ari / Tanggal : Kamis,03 Januari 2013

Waktu : 13.30 WIB selesai

Tempat : Laboratorium Patologi Klinik RSU Tidar Magelang

Tujuan
1. Untuk memeriksa secara mikroskopis bakteri tahan asam (BTA) dari jenis Mycobacterium
tuberculosis
2. Untuk mengetahui bakteri tahan asam (BTA) dari jenis Mycobacterium tuberculosis

Dasar Teori
TBC adalah penyakit infeksi yang menular yang di sebabkan oleh bakteri mikrobakterim
tuberkulosa. Bakteri ini berbentuk batang, berwarna merah dan bersifat asam sehingga dikenal
Bakteri Tahan Asam (BTA). Ciri khas Mycobacterium tuberculosis adalah basil tuberkel merupakan
batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3m, memiliki bentuk batang berwarna merah dan
bergerombol / berkelompok. Penularanya yaitu melalui udara yang tercemar oleh bakteri
mikrobakterium tuberkulosa pada saat penderita batuk atau bersin, menyebar melalui pembuluh
darah/kelenjar getah bening dan pada anak-anak bersumber pada orang dewasa. Sasaran yang
sering terkena biasanya paru-paru, ginjal, tulang ,otak saluran pencernaan dan kelenjar getah
bening.
Gejala umum penyakit TBC penderita mengalami demam tidak tinggi berlangsung lama
sering terjadi pada malam hari disertai dengan keringat, batuk berdarah berlangsung selama lebih
dari tiga hari, nafsu makan dan berat badan terus menurun dan mengalami perasaan tidak
enak/lemah. Gejala khusus penyakit TBC tergantung pada organ yang terkena, apabila terjadi
sumbatan pada bronkus akibat penekanan kelennjar getah bening menimbulkan suara mengi,
kalau ada cairan pada pleura akan disertai dengan keluhan sakit dada, dan pada anak-anak akan
mengenai otak dan sebagai meningitis dengan gejala demam tinggi, kesadaran rendah dan kejang-
kejang.
Metode
Reagen Ziehl Neelsen merupakan reagen yang digunakan dalam pemeriksaan
mikroskopis bakteri tahan asam (BTA) dari jenis Mycobacterium seperti Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium leprae dan Mycobacterium lainnya.
Reagensia
Reagen Ziehl Neelsen meupakan reagen kit yang terdiri dari tiga macam reagen yaitu :
1. Carbol Fuchsin 0,3%

2. Asam Alkohol 3%

3. Methylen blue 0,3%

Prinsip
Dinding sel bakteri tahan asam yng terdiri atas lapisan peptidoglikan dan
senyawa lipida yang mempunyai sifat mudah menyerap sehingga bila diwarnai dengan carbol
fuchsin maka dinding sel tersebut akan meresap zat warna dengan baik bila dipanaskan.
Selanjutnya asam mycolat yang terdapat di pori-pori dinding sel akan berikatan dengan fuchsin
sehingga warna merah sulit dilunturkan dengan asam alkohol. Sedangkan zat warna methylen blue
merupakan counter stain sebagai warna dasar. Salah satu bahan yang digunakan untuk
mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa minimal 3-5 cc.
Dahak yang diambil adalah dahak yang kental kuning kehijauan dengan wakttu pengambilan
sebagai berikut :
 1. Dahak sewaktu : penderita datang berobat dengan keluhan apa saja

ke klinik.
2. Dahak pagi : diambil pagi hari setelah bangun tidur.

3. Dahak sewaktu : diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi

tersebut.
Sputum yang ada dimasukkan ke dalam pot dahak dengan diameter lebar dan
berulir pada bagian leher pot dahak. Tujuan diameter pot dahak lebar yakni agar objek atau bahan
yang akan dianalisa mudah dimasukkan ke dalam pot dahak. Sementara tujuan leher pot berulir
yakni memudahkan untuk membuka dan menutup tutup pot dahak. Dan hal yang penting adalah
menuliskan nama dan alamat atau identitas pasien di permukaan pot dahak.

C. Alat dan Bahan

1. Alat :
a. Lidi
b. Objek glass/ preparat
c. Bunsen
d. Mikroskop
e. Pinset
f. Rak pengecatan
g. Kertas saring
h. Rak pengering (Gambar 1)
2. Bahan :
a. Dahak
b. Carbol Fuchsin 0,3 % (Gambar 1)
c. Asam Alkohol 3 % (Gambar 1)
d. Methylen blue 0,3 % (Gambar 1)
e. Desinfektan
f. Air

D. Cara Kerja
1. Pembuatan Preparat

(Gambar 2)
a. Mengambil lidi sampel dahak pada bagian purulen. (Gambar 2)
b. Menyebarkan secara spiral kecil-kecil dahak pada permukaan kaca sediaan dengan ukuran 2x3
cm.

2. Pengeringan

a. Mengeringkan dahak yang ada pada kaca sediaan pada temperatur kamar.
b. Memasukkan lidi bekas kedalam wadah berisi disinfektan.
3. Fiksasi

a. Menjepit sediaan kaca menggunakan pinset dan fiksasi 2-3 kali melewati api bunsen.
b. Memastikan apusan menghadap ke atas.

4. Pewarnaan

a. Meletakkan sediaan dengan bagian apusan menghadap ke atas pada rak pengecatan dengan
jarak 1 jari antara satu sediaan dengan sediaan lainnya.
b. Menuanginya dengan carbol fuchsin 0,3 % melalui kertas saring sampai menutupi seluruh
permukaan sediaan.
c. Memanaskan dengan sulut api di bagian bawah sediaan sampai timbul uap (tidak sampai
mendidih).
d. Mendiamkannya selama 5 menit.
e. Membilas sediaan dengan air mengalir secara hati-hati.
f. Menggenangi sediaan dengan asam alkohol 3 % sampai semua warna merah fuchsi luntur.
g. Membilas sediaan dengan air mengalir secara hati-hati.
h. Menggenangi sediaan dengan methylen blue 0,3 % selama 10-20 detik.
i. Membilas sediaan dengan air mengalir secara hati-hati.
j. Mengeringkan sediaan pada rak pengering.
k. Memeriksa sediaan dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran objektif 100x.

5. Pembacaan hasil
Membaca hasil melalui pengamatan mikroskop yang dibaca mulai dari ujung kiri ke ujung kanan
minimal 100 lapangan pandang, pada garis horisontal terpanjang.

E. Interpretasi Hasil
Menggunakan skala IUATLD :
Negatif : tidak ditemukan BTA minimal dalam 100 lapang pandang
Scanty : 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (menuliskan jumlah BTA yang ditemukan)
1+ : 10-99 BTA dalam 100 lapang pandang
2+ : 1-10 BTA setiap 1 lapang pandang ( memeriksa minimal 50 lapang pandang).
3+ : 10 BTA dalam 1 lapang pandang (memeriksa minimal 20 lapang pandang).

F. Hasil Pengamatan

Gambar 6. Dilihat dari mikroskop dengan perbesaran 100x

G. Pembahasan
1. Pada spesimen pertama tidak di temukan adanya infeksi penyakit TBC dengan di tandai tidak
di temukan bakteri mikrobakterium tuberkulosa.
 2. Pada spisimen kedua ditemukan adanya infeksi penyakit TBC dengan di tandai adanya bakteri
mikrobakterium tuberkulosa yang berwarna merah dan berbentuk batang.

Bakteri yang didapat adalah positif dan berwarna merah. Bakteri yang terlihat berbentuk
basil atau batang.

Bakteri TA
E. Interpretasi Hasil
Menggunakan skala IUATLD :
Negatif : tidak ditemukan BTA minimal dalam 100 lapang pandang
Scanty : 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (menuliskan jumlah BTA yang ditemukan)
1+ : 10-99 BTA dalam 100 lapang pandang
2+ : 1-10 BTA setiap 1 lapang pandang ( memeriksa minimal 50 lapang pandang).
3+ : 10 BTA dalam 1 lapang pandang (memeriksa minimal 20 lapang pandang).

F. Hasil Pengamatan

Gambar 6. Dilihat dari mikroskop dengan perbesaran 100x

G. Pembahasan
1. Pada spesimen pertama tidak di temukan adanya infeksi penyakit TBC dengan di tandai
tidak di temukan bakteri mikrobakterium tuberkulosa.

2. Pada spisimen kedua ditemukan adanya infeksi penyakit TBC dengan di tandai adanya
bakteri mikrobakterium tuberkulosa yang berwarna merah dan berbentuk batang.

Bakteri yang didapat adalah positif dan berwarna merah. Bakteri yang terlihat
berbentuk basil atau batang.

Bakteri TA

leukosit
l
 Gambar 7. Dilihat dari mikroskop dengan perbesaran 100x

Dalam pengamatan ditemukan bakteri berbentuk basil berwarna merah, dan

diketahui bahwa bakteri tersebut adalah Mycobacterium tuberculosis.
Pada pengamatan yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa bakteri yang tampak dengan
perbesaran 100x bahwa dalam 1 lapang pandang terdapat 7 BTA. Dengan demikian, bakteri
tersebut positif bakteri tahan asam dengan nilai positif dua (+ +).

H. Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa didalam sampel
dahak terdapat bakteri Mycobacterium tuberculosis yang mempunyai sifat khusus, yakni tahan
terhadap asam pada pewarnaan karena dari pengamatan terilhat bahwa
bakteri Mycobacterium tuberculosis berbentuk basil ,berwarna merah setelah diberi carbol
fuchsin, dan dari pengamatan yang telah dilakukan, bateri bakteri tersebut positif bakteri
tahan asam dengan nilai positif dua (+ +). Oleh karena itu, dahak dapat menjadi faktor
penularan tuberculosis yakni dari meludah sembarangan, batuk sembarangan.

A. LATAR BELAKANG
Bakteri berasal dari kata bakterion (bahasa Yunani) yang artinya tongkat atau benang.
Saat ini nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak
berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta demikian
kecilnya sehingga hanya tampak dengan menggunakan mikroskop.
Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa
dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk
mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal
nama spesiesnya.
Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi
tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewana tidak dapat langsung masuk ke dalam
sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang
mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah
dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat
kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel.
Metode mewarnai atau mengecat preparat itu ada banyak sekali antara lain dengan
pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan mikroorganisme dengan
 menggunakan satu jenis zat saja. Kemudian ada pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif
merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan
menjadi lapisan tipis. Selanjutnya ada pewarnaan acid-fast. Pewarnaan acid-fast digunakan
untuk membedakan bakteri yang tahan asam dengan yang tidak tahan asam.
Kemudian pewarnaan gram. Pada tahun 1884, seorang ahli histology dan
bakteriologiawan dari Denmark, Christian Gram secara kebetulan menemukan prosedur
pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting
dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat
dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu pertama, organisme yang dapat
menahan kompleks pewarna primer ungu iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak
biru gelap/ungu), disebut Gram positif. Kedua, organisme yang kehilangan kompleks warna
ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna
bandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negatif.
Pada perkembangan ilmu pangan, pengetahuan akan bakteri sangat dibutuhkan terutama
dalam identifikasi jenis bakteri yang berkaitan dengan pangan. Misalnya pemanfaatan bakteri
yanag menguntungkan sehingga banyak digunakan dalam industri makanan atau proses
pengubahan suatu zat dalam makanan.

B. TUJUAN
Tujuan dari praktikum acara Morfologi dan Pewarnaan Bakteri adalah untuk mempelajari
morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan cara pewarnaan bakteri menggunakan
metode pewarnaan negatif, Gram, dan acid-fast.
C. TINJAUAN PUSTAKA
Ziehl-Neelsen adalah metode yang paling umum digunakan. Dinding sel organisme
mikrobakteri mengandung kompleks lipid dikenal sebagai hidroksi karboksilat asam,
phitiocerols dan polimetil asam. Kompleks lainnya lipid dan
glycolipids telah diisolasi. Karboksilat hidroksi asam yang memiliki sifat tahan luntur asam dan
lainnya menyajikan sebuah penghalang untuk pewarna masuk serta elusi. Metode Ziehl-Neelsen
ini adalah dengan menambahkan fenol, agen lipofilik untuk larutan dari fuchsin dasar oleh
pemanasan dan memperpanjang waktu pewarnaan (Raoul, 2009).
Pencarian untuk kecepatan dan keberhasilan telah menghasilkan beberapa modifikasi
untuk menyederhanakan metode pewarnaan ZN. Namun, tidak satupun yang telah memperoleh
penerimaan yang luas kecuali untuk metode pewarnaan dingin. Dalam studi
ini, pewarnaan ZN menggunakan 0,3% fuchsin dasar yang ditemukan sensitif dan
spesifik untuk yang menggunakan 1% fuchsin dasar. Menggunakan reagen ini dapat menghindari
pemborosan fuchsin dasar dan mengurangi biaya pewarnaan. Mengurangi konsentrasi dari
fuchsin dasar di bawah 0,3%, bagaimanapun, ditemukan mempengaruhi sensitivitas
ZN (Selvakumar, 2005).
 Secara garis besar berdasar pengecatan Gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu
Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna gram A yang mengandung kistal violet, sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah
atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat Gram D sebagai
warna kontras. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif susunan lebih sederhana terdiri
atas 2 lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri
lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Juliantina, 2009).
Bakteri Lactobacillus sp. ini termasuk Gram positif, tidak berspora, tidak motil oleh flagel
peritrichous, fakultatif anaerob, kadang-kadang mikroaerofilik, sedikit tumbuh di udara tapi bagus
pada keadaan di bawah tekanan oksigen rendah, dan beberapa anaerob pada isolasi. Bakteri
yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu
atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol. Sel berbentuk batang dan
biasanya tetap, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 m (Feliatra, 2004).
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan
untuk bakteri adalah pewarnaan Gram. Dalam proses ini olesan bakteri terfiksasi dikenai larutan
sebagai berikut : ungu kristal, larutan yodium, alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau
beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini
dibagi menjadi 2 kelompok yaitu Gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan
karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika
dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan merah safranin, tampak
bewarna merah (Pelczar, 1986).
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal
violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati
dengan mikroskop. Bakteri Gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di
mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai
dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran
luarnya. Banyak spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka
berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel Gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan
LPS atau endotoksin) (Anonima, 2011).
Gram negatif yang paling terkenal adalah Veillonella alcalescens (dahulu Micrococcus
lactilyticus) dan Megasphaera (dahulu Pepto streptococus). Kedua-duanya tidak mampu untuk
meragikan karbohidrat. V. alcalescens ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, dan juga
perut besar hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam organik menjadi propionat,
asetat, CO2, H2 (Schlegel, 1994).
E.coli adalah suatu bakteri Gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif,
dan mempunyai flagella peritrikat. E.coli dibedakan atas sifat scrologinya berdasarkan antigen O
(somatik), K (kapsul), H(flagella). Medium selektif yang dapat digunakan untuk
mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau
MacConkey Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi
oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasikan laktosa dalam
medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan
indikator merah netral (Fardianz,1990).
Lactobacillus adalah suatu bakteri berbentuk batang, bervariasi dari panjang dan ramping
sampai kokobaksilus pendek. Pembentukan rantai umum dijumpai, terutama pada fase
pertumbuhan logaritma lanjut. Tidak membentuk spora. Gram positif berubah menjadi gram
negatif dengan bertambahnya umur dan derajat keasaman. Beberapa galur memperlihatkan
tubuh-tubuh bipolar, granulasi internal atau penampilan seperti batang dengan reaksi gram atau
pewarna biru metilen (Pelczar, 1988).
Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk
membedakan spesimen kecil dengan cairan optiknya.
Untuk mikroskop medan terang, pewarnaan negatif biasanya menggunakan cairan hitam misal
nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur
dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau
kadang sporanya terlihat bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau
pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.
Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin
(Anonimb, 2011).
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap
mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat
warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah
dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain
banyak yang merupakan saprofit (Anonimc,2011).
Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini yaitu pewarna Ziehl
Neelsen, prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena
loeffler sebagai warna tandingan. Alkohol-asam merupakan pemucat yang sangat intensif dan
jangan dikelirukan dengan alkohol aseton yang banyak digunakan dalam pewarnaan gram. Pada
kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan
tampak merah. Pada bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna
karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan
karenanya dikatakan tak tahan asam (Hadioetomo, 1990)
D. METODOLOGI
1 1. Alat
a. Gelas objek
b. Gelas penutup
c. Batang gelas
d. Jarum oose
e. Pipet tetes
f. Rak tabung reaksi
g. Bunsen spirtus
h. Label dan tissue
i. Mikroskop cahaya
2. Bahan
a. Biakan murni Lactobacillus achidophilus, Escherichia coli dan Lactococcus sp.
b. Larutan cat nigrosin
c. Aquades
d. Alkohol 70%
e. Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsin
f. Larutan peluntur alkohol asam
g. Larutan penutup Loeffler methylen blue
h. Larutan cat Hukers crystal violet
i. Larutan mordan Lugols iodine
j. Larutan peluntur alkohol-aseton
k. Larutan Safranin

E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan

untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif.
Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp.
Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan Gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian
alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri
Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis
dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine
lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan
menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun
juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan
melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi
pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam.
Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya
pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian
berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies
yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pembahasan
Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan antara bakteri tahan asam dan
bakteri tidak tahan asam. Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna
akibat alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga
menghasilkan warna merah.
Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan
asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan
mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri
tahan asam. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna adalah
senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion
bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk
membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna
berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.

Pembahasan
Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat
warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Zat warna atau cat yang digunakan memiliki
pengaruh yang lemah terhadap sel mikroorganisme. Pewarnaan ini dinamakan pengecatan
negatif karena sel tidak diwarnai dan dibuat menjadi kasat mata karena latar belakang yang
gelap.
Pada praktikum ini digunakan bakteri Lactobacillus achidophilus. Pewarnaan negatif ini
bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan
 atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah
satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna
bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan
negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh
karena itu sel menjadi tidak berwarna. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop elektron
transmisi, kemampuan optis elektron berhubungan dengan nomor atom. Beberapa pewarna
negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan
auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elekron dengan baik dan menyerap zat
biologi dengan baik. Struktur yang dapat diamati dengan pewarnaan negatif lebih sedikit dari
pada dengan pewarnaan biasa. Cara ini biasa digunakan untuk melihat virus, bakteri, flagel
bakteri, struktur protein atau gabungan protein biologi membran yang memiliki pancaran elektron
dengan kekuatan rendah. Pewarnaan negatif pada mikroskop cahaya atau mikroskop elektron
tidak menimbulkan penularan mikroorganisme. Walau demikian keamanan harus tetap
diperhatikan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan organisme
terlihat transparan dan tampak jelas diantara medan yang gelap karena pewarna tersebut tidak
menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu yang sukar diwarnai.

F. Kesimpulan
Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum Morfologi dan Pewarnaan Bakteri ini
antara lain:
a. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal
(25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
b. Kelompok bakteri yang merupakan Gram positif adalah L.
Achidophyllus dan Lactococcus sp. Sedangkan kelompok bakteri yang merupakan Gram
negatif adalah E. coli.
c. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah
pada bakteri Gram negatif karena akan kehilangan cat utama setelah tahap dekolorasi
sedangkan pada bakteri Gram positif menyebabkan sel menjadi berwarna ungu karena
mengikat kuat cat utama dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur.
d. Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam
yang berwarna merah dengan latar berwarna biru karena tahan terhadap pencucian
dengan asam dan alkohol sehingga mempertahankan warna pertama yang diberikan.
Sedangkan bakteri tidak tahan asam akan tampak berwarna biru karena cat pertama
dilunturkan oleh asam dan alkohol kemudian mengikat cat kedua.
e. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
f. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan
negatif.
g. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate,
phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elektron
 dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Anonima. 2011. Gram Negatif. http://www.wikipedia.com. Diakses pada tanggal 2 Mei 2011 pukul 16.00
WIB.
b
Anonim . 2011. Pewarnaan Negatif http://capuholic.blogspot.com/2010/02/ Diakses pada tanggal 2 Mei
2011 pukul 16.54 WIB.
Anonimc. 2011. Bakteri Tahan Asam . http://my.opera.com/chanlightz/blog. Diakses pada tanggal 2 Mei
2011 pukul 17.12 WIB.
Feliatra, dkk. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan kerapu Macan (Ephinephelus
fuscogatus) dalam upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2).
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.
Fardianz, Srikandi. 1990. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Juliantina, Farida. 2009. Manfaat Sirih Merah sebagai Agen Anti Bakterial terhadap Bakteri Gram Positif
dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.
Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. UI press. Jakarta.
Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. UI press. Jakarta.
Raoul, Dasi Kemgni, dkk. 2009. A Faster and saver staining technique for acid fast bacilli in
resource-poor settting. Vol 1.(5), May.
Schlegel, Hans G.1994. Mikrobiologi Umum. UGM press. Yogyakarta.
Selvakumar, N, dkk. 2005. Comparison of variants of carbol-fuchsin solution in Ziehl-
Neelsen for detection of

leukosit
l

Gambar 7. Dilihat dari mikroskop dengan perbesaran 100x

Dalam pengamatan ditemukan bakteri berbentuk basil berwarna merah, dan diketahui
bahwa bakteri tersebut adalah Mycobacterium tuberculosis.
Pada pengamatan yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa bakteri yang tampak dengan
perbesaran 100x bahwa dalam 1 lapang pandang terdapat 7 BTA. Dengan demikian, bakteri
tersebut positif bakteri tahan asam dengan nilai positif dua (+ +).
H. Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa didalam sampel dahak
terdapat bakteri Mycobacterium tuberculosis yang mempunyai sifat khusus, yakni tahan terhadap
asam pada pewarnaan karena dari pengamatan terilhat bahwa bakteri Mycobacterium
tuberculosis berbentuk basil ,berwarna merah setelah diberi carbol fuchsin, dan dari pengamatan
yang telah dilakukan, bateri bakteri tersebut positif bakteri tahan asam dengan nilai positif dua (+
+). Oleh karena itu, dahak dapat menjadi faktor penularan tuberculosis yakni dari meludah
sembarangan, batuk sembarangan.