Professional Documents
Culture Documents
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang atau
bulat, tidak membentuk spora, fermentasi fakultatif anaeorob, tidak mempunyai sitokrom,
tidak memiliki kemampuan untuk mereduksi nitrat dan memanfaatkan laktat, oksidasi
negatif, katalase negatif, motilitas negatif dan kemampuan memfermentasi glukosa menjadi
Produk fermentasi BAL salah satunya adalah asam organik. Asam organik ini
dihasilkan selama proses fermentasi terkait spesies organisme, gabungan kultur dan kondisi
pertumbuhan (Lindgren dan Dobrogosz, 1990). Asam organik mampu menurunkan pH dan
berfungsi untuk tidak memutus beberapa ikatan molekul sehingga memiliki kemampuan
aktivitas mikroba. Lebih lanjut Lindgren dan Dobrogosz (1990), melaporkan bahwa
BAL juga menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) karena adanya oksigen sehingga
terjadi reaksi flavoprotein oksidasi atau nicotinamida adenin hidroxy dinucleotida (NADH)
perioksida. H2O2 berasal dari oxidation sulfhydril disebabkan karena denaturasi dari
permeabilitas membran (Kong dan Davidson, 1980). H2O2 juga dapat berfungsi sebagai
prekusor untuk memproduksi bakteri radikal bebas antara lain O2 dan OH yang dapat
menghambat kerja enzim dekarboksilase dalam membran lipid sehingga tidak mempunyai
fungsi sebagai permeabilitas (Eklund, 1984). CO2 dapat menghambat mikroba pembusuk
makanan dan juga mampu menghasilkan bakteri gram negatif (Hotchkiss, 1999).
Asetildehida diproduksi oleh L.delbruecki sp dan Bulgaricus yang bila direaksikan
dengan threoin aldolase maka treonin tersebut membelah ke dalam asetildehida dan glisin.
Ketiga BAL tersebut tidak dapat merombak asetildehida, hanya terakumulasi dalam produk
pangan dengan konsentrasi sekitar 25 ppm. Asetildehida dengan konsentrasi 10-100 ppm
dapat menghambat pertumbuhan S.aureus, S.typhimurium dan Escherichia coli (Piard dan
Desmazeaud, 1992).
menghasilkan beberapa asam lemak dalam proses pengeringan dan fermentasi susu (Rao dan
Reddy, 1984). Aktivitas antimikroba dapat memutuskan ikatan molekul dari asam lemak
bukan anionnya, selain itu menurunkan pH memiliki pengaruh besar terhadap aktivitas
Reaksi fermentasi BAL dibagi menjadi 2 bagian yaitu secara homofermentatif dan
biomassa sel dua kali lebih banyak dari pada BAL heterofermentatif. Sedangkan reaksi
heterofermentatif selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan etanol, CO2, asam
asetat serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase. Untuk lebih
Reaksi homofermentatif
Reaksi Heterofermentatif
(FAO/WHO) (2001), idealnya strain probiotik seharusnya tidak hanya mampu bertahan
melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk berkembang biak
dalam saluran pencernaan, tahan terhadap cairan lambung dan cairan empedu dalam jalur
makanan yang memungkinkan untuk bertahan hidup melintasi saluran pencernaan dan
terkena paparan empedu. Selain itu probiotik juga harus mampu menempel pada sel epitel
usus, mampu membentuk kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan zat anti
lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi. Strain probiotik juga harus
tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan makanan dan penyimpanan, mudah
diaplikasikan pada produk makanan, dan tahan terhadap proses psikokimia pada makanan
Efisiensi penggunaan pakan dapat dilakukan dengan pemberian bahan imbuhan (feed
additive) atau zat pemacu tumbuh (growth promotant). Pencampuran feed additive ini
dimaksudkan untuk meningkatkan daya simpan ransum dan memacu pertumbuhan ternak.
Namun penggunaan feed additif secara terus menerus akan mengakibatkan terdapatnya
produk metabolit berupa residu antibiotik. Oleh karena itu penggunaan feed additive alami
merupakan alternatif untuk mengurangi akumulasi residu feed additive dalam daging. Salah
satu feed additive alami yang mulai digunakan yakni bakteri probiotik (Tensiska, 2008).
Pemberian probiotik pada ternak unggas biasanya diberikan dalam bentuk campuran
ransum atau diberikan melalui air minum, atau dalam bentuk probiotik yang hanya
mengandung satu macam strain mikroba saja atau dalam bentuk campuran terdiri dari
beberapa strain mikroba seperti probiolac atau protexin. Beberapa keuntungan dari
penggunaan probiotik pada hewan atau ternak antara lain adalah dapat memacu
Teknologi Enkapsulasi
Enkapsulasi adalah suatu teknologi dalam proses penyalutan partikel inti dapat
berbentuk cair, padat atau gas dengan suatu bahan pengisi khusus sehingga partikel-partikel
inti tersebut mempunyai sifat fisik dan kimia sesuai yang dikehendaki (Kim dan Morr,
1996). Teknologi ini berperan dalam melindungi bahan inti dari lingkungan yang
merugikan. Bakteri probiotik merupakan salah satu jenis komponen bioaktif yang sebaiknya
dilindungi kehidupannya agar dapat dimanfaatkan oleh inangnya. Manfaat enkapsulasi bagi
probiotik yaitu untuk mempertahankan viabilitas dan melindunginya dari kerusakan akibat
Bahan yang umum digunakan sebagai enkapsulan, diantaranya alginat, gum arab, pati,
agar, gelatin, karagenan, albumin dan kasein. Masing-masing bahan tersebut memiliki
karakter tertentu sehingga perlu adanya pertimbangan agar cocok bila digunakan untuk
menyalut suatu bahan inti tertentu. Beberapa peneliti telah melakukan penelitian mengenai
casei dalam alginat-tepung polard dan terigu (Widodo et al. 2003), L.acidophilus dan B.
lactis dalam alginat, gelatin dan pati pada produk yoghurt dengan metode ekstrusi dan
emulsi (Jayalalitha et al. 2011) dan L.plantarum dengan enkapsulan campuran susu skim
dan gum arab (Rizqiati et al. 2009). Dalam hal ini, metode enkapsulasi juga dapat
Teknik enkapsulasi probiotik dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu ekstrusi dan
emulsi (Krasaekoopt et al. 2003). Teknik ekstrusi dilakukan dengan cara menambahkan
beads. Ukuran dan bentuk beads yang dihasilkan bergantung pada diameter jarum dan jarak
sebagian kecil polimer (alginat) ke dalam minyak nabati seperti minyak kedelai, minyak
bunga matahari, minyak conola, atau minyak jagung, kemudian dihomogenisasi dalam
bentuk emulsi. Emulsi tersebut akan membentuk droplet. Ukuran beads pada metode emulsi
ditentukan oleh ukuran droplet emulsi yang terbentuk. Ukuran droplet emulsi dapat
Kelebihan dan kekurangan teknik ekstrusi dan emulsi dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kelebihan dan Kekurangan Teknik Ekstrusi dan Emulsi
Ekstrusi Emulsi
Kelayakan teknologi Sulit untuk meningkatkan Mudah untuk meningkatkan
skala produksi (scale up) skala produksi (scale up)
Biaya Rendah Tinggi
Kemudahan Mudah Sulit
Ketahanan mikroorganisme 80 95% 80 95%
Ukuran beads 2 5 mm 25 m 2 mm
Sumber : Krasaekoopt et al. (2003)
Pada tahap pengeringan bahan pengkapsul berisi sel probiotik untuk mendapatkan sel
terenkapsulasi berbentuk serbuk atau granul dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu
freezedrying (Sultana et al. 2000, Capela et al. 2006) dan spray drying (Lian et al. 2003,
Picot dan Lacroix 2004). Enkapsulasi probiotik dengan teknik pengering semprot dan
pengering beku menghasilkan probiotik terenkapsulasi kering dalam bentuk serbuk atau
granul, sedangkan teknik emulsi dan ekstrusi menghasilkan probiotik terenkapsulasi dalam
bentuk jel (hydrocolloid beads) (Krasaekoopt et al. 2003). Namun, penggunaan teknik
freeze drying relatif mahal dan sangat sulit diaplikasikan pada skala industri (Mortazavian et
al. 2007), sedangkan penggunaan teknik spraydrying membutuhkan suhu operasi yang
(Kailasapathy 2002).
Keefektifan dari bahan dan teknik enkapsulasi yang digunakan untuk menghasilkan
viabilitas sel probiotik selama proses enkapsulasi dan pengeringan, pembuatan produk dan
penyimpanan, kelarutan beads dan kemampuan sel untuk keluarserta sifat mikrogeometri
Bahan pengkapsul merupakan bahan yang berfungsi sebagai pengikat suatu materi
serta memperbaiki mutu fisik produk. Enkapsulasi probiotik biasa dilakukan dalam sistem
polimer yang bersifat lembut dan tidak beracun (food grade) (Anal dan Singh 2007).
Polimer yang biasa digunakan dalam proses enkapsulasi bakteri probiotik adalah
polisakarida yang diekstrak dari rumput laut (karagenan dan alginat), tumbuhan (pati dan
turunannya, gum arab), atau bakteri (gellan dan xanthan), dan protein hewan (kasein, whey,
skim, gelatin) (Rokka dan Rantamaki 2010). Keuntungan penggunaan alginat sebagai bahan
pengkapsul adalah tidak toksik, membentuk matriks secara lembut dengan CaCl2 yang dapat
1. Alginat
Alginat merupakan salah satu jenis hidrokoloid yang dihasilkan dari ekstraksi alga
coklat (Sargassum sp., Turbinaria sp., Hormophyta sp., dan Padinasp.). Alginat telah
diaplikasikan secara luas pada produk pangan sebagai penyalut. Bentuk alginat terdiri dari
dua yaitu asam alginat dan garam alginat. Asam alginat merupakan kopolimer liniar yang
tersusun atas asam D-manuronat dan asam L-guluronat. Dalam suatu larutan, alginat
mengadakan interaksi antara kopolimernya dengan kation divalen (garam) seperti kalsium,
sehingga terbentuk gel kalsium alginat. Gel tersebut dipengaruhi oleh jumlah kation divalen
jelmatriks kalsium alginat. Kapsul kalsium alginat sangat berpori yang memungkinkan air
dapatberdifusi keluar masuk matriks (Rokka dan Rantamaki 2010). Penggunaan alginat
sebagai bahan enkapsulasi sering dikombinasikan dengan bahan lainnya, diantaranya dengan
penambahan probiotik (Sultana et al. 2000, Homayouni et al. 2008a), terigu dan polard
(Widodo et al. 2003) sebagai bahan pengisi, chitosan sebagai coating (Krasaekoopt et al.
2004), dan pektin untuk membentuk kompleks alginat-pektin yang kuat (Castilla et al.
enkapsulan alginat dapat meningkatkan ketahanan probiotik selama penyimpanan pada suhu
rendah (Godward dan Kailasapathy 2003; Krasaekoopt et al. 2006; Kailasapathy 2006;
Purwandhani et al. 2007; Aqilah dan Akhiar 2010). Ketahanan hidup bakteri probiotik
mengemukakan bahwa L.acidophillus dapat lebih bertahan hidup saat konsentrasi alginatnya
ditingkatkan dari 2% menjadi 5%. Probiotik yang dienkapsulasi dengan alginat juga dapat
bertahan pada kondisi asam dalam saluran pencernaan. Hal ini dibuktikan dengan hasil
penelitian Chavarri et al.(2010) bahwa L. gasseri dan B. bifidum dengan enkapsulasi alginat-
kitosan dapat bertahan selama penyimpanan dingin dan pada kondisi simulasi saluran
pencernaan (pH 2) dan konsentrasi larutan empedu (3%) selama 2 jam. Probiotik masih
dapat hidup dan berperan dalam melawan bakteri yang tidak diinginkan dalam usus besar.
2. Maltodekstrin
Menurut FDA (The Food and Drug Administration), Maltodekstrin (C6H12O6) adalah
polimer sakarida yang bergizi, mengandung unit D-Glukose pada ikatan primer -1,4 dan
memiliki nilai dextrose equivalence (DE) kurang dari 20. Dextrose equivalence (DE)
merupakan sifat utama yang menentukan sifat dari maltodekstrin itu sendiri. DE
bahan yang memiliki DE lebih besar dari 42 akan sulit untuk dikeringkan dan dipasarkan
yang dikeringkan karena selain bahan pengisi, maltodekstrin memiliki beberapa kelebihan
antara lain tidak manis mudah larut dalam air. Maltodekstrin juga dapat meningkatkan
viskositas, menghambat kristalisasi dan baik untuk kesehatan karena rendah kalori.
pembentuk produk yang baik untuk produk yang sulit kering dan biasanya dijual dalam
bentuk tepung padat berwarna putih (Kuntz,1998). Komposisi maltodekstrin pada Tabel 3.
kestabilan emulsi yang rendah yang dikarenakan tidak memiliki sifat lipofilik dan hidrofilik,
sifat pembentukan film, seberapa cepat pembentukan film atau membran pada proses
3. Susu Skim
Protein merupakan komponen yang sangat penting, baik dari segi nutrisi maupun sifat
fungsionalnya seperti sebagai bahan pengemulsi, pengikat air atau lemak, serta pembentuk
buih atau gel. Selain itu protein juga dapat menghasilkan flavor, memperbaiki penampakan
dengan menghasilkan tekstur yang lebih baik (Buckle et al., 1987). Protein memiliki sifat
fungsional yang baik seperti viskositas, emulsifikasi serta pembentukan film. Dalam
Susu skim adalah bagian susu yang tertinggal setelah krim diambil sebagian
atauseluruhnya. Susu skim mengandung semua komponen gizi dari susu kecuali lemak dan
vitaminyang larut dalam lemak (Buckle et al. 1987). Karena lemaknya telah dipisahkan,
susu skim hanyamengandung 0,5 2% lemak (Varnam dan Sutherland 1994).Protein susu
dapatdigolongkan menjadi dua bagian, yaitu kasein dan whey. Kasein merupakan fraksi
protein yangmenggumpal ketika susu diasamkan pada pH 4,6 pada suhu sekitar 300C,
sedangkan fraksi yan tertinggal setelah pengendapan kasein disebut whey. Pada susu sapi
dan kerbau, komposisi kaseindan whey yaitu berkisar 80 : 20 (Fox dan McSweeney, 1998).
Susu skim mengandung semua zat makanan dari susu kecuali lemak dan vitamin-
vitamin yang larut dalam lemak. Krim mempunyai berat jenis yang rendah karena banyak
mengandung lemak. Susu skim mempunyai berat jenis yang tinggi karena banyak
mengandung protein. Susu skim adalah susu sapi yang telah diambil lemaknya dan diubah
menjadi bentuk bubuk, mempunyai bentuk seperti granula kecil, dengan warna putih
kekuningan. Susu ini banyak mengandung protein dengan kadar air 5% (Saleh, 2004).
Escherichia coli
1,5mx26m,tersusuntunggalatauberpasangan,bersifatmotilatau nonmotildan
ini dapat menyebabkan kematian selama periode pemeliharaan hingga perolehan berat badan
ayam saat panen akan dibawah standar. Bakteri E.coli ini sangat banyak terdapat di usus,
dan akan dikeluarkan dari tubuh dalam jumlah yang sangat besar bersama feses (kotoran).
Bakteri ini dapat bertahan sampai beberapa minggu di dalam feses, dengan kondisi yang
sangat mendukung. Akan tetapi, E.coli tidak tahan pada kondisi asam, kering, dan akan mati
E.coliyang merupakan infeksi bakteri yang paling umum dijumpai pada peternakan
E.colimenyebabkan kematian embrio pada telur tetas, infeksi kuning telur, koliseptisemia,
peradangan kantung udara, radang usus, infeksi saluran reproduksi, radang persendian dan
bahkan menyebabkan kematian. Mortalitas dari penyakit ini adalah 10% - 15%. Penularan
kolibasilosis biasanya terjadi secara oral melalui pakan, air minum atau debu yang tercemar
oleh E.coli. Bakteri E.coli juga mampu menyebar melalui peredaran darah sehingga dapat
menyebabkan kerusakan pada berbagai organ sehingga mengganggu pertumbuhan dari ayam
tersebut (Djaafar et al.,1996) hal ini akan menyebabkan kerugian yang cukup besar untuk
peternak broiler. Menurut Fuller (1989) bakteri ini termasuk bakteri enterotoksigenik yang
dapat menyebabkan penyakit diare. Strain bakteri ini memproduksi dua tipe enterotoksin,
yaitu toksin yang tidak tahan panas dan toksin yang stabil pada suhu tinggi.
Bakteri dalam Saluran Pencernaan
Lebih dari 99% bakteri tinggal di dalam usus besar atau colon dan lebih dari 99%
Bifidobacterium dan lain-lain. Hanya kurang dari 1% berupa bakteri fakultatif anaerob
seperti E.coli, Enterobacter dan bakteri patogen lainnya. Dengan demikian diperlukan
Lebih lanjut Surono (2004) menyatakan bahwa berbagai rintangan yang harus
dihadapi mikroba dalam saluran pencernaan dari mulut sampai anus. Pada perjalannya
melintasi berbagai sistem pencernaan khususnya yang dijumpai diantaranya enzim lisosom
pada air liur, asam lambung, garam empedu dan senyawa metabolit oleh BAL terutama
asam laktat. Pada usus besar hampir tidak ditemukan lagi hambatan yang cukup berarti
kecuali terjadinya kompetisi terhadap nutrisi. Bakteri probiotik harus mampu bertahan
menghadapi rintangan-rintangan tersebut, agar mencapai usus dalam keadaan hidup dalam
usus. Untuk mengetahui pH dan waktu transit dapat dilihat pada Tabel 5.
Tembolok 5.5 50
Proventriculus & gizzard 2.5 3.5 90
Duodenum 5.6 5-8
Jejenum 6.5 7 20 - 30
Ileum 7 7.5 50 - 70
Rektum 8 25
Sumber: Surono (2004)
Populasi bakteri semakin kompleks baik jenis dan jumlahnya dengan bertambahnya
umur disepanjang saluran pencernaan. Lambung hanya mengandung bakteri yang tahan
terhadap asam, sebagaimana diketahui bahwa pH atau keasaman lambung sangat rendah
sekitar 1,7 dan BAL bisa bertahan dalam bilangan ribuan (103). Usus kecil ditempati 400
500 jenis bakteri yang jumlahnya trilyunan (1012 - 1014) bakteri dan BAL sekitar 104 - 109
bakteri. Mikroba dalam saluran pencernaan bisa membantu pencernaan makanan bahkan
beberapa jenis menghasilkan beberapa vitamin yang dibutuhkan oleh tubuh, namun
demikian beberapa efek negatif yang secara umum adalah dihasilkan senyawa-senyawa hasil
Saat ini telah beredar produk probiotik yang mengandung mikroba lipolitik,
selulolitik, lignolitik, dan mikroba asam lambung. Beberapa penelitian pada broiler
bobot badan, menurunkan konversi pakan dan mortalitas. Penelitian Kim et al., (1988)
ke dalam pakan broiler yang mengandung jagung meningkatkan pertambahan bobot badan.
Probiotik dapat mengubah pergerakan pada populasi mikroba di dalam usus halus
meningkatkan kecernaan pakan, yaitu dengan cara menekan bakteri patogen dalam saluran
pertumbuhan yang berhubungan dengan manfaat probiotik dapat meningkatkan nafsu makan
bobot badan sekaligus bobot karkas ayam broiler (Abrar dan Raudhati, 2006).
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Universitas Sumatera Utara Medan. Penelitian ini dilakukan atas 3 tahap yaitu isolasi dan
karakteristik BAL asal ayam kampung, pembuatan kapsul BAL dan uji kualitasnya, daya
simpan kapsul BAL dan pembuatan enkapsulasi BAL dalam bentuk kering.
Metode Penelitian
Tahap I: Isolasi dan Karakteristik BAL Asal Ayam Kampung terhadap Bakteri Uji
Bahan yang digunakan dalam penelitian tahap I ini yaitu isolat bakteri asam laktat
(BAL) yang telah diisolasi dari usus ayam kampung, bakteri indikator Escherichia coli yang
diisolasi dari feses ayam, media yang digunakan adalah medium selektif MRSA (deMan
Rogosa Sharp Agar), deMan Rogosa Sharp Broth (MRSB), Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA), Nurient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Muller Hilton Agar (MHA), penicilin, PP
1%, NaOH 0,1N, aquades, NaCl fisiologis 0,85%, kristal violet, iodin, alkohol asam, safranin,
HCl, etanol 70%, CaCO3 1%, reagen H2O2 3%, garam empedu sintetik (Ox bile) 1% dan 5%,
kertas cakram, alkohol 70%, medium SIM (Sulfid Indol Motility), minyak emersi.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, laminar flow, jarum ose,
inkubator, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, inkubator shaker, sentrifuse, mikropipet,
gelas objek, neraca analitik, desikator, pipet tetes, pH meter, holder milipore dan milipore
0,22 m, pipet valumetrik, pipet 5 ml, kapas, aluminium foil, kertas saring, pemanas bunsen,
jangka sorong, oven, lemari pendingin, water bath, termometer, gelas ukur, hot plate,
preparat, mikroskop, kertas cakram, pipet pasteur, jangka sorong, scapel (pisau kecil),
BAL diisolasi dari berbagai segmen pada saluran pencernaan ayam kampung yaitu
pada proventriculus, ventriculus, yeyenum, ileum, usus besar dan cecum. Isolasi dilakukan
kedalam 100 ml larutan NaCl 0,85% secara aseptis. Kemudian dibuat pengenceran 10-2 107.
(Man Ragosa Sharpe Agar) yang mengandung CaCO3 1 % kemudian diinkubasikan pada
suhu 370C selama 48 jam. Koloni yang menunjukkan zona bening disekitar koloni
Setiap koloni yang terbentuk diamati dan diidentifikasi berdasarkan morfologi, reaksi
medium MRSB. Inkubasi pertumbuhan BAL dilakukan pada suhu 37oC selama 48 jam.
Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil menggunakan
jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA yang telah beku dan diinkubasi pada kondisi
yang sama membentuk goresan kuadran. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni
yang seragam. Koloni yang murni dipilih, lalu dilakukan pewarnaan gram dan uji katalase.
Tahap awal pemurnian dimulai dengan memilih koloni tunggal yang tumbuh pada
medium MRSA setelah diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya mengambil koloni tunggal
pada kultur, kemudian diinokulasikan secara goresan pada medium MRSA dan diinkubasi
pada temperatur 370C selama 48 jam. Koloni dari kultur murni selanjutnya diamati
Prosedur pewarnaan mengikuti metode (Djide dan Sartini, 2008), dalam Trisna (2012),
biakan bakteri diambil dari stok dan diratakan diatas preparat yang telah dibersihkan
menggunakan etanol 70%. Kemudian difiksasi diatas api bunsen lalu ditetesi dengan zat
warna kristal violet selama 1 menit agar zat warna meresap pada bakteri. Preparat kemudian
dibilas dengan aquades mengalir dan ditetesi dengan larutan iodine kompleks. Kemudian
ditunggu selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades mengalir. Preparat dicuci dengan
alkohol asam. Kemudian ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik. Setelah
itu dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.
Sebanyak 1 ose isolat diambil dari stok kemudian diinokulasikan dengan cara ditusuk
pada medium SIM tegak. Selanjutnya diinkubasi pada temperatur 370C selama 48 jam. Hasil
positif (motil) jika terdapat rambatan rambatan disekitar bekas tusukan jarum pada
medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas
Sebanyak 2 tetes larutan hidrogen peroksida (H2O2) 3% diteteskan pada gelas obyek
gelembung oksigen dan uji negatif tidak adanya gelembung gas (isolat tidak tumbuh)
Menurut Djide dan Wahyuddin (2008), uji ketahanan terhadap asam dilakukan dengan
menggunakan medium MRSB yang ditambahkan dengan HCl 0,1 N untuk mendapatkan pH
2,5 dan 3 (sesuai dengan pH lambung). Sebanyak 1 ose (ose bulat) masing-masing isolat
bakteri yang diambil dari stok kultur kemudian diinokulasikan pada medium MRSB-HCl.
Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri
pada medium dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium.
kemampuan isolat bertahan pada saluran pencernaan yang terdapat garam empedu pada
permukaan atas usus. Pengujian dilakukan menurut metode Djide dan Wahyuddin (2008).
Metode ini dilakukan dengan menambahkan garam empedu sintetik (oxbile) dengan
konsentrasi 1 % dan 5 % pada medium MRSB. Selanjutnya isolat bakteri diambil dari stok
sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan pada medium MRSB garam empedu. Diinkubasi
selama 48 jam dengan temperatur 370C. Ketahanan terhadap garam empedu ditentukan
berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada medium. Hasil positif jika ditandai
dengan adanya endapan pada dasar tabung dan adanya perubahan media menjadi lebih keruh
Isolat bakteri diambil dari stok sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan pada medium
MRSB. Selanjutnya medium yang telah berisi isolat diinkubasi pada temperatur 150C, 370C,
dan 450C selama 48 jam. Kemudian diamati apakah terjadi petumbuhan bakteri pada
medium. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium dan hasil negatif
Jumlah koloni BAL dari isolat diukur menggunakan metode Total Plate Count (TPC)
NaCl fisiologis 0.85%, lalu diencerkan sampai pengenceran 7 kali secara serial. Sebanyak
0,1 ml dari pengenceran 6 dan 7 kali ditanam pada cawan petri berisi media MRS agar.
Media agar yang ditanam kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni yang
tumbuh berbentuk bulat miring berwarna agak kekuningan. Kemudian dihitung sebagai
beirikut:
Sampel feses segar dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi NaCl fisiologis 10 ml.
Diambil 1 tetes feses yang sudah dihomogenkan dengan larutan NaCl fisiologis. Sebanyak
15 ml media Eosin Methylene Blue (EMB) dimasukkan ke dalam cawan petri untuk
disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media
diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar agar media menjadi
padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki, sebanyak 0,1 ml larutan tersebut
dimasukkan ke dalam cawan petri dengan metode sebar menggunakan gelas bengkok.
Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang
tumbuh dan berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung
sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara diinokulasikan pada
Untuk mengetahui bahwa isolat bakteri mempunyai potensi yang bagus sebagai
bakteri BAL maka perlu dilakukan uji daya hambat terhadap bakteri patogen. Bakteri
patogen yang digunakan adalah E.coli (bakteri gram negatif).Untuk perlakuan kontrol positif
digunakan kertas cakram yang telah berisi antibiotika amoksilin, karena kloramfenikol
memiliki sensitivitas yang sangat tinggi, dimana pada dosis 30 g/kertas cakram mampu
Langkah awal yang dilakukan adalah menginokulasi 1 ose (ose bulat) isolat dari stok
kultur pada medium MRSA miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C. Hal yang
sama dilakukan terhadap bakteri uji (E. coli) yang diinokulasikan pada medium NAmiring
dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37C. Sebanyak 1 ml isolat E. coli
memadat membentuk ketebalan agar. Campuran dihomogenkan dengan cara cawan petri
digerakkan membentuk angka delapan diatas bidang datar. Sementara itu disiapkan kertas
cakram steril lalu direndam sebanyak 10 l dalam masing-masing suspensi isolat BAL
selama 10 menit. Kemudian kertas cakram diletakkan di permukaan medium NA yang telah
memadat, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37C untuk memberikan kesempatan
supernatan beraktivitas terhadap bakteri uji. Zona bening yang terbentuk menunjukkan
adanya hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona bening
(mm) diukur dengan jangka sorong sebanyak tiga kali pada posisi yang berbeda dan dirata-
ratakan.
Pengukuran total asam tertitrasi dilakukan dengan prinsip titrasi asam basa. Sebanyak
10 ml filtrat dari sampel dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer lalu ditambahkan 3 tetes
larutan indikator fenolftalein 1%, selanjutnya dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N hingga
terbentuk warna merah muda. Tepat saat warna merah muda terbentuk, titrasi dihentikan.
Total asam tertitrasi dinyatakan sebagai persen asam laktat. Total asam dapat diperoleh
Tujuan tahap ini adalah menentukan komposisi bahan enkapsulasi (biopolimer) yang
tepat untuk mengenkapsulasi BAL dengan teknik ekstrusi. Enkapsulasi yang digunakan
adalah natrium alginat, maltodeksttri dan skim. Maltodekstrin dan skim digunakan sebagai
bahan pengisi. Tahap ini terdiri atas beberapa kegiatan yaitu: penentuan total padatan bahan
pengkapsul, penentuan perbandingan natrium alginat dengan bahan pengisi optimum serta
pengujian viabilitas, efisiensi dan jumlah populasi BAL terenkapsulasi serta pembuatan
Bahan yang digunakan dalam penelitian penelitian ini adalah BAL, natrium alginat,
CaCl2 0,1M, NaCl 0,85%, alkohol 70%, aquadest, susu skim, maltodekstrin, MRSB, MRSA.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah magnetic stirer, syiringe, gelas
ukur, erlenmeyer, jarum ose, cawan petri, neraca analitic, tabung reaksi, kertas saring, pipet
Enkapsulasi yang digunakan untuk menentukan total padatan optimum adalah natrium
alginat. Pembentukan beads jel kalsium alginat dilakukan dengan metode ekstrusi
(Krasaekoopt et al., 2003). Sebanyak 20 gram `suspensi natrium alginat (1%, 2%, 3%, 4%,
5%, dan 6% b/v) yang telah didinginkan pada suhu ruang diteteskan dalam 60 ml CaCl2
0,1M menggunakan syringe berukuran 0,7 mm dengan jarak tetes 1 cm dan diaduk
menggunakan magnetic stirer dengan kecepatan 150 200 rpm. Waktu pengerasan jel dalam
larutan CaCl2 0,1M dilakukan selama 30 menit, kemudian beads disaring secara steril dan
dibilas dengan NaCl 0,85% lalu ditiriskan selama 2 menit. Selanjutnya beads ditimbang.
Pada tahap ini, analisis statistik yang digunakan adalah rancangan acak lengkap factor
tunggal (single factor), yaitu konsentrasi biopolimer (natrium alginat). Faktor ini terdiri dari
empat taraf perlakuan, yaitu alginat 1% (A1), alginat 2% (A2), alginat 3% (A3), alginat 4%
(A4), alginat 5% (A5), alginat 6% (A6). Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Model
Yij = + Ai + ij
Keterangan:
Yij= Pengamatan pada faktor A taraf ke-i dan ulangan ke-j
= Rataan umum
Ai = Pengaruh faktor A taraf ke-i
ij = Pengaruh galat percobaan
Untuk mengetahui pengaruh antara taraf tersebut dilakukan analisis ragam (analisis
varian) menggunakan tingkat kepercayaan 95% (=0,05). Jika hasilnya berbeda nyata,
Kegiatan ini dilakukan untuk menentukan perbandingan natrium alginat dengan bahan
pengisi optimum pada masing-masing bahan pengisi. Tahap ini diawali dengan menyiapkan
sebanyak 20 gram suspensi bahan pengkapsul yang terdiri atas natrium alginat dan bahan
pengisi dengan perbandingan 1:1, 2:1, 3:1 (b/v) dari masing-masing bahan pengisi.
Pada tahap ini analisis statistik yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktor
tunggal (single factor) yaitu komposisi bahan pengkapsul yang terdiri dari natrium alginat
dan bahan pengisi. Faktor ini terdiri dari 7 taraf perlakuan yaitu natrium alginat tanpa bahan
pengisi (B0), natrium alginat-skim 1:1 (B1), natrium alginat-skim 2:1 (B2), natrium alginat-
skim 3:1 (B3), natrium alginat-maltodekstrin 1:1 (B4), natrium alginat-maltodekstrin 2:1
Yij = + Bi + ij
Keterangan:
Yij= Pengamatan pada faktor B taraf ke-i dan ulangan ke-j
= Rataan umum
Bi = Pengaruh faktor B taraf ke-i
ij = Pengaruh galat percobaan
Untuk mengetahui pengaruh antara taraf tersebut dilakukan analisis ragam (analisis
varian) menggunakan tingkat kepercayaan 95% (=0,05). Jika hasilnya berbeda nyata,
Kegiatan ini dilakukan untuk mengetahui viabilitas dan efisiensi BAL terenkapsulasi.
Komposisi bahan pengkapsul yang digunakan adalah komposisi optimum yang didapat dari
tahap penentuan perbandingan natrium-alginat dan bahan pengisi optimum. Preparasi BAL
terlebih dahulu diaktivasi dalam 10 ml MRS broth sebanyak 23 kali dan diinkubasi pada
suhu 370C selama 24 jam. Suspensi kultur disimpan dalam refrigerator pada suhu 40C
sebagai kultur stok. Suspensi sel yang akan digunakan untuk enkapsulasi merupakan kultur
sel sebanyak 0,1% (Homayouni et al. 2008a) atau denganperbandingan 9:1 (Castilla et al.
steril dan diteteskan kedalam larutan CaCl2 0,1 M steril(perbandingan suspensi biopolimer-
sel dan CaCl2 0,1 M adalah 1:3) dengan jarak tetes 1 cm dandilakukan pengadukan 150
200 rpm menggunakan magnetic stirer. Pengerasan jel dilakukanselama 30 menit. Beads
kemudian disaring dan dibilas menggunakan NaCl 0,85% yang telahdisterilisasi. Beads
basah kemudian dimasukan ke dalam wadah atau botol steril. Jumlah selyang terenkapsulasi
di dalam beads dihitung dengan metode yang digunakan Sheu dan Marshal (1993).
Keterangan:
P = Populasi BAL per gram beads (cfu/g beads)
R = Total BAL didalam suspensi biopolimer sel (cfu)
Q = Massa beads yang dihasilkan dari total suspensi biopolimer sel yang digunakan (g)
Pengujian jumlah koloni BAL didalam kapsul pada masing-masing perlakuan diukur
dengan menggunakan metode Total Plate Count (TPC) menurut Fardiaz (1992). Sebanyak
0,5 g kapsul BAL dimasukkan ke dalam 4,5 ml NaCl fisiologis 0,85% dan divortex untuk
proses pelarutan kapsul, lalu diencerkan secara serial (4,5,6 dan 7) dan kemudian diambil
sebanyak 0,1 ml untuk ditanam pada cawan petri berisi media MRS agar. Kultur diinkubasi
pada suhu ruang selama 2 hari. Koloni yang tumbuh kemudian dihitung sebagai berikut:
Sebanyak 5 g kapsul BAL disimpan dalam 30 kantong plastik steril pada suhu kamar
(270C - 280C) dengan kelembaban relatif (75% - 89%) selama 4 minggu. Masing-masing
sampel setiap minggu diambil untuk dianalisis jumlah koloni dan daya hambat BAL
melawan E.coli. Pengujian jumlah koloni BAL didalam kapsul pada masing-masing
(TPC)menurut Fardiaz (1992). Kapsul yang berisi BAL dilarutkan terlebih dahulu
menggunakan NaCl sebelum dilakukan penghitungan jumlah koloni BAL. Begitu juga
pengujian terhadap daya hambat E.coli. Jumlah koloni dan daya simpan BAL yang
Kestabilan BAL dalam menghambat E.coli dihitung berdasarkan daya hambat BAL
yang diperoleh sebelumnya dengan asumsi bahwa daya hambat BAL yang tertinggi (awal)
mempunyai nilai 100%, selanjutnya diperoleh % penurunan kestabilan BAL seiring dengan
Pada tahap ini, analisis statistik yang digunakan adalah rancangan acak lengkap
dengan pola faktorial 2 X 5 dengan 3 kali ulangan. Dimana faktor tersebut adalah:
Faktor A : Enkapsulasi BAL
A2 = Kapsulasi BAL
B0 = 0 Minggu
B1 = 1 Minggu
B2 = 2 Minggu
B3 = 0 Minggu
B4 = 4 Minggu
Yijk = + i + j + ()ij + ij
Keterangan:
i = 1,2 dan 3
j = 1,2 dan 3
k = 1,2 dan 3
Yijk = Nilai kestabilan data ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan penambahan
enkaspulasi ke-i dan lama penyimpanan ke-j
= Rataan umum
()ij = Pengaruh interaksi perlakuan ke-i dan ke-j
ijk = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j pada satuan percobaan
Untuk mengetahui pengaruh antara taraf tersebut dilakukan analisis ragam (analisis
varian) menggunakan tingkat kepercayaan 95% (=0,05). Jika hasilnya berbeda nyata,
suhu 470C. Waktu pengeringan ditentukan dengan mengukur perubahan kadar air probiotik
terenkapsulasi selama pengeringan hingga dicapai kadar air konstan selama pengeringan.
Pada tahap ini juga dikaji pengaruh bahan pengkapsul yang digunakan terhadap viabilitas
kemudian dimasukan ke dalam oven bersuhu 470C. Setiap jam dilakukan penimbangan
beads hingga massa beads telah cukup konstan (tidak mengalami penurunan). Kadar air
Keterangan :
Kat = Kadar air probiotik terenkapsulasi pada jam ke-t (%)
MBt = Massa probiotik terenkapsulasi pada jam ke-t (gram)
MBK = Massa kering (dry matter) probiotik terenkapsulasi (1050C) (gram)
t = Waktu (lama) pengeringan (jam)
dikeringkan pada suhu 470C selama waktu pengeringan optimum yang didapat. Sebelum dan
tunggal (single factor), dengan perlakuan yaitu natrium aginat 5% dengan natrium alginat
Yij = + Ci + ij
Keterangan:
Yij = Pengamatan pada faktor C taraf ke-i dan ulangan ke-j
= Rataan umum
Ci = Pengaruh faktor C taraf ke-i
ij = Pengaruh galat percobaan
Untuk mengetahui pengaruh antara taraf tersebut dilakukan analisis ragam (analisis
varian) menggunakan tingkat kepercayaan 95% (=0,05). Jika hasilnya berbeda nyata,