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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

Adriano Palharini de Arajo 31624561


Andr Pires de Oliveira - 31630138
Giulia da Matta Nigro 41604237

EMBRIOLOGIA

SO PAULO
2017
Artigo - Traduo

Um novo sistema de cultura sem casca para embries de pintinhos usando


plstico filme como vasos.

Yutaka Tahara1 and Katsuya Obara2


1 Oihama High School, Shioda-cho, Chuo-ku, Chiba 260-0823, Japan
2 Takanedai Animal Clinic, Narashinodai, Funabashi 274-0063, Japan

O desenvolvimento dos mtodos da cultura sem casca para embries de aves com alta
eclodibilidade/ ser til para a gerao eficiente de frangos transgnicos, manipulao de
embries, engenharia de tecidos, e estudos bsicos em medicina regenerativa. At a data,
estudos dos mtodos de cultura para embries de aves incluem toda a cultura de embries
usando cascas de ovo estreitas, cascas de ovos de substituio e um vaso artificial usando uma
membrana permevel a gs. No entanto, no h relatos de alcanar alta eclodibilidade de >
50% usando vasos completamente artificiais. Para estabelecer um mtodo simples para
cultivar embries de pintinhos com alta capacidade de eclodibilidade, examinamos vrias
condies de cultura, incluindo mtodos para suplementao de clcio e aerao com
oxignio. Nas culturas de embries onde os embries foram transferidos para o vaso de
cultura aps 55-56 h de incubao, mais de 90% dos embries sobreviveram at o dia 17
quando uma pelcula de polimetilpenteno foi utilizada como vaso de cultura com lactato de
clcio e suplementao de gua destilada. A aerao de oxignio puro aos embries
sobreviventes a partir do dia 17 produziu uma eclodibilidade de 57,1% (8 de 14). Assim,
obtivemos com sucesso uma elevada eclodibilidade com este mtodo na cultura de embries
de galinha utilizando um recipiente artificial.

Palavras-chave: recipientes artificiais, cultura de embries de galinha, incubar,


polimetilpenteno.
Introduo

Uma cultura sem casca, onde um embrio de pintinho retirado de uma casca de ovo e
cultivado em ambiente artificial, uma tcnica importante para a gerao de frangos
transgnicos que produzem substncias teis em seus ovos, bem como para vrias
manipulaes embrionrias (Kamihira et al., 2005; Kyogoku et al., 2008). Alm disso, esta
tcnica pode ser til para a preservao de aves raras, se ele pode ser aplicado para salvar
ovos danificados. No entanto, a janela (abertura) na casca do ovo para facilitar a introduo de
genes e outras manipulaes reduz significativamente a ecloso (Andacht et al., 2004). A
tcnica de cultura sem casca para embries de pintinhos tambm desempenha potencialmente
um papel importante na educao de crianas em idade escolar em cincias da vida, atravs da
observao direta do desenvolvimento embrionrio.
Perry (1988) relatou um mtodo de cultura para embries de pintinho usando uma
casca de ovo substituta como um recipiente de cultura para a cultura ex ovo de um vulo
fertilizado de uma nica clula tomado do oviduto materno. Este mtodo composto de trs
sistemas: sistema I para embries do estgio de clula nica para o estgio de blastoderma,
sistema II para embries aps o estgio de blastoderma at o dia 3 e sistema III para embries
do dia 3 at a ecloso. O embrio foi cultivado nos trs sistemas e transferido de um
recipiente para outro. Utilizou-se uma casca de ovo de galinha grande como vaso de cultura
no sistema III. No entanto, a incubabilidade foi de aproximadamente 7% com este mtodo,
que foi melhorado para aproximadamente 50% por Naito et al. (1990). Alguns mtodos de
cultura usando cascas de ovos de substituio foram relatados para codornas (Ono et al., 1994,
Kamihira et al., 1998, Ono et al., 2005, Kato et al., 2013).
Kamihira et al. (1998) relataram um mtodo de cultura sem casca para embries de
codorna usando um recipiente artificial feito de uma membrana de politetrafluoroetileno
(PTFE) permevel ao gs. No seu mtodo, mais de 43% de embries de codorna eclodiram
quando o lactato de clcio foi suplementado na cultura. Este sistema correspondeu ao sistema
III de Perry e o mtodo de cultura tambm foi aplicado a embries de pintinho (Kamihira et
al., 2004).
Vrias melhorias na cultura de embries de pintinho foram relatadas. No entanto,
muitos destes mtodos envolveram a substituio de cascas de ovos de substituio derivadas
de diferentes espcies de aves, colocando ovos relativamente grandes, como o pato aigamo e
o peru (Borwornpinyo et al., 2005). Contudo, os mtodos de cultura que utilizam cascas de
ovos de substituio apresentam desvantagens, tais como a preparao de cascas de ovos,
diferenas entre os lotes de cascas de ovos, a incapacidade do uso de reciclagem e a baixa
operabilidade durante a manipulao do embrio.

FIG. 1. Processamento da pelcula de polimetilpenteno. Para preparar um recipiente


de cultura, os lados direito e esquerdo de uma pelcula (papel filme) quadrada de
aproximadamente 30 cm foram segurados e esticados na forma apropriada (A). Alm disso, os
lados que permaneceram folgados foram mantidos e a pelcula foi esticada da mesma maneira
(B). Uma forma oval foi criada de modo a ter aproximadamente o mesmo tamanho de um
ovo. A pelcula deve ento ser aspirada usando um aspirador equipado com um copo de
plstico, que tem o mesmo dimetro que o recipiente artificial. Isto tambm impediu o
enrugamento do filme quando foi instalado no recipiente de cultura artificial (C).

Para estabelecer um mtodo de cultura simples com alta capacidade de incubao,


desenvolvemos um vaso artificial usando uma pelcula plstica transparente altamente
conveniente em vez de cascas de ovos de substituio e examinamos condies de cultura,
como suplementao de clcio e gua e aerao de oxignio.
Materiais e Mtodos

Ovos de galinha
Todos os ovos fertilizados utilizados neste estudo foram ovos Dekalb Brown, que
foram obtidos de uma mercearia (Yamagishism Jikkenchi, Mie, Japo).
Recipientes de cultura
Utilizou-se um copo de plstico de poliestireno de 430 ml como cpsula para o
recipiente de cultura. Um orifcio de 1-1,5 cm de dimetro foi feito no lado do copo a
aproximadamente 2 cm do fundo, e o orifcio foi tapado com um pedao de algodo como um
filtro. Um tubo de plstico de 2 mm de dimetro (Atom Multipurpose Tube, Atom Medical,
Tquio, Japo) foi inserido atravs do espao entre o pedao de algodo e o orifcio para
fornecer um fornecimento de oxignio. Uma soluo aquosa (40 mL) de cloreto de
benzalcnio 0,01% (OSUBAN-S, Nihon Pharmaceutical, Tquio, Japo, diluda com gua
destilada) foi ento adicionada ao copo. Uma pelcula de polimetilpenteno (FOR-WRAP,
Riken Technos, Tquio, Japo) foi formada numa forma cncava, evitando cuidadosamente
rugas (Fig. 1) e instalada como um recipiente de cultura artificial na cpsula (Figuras 2A e 3).
Uma cobertura de plstico de poliestireno foi colocada no topo do recipiente de cultura.
Cultura de embries
Os ovos de galinha fertilizados foram pr-incubados durante 48-50 h (Grupo A) ou 55-
56 h (Grupo B) a 38 e 60% de humidade numa incubadora (BITEC-300; Shimadzu RIKA
Co., Tquio, Japo). Para a preparao da cultura de embries, 250-300 mg de lactato de
clcio pentahidratado em p (Showa Chemical Co., Tquio, Japo) foram adicionados aos
vasos (recipientes) de cultura. Subsequentemente, foram adicionados suavemente aos vasos
de cultura 2,5-3 ml de gua destilada esterilizada (Otsuka Pharmaceutical Co., Tquio, Japo).
Cada casca de ovo foi varrida/limpada usando etanol a 70%, rachada sem usar uma broca, e
os contedos de ovos inteiros foram transferidos para o recipiente de cultura (Figura 2B). Se
os pedaos quebrados da casca caiam dentro do recipiente de cultura, as peas foram
removidas cuidadosamente usando pinas esterilizadas.
Alm disso, fizemos 10 furos de ventilao com um dimetro de 5-8mm na superfcie
superior da pelcula do filme de polimetilpenteno, com a qual os embries no fizeram
contato direto. Os furos foram criados fundindo o filme usando um basto de vidro aquecido.
O recipiente de cultura foi coberto com uma tampa de plstico de polietileno de modo
que a humidade no interior do recipiente permaneceu a aproximadamente 100%. O recipiente
de cultura foi mantido a 38 e 80% de humidade numa incubadora. O recipiente de cultura
foi colocado com um ngulo de aproximadamente 8 e rodado com 120 no sentido horrio,
duas vezes por dia.
A partir do dia 17 do perodo de cultura at ecloso, foi fornecido oxignio puro a
um fluxo de aproximadamente 500 ml / h atravs do tubo de plstico previamente instalado.
Se o embrio no pudesse romper a membrana corioalantide por si s nos dias 19 ou
20 do perodo de cultura, criamos cuidadosamente uma inciso de 5 mm na membrana em
torno do bico sem sangramento grave na membrana. FIG. 4 mostra a programao para a
cultura de embries de galinha. Os ovos fertilizados intactos sem manipulao foram
incubados como controles (n = 10). Eles foram incubados a 38 e 80% de umidade em uma
incubadora, e girado com 120 no sentido horrio, duas vezes por dia at o dia 18.
Galinhas foram dadas aos novos proprietrios e criados para a maturao sexual como
animais de companhia.
Anlise estatstica
A viabilidade de embries de cultura durante o perodo de incubao at ao dia 17 da
cultura foi determinada pela contagem dos embries viveis, onde 100% de viabilidade foi
definida como o nmero de embries viveis no dia no incio da cultura ex ovo. A
incubabilidade na presena ou ausncia de oxignio foi determinada pela contagem de
embries incubados, onde o nmero de embries no dia 17, no incio da aerao, foi definido
como 100%. Os dados foram analisados utilizando o teste de probabilidade exata de Fisher. O
valor de P <0,01 foi considerado estatisticamente significativo.

FIG. 2. Vasilha de cultura artificial utilizada para culturas de embries de


galinha. Nesta figura, o cloreto de benzalcnio no foi adicionado (antes da transferncia do
embrio; A). O recipiente de cultura artificial para galinhas (imediatamente aps o embrio
foi transferido, B). Bar, 1 cm.
FIG. 3. Desenhos esquemticos do recipiente de cultura artificial utilizado para cultura
de embrio de galinha. (Ver imagem original no artigo)

FIG. 4. Cronograma de cultura para embries de pintinhos. (Ver imagem original no


artigo)
Resultados

Perodos de pr-incubao
Para os embries que foram transferidos para o vaso de cultura antes de 50 h de
incubao (Grupo A, Fase 12-15, Hamburger e Hamilton, 1951), nenhum embrio sobreviveu
at o dia 8. Quando os embries foram transferidos para o vaso de cultura aps 55-56 H de
incubao (Grupo B, Fase 16), a viabilidade no dia 8 do perodo de cultura foi
significativamente mais elevada do que o Grupo A (P <0,01, Tabela 1, Fig. 5) e a viabilidade
no dia 17 do perodo de cultura foi de 92 % (23 em 25).
Suprimento de oxignio
Durante a cultura no vaso artificial aproximadamente no dia 17 do perodo de cultura
(Fase 43-44), o tom de cor da corrente sangunea nas veias da membrana corioalantide
mudou para vermelho escuro, sugerindo uma deficincia no fornecimento de oxignio para os
embries. Por conseguinte, o oxignio puro foi arejado a aproximadamente 500 ml / h atravs
do tubo de plstico inserido no recipiente artificial. Como resultado, no Grupo B, 57,1% (8
em 14) dos embries fornecidos com oxignio desenvolveram-se para eclodir. Em contraste,
nenhum embrio desenvolveu-se para eclodir nas condies onde nenhum oxignio foi
fornecido (Tabela 1, Fig. 6).
Assim, a aerao com oxignio aumentou significativamente a eclodibilidade (P
<0,01).
Crescimento de pintinhos aps a incubao
Os pintinhos que nasceram nesse mtodo eram saudveis, e foram criados para a
maturao sexual. Depois que as galinhas estavam se acasalando, obtivemos uma prole
saudvel.
Controle de ovos intacto
A incubabilidade dos embries de controle intactos foi de 70% (7 em 10) e no foram
observadas anomalias. Dois ovos estavam mortos com ovos bicados (fase antes da ecloso),
e outro ovo estava morto na ecloso por causa de dano no saco vitelino.
Discusso

No presente estudo, desenvolvemos um sistema de cultura sem casca para embries de


pintinhos usando uma pelcula plstica como recipiente de cultura e examinamos as condies
necessrias para a incubao embrionria comparando fatores como a adio de lactato de
clcio e a presena ou ausncia de um suprimento de oxignio. Em vez de uma membrana de
PTFE permevel a gs, usamos envoltrios de alimentos, que so baratos, fceis de processar
e fceis de obter como recipientes de cultura. Embora tenhamos testado vrios revestimentos,
incluindo polietileno e cloreto de polivinilideno, preferimos utilizar uma pelcula de
polimetilpenteno devido sua elevada permeabilidade ao oxignio (8,0 10-10 mol / m2 sPa,
dados da Riken Technos). importante eliminar as rugas ao produzir um vaso de cultura
porque a presena de rugas de pelcula leva a taxas de sobrevivncia mais baixas (dados no
mostrados).
Em nosso estudo, os embries foram pr-incubados dentro da casca do ovo at o dia 3
e a casca do ovo foi ento rachada para transferir os embries para o recipiente artificial,
correspondendo ao sistema de Perry III. O perodo de pr-incubao at transferncia de
embries para o recipiente de cultura influenciou a viabilidade no dia 8 de cultura bem como
a transferncia bem sucedida de embries para o recipiente de cultura. A transferncia de
embries para o recipiente de cultura foi considerada tima no dia 3 (Rowlett e Simkiss,
1987, Borwornpinyo et al., 2005). No presente estudo, diferentes perodos de pr-incubao
de ovos entre 48h e 56 h apresentaram efeitos variveis na viabilidade. Viabilidade
significativamente maior obtida com 55-56 h de pr-incubao (Fase 16). Em nosso
experimento preliminar, a membrana vitelina foi frequentemente danificada quando o embrio
foi transferido para o vaso de cultura aps 56 h (Estgio 17). Aps 60 h, foi difcil transferir o
embrio para o vaso de cultura por craquelamento da casca de ovo, devido ao risco de danos
membrana vitelina (dados no mostrados).
Um estudo prvio de Kamihira et al. (1998), utilizando codornas, mencionaram que o
lactato de clcio era altamente eficaz em culturas bem-sucedidas de embries avirios. Em
nosso sistema de cultura, a adio de lactato de clcio tambm foi eficaz para o
desenvolvimento embrionrio, e a viabilidade dos embries se tornou a mais alta quando 250-
300 mg de lactato de clcio foi adicionado (dados no mostrados). Assim, a suplementao de
clcio com embries essencial para culturas sem casca, porque embries normais de galinha
dentro de cascas de ovos so fornecidos a maioria de clcio da casca de ovo durante o
desenvolvimento embrionrio at a ecloso (Rowlett e Simkiss, 1987; Kamihira et al. Ns
acreditamos que a quantidade de lactato de clcio fornecida aos embries na cultura foi
suficiente para o mnimo requerimento para o desenvolvimento embrionrio para eclodir,
embora estudos adicionais sejam ainda necessrios para compreender a disponibilidade
embrionria de clcio.
Estvamos preocupados que a aerao do recipiente artificial poderia causar a perda de
umidade de embries por transpirao. Consequentemente, adicionou-se primeiro 2,5-3 ml de
gua destilada esterilizada ao recipiente de cultura. Alm disso, quando o lactato de clcio
suspenso em gua destilada foi adicionado ao recipiente, a viabilidade dos embries em
cultura diminuiu (dados no apresentados), sugerindo que isto pode ser causado por um
desequilbrio eletroltico ou hipercalcemia. Por conseguinte, adicionou-se, em primeiro lugar,
lactato de clcio em p ao recipiente de cultura, antes de adicionar suavemente gua destilada
porque isso pode facilitar a absoro mais lenta de lactato de clcio pelo embrio.
Com o mtodo de cultura utilizado neste estudo, as veias distribudas na membrana
corioalantide tornaram-se vermelho escuro aproximadamente ao dia 17 do perodo de cultura
(estdio 43-44), o que sugeria fortemente a deficincia de oxignio. Rowlett e Simkiss (1989)
relataram que os embries de pintinhos cultivados em um recipiente artificial feito de uma
"pelcula de aderncia" eram hipxicos e hipocapicais. Kamihira et ai. (1998) tambm
apontaram a importncia do suprimento de oxignio na fase seguinte da cultura do embrio
usando casca de ovo substituta. Portanto, examinamos a aerao de oxignio na segunda
metade do perodo de cultura. O oxignio aerado durante o estdio inicial da cultura pode
reduzir a viabilidade devido ao efeito txico do oxignio. No presente estudo, a cor da
corrente sangunea na membrana corioalantide pareceu ser normal durante as fases iniciais
do perodo de cultura. Assim, para os embries que sobreviveram at ao dia 17 (estdio 43-
44), oxignio puro foi areado a partir do dia 17 para prevenir a deficincia de oxignio nas
fases posteriores. Como resultado, o tom de cor da corrente sangunea tornou-se normal, e 8
de 14 embries desenvolvidos para eclodir, demonstrando que o fornecimento de oxignio na
fase posterior extremamente importante durante cultura de ovos sem casca usando um
recipiente artificial.
Nos dias 19-20 do perodo de cultura (Fase 45), os embries comearam a rasgar as
membranas corioalantides e seus sistemas de respirao pulmonar foram ativados. Quando
os embries no podiam rasgar a membrana corioalantide, uma inciso de 5 mm em torno do
bico foi feita para promover a ecloso. Isto pode corresponder morte em ovos bicados, o que
ocorre a uma taxa constante quando os ovos so cultivados sem quebra de casca e tratamento.
Os resultados revelaram que utilizando o recipiente de cultura descrito no presente
estudo, a maior incubabilidade foi alcanada com 55-56 h de pr-incubao de ovos, adio
de 250-300 mg de lactato de clcio, adio de 2,5-3ml de gua destilada esterilizada, aerao
de oxignio puro a aproximadamente 500 mL / h a partir do dia 17 da cultura (Fase 43-44). A
incubabilidade de embries cultivados sob estas condies foi de 57,1% (8 de 14) quando se
tomou o nmero de embries sobreviventes no dia 17 como 100%.
Borwornpinyo et al. (2005) relataram que o mtodo de cultura de embrio de galinha
usando cascas de ovo de peru e Handi-Wrap como recipientes de cultura antes da transio
para o Sistema III de Perry exibiu 81,1% de incubabilidade quando o nmero de embries
sobreviventes no dia 3 foi tomado como 100%. Embora o nosso mtodo de cultura no utilize
cascas de ovos de substituio, uma elevada eclodibilidade de mais de 50% foi alcanada.
Este mtodo no requer quaisquer operaes complicadas, materiais especiais ou tcnicas. Ele
tambm elimina incertezas como a disponibilidade e diferena de qualidade de cascas de
ovos, o que frequentemente causou problemas em mtodos anteriores usando cascas de ovos
de substituio. Alm disso, o uso de uma pelcula de plstico transparente permite no s a
fcil observao da morfologia embrionria de todos os ngulos, mas tambm o acesso fcil
ao embrio para manipulao, removendo a cobertura de plstico. Atualmente, est a ser
tentada uma melhoria adicional do mtodo de cultura para aumentar a capacidade de
incubao.
Se pudermos obter uma incubabilidade estvel, este mtodo poderia facilitar a gerao
de galinhas transgnicas e outras manipulaes embrionrias, que so necessrias para
estudos bsicos em medicina regenerativa. Poderia tambm apoiar a cultura de tecidos,
estudos utilizando clulas estaminais embrionrias de aves e a produo em massa de ovos de
galinha como biorreatores vivos.
Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid (No. 23924002) da Sociedade Japonesa
para a Promoo da Cincia. Agradecemos profundamente a ajuda prestada pelo Dr. Mitsuru
Naito do Instituto Nacional de Cincias Agrobiolgicas, pelo Dr. Masamichi Kamihira da
Universidade de Kyushu, pelo Dr. Kimimasa Takahashi da Nippon Veterinary e pela Life
Science University. O Dr. Masayuki Waki, do Centro de Pesquisa de Pecuria Prefeitora de
Chiba, tambm nos forneceu muitos conselhos, pelos quais somos gratos. Agradecemos
tambm aos funcionrios e estudantes de Makuhari Nishi High School, Isobe High School,
Chiba Kogyo High School, e Oihama High School. Agradecemos a Crimson Interactive Pvt.
Ltd. (Ulatus e Enago) por sua ajuda na traduo e edio de manuscritos.

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