J.L.C, Ribeiro
L.A, Fan H.W, Franca F.O.S, Sano-Martins I.S, Cardoso D, Fernandez I.C.O, Fernandes
J.C, Aldred V.L, Sandoval M.P, Puorto G, Theakston R.D.G, Warrell D.A, (1997). Snake
bites by the jararacucu (Bothrops jararacussu): clinicopathological studies of 29 proven
cases in Sao Paulo state, Brazil. Q. J. Med. 90: 32334.
Montecucco C, Gutirrez J.M, Lomonte B. (2008). Cellular pathology induced by snake
venom phospholipase A2 myotoxins and neurotoxins: common aspects of their
mechanisms of action. Cell Mol Life Sci. 65: 2897-912.
Murakami M.T., Arni R.K. (2003). A structure based model for liposome disruption and the
role of catalytic activity in myotoxic phospholipase A2s. Toxicon 42: 903913.
Nez V, Arce V, Gutirrez JM, Lomonte B. (2004). Structural and functional characterization
of myotoxin I, a Lys49 phospholipase A2 homologue from the venom of the snake
Bothrops atrox. Toxicon 44: 91-101.
Otero, R., Gutirrez, J., Mesa, M.B., Duque, E., Rodrguez, O., Arango, J.L., Gmez, F., Toro,
A., Cano, F., Rodrguez, L.M., Caro, E., Martnez, J., Cornejo, W., Gmez, L., Uribe,
F.L., Crdenas, S., Nez, V., Daz, A., (2002) Complications of Bothrops, Porthidium,
 91

and Bothriechis snakebites in Colombia. A clinical and epidemiological study of 39 cases

attended in a university hospital. Toxicon 40: 11071114.
Ownby C.L, Selistre de Arajo H.S, White S.P, Fletcher J.E, (1999) Lysine 49 phospholipase
A2 proteins Review. Toxicon 37: 411-445.
Panini, S.R., Yang, L., Rusinol, A.E., Sinensky, M.S., Bonventre, J.V., Leslie, C.C. (2001)
Arachidonate metabolism and the signaling pathway of induction of apoptosis by oxidized
LDL/oxysterol. J Lipid Res. 42: 1678-1686.
Pereaez J.A, Nuez V, Huancahuire-Vega S, Marangoni S, Ponce-Soto L.A. (2009)
Biochemical and biological characterization of a PLA2 from crotoxin complex of Crotalus
durissus cumanensis. Toxicon 53: 534542.
Perumal, S.R., Gopalakrishnakone, P., Ho, B., Chow, V.T. (2008). Purification,
characterization and bactericidal activities of basic phospholipase A2 from the venom of
Agkistrodon halys (Chinese pallas). Biochimie. 90: 1372-1388.
Peterson CR, Gibson RA, Dorcas ME (1993) Snake thermal ecology: the causes and
consequences of body temperature variation. In: Seigel RA, Collins JT (eds) Snakes:
ecology and behavior. The Blackburn, Caldwell, pp 241314.
Petricevich VL, Teixeira CF, Tambourgi DV, (2000) Gutirrez JM. Increments in serum
cytokine and nitric oxide levels in mice injected with Bothrops asper and Bothrops
jararaca snake venoms. Toxicon. 389: 1253-66.
Ponce-Soto L.A, Barros J.C, Marangoni S, Hernandez S, Dal Belo C.A, Corrado A.P, Hyslop
S, Rodrigues-Simioni L. (2009) Neuromuscular activity of BaTX, a presynaptic basic
PLA2 isolated from Bothrops alternatus snake venom. Comp Biochem Physiol C Toxicol
Pharmacol. 150: 291-7.
Ponce-Soto L.A, Martins-de-Souza D, Marangoni S. (2010). Neurotoxic, Myotoxic and
Cytolytic Activities of the New Basic PLA 2 Isoforms BmjeTX-I and BmjeTX-II Isolated
from the Bothrops marajoensis (Maraj Lancehead) Snake Venom. Protein J. 29: 103-13.
Ponce-Soto LA, Bonfim VL, Rodrigues-Simioni L, Novello JC, Marangoni S. (2006)
Determination of primary structure of two isoforms 6-1 and 6-2 PLA 2 D49 from Bothrops
jararacussu snake venom and neurotoxic characterization using in vitro neuromuscular
preparation. Protein J. 25: 147-55
Ponce-Soto L.A, Lomonte B, Gutirrez J.M, Rodrigues-Simioni L, Novello J.C, Marangoni S,
(2007) Structural and functional properties of BaTX, a new Lys49 phospholipase A2
homologue isolated from the venom of the snake Bothrops alternatus.Biochim Biophys
Acta. 770(4):585-93.
Porto BN, Telli CA, Dutra TP, Alves LS, Bozza MT, Fin CA, Thiesen FV, Renner MF. (2007)
Biochemical and biological characterization of the venoms of Bothriopsis bilineata and
Bothriopsis taeniata (Serpentes: Viperidae). Toxicon. 50: 270-7.
Prasarnpun S, Walsh J, Awad SS, Harris J.B. (2005). Envenoming bites by kraits: the
biological basis of treatment-resistant neuromuscular paralysis. Brain. 128: 2987-96.
Prianti AC Jr, Ribeiro W, Lopes-Martins RA, Lira-Da-Silva RM, Prado-Franceschi J,
Rodrigues-Simioni L, da Cruz-Hfling MA, Leite GB, Hyslop S, Cogo JC. (2003). Effect
of Bothrops leucurus venom in chick biventer cervicis preparations. Toxicon 41: 595-603.
Pungercar J., Krizaj I. (2007). Understanding the molecular mechanism underlying the
presynaptic toxicity of secreted phospholipases A2 Toxicon 50: 871892.
 92

Qin S, Pande A.H, Nemec K.N, He X.M, Tatulian S.A (2005). Evidence for the regulatory
role of the N-terminal helix of secretory phospholipase A2 from studies on native and
chimeric proteins. J. Biol. Chem. 280: 3677336783.
Qin S, Pande A.H, Nemec K.N, Tatulian S.A. (2004). The N-terminal - helix of pancreatic
phospholipase A2 determines productive-mode orientation of the enzyme at the membrane
surface. J. Mol. Biol. 344: 7189.
Randazzo-Moura P, Ponce-Soto L.A, Rodrigues-Simioni L, Marangoni S, (2008) Structural
Characterization and Neuromuscular Activity of a New Lys49 Phospholipase A2
Homologous (Bp-12) Isolated from Bothrops pauloensis Snake Venom.Protein J. 27: 355-
62.
Rodrigues-Simioni L, Zamunr SR, Cogo JC, Borja-Oliveira CR, Prado-Franceschi J, da
Cruz-Hfling MA, Corrado AP. (2004) Pharmacological evidence for a presynaptic action
of venoms from Bothrops insularis (jararaca ilhoa) and Bothrops neuwiedi (jararaca
pintada). Toxicon. 43: 633-8.
Rodrigues-Simioni L, Borgese N, Ceccarelli B, (1983), The effects of Bothrops jararacussu
venom and its components on frog nerve-muscle preparation. Neuroscience 10: 475-489.
Romero-Vargas FF, Ponce-Soto LA, Martins-de-Souza D, Marangoni S. (2010) Biological
and biochemical characterization of two new PLA 2 isoforms Cdc-9 and Cdc-10 from
Crotalus durissus cumanensis snake venom. Comp Biochem Physiol C Toxicol
Pharmacol. 151: 66-74.
Rosenberg, P., Ghassemi, A., Condrea, E., Dhillon, D., Yang, C.C., (1989) Do chemical
modifications dissociate between the enzymatic and pharmacological activities of beta
bungarotoxin and notexin? Toxicon 27: 137159.
Rucavado A, Lomonte V, Obadia M, Gutierrez J.M. (1995) Local tissue damage induced by
BaP1, a metalloproteinase isolated Bothrops asper (Terciopelo) snake venom. Exp Mol
Pathol. 63: 186-99.
Rufini S, Cesaroni M., Balestro N, Luly P. (1996) Proliferative effect of ammodytin L from
the venom of Vipera ammodytes on 208F rat fibroblasts in culture.Biochem J. 320: 467-
72
Schaloske RH, Dennis EA. (2006) The phospholipase A2 superfamily and its group
numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761: 1246-59.
Scott DL, Otwinowski Z, Gelb MH, Sigler PB. (1990). Crystal structure of bee-venom
phospholipase A2 in a complex with a transition-state analogue. 250: 1563-6.
Scott D.L., Achari A., Vidal J.C., Sigler P.B., (1992). Crystallographic and biochemical
studies of the (inactive) Lys-49 phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon
piscivorus piscivorus. J. Biol. Chem. 267: 2264522657.
Scott, D.L. (1997) Phospholipase A2: structure and catalytic properties. In: Kini, R.M., (Ed.),
Venom Phospholipase A2 Enzymes: Structure, Function and Mechanism, Wiley,
Chichester, England, pp. 97128.
Selistre de Arajo H.S, White S.P, Ownby C.L, (1996). Sequence analysis of Lys 49
phospholipase A2 myotoxins: a highly conserved class of protein. Toxicon 34(11\12):
1237-1242.
 93

Shina R, Yates S.L, Ghassemi A, Rosenberg P, Condrea E. (1990) Inhibitory effect of

EDTA.Ca2+ on the hydrolysis of synaptosomal phospholipids by phospholipase A2 toxins
and enzymes. Biochem Pharmacol. 40: 2233-9.
Singh G, Gourinath S, Sharma S, Paramasivam M, Srinivasan A, Singh TP. (2001) Sequence
and crystal structure determination of a basic phospholipase A2 from common krait
(Bungarus caeruleus) at 2.4 A resolution: identification and characterization of its
pharmacological sites. J Mol Biol. 307: 1049-1059.
Six D.A, Dennis E.A, (2000). The expanding superfamily of phospholipase A 2 enzymes:
classification and characterization. Biochim Biophys Acta. 1488(1-2):1-19.
Soares A.M, Giglio J.R. (2003) Chemical modifications of phospholipases A2 from snake
venoms: effects on catalytic and pharmacological properties. Toxicon 42: 855-68.
Soares A.M, Andrio-Escarso S.H, Bortoleto R.K, Rodrigues-Simioni L, Arni R.K, Ward R.J,
Gutierrez J.M, Giglio J.R, (2001a) Dissociation of enzymatic and pharmacological
properties of piratoxins-I and -III, two myotoxic phospholipases A2 from Bothrops pirajai
snake venom. Arch. Biochem. Biophys. 387: 18896.
Soares A.M., Mancin A.C., Cecchini A.L., Arantes E.C., Franca S.C., Gutirrez J.M., Giglio
J.R., (2001b). Effects of chemical modifications of crotoxin B, the phospholipase A2
subunit of crotoxin from Crotalus durissus terrificus snake venom, on its enzymatic and
pharmacological activities. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 877888.
Soares A.M., Andrio-Escarso S.H., Angulo Y., Lomonte B., Gutirrez J.M., Marangoni S.,
Toyama M.H., Arni R.K., Giglio J.R., (2000b). Structural and functional characterization
of a myotoxin I from Bothrops moojeni (caissaca) snake venom. Arch. Biochem. Biophys.
373: 7 15.
Soares, A.M., Sestito, W.P., Marcussi, S., Stbeli, R.G., Andrio-Escarso, S.H., Cunha, O.A.,
Vieira, C.A., Giglio, J.R. (2004) Alkylation of myotoxic phospholipases A2 in Bothrops
moojeni venom: a promising approach to an enhanced antivenom production. Int J
Biochem Cell Biol. 36: 258-70.
Soares A.M, Guerra-S R, Borja-Oliveira C.R, Rodrigues V.M, Rodrigues-Simioni L,
Rodrigues V, Fontes M.R, Lomonte B, Gutirrez JM, Giglio JR. (2000a) Structural and
functional characterization of BnSP-7, a Lys49 myotoxic phospholipase A(2) homologue
from Bothrops neuwiedi pauloensis venom. Arch Biochem Biophys. 378: 201-9.
Takasaki C.; Sugama A.; Yanagita A.; Tamiya N.; Rowan E. G. and Harvey A. L. (1990).
Effects of chemical modifications of Pa-11, a phospholipase A2 from the venom of
australian king brown snake (Pseudechis australis), on its biological actiities. Toxicon 28:
107-117.
Tan, P.T.J., Khan, M.A., Brusic, V. (2003) Bioinformatics for venom and toxin sciences. Brief
Bioinform. 4: 5362.
Torres-Huaco FD, Ponce-Soto LA, Martins-de-Souza D, Marangoni S. (2010) Purification
and characterization of a new weak hemorrhagic metalloproteinase BmHF-1 from
Bothrops marajoensis snake venom. Protein J. 29: 407-16.
Stbeli R.G, Amui S.F, Sant'Ana C.D, Pires M.G, Nomizo A, Monteiro M.C, Romo P.R,
Guerra-S R, Vieira C.A, Giglio J.R, Fontes M.R, Soares A.M. (2006) Bothrops moojeni
myotoxin-II, a Lys49-phospholipase A2 homologue: an example of function versatility of
snake venom proteins. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 142: 371-81.
 94

Teixeira C.F.P, Landucci E.C.T. Antunes E, Chacur M, Cury Y, (2003) Inflammatory effects of
snake venom myotoxic phospholipases A2.Toxicon, 42: 947962.
Teixeira, C., Cury, Y., Moreira, V., Picolob, G., Chaves, F. (2009). Inflammation induced by
Bothrops asper venom. Toxicon. 54: 988-997.
Toyama Dde O, Diz Filho EB, Cavada BS, da Rocha BA, de Oliveira SC, Cotrim CA, Soares
VC, Delatorre P, Marangoni S, Toyama MH. (2011) Umbelliferone induces changes in the
structure and pharmacological activities of Bn IV, a phospholipase A(2) isoform isolated
from Bothrops neuwiedi. Toxicon. 57: 851-60.
Verheij H.M; Vowerk J.J; Jasen E.H.J.M; Puyk W.C; Dkstra B.W; Drenth J, Hass G.H,
(1980) Methylation of Histidine-48 in pancreatic phospholipase A2, role of histidine and
calcium ion in the catalytic mechanism. Biochemistry 19:743 - 748.
Verhei H.M., Slotboom A.J., de Haas G.H., (1981). Structure and function of phospholipase
A2. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 91: 91203.
Vishwanath, B.S., Kini, R.M., Gowda, T.V. (1987) Characterization of three edema inducing
phospholipase A2 enzymes from habu (Trimeresurus flavoviridis) venom and their
interation with the alkaloid aristolochic acid. Toxicon. 25: 501509.
Ward R.J, de Azevedo W.F Jr, Arni R.K. (1998) At the interface: crystal structures of
phospholipases A2. Toxicon 36: 1623-33.
Ward R. J.; Monesi, N.; Arni, R. K.; Larson, R. E. e Pao-Larson M. L. (1995). Sequence of a
cDNA encoding bothopstoxin I, a myotoxin from the venom of Bothrops jararacussu.
Gene, 156: 305-306.
Warrell DA. (2005) Treatment of bites by adders and exotic venomous snakes. BMJ. 21;332
(7534):151.
Westerlund B, Nordlund P, Uhlin U, Eaker D, Eklund H. (1992) The three-dimensional
structure of notexin, a presynaptic neurotoxic phospholipase A2 at 2.0 A resolution. FEBS
Lett. 301: 159-64.
Yang C.C. (1994). Structure-function relationship of phospholipase A2 from snake venoms.
J.Toxicol, 13 (2): 125-177.
Yang C.C., (1997). Chemical modification and functional sites of phospholipases A2. In: Kini,
R.M., (Ed.), Venom Phospholipase A2 Enzymes: Structure, Function and Mechanism,
Wiley, Chichester, pp. 185204.
Yang C-C.; Huang C.S.; Lee H.J. (1985). Studies on the status of tyrosyl residues in
phospholipases A2 from Naja naja atra and Naja nigricollis snake venom. J. protein
Chem. 4: 87.
Yang C.C., Chang L.S., (1991). Dissociation of lethal toxicity and enzymic activity of notexin
from Notechis scutatus scutatus (Australian-tiger-snake) venom by modification of
tyrosine residues. Biochem. J. 280: 739744.
Yu B.Z, Berg O.G, Jain M.K. (1993) The divalent cation is obligatory for the binding of
ligands to the catalytic site of secreted phospholipase A2. Biochemistry 32: 6485-92.
Zamunr SR, da Cruz-Hfling MA, Corrado AP, Hyslop S, Rodrigues-Simioni L. (2004)
Comparison of the neurotoxic and myotoxic effects of Brazilian Bothrops venoms and
their neutralization by commercial antivenom. Toxicon. 44: 259-71.
Zhao, H.; Tang, L.; Wang, X.; Zhou, Y.; Lin, Z. (1998).Structure of a snake venom
phospholipase A2 modified by p-bromo-phenacyl-bromide. Toxicon 36: 875-886.
 95

Ziolkowski C, Bieber AL. (1992). Mojave toxin affects fusion of myoblasts and viability of
myotubes in cell cultures. Toxicon, 30: 733-44.
Zuliani J.P, Fernandez C.M, Zamuner S.R, Gutirrez J.M, Teixeira C.F, (2005) Inflammatory
events induced by Lys 49 and Asp49 phospholipases A2 isolated from Bothrops asper
snake venom: role of catalytic. Toxicon 45: 335-46.