TEST DE SUPERVIVENCIA EN GUSANOS DE LA ESPECIE Eiseniafetida.

Preparacin de las muestras de sedimentos

- Pesar cada una de las muestras de sedimentos a analizar y colocarla
en los recipientes de material inerte destinados al ensayo.
- Preparar la muestra control: 10% turba de saphagnum, 70% argila
blanca (Caolina), 10% arena de cuarzo.
- Humedecer cada una de las muestras mediante la incorporacin de
agua desionizada gota a gota evitando que se produzca un exceso de
agua.

Seleccin y preparacin de los individuos

- Pesar cada uno de los individuos a utilizar en el ensayo. El peso de los
gusanos debe ser entre 250 y 500mg Registrar el peso de cada uno
de los individuos al inicio del ensayo.
- Distribuir los gusanos uniformemente entre las diferentes muestras a
estudiar. La ratio de gusanos por peso de muestra a utilizar es de 1
gusano por cada 40g de muestra.
- Aadir la cantidad de comida necesaria por individuos presentes en
cada muestra. La cantidad de comida a aadir corresponde a 2g de
comida por gusano. Distribuir la comida entre la muestra de
sedimento.
- Pesar el recipiente con la muestra, el agua, los individuos y la comida
SIN LA TAPA y registrar el peso. Este es el parmetro de referencia
para la monitorizacin del contenido de agua de las muestras.

Condiciones experimentales del test

Temperatura: 20 2C
Fotoperiodo: 16 horas de luz 8 horas de oscuridad
Iluminacin: 400 800 lux en el rea donde se encuentran los contenedores del
test.
Humedad del sustrato: 40% - 60% 10 %

Una vez por semana

Registrar el peso de todos los gusanos de cada muestra.

Dos veces por semana

Registrar el peso de todos los recipientes que forman parte del ensayo.
Corregir la diferencia de peso con el ltimo registro (correspondiente a la
prdida de agua) aadiendo el volumen correspondiente de agua
desionizada.

Durante todo el ensayo

Mantener la temperatura a 20C 2C y la humedad del sustrato al 40-60%
10%.
TEST DE COMET ENGUSANOS DE TIERRA DE LA ESPECIE
Eiseniafetida.

Preparacin de portaobjetos con la primera capa de agarosa.

Da previo al test de Comet(da 27 del test de supervivencia):

Durante todo el proceso deben utilizarse guantes ya que las grasas presentes en la
piel reducen la adherencia de la agarosa en los portaobjetos.

1- Encender el bao termostticoy programarlo a una temperatura de 40C.

2- Preparar la solucin de agarosa para electroforesis de punto de fusin
normal al1% en agua milli-Q en un Erlenmeyer de 250mL de capacidad.
Pesar la agarosa y mezclarla con el agua milli Q en el Erlenmeyer, introducirlo en
el microondas ycalentarla solucin mediante diferentes pulsos de microondas
(evitar que el agua hierva) alternados constantementecon la agitacin del
Erlenmeyer hasta que la agarosa se haya disuelto del todo. Atemperar la
solucinmediante el contacto del Erlenmeyer con un flujo de agua fra y agitacin
constante. Una vez el Erlenmeyer ha llegado a temperatura ambiente, mantener
la solucin en el bao termosttico previamente atemperado.
3- Transferir parte de la solucin de agarosa a un vaso de precipitados y
mantenerlo en el bao termosttico.
4- Sumergir el portaobjetos enel vaso de precipitados que contiene la
solucin de agarosa a 40C.
5- Retirar el portaobjetos de la soluciny secar la parte inferior con un papel.
Comentario: Algunos portaobjetos contienen cierta cantidad de grasas en su
superficie, debido a su propio proceso de fabricacin. En estos casos la solucin
de agarosa no puede distribuirse uniformemente por la superficie del
portaobjetos. En los casos en que se produzca esta situacin no deben utilizarse
esos portaobjetos.
6- Dejar secar el portaobjetos a temperatura ambientey guardarlo en una
caja de preparaciones. Una vez seco, el portaobjetos con la primera capa
de agarosa puede guardarse indefinidamente.

Test de Comet (da 28 del test de supervivencia):

Se deben rotular todos los portaobjetos con el cdigo de cada gusano.

Dependiendo de la capacidad de la cubeta de electroforesis, seleccionar el

nmero de individuos que se pueden utilizar en cada ensayo.
Ejemplo: Empezar con un mximo de 48 gusanos, ya que en la cubeta de
electroforesis caben como mximo 24 portaobjetos y solamente tenemos dos
cubetas para 24 portaobjetos y 2 fuentes de alimentacin para la realizacin de la
electroforesis.

1- Obtencin de la suspensin celular

1.1- Lavar cada gusano con solucin salina de Eyambe (0.57 gNaCl/100
mL agua desionizada) a temperatura ambiente, un mnimo de tres
lavados.
1.2- Colocar el gusano sobre un papel de filtro humedecido con agua y
realizar un masaje del individuo. Des de les partes del organismo
hasta la cola, en sentido longitudinal. De esta manera se vaca el
contenido intestinal del individuo eliminando la materia orgnica y las
bacterias presentes, que podran interferir con la muestra a analizar.
1.3- Colocar el gusano en un tubo de centrfuga ( previamente rotulado con el
cdigo del gusano) y aadir 3mL de la solucin de extrusin (95% solucin
 salina, 2.5mg/ml EDTA sdico, 10mg/ml de GuiacolGlycerilEther [GGE] y
5% de alcohol absoluto QUE SE AADE AL LTIMO MOMENTO ) a
temperatura ambiente y a un pH 7.3, durante 3minutos.
Pasado este tiempo se retira el gusano y se coloca en una placa de Petri
con solucin salina.
1.4- El lquido remanente en los tubos donde se ha realizado la extrusin
contiene los celomocitos del gusano. Se centrifuga el lquido a 3000g
durante 3minutos.
1.5- Se extrae el sobrenadante i se aade 1mL de solucin salina a 4C.
1.6- Se traspasa el contenido del tubo (celomocitos + solucin salina) a un
eppendorf (previamente rotulado con el cdigo del gusano).
1.7- Se centrifuga el contenido del eppendorf a 3000g durante
3minutos.Se retira el sobrenadante y ser resuspende con 60l de
solucin salina.

2- Preparacin del lquido de lisis (Esta parte se prepara mientras

se realiza la obtencin de la suspensin celular)

2.1- La solucin de stock de lisis se preparar previamente . Preparar 300mL de

solucin de lisis completa para cada 24 portaobjetos. Solucin stock +
Triton X-100 10% + LaurylSarcosine 1% 297mL solucin stock + 3mL
Triton X-100 + 3mL LaurylSarcosine.
2.2- Dejar en agitacin en el agitador magntico hasta que empiece el
siguiente paso del protocolo (3), momento en el cual, se debe repartir el
lquido de lisis en cubetas y guardarlo en la nevera a 4C.

3- Preparacin de la segunda capa de agarosa

3.1- Encender el bao termostticoy programarlo a una temperatura de

37C.
3.2- Preparar agarosa para electroforesis de bajo punto de fusin
(lowmeltingpoint LMP) al1% en agua milliQ en un Erlenmeyer. ( El
procedimiento a seguir es el mismo que el utilizado en el punto 2 del apartado
Preparacin de portaobjetos con la primera capa de agarosa )
3.3- En un eppendorf nuevo mezclar 60l de la suspensin celular del
apartado 1.7 con 80l de la solucin de agarosa. Pipetear varias veces
para resuspender la suspensin celular en la solucin de agarosa.
3.4- Extender la mezcla en el portaobjetos correspondiente (rotulado con
el cdigo del gusano)y cubrir rpidamente con un cubreobjetos. Este
paso se debe realizar rpidamente para evitar que la agarosa de la
mezcla solidifique.
3.5- Unavez preparados todos los portaobjetos, colocarlos en una bandeja
de plstico y guardarlos en el congelador a -20C durante 6minutos
EXACTOS.

A PARTIR DE ESTE MOMENTO TODOS LOS PASOS DEBEN REALIZARSE

A OSCURAS (SIN PRESENCIA DE LUZ BLANCA DIRECTA) DEBIDO A
QUE EL MATERIAL GENTICO ES FOTOSENSIBLE!!!

4- Lisis alcalina

4.1- Sacar los portaobjetos del congelador.

4.2- Retirar los cubreobjetos y colocarlos en cestas de tincin dentro
de las cubetas de tincin que contienen el lquido de lisis completo y que
se mantenan a 4C hasta este momento.
4.3- Mantener las cubetas de tincin en la nevera a 4C durante el tiempo
de lisis, que son 2horas.

En caso de necesitar realizar el proceso del Comet en dos o ms veces (porque se

tienen ms de 24 gusanos), este es un buen momento para empezar con la
preparacin de otra tanda de muestras de gusanos. Empezar desde el punto 1 del
protocolo. Obtencin de la suspensin celular.

5- Desenrollamiento del DNA

5.1- Mientras no ha acabado la lisis, llenar dos cubetas de electroforesis

grandes con tampn de electroforesis ( el tampn de electroforesis deber
cubrir la superficie de los portaobjetos una vez estn colocados en la cubeta ) y
dejarlas en la nevera.
5.2- Una vez finalizadas las 2horas de lisis, transferir los portaobjetos a las
cubetas de electroforesis y dejarlos 20minutos.
5.3- Durante este tiempo y con ayuda de las pinzas organizar los
portaobjetos en la superficie de la cubeta, de manera que formen una
capa uniforme sin espacios vacos entre ellos. Si quedan hileras
incompletas en la cubeta, acabar de llenarlas con portaobjetos limpios
sin agarosa para igualar la resistencia.Transferir de nuevo las cubetas a
la nevera a 4C, taparlas y programar las fuentes de alimentacin a 25V
y 300mA.
5.4- Antes de que pasen los 20minutos, apretar START en la fuente de
alimentacin y comprobar que los parmetros introducidos son
correctos.
Si el voltaje real indicado por la fuente es superior a 25V y/o el amperaje
es superior a 300mA, es necesario retirar tampn de electroforesis de la
cubeta, hasta que los valores coincidan con 25V y 300mA.
En el caso contrario, el voltaje y el amperaje son inferiores a los valores
establecidos, es necesario aumentar el volumen del tampn de
electroforesis de la cubeta.
Una vez comprobados y ajustados, apagar la fuente de alimentacin.

6- Electroforesis alcalina

6.1- Una vez transcurridos los 20minutos de desenrollamiento del DNA,

organizados los portaobjetos sobre la cubeta y equilibrados los
volmenes de tampn de electroforesis, pulsar START en la fuente
alimentacin, cerrar la nevera y esperar al desarrollo de la electroforesis
durante 20minutos.
Durante el transcurso de la electroforesis, comprobar que los valores de voltaje
y amperaje se mantienen.

7- Neutralizacin

7.1- Mientras transcurren los 20 minutos de electroforesis, preparar 3

cubetas de tincin llenas de solucin de Tris 1M.
7.2- Retirar los portaobjetos de las cubetas de tincin, transferirlos a cestas
de tincin y pasarlas cada una de las cestas durante 5minutos en cada
una de las 3 soluciones de Tris preparadas (3 lavados de 5minutos).
7.3- Dejar secar las cestas con los portaobjetos overnight y guardarlos en
cajas de preparaciones hasta el anlisis.

8- Tincin y anlisis

MANTENER LA LUZ APAGADA EN TODO MOMENTO

8.1- Hidratar los portaobjetos por inmersin en agua milliQ durante 5-

10minutos.
8.2- Teir los portaobjetos con 20L de DAPI, extendindolo por la superficie
del portaobjetos (Al estar previamente hidratado, se extiende fcilmente ).
Esperar aproximadamente 3 minutos.
8.3- Observar y analizar el portaobjetos con un microscopio de
epifluorescencia con un filtro de excitacin del espectro ultravioleta de
entre 330 y 380nm.