SELECCIN Y EVALUACIN DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE

FOSFATOS EN SUELOS CALCREOS DEL VALLE DEL MANTARO

Pablo Alvarez Figueroa1 Sady Garca Bendez2

RESUMEN

El fsforo (P) es un elemento limitante para la productividad de ecosistemas terrestres.

Una estrategia para aprovechar eficientemente el P del suelo es el uso de microorganismos
solubilizadores de fosfatos (MSP). El presente trabajo fue planteado para evaluar la presencia
de MSP en suelos calcreos del valle del Mantaro y su capacidad para solubilizar fosfatos de
calcio in vitro, con nfasis en la roca fosfrica de Bayvar. Siete suelos agrcolas del valle del
Mantaro y un suelo de La Molina fueron evaluados por su presencia de MSP mediante el
mtodo de placas de dilucin empleando el medio de Pikovskaya (PVK). En total, 13 cepas
bacterianas y 7 de hongos promisorias fueron aisladas. Tres cepas bacterianas (Pseudomonas
sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) y una cepa de hongo (Penicillium sp.) fueron seleccionadas
por presentar mayores halos de solubilizacin. La eficiencia de solubilizacin in vitro de las
cuatro cepas fue evaluada empleando el medio lquido PKV adicionado con 1000 mg P L-1
como fosfato triclcico [Ca3(PO4)2] o roca fosfrica de Bayvar. El P soluble, el pH y la
acidez titulable fueron medidos. Clostridium sp. mostr la mayor eficiencia de solubilizacin
con 429 mg P L-1 a partir del fosfato triclcico. Una estrecha relacin entre la concentracin de
P soluble y la acidez titulable fue encontrada en todas las cepas. La solubilizacin de P a partir
de la roca fosfrica fue notablemente menor que para el fosfato triclcico. Clostridium sp. es
promisoria en su capacidad solubilizadora in vitro, pero mayores estudios se requieren para
recomendar su aplicacin en campo.

Palabras clave: MSP, Pseudomonas sp., Clostridium sp., roca fosfrica, fosfato triclcico.

1
Ingeniero Agrnomo, Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Loja-Ecuador.
2
Dr. Profesor Principal, Departamento de Suelos, Facultad de Agronoma, Universidad Nacional Agraria La Molina

1
 SELECTION AND EVALUATION OF PHOSPHATE SOLUBILIZING
MICROORGANISMS IN CALCAREOUS SOILS OF MANTARO VALLEY

SUMMARY

Phosphorus is a limiting factor for the productivity of terrestrial ecosystems. A

promising strategy for efficiently using the soil P pools is the use of phosphate solubilizing
microorganisms (PSM). The objective of this work was evaluating the presence of
microorganisms with ability to solubilize calcium phosphates in calcareous soils from Mantaro
Valley, and their efficiency for in vitro P solubilization with emphasis in Bayovar rock
phosphate. Seven soils from Mantaro valley and one from La Molina were screened for
presence of PSM applying the technique of dilution plates with the nutrient medium of
Pikovskaya (PVK). In total, 13 bacterial and 7 fungal isolates with P solubilization capacity
were identified. Three bacterial isolates (Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp.) and
one fungal isolate (Penicillium sp.) were selected due to the appearance of clear solubilization
haloes. For all the isolates, the in vitro P solubilization efficiency was evaluated using the
liquid nutrient medium of Pikovskaya added with 1000 mg L-1 of P as tricalcium phosphate
[Ca3(PO4)2] and Bayovar rock phosphate. The amount of dissolved P, pH and titratable
acidity were measured in the medium at 5, 10, 15 20, 15 and 30 days after inoculation (dai).
The maximum solubilization rates were reached between 15 to 25 dai. Clostridium sp. was the
most efficient, with 429 mg L-1 of P solubilized. A close correlation between soluble P
concentration and titratable acidity was found in all the isolates. Phosphorus solubilization
from Bayovar rock phosphate was noticeably lower than that from tricalcium phosphate.
Clostridium sp. is an isolate with promising capacity for P solubilization in vitro, but further
studies are required to be recommended for field applications.

Keywords: PSM, Pseudomonas sp., Clostridium sp., rock phosphate, tricalcium phosphate.

2
I. INTRODUCCIN

El fsforo (P) es un elemento escaso en la naturaleza. El contenido total de P en la capa

superior del suelo vara entre 50 a 3000 mg kg-1 (Sims y Pierzynski 2005). El P absorbido por
las plantas alcanza solamente un 0.1% del total (Chen et al. 2006, Sample et al. 1980), y est
representado por los iones ortofosfato H2PO4- y HPO42- (Walker y Syers 1976, Foth y Ellis
1997). En la mayora de suelos el P en solucin es insuficiente para cubrir los requerimientos
de la planta (Kirkby y Johnston 2008).

Diversos investigadores advierten sobre una inminente crisis de fsforo, ya que las
reservas mundiales de fsforo se encuentran en un proceso de agotamiento (Cordell et al.
2009, Vaccari 2009). La distribucin de estas reservas es desigual; a lo que se aaden
dificultades de suministro (FAO 2005). Este desequilibrio convierte al fsforo en un recurso
geoestratgico.

El Per tiene reservas importantes de roca fosfrica (RF) en los depsitos

sedimentarios de Bayvar, ubicados en la costa norte en el desierto de Sechura, con reservas
potenciales estimadas en 10 mil millones de TM (Alegre y Chumbimune 1991) con una
riqueza de 30.5 % de P2O5 (Aguirre 1993).

Dada la baja solubilidad de este mineral fosfatado, surge la necesidad de investigar en

microorganismos con capacidad para solubilizar RF y fosfatos de calcio. Una cantidad
importante de investigaciones han sido orientadas a mejorar la eficiencia de la nutricin
fosfrica de las plantas a travs de microorganismos que solubilizan FePO4 y AlPO4 en suelos
cidos y Ca3(PO4)2 en suelos bsicos.

El objetivo del presente trabajo de investigacin fue determinar la presencia de

microorganismos con capacidad de disolucin de fosfatos de calcio en suelos calcreos del
valle del Mantaro y evaluar su potencial para solubilizar la RF de Bayvar.

3
II. MATERIALES Y MTODOS

Seleccin de suelos para el aislamiento de cepas.

Los suelos empleados para el aislamiento e identificacin de cepas fueron

seleccionados de una coleccin de 50 muestras de suelo obtenidas de las comunidades de
Chacrampa, Aramachay y Sincos (Distrito de Sincos, Provincia de Jauja, Regin Junn) en el
valle del Mantaro.

La coleccin fue preparada entre los meses de julio a agosto del 2011, como parte del
subproyecto 4 del proyecto de investigacin en evaluacin de sistemas productivos en el
marco del convenio IUC-VLIR-UNALM. Las muestras fueron obtenidas de los primeros 30
cm de campos agrcolas cultivados con papa, cebada, avena y leguminosas de grano,
manejadas bajo un sistema de rotacin que incluye periodos de descanso entre 1 a 2 aos.

Las propiedades fsico-qumicas de los suelos relacionadas con su fertilidad fueron

determinadas en el Laboratorio de Anlisis de Suelos, Plantas, Aguas y Fertilizantes de la
Universidad Nacional Agraria La Molina (LASPAF-UNALM). Siete suelos fueron
seleccionados por su alto contenido de carbonato de calcio y bajo fsforo disponible. El
fsforo disponible fue medido por el mtodo Olsen (Olsen et al. 1954), despus de realizar la
extraccin de las muestras de suelo con NaHCO3 0.5 M a pH 8.5.

Un suelo del campo Libres ubicado en el campus de la UNALM, con contenido

medio de calcreo total, fue tambin incluido en el proceso de seleccin.

En el cuadro 1, se muestra las caractersticas de los ocho suelos utilizados para el

aislamiento de microorganismos solubilizadores de fsforo (MSP)

4
Cuadro 1: Descripcin de los suelos utilizados para el aislamiento

Altitud CE(1:1) P2O5 CaCO3 Clasificacin taxonmica

Suelo Localidad pH*
msnm dS m-1 mg kg-1 % Soil Taxonomy (2010)
1 Aramachay 3698 7.96 0.26 4.0 33.90 Typic Ustorthents
2 Chacrampa-1 3607 7.81 0.25 3.5 6.30 Typic Ustorthents
3 Chacrampa-2 3588 7.46 0.82 14.7 19.10 Typic Ustorthents
4 Sincos-1 3413 7.91 0.28 3.4 24.80 Typic Ustorthents
5 Chacrampa-3 3605 7.59 0.48 39.2 10.10 Typic Ustorthents
6 Sincos-2 3307 7.57 1.37 16.4 14.30 Typic Ustifluvents
7 Sincos-3 3301 7.49 2.40 13.3 13.40 Typic Ustifluvents
8 La Molina 234 7.33 2.30 28.6 6.30 Ustic Torrifluvents
*Los anlisis de caracterizacin fueron realizados en el LASPAF-UNALM

Aislamiento de microorganismos

Para el aislamiento de MSP, las muestras fueron secadas al aire por 48 horas,
tamizadas a travs de una malla de 2 mm de dimetro para remover los fragmentos gruesos;
posteriormente fueron homogenizadas y almacenadas en recipientes hermticos de plstico.

Bacterias y hongos se aislaron a partir de ocho suelos mencionados anteriormente,

mediante la tcnica de dilucin en placas. El medio PKV fue utilizado para el cultivo de los
microorganismos. Se trabaj con las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 para bacterias y con 10-4, 10-5,
10-6 para hongos; a partir de las cuales se realiz el conteo de colonias totales y colonias que
solubilizan fsforo, y en base a esto se determin la poblacin.

Seleccin de cepas con capacidad de disolucin en medio slido

Para la deteccin selectiva de los MSP se emple el medio slido de PKV

complementado con 5.0 g L-1 de fosfato triclcico grado reactivo 7.63 g L-1 de roca fosfrica
de Bayvar, para aportar 1000 mg L-1 de P inorgnico. Despus de 5 das de incubacin a 24
C, se evalu si los microorganismos desarrollaron zonas transparentes alrededor de las
colonias (halozonas). Las cepas que presentaron esta caracterstica fueron repicadas por un

5
procedimiento de picado con punta de aguja y a los 4 das fue determinado el ndice de
solubilizacin. Es importante mencionar que el fosfato triclcico y la RF se adicionaron en
tratamientos diferentes para determinar la presencia de MSP en ambos medios; ya que
presentan diferente constante de producto de solubilidad (Kps), siendo la RF ms difcil de ser
solubilizada.

Las colonias dentro de las placas y sus halos de solubilizacin fueron fotografiados
mediante una cmara digital Sony Easyshare. Los dimetros de crecimiento de cada colonia
y los dimetros de los halos de solubilizacin respectivos fueron medidos con ayuda del
software AutoCAD 2012 en espaol. Los dimetros fueron determinados utilizando
fotografas de las placas y calibrndolas dentro del programa a un tamao real usando
referencias de tamao conocido como el dimetro de la placa, monedas y el tamao real de las
etiquetas presentes en las placas.

El ndice de solubilizacin (IS) en los repiques fue calculado mediante la frmula

siguiente (Kumar y Narula 1999):

Donde:
Halo = dimetro del halo de solubilizacin (dimetro colonia + halozona)
Colonia = dimetro de la colonia
Con el mismo programa y calibrada la fotografa al tamao real, se determin el rea
del halo de solubilizacin que corresponde al rea total (rea de la colonia ms rea de la
halozona).

Prueba de solubilizacin in vitro en medio lquido

Las cepas puras que desarrollaron halo en medio slido y que presentaron el ndice ms
alto de solubilizacin y/o mayor rea del halo de solubilizacin se evaluaron en medio lquido.

6
 En frascos conteniendo 150 mL de medio lquido PVK modificado con 1000 mg L-1 de
fosfato triclcico o roca fosfrica de Bayvar, fue inoculado 1 mL de una suspensin de
Bacillus sp., Clostridium sp. y Pseudomonas sp. a una concentracin de 3 x 108 ufc mL-1
validada previamente con la escala de McFarland, y Penicillium sp. a una concentracin de 1 x
106 esporas mL-1 determinada por conteo de conidios con el hemocitmetro de Neubauer
segn el procedimiento descrito por French y Hebert (1980). La temperatura de incubacin fue
28 C.

La concentracin de fsforo en la solucin nutritiva fue medida a los 5, 10, 15, 20, 25 y
30 das. El muestreo se realiz por descarte tomando una alcuota de las tres repeticiones por
tratamiento y un blanco por cada cepa y fuente de P insoluble. Fue determinada tambin la
acidez titulable por el mtodo descrito por Cerezine et al. (1988) y el pH de los filtrados.

El ensayo estuvo conformado por cuatro cepas y dos enmiendas que fueron las fuentes
de P insoluble (cuadro 2) con un total de 144 unidades experimentales.

Cuadro 2: Estructura del ensayo de solubilizacin in vitro

Fuente de P N N Total
Cepa
insoluble repeticiones evaluaciones repeticiones
Bacillus sp. 3 6 18
Clostridium sp. Fosfato 3 6 18
Penicillium sp. triclcico 3 6 18
Pseudomonas sp. 3 6 18
Bacillus sp. 3 6 18
Clostridium sp. Roca fosfrica 3 6 18
Penicillium sp. de Bayvar 3 6 18
Pseudomonas sp. 3 6 18

La cantidad de fsforo soluble fue medida por el mtodo azul de molibdeno (Watanabe
y Olsen 1965), y se expres en mg P L-1 solubilizado por cada unidad muestreada. Para ello, la
alcuota de caldo microbiano se centrifug a 5000 rpm durante 20 minutos, y posteriormente
se filtr con papel Whatman No. 40.

7
III. RESULTADOS Y DISCUSIN

Aislamiento

Fueron encontradas 13 cepas de bacterias y de 7 de hongos con capacidad para disolver

P insoluble. La poblacin de bacterias solubilizadoras de P en el medio adicionado con RF fue
de 0.55 % del total; mientras que la poblacin de estas en medio con fosfato triclcico (FTC)
fue 9.25%. La poblacin de hongos solubilizadores en medio de cultivo con RF fue de 15.50
% mientras que en medio con FTC la poblacin de solubilizadores fue de 28.40 %. En general,
la poblacin fue ms alta en el medio adicionado con FTC en comparacin con la poblacin
encontrada en medio con RF, ya que esta ltima es un compuesto de difcil solubilizacin, y al
no proveer P al medio nutritivo la poblacin fue notablemente menor.

Fue realizada la identificacin de las cepas mediante pruebas bioqumicas.

ndice de solubilizacin

El ndice de solubilizacin (IS) in vitro en medio slido present alta diferencia

significativa entre las 20 cepas seleccionadas para su estudio por su capacidad de disolucin
de P inorgnico. La mejor cepa bacteriana fue Pseudomonas sp. que supera ampliamente a las
dems alcanzando 3.05, seguida por Clostridium sp. y la CBact6, que fueron el segundo grupo
con 1.94 y 1.75 respectivamente. En relacin a las cepas fngicas la que destac sobre las
dems fue Penicillium sp. con 1.45. Es importante mencionar que lo que pretende el trabajo es
aportar con cepas promisorias que solubilicen P, en este sentido el objetivo fue seleccionar tres
cepas bacterianas para realizar pruebas en la siguiente fase, y de acuerdo al ndice de
solubilizacin se seleccion a la Pseudomonas sp. y Clostridium sp. por presentar los valores
ms altos.

rea del halo de solubilizacin

Se realiz para diferenciar entre bacterias que presentando ndices de solubilizacin

similares pueden presentar diferentes reas de solubilizacin, es decir, una bacteria pequea
puede presentar el mismo ndice de solubilizacin que una bacteria de mayor tamao y en este
8
sentido el rea del halo de solubilizacin nos permiti diferenciar cepas que solubilizaron una
mayor rea y por lo tanto son ms promisorias.

Las cepas bacterianas con el mayor rea de halo de solubilizacin fueron Clostridium
sp., Pseudomonas sp. y Bacillus sp. con 196.8, 186.4 y 144.4 mm2 respectivamente.

Relacionando las mejores cepas por la mayor rea de halo de solubilizacin y el alto
ndice de solubilizacin, se observa que Pseudomonas sp. y Clostridium sp. presentan los
mejores resultados en ambas mediciones y por lo tanto constituyen las cepas ms promisorias.
Estas dos bacterias fueron seleccionadas para estudios posteriores.

Aunque Bacillus sp. present un rea del halo solubilizacin menor que las dos
bacterias mencionadas, tambin fue considerada para la siguiente fase de laboratorio, ya que el
rea de halo solubilizado en medio slido fue uno de los ms altos.

La CBact6 considerada dentro de las tres mejores por su alto IS, no fue considerada
para la siguiente prueba ya que el rea del halo de solubilizacin estuvo entre los ms bajos, es
decir present uno de los menores dimetros totales.

Aunque las cepas fngicas CFung2, CFung4, CFung5 y CFung1 fueron las que
presentaron la mayor rea de halo de solubilizacin; durante los repiques, las tres primeras
redujeron gradualmente el rea del halo de solubilizacin, llegando incluso a dejar de ser
visible; mientras que la CFung1 siempre present la misma rea de halo de solubilizacin y se
mantuvo as durante todo el ensayo, por tanto, la cepa fngica ms promisoria de acuerdo al
rea del halo de solubilizacin fue la CFung1 que corresponde a una especie de Penicillium
sp., que present adems el mayor IS.

Por las razones mencionadas, las bacterias Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium
sp. y el hongo Penicillium sp. fueron considerados como microorganismos solubilizadores de
fosfatos promisorios.

9
 Prueba de solubilizacin in vitro en medio lquido

Se encontr una alta variabilidad temporal en la concentracin de P que las cuatro

cepas mencionadas solubilizaron in vitro. Se determin adems una relacin entre la acidez
titulable, pH, y el P solubilizado en medio liquido adicionado con RF y FTC, pero la
intensidad de cada uno de estos vara en funcin de la cepa y la fuente de P insoluble utilizada.

Diferencias altamente significativas fueron encontradas para los efectos principales

cepas microbianas y enmienda; as como para los efectos de interaccin respectivos. En los
diferentes tiempos de medicin tambin se encontraron diferencias altamente significativas, es
decir que el P solubilizado para una misma cepa y enmienda vari notablemente a travs de las
evaluaciones realizadas. En el cuadro 3 se puede observar la separacin de medias para la
fuente de variacin cepa.

Cuadro 3: Promedio total de P solubilizado por cepa

durante el periodo evaluacin

Cepas P soluble (mg P L-1)

Clostridium sp. 196.77 a
Bacillus sp. 147.89 b
Pseudomonas sp. 74.55 c
Penicillium sp. 48.93 d

Se observa que cada cepa forma un grupo estadsticamente distinto en relacin a la

cantidad de P solubilizada en medio lquido. Clostridium sp. presenta la mayor capacidad para
solubilizar P con 196.77 mg P L-1, seguida por Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Penicillium sp.
respectivamente, siendo esta ultima la que presenta menor solubilizacin de P con 48.93 mg P
L-1. Es importante mencionar que el cuadro 3 considera el promedio de todos los valores
registrados en las 6 evaluaciones para cada cepa con valores muy bajos en sus inicios y
tambin con valores muy altos de P liberado en los picos de solubilizacin.

10
 Fsforo soluble

La variacin temporal de la concentracin de P soluble en el medio nutritivo para las

cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 1.

Figura 1: Variacin de la concentracin de P soluble en medio nutritivo

adicionado con fosfato triclcico y roca fosfrica

Con Bacillus sp. la mayor concentracin de P soluble se alcanz a los 15 das en las
dos fuentes de P insoluble, sin embargo la concentracin de P liberado a partir del fosfato
triclcico fue de 304 mg P L-1 mientras que de la roca fosfrica se liberaron solamente 99 mg
P L-1. Es importante mencionar que aunque el pico de solubilizacin para el fosfato triclcico
ocurri a los 15 das, la concentracin de P soluble disminuy en las dos evaluaciones
subsecuentes, pero en la ltima evaluacin realizada, se produjo un incremento de la
11
concentracin de P soluble alcanzando esta vez 280 mg P L-1 de P solubilizado que si bien es
inferior al pico encontrado, no deja de ser un valor importante. Esta variacin en la
concentracin de P, se explicara por la incorporacin de P soluble al metabolismo de la
bacteria, pero luego de este periodo, se comienza nuevamente a liberar P al medio, es decir la
bacteria empieza nuevamente a solubilizar P. En la roca fosfrica luego del pico de
solubilizacin encontrado a los 15 das, no ocurre este proceso y el P soluble en el medio
presenta valores similares a los registrados antes del valor ms alto, esto debido a que la roca
fosfrica al tener la constante de producto de solubilidad ms alta, es ms difcil que se
solubilice y por lo tanto la cantidad de P liberado en el medio es escasa.

En el medio inoculado con Clostridium sp. se observa que la concentracin de P

solubilizado a partir de la roca fosfrica a lo largo del tiempo es casi similar durante todo el
periodo de evaluacin y la mxima concentracin liberada a partir de esta fuente de P
insoluble fue 59 mg P L-1. En el medio con fosfato triclcico se observ que a los 20 das
ocurri la mayor liberacin de P soluble registrndose una concentracin de 429 mg P L-1.
Cabe resaltar que las diferencias en las concentraciones P solubilizado a partir de ambas
fuentes de P insoluble son mucho mayores que en las otras cepas y que claramente se observa
que esta cepa es la que solubiliz la mayor cantidad de P a partir del fosfato triclcico en
comparacin con las dems. Adems se observ que la concentracin de P soluble en el medio
lquido adicionado con fosfato triclcico vari notablemente durante todo el ensayo, lo cual
coincide con lo encontrado por Illmer y Schinner (1994), incrementndose gradualmente hasta
alcanzar su mximo valor a los 20 das pero luego disminuy en las dos ltimas evaluaciones.
Esta disminucin puede deberse a que este microorganismo puede utilizar una parte del P
soluble que se encuentra en el medio lquido e incorporarlo a su metabolismo.

En la solubilizacin del FTC y la RF realizada por el hongo Penicillium sp. se observa

un patrn similar en la concentracin P soluble liberado a partir de estas dos fuentes de P
insoluble en todo el periodo de evaluacin. La mxima concentracin de P liberado a partir del
fosfato triclcico fue de 102 mg P L-1 y es el menor valor registrado en esta fuente de P
insoluble; mientras que a partir de la roca fosfrica se liberaron 57 mg P L-1, que igualmente
es el valor ms bajo para esta fuente de P. Ambos valores se registraron 25 das. Por lo tanto,
12
esta cepa fngica solubiliz la menor cantidad de P en comparacin con las tres cepas
bacterianas en ambas fuentes de P insoluble.

En el medio inoculado con Pseudomonas sp. la mayor concentracin de P solubilizado

fue 151 mg P L-1 la cual se alcanz a los 15 das en el medio adicionado con fosfato triclcico;
mientras que cuando se utiliz roca fosfrica la mayor concentracin de P solubilizado fue 116
mg P L-1 pero esto ocurri a los 25 das. Para esta cepa bacteriana, las concentraciones de P
liberado al medio a partir del fosfato triclcico fueron las ms bajas en comparacin con las
otras dos cepas bacterianas, pero superior a las registradas para la cepa fngica. En relacin a
la roca fosfrica, aunque Pseudomonas sp. alcanz el pico ms alto en solubilizacin de P
superando a las dems cepas bacterianas y a la fngica, esta cantidad es baja en comparacin
con el P liberado a partir del fosfato triclcico.

pH

El valor inicial de pH para el medio de cultivo antes de la esterilizacin fue 6.98 para
el fosfato triclcico y 7.26 para la roca fosfrica; despus de la esterilizacin el pH para en el
medio con fosfato triclcico vari ligeramente hasta 6.90, mientras que en el medio con roca
fosfrica el pH se mantuvo exactamente en el mismo valor.

El pH promedio durante todas las evaluaciones en medio adicionado con fosfato

triclcico fue de 4.22, 4.43, 4.59 y 5.26 para Clostridium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. y
Penicillium sp. respectivamente.

El pH promedio en medio con roca fosfrica fue de 4.09, 4.21, 4.24 y 4.61 para
Pseudomonas sp., Bacillus sp., Clostridium sp., y Penicillium sp. respectivamente.

Las diferentes variaciones en el pH son como resultado de la produccin de acidez

realizada por las diferentes cepas microbianas y explicada por la produccin de cidos
orgnicos como el glucnico, ctrico, mlico, lctico entre otros, la liberacin de H+ que se
produce en la asimilacin del amonio, o por la produccin de H2CO3 que se supone es una
ayuda inicial.

13
 La variacin temporal del pH en el medio nutritivo para las cuatro cepas microbianas,
puede apreciarse en la figura 2.

Figura 2: Variacin del pH en medio nutritivo adicionado con fosfato

triclcico y roca fosfrica

A los 5 das despus de la inoculacin (ddi) el pH disminuyo drsticamente, el cual

para Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Clostridium sp. estuvo en el rango de 4.24 a 4,10 en el
medio con fosfato triclcico y de 4.08 a 4.17 en el medio con roca fosfrica. Para
Pseudomonas sp. y Bacillus sp. el pH fue ligeramente menor en el medio con roca fosfrica,
pero en Clostridium sp. ocurre lo contrario ya que el pH es ligeramente inferior para el medio
adicionado con fosfato triclcico. En el medio inoculado con Penicillium sp. el pH fue de 5.36

14
para el fosfato triclcico y de 5.08 para la roca fosfrica, observndose por lo tanto que el
menor valor de pH fue observado en el medio con roca fosfrica.

Relacionando el pH con el P solubilizado (figura 3) a los 5 ddi en el medio con fosfato

triclcico, la variacin de pH no es alta entre las tres cepas bacterianas, a pesar de esto,
Clostridium sp. tiene la mayor cantidad de P solubilizado con 255 mg P L-1, seguida por
Bacillus sp. con 228 mg P L-1 y Pseudomonas sp. con 57 mg P L-1; mientas que Penicillium
sp. que registr un pH notablemente ms alto que las tres cepas mencionadas anteriormente,
solubiliz nicamente 32 mg P L-1; lo cual quiere decir que la cepa fngica est generando
menor acidez que las otras cepas y esta es considera como uno de los factores responsables de
la solubilizacin, debido a la relacin inversamente proporcional que se ha reportado entre el
pH y la cantidad de P liberado; pero en las tres cepas bacterianas el pH es similar y por lo
tanto no es nicamente el pH el factor que interviene como mecanismo de solubilizacin.

Figura 3: Relacin entre el pH y concentracin de P soluble en medio

adicionado con fosfato triclcico

15
 En relacin al fosfato triclcico, es importante hacer nfasis que para Pseudomonas sp.,
Bacillus sp. y Clostridium sp. el valor ms bajo de pH se registr a los 5 ddi y aunque se
produjeron variaciones de pH durante las evaluaciones subsiguientes la tendencia siempre fue
a incrementarse ligeramente el pH. En relacin a Penicillium sp. se observa claramente que el
pH a los 25 ddi fue ms bajo que en la otras evaluaciones y es aqu donde se observ la mayor
cantidad de P solubilizado. Para Clostridium sp. al igual que con Penicillium sp. se observa
que la mayor solubilizacin ocurri cuando el pH disminuy, mientras que para Pseudomonas
sp. y Bacillus sp. cuando se alcanzaron los picos ms altos de P solubilizado, no se registraron
necesariamente los valores ms bajos de pH, por lo que otro mecanismo tiene que estar
involucrado en la solubilizacin de P realizada por estas dos cepas bacterianas cuando fosfato
triclcico fue utilizado como fuente de P insoluble.

En relacin al pH y el P solubilizado en el medio con roca fosfrica (figura 4) se

observa que inicialmente, a los 5 ddi, Bacillus sp y Clostridium sp. solubilizaron la mayor
cantidad de P con 56 y 53 mg P L-1 respectivamente, seguidas por Pseudomonas sp. con 28
mg P L-1 y Penicillium sp. que solubiliz nicamente 9 mg P L-1. Bacillus sp. que es la que
ms solubiliza tiene el menor valor de pH con 4.08 y Penicillium sp. que es la que solubiliza la
menor cantidad de P tiene el pH ms alto con 5.08. Clostridium sp. present valores de pH y P
similares a Bacillus sp., pero Pseudomonas sp. aunque tambin logr disminuir el pH
signicativamente hasta 4.14, la cantidad de P liberado fue mucho menor con 28 mg P L-1.

16
 Figura 4: Relacin entre la concentracin de P soluble y el pH en medio con
roca fosfrica

En Bacillus sp. no se observa una relacin entre la mxima cantidad de P solubilizado

y el pH. En el medio inoculado con Clostridium sp. el P soluble liberado al medio se mantiene
prcticamente constante al igual que el pH durante todo el ensayo y se constituye en la cepa
con el pico ms bajo de solubilizacin. En Penicillium sp. se observa claramente que la mayor
cantidad de P solubilizado ocurri cuando el pH present el valor ms bajo, por lo tanto en el
medio adicionado con roca fosfrica el pH es el mecanismo que mayor influencia tiene sobre
la solubilizacin, sin embargo en comparacin con las cepas bacterianas no logr disminuir el
gran medida el pH y por lo tanto el P liberado es menor.

En el medio inoculado con Pseudomonas sp. se observa que la mayor cantidad de P

liberado a partir de la roca fosfrica fue determinado cuando el pH del medio estuvo en 3.72
que est entre los dos valores ms bajos registrados durante todo el ensayo. Adems se aprecia

17
claramente en las cepas bacterianas que la disminucin en la concentracin de P en las ultimas
evaluaciones se debe principalmente a que el pH se increment, mientras que con Penicillium
sp. en las tres ltimas evaluaciones ocurri lo contrario, es decir se produjo la disminucin
ms notable del pH y la concentracin de P se increment. De las cuatro cepas microbianas,
Pseudomonas sp. y Penicillium sp. presentaron una evidente relacin inversamente
proporcional entre el P solubilizado y el pH en el pico de solubilizacin. En Bacillus sp. y
Clostridium sp. la mxima disminucin de pH no coincide con el valor ms alto de P liberado,
pero en comparacin con el pH inicial del medio, la disminucin del pH si sera la responsable
de la solubilizacin.

Acidez titulable

Con Bacillus sp., Clostridium sp. y Penicillium sp. se observa claramente que la mayor
cantidad de acidez titulable se produce en el medio adicionado con fosfato triclcico aunque
con algunas particularidades. Bacillus sp. produjo acidez titulable en forma irregular con dos
picos pero siempre en mayor cantidad que cuando se utiliz roca fosfrica; Clostridium sp.
increment gradualmente la acidez titulable (a excepcin de penltima evaluacin) y presenta
los valores ms altos registrados para esta medida; y Penicillium sp. fue quien produjo la
menor cantidad de acidez titulable en comparacin con todas las cepas, pero igualmente en
cantidades superiores al medio con roca fosfrica. En Pseudomonas sp. la mayor cantidad de
acidez titulable se produjo en el medio adicionado con roca fosfrica y su valor ms alto se
registr entre los 20 y 25 ddi, mientras que con fosfato triclcico la AT muestra una ligera
disminucin lineal desde la segunda evaluacin. La variacin temporal de la AT en el medio
nutritivo para las cuatro cepas microbianas, puede apreciarse en la figura 5.

18
 Figura 5: Variacin de la acidez titulable en medio adicionado con
fosfato triclcico y roca fosfrica

Relacionando la acidez titulable y el P solubilizado en el medio adicionado con fosfato

triclcico (figura 6), se observa una relacin directamente proporcional y muy evidente entre
la cantidad de P solubilizado y la AT, es decir que para todas las cepas, a mayor cantidad de
acidez titulable se observa mayor concentracin de P solubilizado. Se puede apreciar que la
lnea de variacin del P soluble en todo el periodo de evaluacin tiene el mismo
comportamiento que la lnea de variacin de la acidez titulable. Por lo tanto la variable que
mayor incidencia tiene sobre la solubilizacin, o que explicara de mejor forma la
solubilizacin del fosfato triclcico es la acidez titulable y en menor medida el pH. La menor
cantidad de acidez titulable fue determinada en Penicillium sp. y Pseudomonas sp. y estos dos
cepas se registra tambin la menor cantidad de P soluble. La mayor cantidad de acidez

19
titulable se registr en Clostridium sp. y es en esta cepa donde se encontr la mayor cantidad
de P soluble en comparacin con las dems cepas, luego le sigue Bacillus sp. que produjo una
cantidad menor de acidez titulable y fue la cepa que ocupo el segundo lugar en solubilizacin
de P a partir del fosfato triclcico.

Figura 6: Relacin entre la concentracin de P soluble y la acidez titulable en

medio adicionado con fosfato triclcico.

En relacin a la acidez titulable y el P solubilizado en el medio con roca fosfrica, se

observa, al igual que en el caso del fosfato triclcico, una relacin directamente proporcional
entre la cantidad de P solubilizado y la acidez titulable. El pico ms alto de produccin de
acidez titulable en medio con roca fosfrica lo produjo Pseudomonas sp. y es aqu donde
tambin se registr la mayor cantidad de P solubilizado, lo cual ocurri entre los 20 a 25 ddi,
la que le sigue es Clostridium sp. que si bien no alcanz un pico tan alto de acidez titulable,
esta se mantuvo prcticamente sin mayor variacin durante todas las evaluaciones pero con

20
promedio ms alto que el determinado para Pseudomonas sp. en todo el periodo de
evaluaciones y como resultado la concentracin de P soluble tambin se mantuvo sin
variaciones importantes. Le sigue Bacillus sp. y finalmente Penicillium sp. con la menor
produccin de acidez titulable y por lo tanto la menor cantidad de P solubilizado. Por lo tanto,
tambin para la roca fosfrica la variable que mayor incidencia tiene sobre la solubilizacin es
la acidez titulable y no nicamente el pH (figura 7).

Figura 7: Relacin entre la concentracin de P soluble y la acidez

titulable en medio adicionado con roca fosfrica.
A los 20 ddi se registr el valor ms alto de solubilizacin en Clostridium sp. en medio
de cultivo con FTC, seguida por Bacillus sp., Penicillium sp. y Pseudomonas sp. Adems
Clostridium sp. fue la cepa que mayor cantidad de P solubiliz en todas las evaluaciones
realizadas a partir del FTC. En la RF se observ poca variabilidad entre el P que puede
solubilizar cada cepa. Las cuatro cepas microbianas evaluadas son ms efectivas en la
solubilizacin del fosfato triclcico en comparacin con la roca fosfrica (figura 8).

21
 Figura 8: Solubilizacin de fosfato triclcico y roca fosfrica
a los 20 das despus de la inoculacin

En el cuadro 4 se resume los valores ms altos de solubilizacin alcanzados por cada

cepa, la disminucin del pH y la acidez titulable producida en la evaluacin respectiva.

Cuadro 4: Solubilizacin de fosfato triclcico y roca fosfrica en medio lquido por

las cepas microbianas

Cepa Fuente de fsforo

Fosfato triclcico Roca fosfrica
pH Acidez P pH final Acidez P
final titulable mg L-1 titulable mg L-1
meq L-1 meq L-1
Clostridium sp. 4.11 31.69 429.11 4.32 11.76 58.90
Bacillus sp. 4.38 28.42 304.42 4.18 12.41 99.34
Pseudomonas sp. 4.47 11.43 151.40 3.72 13.72 115.73
Penicillium sp. 4.87 12.09 101.91 4.01 9.47 56.94

22
IV. CONCLUSIONES

Fueron aisladas 13 cepas de bacterias y 7 de hongos con capacidad para solubilizar

fosfatos. De acuerdo al ndice y el rea del halo de solubilizacin se consider como
las cepas promisorias la CBact1, CBact2 y CBact3 y la CFung1.

La cepa bacteriana CBact1 corresponde a Pseudomonas sp. (fluorescente), la CBact2 a

Bacillus sp. y la CBact3 a Clostridium sp. La CFung1 corresponde a una especie de
Penicillium sp.

Clostridium sp. fue la cepa con mayor eficiencia de solubilizacin in vitro, mientras
que Penicillium sp. result en los valores ms bajos a partir del fosfato triclcico.

La solubilizacin de fsforo a partir de la roca fosfrica fue notablemente menor en

comparacin con el fosfato triclcico.

23
V. BIBLIOGRAFA

1. Aguirre, G. 1993. Evaluacin de fuentes de fsforo en el rendimiento del cultivo de papa,

con nfasis en roca fosfatada y fuentes orgnicas. Anales Cientficos Universidad Nacional
Agraria La Molina (en lnea). Per. Consultado 27 abr. 2012. Disponible en
http://tumi.lamolina.edu.pe/resumen/anales/1999_92.pdf

2. Alegre, J; Chumbimune, R. 1991. Investigaciones y usos de la roca fosfrica en el Per. II

Reunin de la Red Latinoamericana de Roca Fosfrica. Tchira, Venezuela. 13 al 16 de
marzo.

3. Cerezine, P; Nahas, E; Banzatto, D. 1988. Soluble phosphate accumulation by Aspergillus

niger from fluoroapatite. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 501-505.

4. Chen, Y; Rekha, P; Arun, A; Shen, F; Lai, W; Young, C. 2006. Phosphate solubilizing

bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied
Soil Ecology 34:3341.

5. Cordell, D; Drangert, J; White, S. 2009. The story of phosphorus: global food security and
food for thought. Global Environmental Change 19:292305.

6. FAO. 2005. Tendencias mundiales actuales y perspectivas de los fertilizantes (en lnea).
Italia. Consultado 26 abr. 2012. Disponible en ftp://ftp.fao.org/agl/agll/docs/-cwfto08s.pdf

7. Foth, H; Ellis, B. 1997. Soil Fertility. 2 ed. Boca Raton, Florida. CRC Press. 290 p.

8. French, E; Hebert, T. 1980. Mtodos de investigacin fitopatolgica. San Jos, Costa

Rica. IICA. 289 p.

9. Illmer, P; Schinner, F. 1994. Solubilization of inorganic calcium phosphates,

solubilization mechanisms. Soil Biology and Biochemistry 27(3):257-263.

10. Kirkby, E; Johnston, A. 2008. Soil and fertilizer phosphorus in relation to crop nutrition.
In Hammond, JP; White, PJ. eds. The ecophysiology of plantphosphorus interactions.
Dordrecht, Holanda, Springer. p. 177223.

24
11. Kumar, V; Narula, N. 1999. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergente
of wheat as affected by Azotobacter chroococum mutans. Biol. Fertil. Soils 28:301-305.

12. Olsen, SR; Cole, CV; Watanabe, FS; Dean, LA. 1954. Estimation of available phosphorus
in soils by extraction with sodium bicarbonate. USDA Circ. 939. U.S. Govt. Print. Office,
Washington, DC.

13. Sample, E; Soper, R; Racz, G. 1980. Reactions of phosphate fertilizers in soils. In

Khasawneh, FE; Sample, EC; Kamprath, EJ. eds. The role of phosphorus in agriculture. USA,
American Society of Agronomy. p. 263310.

14. Sims, J; Pierzynski, G. 2005. Chemistry of phosphorus in soil. In Tabatabai, AM; Sparks,
DL. eds. Chemical processes in soil, SSSA book series 8. SSSA, Madison, USA. p. 151192.

15. Soil Survey Staff. 2010. Keys to Soil Taxonomy. 11 ed. USDA-Natural Resources
Conservation Service, Washington, DC. 365 p.

16. Vaccari, D. 2009. La crisis del fsforo. Investigacin y Ciencia, edicin espaola de
Scientific American. Espaa 395:22-27.

17. Walker, T; Syers, J. 1976. The fate of phosphorus during pedogenesis. Geoderma 15:119.

18. Watanabe, F; Olsen, S. 1965. Test of an ascorbic acid method for determining
phosphorous in water and NaHCO3 extracts from soil. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 29:677678.

25