Clulas cultivadas en suspensin (no utilizar ms de 1 x 107 clulas):

Determine el nmero de celdas. Pellet el nmero apropiado de clulas por

centrifugacin durante 5 min a 300 x g en un tubo de centrfuga (no
suministrado). Retire cuidadosamente todo el sobrenadante por aspiracin y
contine con el paso 2.

Nota: La eliminacin incompleta del medio de cultivo celular inhibir la lisis y

diluir el lisado, afectando las condiciones de unin del ARN a la membrana
RNeasy. Ambos efectos pueden reducir el rendimiento de ARN.

Interrumpir las clulas mediante la adicin de buffer RLT. Tiosianato de

guanidina.
Para las clulas sedimentadas, afloje el grnulo de las clulas a fondo
golpeando el tubo. Aada el volumen apropiado de Tampn RLT (ver Tabla 5).
Vortex o pipeta para mezclar, y contine con el paso 3.
Nota: El aflojamiento incompleto del grnulo celular puede conducir a una lisis
ineficiente ya una reduccin de los rendimientos de ARN.

Para la lisis directa de clulas cultivadas en una monocapa, se aade el

volumen apropiado de Tampn RLT (vase la Tabla 6) al plato de cultivo celular.
Recoger el lisado con un polica de goma. Pipetar el lisado en un tubo de
microcentrfuga (no suministrado). Vortex o pipeta para mezclar, y asegrese
de que no hay grupos de clulas son visibles antes de proceder al paso 3.

Homogeneizar el lisado de acuerdo con el paso 3a, 3b, o 3c.

Ver "Interrupcin y homogeneizacin del material de partida", pginas 18-21,

para ms detalles sobre la homogeneizacin. Si se procesan 1 x 10 ^ {5}
clulas, homogeneizar por vrtex durante 1 minuto. Despus de la
homogeneizacin, contine con el paso 4.

Nota: La homogeneizacin incompleta conduce a rendimientos de ARN

significativamente reducidos y puede causar la obstruccin de la columna de
spin RNeasy. La homogeneizacin con un rotor-estator o un homogeneizador
QIAshredder generalmente da lugar a rendimientos de ARN ms altos que con
una jeringa y una aguja.
3a. Pipetar el lisado directamente en una columna de centrifugado QIAshredder
colocada en un tubo de recogida de 2 ml, y centrifugar durante 2 min a toda
velocidad. Contine con el paso 4.

3b. Homogeneizar el lisado durante 30 s usando un homogeneizador rotor-

estator. Contine con el paso 4.

3c. Pasar el lisado al menos 5 veces a travs de una aguja de calibre 20 romo
(0,9 mm de dimetro) ajustada a una jeringa libre de RNasa. Contine con el
paso 4.

4 Aadir 1 volumen de etanol al 70% al lisado homogeneizado, y mezclar bien

por pipeteado. No centrifugar.
Nota: El volumen de lisado puede ser inferior a 350 l o 600 l debido a
prdidas durante la homogeneizacin.

Nota: Cuando se purifica ARN de ciertas lneas celulares, los precipitados

pueden ser visibles despus de la adicin de etanol. Esto no afecta al
procedimiento.

5 Transferir hasta 700 l de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que

se haya formado, a una columna de centrifugado RNeasy colocada en un tubo
de recogida de 2 ml (suministrado). Cerrar la tapa suavemente y centrifugar
durante 15 s a 8000 x g ( 10.000 rpm). Descartar el flujo. *

Vuelva a utilizar el tubo de recogida en el paso 6.

Si el volumen de muestra excede de 700 l, centrifugar las alcuotas sucesivas

en el mismo
RNeasy columna de giro. Deseche el flujo despus de cada centrifugacin. *

Opcional: Si realiza la digestin opcional de la DNasa en la columna (consulte

"Eliminacin de la contaminacin por ADN genmico", pgina 21), siga los
pasos D1 a D4 (pgina 67) despus de realizar este paso.
6 Aadir 700 l de tampn RW1 a la columna de centrifugado RNeasy. Cerrar la
tapa suavemente y centrifugar durante 15 s a 8000 x g ( 10.000 rpm) para
lavar la membrana de la columna de centrifugado. Descartar el flujo. *
Rw1 sales de guanidina y etanol. remueve biomolculas como carbohidratos
proteanas y acidos grasos

Vuelva a utilizar el tubo de recogida en el paso 7.

Nota: Despus de la centrifugacin, retire cuidadosamente la columna de

rotacin RNeasy del tubo de recogida para que la columna no entre en
contacto con el flujo. Asegrese de vaciar completamente el tubo de recogida.
Omita este paso si realiza la digestin DNasa opcional en la columna (pgina
67).

7. Aadir 500 l de Tampn RPE a la columna de giro RNeasy. Cierre

suavemente la tapa y centrifugue durante 15 s a 8000 x g (10.000 rpm).
Deseche el flujo.
PER para remover trasas de sales
Vuelva a usar el tubo de recogida en el paso 8.

Nota: El tampn RPE se suministra como concentrado. Asegrese de que el

etanol se aada al tampn RPE antes de usarlo (ver "Cosas que hacer antes de
comenzar").

8 Aadir 500 l de tampn RPE a la columna de rotacin RNeasy. Cerrar la tapa

suavemente y centrifugar durante 2 min a 8000 x g ( 10.000 rpm).

La centrifugacin larga seca la membrana de la columna de centrifugado,

asegurando que no se transporta etanol durante la elucin de ARN. El etanol
residual puede interferir con las reacciones aguas abajo.

Nota: Despus de la centrifugacin, retire cuidadosamente la columna de

rotacin RNeasy del tubo de recogida para que la columna no entre en
contacto con el flujo. De lo contrario, se producir la acumulacin de etanol.
9. Opcional: Coloque la columna de rotacin RNeasy en un nuevo tubo de
recogida de 2 ml (suministrado) y deseche el tubo de recogida antiguo con el
flujo. Cierre suavemente la tapa y centrifugue a velocidad completa durante 1
min.

Realice este paso para eliminar cualquier posible remanente del Buffer RPE, o
si el flujo residual permanece en el exterior de la columna de giro RNeasy
despus del paso 8.

10. Coloque la columna de centrifugado RNeasy en un nuevo tubo de recogida

de 1,5 ml (suministrado). Aada 30-50 l de agua libre de RNasa directamente
a la membrana de la columna de centrifugado. Cerrar la tapa suavemente, y
centrifugar durante 1 min a 8000 x g ( 10.000 rpm) para eluir el ARN.

Sntesis del cDNA

El sistema de sntesis de primera cadena SuperScript para RT-PCR se
optimiza para sintetizar ADNc de primera cadena a partir de poli (A) +
purificado o ARN total. El sistema se puede utilizar con tan poco como 1 ng o
hasta 5 g de ARN total. Despus de la sntesis, el ADNc puede amplificarse
con cebadores especficos mediante PCR sin extracciones orgnicas
intermedias o precipitaciones con etanol.

La reaccin de sntesis de cDNA de primera cadena se cataliza mediante la

Transcriptasa Inversa SuperScript II (RT). Esta enzima ha sido diseada para
reducir la actividad de la RNasa H que degrada el ARNm durante la reaccin de
la primera cadena, dando como resultado una mayor sntesis de cDNA de
longitud completa y mayores rendimientos de cDNA de primera cadena que la
obtenida con RT de RNasa H +. Debido a que la RT de SuperScript II no est
inhibida significativamente por el ARN ribosmico y de transferencia, puede
utilizarse eficazmente para sintetizar ADNc de primera cadena a partir de una
preparacin de ARN total. La enzima presenta una estabilidad trmica
incrementada y puede utilizarse a temperaturas de hasta 50C.
Este sistema ha sido optimizado para sintetizar ADNc de primera cadena a
partir de cantidades variables de material de partida. La concentracin de
SuperScript II RT se ha reducido y RNaseOUT Inhibidor de RNasa
Recombinante se ha aadido al sistema como parte de este proceso de
optimizacin. Adicionalmente, las condiciones de reaccin se han modificado
para aumentar an ms la sensibilidad del sistema.

Usando el kit, se sintetiza cDNA de primera cadena usando ARN total o ARN
seleccionado poli (A) + cebado con oligo (dT), cebadores aleatorios o un
cebador especfico de gen. A continuacin, realizar PCR en un tubo separado
utilizando primers especficos para el gen de inters.

Recomendaciones y directrices para la primera cadena de sntesis ARN

El ARN intacto de alta calidad es esencial para la sntesis de cDNA de larga
duracin y de alta calidad. Este kit est diseado para ser utilizado con 1 ng a
5 g de ARN total o 50 a 500 ng de poli (A) + ARN. Si tiene> 5 g de ARN total,
aumente los volmenes de reaccin y la cantidad de SuperScript II RT
proporcionalmente.

El RNaseOUT Inhibidor de RNasa Recombinante se incluye con el sistema

para salvaguardar contra la degradacin del ARN diana debido a la
contaminacin por ribonucleasa.

Para aislar el ARN total, recomendamos el Sistema de Purificacin de ARN

Total PureLink Micro-to-Midi , el Reactivo TRIzol o el Kit de Purificacin de
ARN Total PureLink 96 para aplicaciones de alto rendimiento. El aislamiento
de mRNA no es tpicamente necesario, aunque la incorporacin de este paso
puede mejorar el rendimiento de cDNAs especficos y reducir la probabilidad de
contaminacin de ADN genmico.

Pequeas cantidades de ADN genmico en la preparacin de ARN pueden

amplificarse junto con el cDNA diana. Si su aplicacin requiere la eliminacin
de todo el ADN genmico de su preparacin de ARN, recomendamos el uso de
DNase I, Grado de Amplificacin (Nro. De catlogo 18068-015).
Digestin con RNasa H
La sensibilidad de la etapa de PCR puede incrementarse (especialmente para
plantillas largas) eliminando la plantilla de ARN de la molcula de hbrido cADN:
ARN por digestin con RNasa H despus de la sntesis de la primera cadena. La
presencia de RNasa H durante la sntesis de la primera cadena degradar el
ARNm de la plantilla, dando como resultado una reduccin de la sntesis de
ADNc de longitud completa y una disminucin de los rendimientos de la
primera cadena de cDNA. El sistema de sntesis de primera cadena SuperScript
introduce la actividad de la RNasa H slo cuando es beneficiosa.

Cebadores
La reaccin de sntesis de cDNA de primera cadena puede cebarse utilizando
hexmeros aleatorios, oligo (dT) o cebadores especficos de genes (GSP):

Los hexmeros aleatorios son el mtodo de cebado ms inespecfico, y se

usan tpicamente cuando el ARNm es difcil de copiar en su totalidad. Con este
mtodo, todos los ARN en una poblacin son plantillas para la sntesis de cDNA
de primera cadena, y los cebadores de PCR confieren especificidad durante la
PCR. Para maximizar el tamao del ADNc, debe determinar la proporcin de
hexmeros aleatorios al ARN empricamente para cada preparacin de ARN.
Nota: Para la mayora de las aplicaciones de RT-PCR, 50 ng de hexmeros
aleatorios por 5 g de ARN total son adecuados. El aumento de los
hexmeros a 250 ng por cada 5 g de ARN puede aumentar el rendimiento de
pequeos productos de PCR (<500 pb), pero puede disminuir el rendimiento de
productos de PCR ms largos y transcripciones de longitud completa.

Oligo (dT), un mtodo de cebado ms especfico, se utiliza para hibridarse

con las colas 3 'poli (A), que se encuentran en la gran mayora de ARNm
eucariotas. Dado que el ARN poli (A) + constituye aproximadamente del 1% al
2% del ARN total, la cantidad y complejidad del ADNc es considerablemente
menor que con los hexmeros aleatorios. Nota: Oligo (dT) se recomienda sobre
hexamers o GSP al azar al realizar RT-PCR con nuevos objetivos de mRNA. Oligo
(dT) produce un producto de RT-PCR ms consistentemente que los hexmeros
aleatorios o los SPG.
 El mtodo de cebado ms especfico utiliza un cebador especfico de gen
(GSP) para la secuencia de inters. La sntesis de la primera cadena puede
cebarse con el cebador de PCR que hibrida ms prximo al extremo 3 'del
ARNm. Obsrvese que algunos SPGs fallan en la sntesis de cDNA, aunque
funcionan en PCR en plantillas de ADN. Si el cebado especfico del gen falla en
la RT-PCR, repita la sntesis de la primera cadena usando oligo (dT) como
cebador.

Sntesis de la primera cadena usando Oligo (dT) o GSP

Material de partida: 1 ng-5 g de ARN total o 50 500 ng de poli (A) + ARN

Reacciones de control: Utilizar 1 l de ARN de control (50 ng / l)

1. Mezclar y centrifugar brevemente cada componente antes de usarlo.

2. Para cada reaccin, combinar lo siguiente en una solucin estril de 0,2

Tubo de 0,5 ml:
Componente Cantidad
ARN n \ mu l
10 mM dNTP mezcla 1 l
Primer (0,5 g / l de oligo (dT) 12-18, o 1 l
2 \ mu M de cebador especfico del gen)
Agua tratada con DEPC a 10 l

3. Incubar la mezcla de ARN / cebador a 65 C durante 5 minutos, luego

colocar en hielo durante al menos 1 minuto.

4. En un tubo separado, preparar la siguiente mezcla de reaccin 2X,

Agregando cada componente en el orden indicado.
Componente 1 Rxn 10 Rxns
10X tampn RT 2 l 20 l
MgCl _ {2} 25 mM 4 \ mu l 40 \ mu l
0,1 M DTT 2 \ mu l 20 \ mu l
RNaseOUT (40 U / l) 1 l 10 l

5. Aadir 9 l de la mezcla de reaccin 2X a cada mezcla de ARN / cebador del

paso 3, mezclar suavemente y recoger por centrifugacin breve.

6. Incubar a 42 C durante 2 minutos.

7. Aadir 1 l de SuperScript II RT a cada tubo. Menos control de RT: Aadir

1 l de agua tratada con DEPC en lugar de RT.

8. Incubar a 42 C durante 50 minutos.

9. Terminar la reaccin a 70 C durante 15 minutos. Chill en el hielo.

10. Recoger la reaccin mediante centrifugacin breve. Aadir 1 l de RNasa H

a cada tubo e incubar durante 20 minutos a 37 C.

La reaccin puede almacenarse a -20 C o utilizarse para PCR

inmediatamente.

RPC protocolo
1 Thaw 10x CoralLoad PCR Buffer o 10x PCR Buffer, dNTP mix, primer solutions,
y 25 mM MgCl2 (si es necesario) a temperatura ambiente o en hielo.

Mantenga las soluciones en hielo despus de la descongelacin completa.

Mezclar bien antes de usar para evitar diferencias localizadas en la
concentracin de sal.

2. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con la Tabla 1, pgina 14.

La mezcla maestra contiene tpicamente todos los componentes necesarios
para la PCR excepto el ADN molde. Preparar un volumen de mezcla maestra
10% mayor que la requerida para el nmero total de ensayos de PCR a realizar.
Se debe incluir un control negativo (sin ADN molde) en cada experimento. La
concentracin ptima de Mg2 + debe determinarse empricamente, pero en la
mayora de los casos una concentracin de 1,5 mM, tal como se proporciona en
el tampn de PCR 1x QIAGEN, producir resultados satisfactorios. Mantenga la
mezcla principal sobre hielo.

Nota: La concentracin de Mg2 + proporcionada por la PCR suministrada o el

tampn de PCR CoralLoad producir resultados satisfactorios en la mayora de
los casos. Sin embargo, en algunos casos, las reacciones pueden mejorarse
aumentando la concentracin final de Mg2 + de acuerdo con la Tabla 2.

3. Mezcle bien la mezcla maestra y distribuya los volmenes apropiados en los

tubos de PCR. Mezcle suavemente, por ejemplo, pipeteando la mezcla maestra
hacia arriba y hacia abajo varias veces. Se recomienda que los tubos de PCR se
mantengan en hielo antes de colocarlos en el termociclador.

4. Aadir ADN molde ( 1 g / reaccin) a los tubos individuales que contienen

la mezcla maestra.
Para RT-PCR, aadir una alcuota de la reaccin de la transcriptasa inversa. El
volumen aadido no debe exceder el 10% del volumen final de PCR (ver
Apndice E, pgina 36).
5. Cuando utilice un termociclador con una tapa calentada, no utilice aceite
mineral. Proceda directamente al paso 6. De lo contrario, cubra con
aproximadamente 100 l de aceite mineral.

6. Programe el termociclador de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Un programa tpico de ciclos de PCR se describe en la Tabla 3. Para rendimiento
y especificidad mximos, las temperaturas y los tiempos de ciclo deben
optimizarse para cada nuevo par de diana o cebador

7. Para un arranque en caliente simplificado, proceda como se describe en el

paso 7a.
De lo contrario, coloque los tubos de PCR en el termociclador e inicie el
programa de ciclismo.

7a. Inicio en caliente simplificado: Inicie el programa de PCR. Una vez que el
termociclador haya alcanzado 94 C, coloque los tubos de PCR en el
termociclador.

En muchos casos, este inicio caliente simplificado mejora la especificidad de la

PCR. Para obtener informacin sobre la PCR de inicio en caliente altamente
especfica y conveniente utilizando la polimerasa de ADN HotStarTaq,
consulte el Apndice F, pgina 38.

Nota: Despus de la amplificacin, las muestras se pueden almacenar durante

la noche a 2-8 C, oa -20 C para un almacenamiento ms largo.

8. Cuando se usa tampn de PCR de CoralLoad, el producto de PCR puede

cargarse directamente en un gel de agarosa sin la adicin previa de un tampn
de carga de PCR y colorantes de seguimiento de gel.

El tampn de PCR de CoralLoad contiene un reactivo de carga de gel y

colorantes de seguimiento de gel. Consulte la Tabla 4 a continuacin para
identificar los colorantes de acuerdo con la distancia de migracin y el
porcentaje y tipo de gel de agarosa.