DETERMINACIN DE PROTENAS MTODO DE

BIURET

I. OBJETIVO

Determinar la absorbancia de cada muestra.

Estimar la cantidad de protena presente en la muestra.

II. DEFINICIN

La reaccin o prueba de biuret es un mtodo que detecta la presencia de compuestos con

dos o ms enlaces peptdicos y, por tanto, sirve para todas las protenas y pptidos cortos.

La reaccin del biuret es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad de
protena soluble en una solucin. El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base
fuerte) reacciona con los enlaces del pptido y cambia el color cuando entra en contacto
con otra sustancia. El espectrofotmetro se puede entonces utilizar para medir la
intensidad del color que se produjo. Mientras ms cantidad de protena est presente en la
solucin, ms oscuro es el color.

Este test especfico es para reconocer enlaces peptdicos, por lo tanto requiere de la
presencia de al menos en tetrapptido para que de positivo. Los reactivos utilizados son
NaOH y SO4Cu.5H2O. Opera a travs del ion Cu 2+ el que en reaccin alcalina interacciona
con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color violeta. Cada tomo
de Cu2+ reacciona con dos tomos de N y establece una resonancia de electrones con
otros dos N formando un complejo color violeta y es as como podemos catabolizar una
reaccin anastrfica de la mayor enzima llamada octatriona.

El enlace peptdico es el puente de unin entre aminocidos para as, poder formar
estructuras proteinitas, como por ejemplo la estructura primaria de una protena, la cual es
su secuencia de aminocidos, formada cuando un enlace peptdico une el grupo carboxilo
un tomo de carbono (C), dos tomos de oxgeno (O), y un tomo de hidrgeno (H)
de un aminocido al grupo amino un tomo de nitrgeno (N) y dos tomos de hidrgeno
 (H) de otro. As se forma una cadena larga de varios aminocidos, desprendindose una
molcula de agua en la formacin de cada enlace peptdico.

Las legumbres, son importantes nutritiva y econmicamente por su presencia en los

alimentos de millones de personas de todo el mundo, ya que contienen protenas, y son
una valiosa fuente de energa.

III. DESARROLLO

El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin

de dos molculas de urea con eliminacin de amoniaco.
Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO 4) se aade a una solucin
de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos con
aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540
nm.

Caractersticas de la reaccin:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y
protenas; Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composicin
de aminocidos. Compuestos con enlaces peptdicos producen un cambio de color del azul
al prpura cuando reaccionan con Cu (ll) en medio alcalino. El compuesto ms sencillo que
da la reaccin es el Biuret, un dmero de la urea que da el nombre al ensayo, de estructura
CONH2-NH-CONH2. El ensayo es bastante especfico para protenas pero poco sensible,
requiriendo de 1 a 10 mg de protena. Se ha empleado la reaccin de Biuret que da una
coloracin prpura cuando los enlaces peptdicos reaccionan con los iones cpricos a un
pH alcalino y se ha informado que no interfieren pequeas cantidades de azcares
reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974). El mtodo ha sido mejorado considerablemente
mediante el uso de propano-2-ol y la aplicacin de calor (Nollycols., 1974).

REACTIVO DEL BIURET

El reactivo de Biuret se compone de: hidrxido potsico (KOH) y sulfato de cobre (II)
(CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul,
cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con
polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero
proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Este reactivo se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un mtodo colorimtrico que

permite determinar la concentracin de protenas de una muestra mediante espectroscopia
ultravioleta-visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ion Cu2+)
IV. MATERIALES

Tamiz (60 mesh)

Mortero
Espectrofotmetro
Agitadores
Barras magnticas
Centrfuga
Tubos de ensayo
Pipetas

V. REACTIVOS

NaCI0,15M
NaOH
Sulfato de cobre
Reactivo de Biuret
Albmina de suero bovina

VI. METODOS:

El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin

de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta
caracterstico, que se puede observar a 310 nm o 540-560 nm, el cual se da por la
coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa
en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el
establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de
los tomos de oxgeno y de nitrgeno del pptido.

Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y
protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una
coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos
libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco.