Universidade Estadual de Feira de Santana

Engenharia de Alimentos
Departamento de Cincias Exatas
Disciplina: Qumica orgnica II Exa 411
Docente: Carla Mendes

Separao cromatogrfica de pigmentos de folhas verdes

Feira de Santana Ba
Agosto, 2012
 Universidade Estadual de Feira de Santana
Engenharia de Alimentos
Departamento de Cincias Exatas
Disciplina: Qumica orgnica II Exa 411
Docente: Carla Mendes
Discentes: Edinara Lacerda Queiroz e Samanta Sousa Silva

Cromatografia

Relatrio de aula prtica da disciplina

Qumica orgnica II do curso de
engenharia de alimentos, ministrado pela
docente Carla Mendes, requerido como
atividade avaliativa.

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Feira de Santana Ba
Agosto, 2012
RESUMO

A cromatografia um mtodo de separao fsico- qumica dos componentes de uma

mistura, realizado atravs de uma migrao destes componentes entre duas fases que
esto em contato, a fase mvel e a fase estacionria, uma das fases permanece
estacionria, enquanto a outra se move atravs dela. A tcnica cromatogrfica possui
uma grande variabilidade de aplicaes, podendo ser utilizada para purificao de
compostos, separao dos componentes de uma mistura e para estabelecer a identidade
de compostos.
OBJETIVO

Observar a separao das substncias que compem o extrato de coentro, sendo

elas as clorofilas a, b e os carotenos a partir da anlise das bandas obtidas nas
cromatografias em camada delgada (CCD) e cromatografia em coluna (CC).
INTRODUO

A cromatografia um mtodo simples e de grande aplicao na qumica, devido

a sua facilidade de executar a separao e identificao de compostos. A tcnica envolve
uma srie de processos de separao de misturas e acontece pela passagem de uma
mistura atravs de duas fases: uma estacionria (fixa) e outra mvel que esto
intimamente ligadas. A fase mvel pode ser um gs, um lquido ou um fluido super
crtico e a fase estacionria fixa pode ser colocada em uma coluna ou numa superfcie
slida. A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciada por
diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e especficos efeitos
de afinidade e solubilidade.
Os termos cromatografia e cromatograma surgiram em 1906, quando o botnico
russo Mikhail Tswett descreveu suas experincias na separao dos componentes de
extratos de folhas e de gemas de ovo, utilizando uma coluna de vidro empacotada com
CaCO3 e ter de petrleo, a separao foi visualizada atravs de faixas coloridas na
coluna.

H diversas formas de cromatografia e estas podem ser classificadas, levando-se

em conta alguns critrios como a forma fsica do sistema, a fase mvel empregada, a
fase estacionria empregada e o mtodo de separao. De acordo com a forma fsica do
sistema a cromatografia pode ser classificada como cromatografia em coluna e
cromatografia planar, a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP),
e as cromatografias por centrifugao e em camada delgada (CCD) so os tipos de
cromatografia em coluna. Quanto a fase mvel utilizada a cromatografia pode ser
classificada como: cromatografia gasosa, cromatografia lquida ou cromatografia
supercrtica (CSC). Quanto fase estacionria, diferem entre fases estacionrias
lquidas, slidas e quimicamente ligadas. Quando a fase estacionria composta por um
lquido, ele pode estar adsorvido em um suporte slido ou imobilizado sobre ele.
Suportes modificados so considerados isoladamente, como fases quimicamente
ligadas, por serem diferentes dos outros dois em seus mecanismos de separao. Quanto
ao modo de separao cromatografia pode ser por partio, adsoro, excluso, e troca
inica.
Na cromatografia em camada delgada (CCD) a separao das substncias ocorre
pela migrao das mesmas sobre uma camada delgada de adsorvente que est retido
numa superfcie plana por meio da fase mvel, que neste caso pode ser um lquido ou
uma mistura deles. Esta uma tcnica de adsoro slido-lquido, onde a separao dos
componentes da mistura acontece pela diferena de afinidade dos mesmos pela fase
estacionria. Os principais fenmenos que governam a CCD so a adsoro e a absoro
ou partio, a adsoro acontece com fase estacionria slida, neste caso a slica gel e a
alumina. Outros adsorventes como celulose, a poliamida e a diatomcea tambm so
utilizados nesta tcnica. Na cromatografia em camada delgada uma camada fina de
adsorvente espalhada em uma placa de vidro, aps seca e ativada, uma pequena
amostra de mistura aplicada na extremidade desta cromatoplaca com auxlio de um
capilar, depois a placa e colocada na posio vertical dentro de um recipiente,
devidamente tampado, com uma quantidade de eluente. O eluente ir ascender pela
cromatoplaca, durante este processo os componentes da mistura sero separados. As
substncias mais polares iro avanar pela placa mais lentamente que as menos polares,
cada uma delas ter um comportamento segundo as suas caractersticas como
solubilidade e poder de adsoro. A cromatografia em camada delgada uma tcnica de
fcil execuo e compreenso e de baixo custo, por isso amplamente utilizada em
reaes orgnicas e purificao de compostos.
 A cromatografia em coluna um mtodo utilizado para isolamento, purificao e
separao de compostos orgnicos, quando a fase estacionria utilizada um lquido a
separao cromatogrfica acontece por partio, quando a fase estacionria um slido
a separao acontece por adsoro, de uma forma ou de outra, a cromatografia em
coluna se baseia na diferena das polaridades dos componentes da mistura. Durante o
procedimento utilizada uma coluna com uma substncia polar (fase estacionria),
empacotada com um solvente orgnico, o adsorvente pode ser colocado na coluna seco
ou suspendido em um solvente adequado. Os adsorventes normalmente utilizados so a
slica gel, a alumina, o carbonato de clcio, o xido de magnsio, entre outros. Os
principais eluentes so: teres de petrleo, ter etlico, clorofrmio, acetato de etila,
acetona, etanol, metanol, gua destilada ou misturas dos eluentes.
FLUXOGRAMA

Parte I
Obteno do extrato orgnico de folhas verdes:

Folhas verdes: 30g

Apresentar uma
colorao verde Triturar em um almofariz
escura. Diclorometano

Transferir o lquido para um bquer de 100 mL

Levar capela

Separao por cromatografia em camada delgada.

a) Preparo das placas cromatogrficas:

06 placas de vidro desengorduradas

Gel de slica 60 G: 3g
gua destilada: 10 mL

Espalhar a suspenso sobre a placa de vidro

Repousar as placas e deixar secar ao ar

b) Seleo da fase

03 solventes puros para ser

usados como fase mvel

c) Preparo da cuba cromatogrfica

Fase mvel: 20 mL
 Bquer de 250 mL Altura no pode
contendo papel filtro ultrapassar 1,5 cm.

Tampar com placa de filtro

d) Aplicao da amostra na placa e desenvolvimento do cromatograma

Estufa a 110C

Ativar as placas cromatogrficas por 30 min.

1,5 cm borda inferior

Marcar as placas, ainda quentes,
0,5 cm borda superior nas bordas laterais

Tubo capilar
01 gota de soluo de extrato orgnico

Na parte inferior e central da placa

Introduzir a placa dentro da cuba cromatogrfica

Tampar a cuba

Esperar a fase mvel atingir a

marca de chegada

Medir (em cm) as distncias percorridas pela

fase mvel e por cada banda observada.

Guardar o extrato orgnico em local apropriado

Parte II
Pesar o extrato orgnico
 a) Empacotamento da coluna cromatogrfica

Fixar a coluna verticalmente

Gel de slica 60G: 9g

Hexano

Agitar com basto de vidro

Hexano At completar
do volume
Torneira
fechada Coluna

Suspenso de slica

Com auxlio do funil de vidro Torneira

aberta

No deixar a
Passar vrias vezes hexano na coluna
coluna secar

Fechar a torneira aps o empacotamento

b) Aplicao do extrato na coluna cromatogrfica

Extrato lquido

Abrir a torneira da coluna at o nvel No deixar a

se aproximar da superfcie da slica coluna secar

Pipeta Pasteur

A soluo no deve Transferir a soluo concentrada do

tocar nas paredes da extrato para o topo da coluna
coluna
Abrir lentamente a torneira at a soluo do
extrato ser totalmente adsorvida na slica
Torneira
fechada Colocar sobre o extrato uma camada de slica

c) Eluio do extrato na coluna cromatogrfica

08 frascos coletores rotulados

 Torneira fechada

Fase mvel selecionada na parte I

Sobre a camada de slica

Abrir a torneira e no
deixar a coluna secar Iniciar a eluio das bandas

Recolher o volume morto

no primeiro frasco coletor

Trocar de frasco quando a primeira banda

atingir a placa de vidro sinterizado

At coletar a primeira
Manter a fase mvel
banda no segundo frasco
A segunda fase mvel escolhida

Recolher as bandas seguintes, trocando At recolher a

o frasco e a fase mvel quando necessrio banda verde

Mudar a fase mvel para a lavagem da coluna

Observar a colorao de cada frao cromatogrfica obtida

Evaporar o solvente na capela

MATERIAIS E REAGENTES

Equipamentos:

Balana analtica;
Bquer;
Almofariz;
Pistilo;
Proveta;
Pipeta Pasteur;
Placas de vidro;
Papel de filtro;
Placa de Petri;
Estufa;
Tubo capilar;
Pina metlica.
Coluna cromatogrfica;
Suporte universal;
Basto de vidro;
Funil de vidro;
Erlenmeyer;
Esptula;
Frascos coletores.

Reagentes:

Folhas de coentro;
Diclorometano;
Slica 60 G;
gua destilada;
Acetona;
Hexano.

Toxidade

Reagentes Toxidez
Ligeira irritao aos olhos, irritao a pele. Tem potencial
Diclorometano
cancergeno.
Slica 60 G Irritante aos pulmes, evitar inalar seu p muito fino.
gua destilada No possui
Acetona irritante aos olhos. txica ao sangue, pulmes, rins e fgado.
Irritante a pele e aos olhos. Pode causar dor de cabea, nuseas,
Hexano tonteiras, perturbaes visuais e auditivas, quando exposto por
muito tempo.
Tabela 01: toxidez dos reagentes utilizados.

PROPRIEDADES FSICAS
 Peso Densidade
Frmula P.F. P.E.
Componente molecular Aparncia Solubilidade (g.cm3) a
qumica (C) (C)
(g/mol) 20C

Em gua 20 g/l
(20C) e
Lquido
Diclorometano Cl2CH2 86, 95 imiscvel em 1, 36 -97 39
incolor
solventes
orgnicos
Slido
Slica 60 G SiO2 60, 09
branco
Lquido Totalmente
gua destilada H2O 18, 01 1, 00 0 100
incolor solvel
Miscvel em
gua, etanol e
Lquido 0,7700
Acetona C3H6O 58, 08 ter etlico, ---- 56,2
incolor 0,8511
clorofrmio e
essncias
Solvel em
Lquido
Hexano C6H14 86, 18 etanol e 0, 66 ---- 69
incolor
clorofrmio
Tabela 02: propriedades fsicas.
DISCUSSO

O extrato de coentro composto por grupos, carotenos e clorofilas, o mtodo de

separao de compostos como este a cromatografia. No procedimento experimental,
foram utilizadas as tcnicas de cromatografia em camada delgada, com o objetivo de
identificar e determinar os componentes da mistura e determinar o solvente adequado
para a cromatografia em coluna, que foi realizada posteriormente para obteno destes
compostos. A slica gel 60 G, uma substncia polar, geralmente o adsorvente
comercial mais utilizado. No caso de fases estacionrias polares, como o caso da
slica, o solvente a ser utilizado como fase mvel deve ser de mdia ou baixa
polaridade. Foram feitas trs cubas cromatogrficas para a CCD, com a seguinte ordem
de eluentes: hexano, hexano acetona 8:2 e hexano ter 8:2. A escolha foi feita tendo-se
em vista as diferentes polaridades dos eluentes. Aps as eluies os seguintes resultados
foram obtidos:
Placa 1 : hexano puro
Na placa com hexano puro a eluio deu-se apenas no grupo dos carotenos,
como o hexano uma substncia apolar, este tem afinidade com substncias tambm
apolares, como o caso dos carotenos. Enquanto que as clorofilas como so polares no
tiveram afinidade com a fase mvel, consequentemente no foram eluidas.
Placa 2 : Hexano: Acetona (8:2)
Esta placa apresentou maior resoluo, obtendo seis bandas cromatogrficas,
com as cores amarelo, laranja, cinza, verde azulado, verde e verde claro,
respectivamente. Este fato pode ser explicado pela afinidade entre as fases estacionria
e mvel, pela polaridade do solvente. O grupo dos carotenos eluiram primeiro seguidos
das clorofilas A e B, e aps estas a xantofila. Neste caso os componentes apolares
eluiram primeiro, devido a maior concentrao de hexano no solvente, os compostos
mais polares por possurem afinidade coma fase estacionria tambm polar, ficaram
retidos e eluiram posteriormente.
Placa 3: Hexano: ter etlico (8:2)
A resoluo desta placa no se apresentou boa, eluindo apenas o grupo dos
carotenos. Em comparao ao hexano puro, houve uma melhor eluio, porm o
resultado no foi satisfatrio, eluindo apenas duas bandas, uma amarela clara e uma
laranja, que representam o grupo dos carotenos.
 n0 de bandas Colorao das bandas
Solvente
cromatogrficas cromatogrficas
Hexano 1 Amarelo
Hexano ter etlico 2 Amarelo e laranja
Amarelo, laranja, cinza, verde
Hexano acetona 3
azulado, verde e verde claro
Tabela 03: resultado da cromatografia em camada delgada.

Rf - de um composto. definido como a razo entre a distncia percorrida

pelo composto (dc) e a distncia percorrida pelo eluente (de).

fator de reteno pode ser alterado atravs de mudanas nas fases estacionria e/ou mvel; mudanas
na temperatura, no volume ou na concentrao da substncia aplicada.

Solvente Bandas cromatogrficas dc (cm) de (cm) Rf (dc/de)

1-Amarelo 0, 5 0, 09
2-Laranja 0, 6 0, 11
Hexano: 3-Cinza 0, 7 0, 12
5, 5
acetona 4-Verde azulado 0, 4 0, 07
5-Verde 1, 5 0, 27
6-Verde claro 1, 2 0, 22
Hexano: 1-Amarelo 0, 7 0, 13
5, 4
ter etlico 2-Laranja 4, 2 0, 78
Hexano 1-Amarelo 1, 5 1, 5 1
Tabela 04: Fator de reteno da cromatografia em camada delgada

Na cromatografia em coluna, o eluente utilizado inicialmente foi o hexano, e

posteriormente, foi utilizada uma mistura de hexano- acetona em diferentes propores.
Utilizando como eluente o hexano, assim como na cromatografia em camada delgada, a
primeira banda a ser eluida foi a amarela, que corresponde ao grupo dos carotenos. Este
fato j era esperado, j que como o solvente utilizado era de baixa polaridade, a primeira
banda a ser eluida seria a que houvesse maior afinidade com a fase mvel, ou seja, a
que, neste caso, possua o componente apolar. (Figura 1).
A frao amarela foi recolhida em um frasco, que correspondeu a frao 1 e a
frao 2, amarelo claro, foi recolhida num outro frasco. (Figura 2)
A medida que as fraes foram recolhidas, a polaridade do solvente ia sendo
aumentada, para que as prximas fraes, mais polares, pudessem ser eluidas. O eluente
agora utilizado foi uma mistura de hexano- acetona 9:1,e a frao a ser recolhida foi a
cinza, que correspondeu a frao 2 .Em seguida o eluente utilizado foi uma mistura de
hexano- acetona 8:2, com este eluente foram recolhidas as fraes verde escuro(frao
3), amarelo esverdeado (frao 4) e verde claro (frao 5), respectivamente, que
corresponde ao grupo das clorofilas. Esta ordem de eluio j era esperada, devido aos
resultados obtidos na CCD, e pode ser explicada levando-se em conta a afinidade ente
as fases mvel e estacionria a polaridade do solvente utilizado. (Figura 3)
Durante a realizao do procedimento, devido a baixa temperatura no
laboratrio, a coluna apresentou algumas bolhas de ar, j que ela estava localizada
prxima ao ar condicionado. Esta irregularidade pode causar problemas durante a
separao dos componentes, o que torna o resultado no satisfatrio. Para solucion-lo,
foi colocado um curativo na coluna, com algodo umedecido com solvente
(diclorometano). O solvente voltil rouba calor da coluna, o que faz com que as bolhas
sejam desfeitas. (Figura 4)
Outro problema foi verificado durante o experimento, a coluna estava vazando,
sendo assim, algumas partes da fase estacionria (slica gel) estava passando juntamente
com as fraes que estavam sendo recolhidas, o que comprometeu o rendimento do
procedimento experimental. Portanto no h como realizar uma anlise quantitativa do
mesmo, j que as massas estaro com valores incorretos, logo, o rendimento possuir
tambm resultado incorreto.

CROMATOGRAMAS

Placa I
Fase estacionria: Slica gel 60G
Fase mvel: hexano puro
Placa II
Fase estacionria: Slica gel 60G
Fase mvel: Mistura hexano e acetona (8:2)

Placa III
Fase estacionria: Slica gel 60G
Fase mvel: Mistura hexano e ter (8:2)

CONCLUSO

Este experimento proporcionou aos alunos uma vivncia da prtica de

cromatografia, mostrando como simples a separao de compostos complexos no-
volteis e com ponto de ebulio no definido. A partir da cromatografia em camada
delgada possvel identificar os componentes existentes no composto e o melhor
solvente a ser utilizado para a eluio deste atravs da cromatografia em coluna.
QUESTIONRIO

1) Por que as folhas foram modas?

As folhas foram muitas para que se aumentasse a superfcie de contato para que o
solvente pudesse agir de uma forma melhor e ento extrair a maior quantidade possvel
de extrato orgnico.

2) Aps a preparao do extrato das folhas observa-se a presena de duas fases.

Explicar.
As duas fases visualizadas aps a macerao das folhas de coentro so a fase orgnica,
extrada pelo solvente, e fase aquosa originada da umidade natural das folhas da planta.

3) Qual a finalidade do uso da CCD neste experimento?

A CCD tem como finalidade separao dos componentes da do extrato (caroteno e
clorofila), alm de determinar o solvente apropriado para uma separao por
cromatografia em coluna e verificar a eficincia de uma separao.

4) Qual a finalidade do papel de filtro dentro da cuba cromatogrfica? Explicar.

O papel de filtro tem a funo de saturar o ambiente, ele fica umedecido com a fase
mvel e promove a saturao da atmosfera da cmara com a fase mvel na forma de
vapor.

5) O que Rf? Calcular os valores de Rf para as bandas. Explicar as diferenas

encontradas.
Rf o fator de reteno o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em
questo e a distncia percorrida pela fase mvel.
Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano, 1 banda
Rf= 1,5cm/1,5cm = 1
Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano: acetona 8:2, 2 bandas
Rf1= 4,2cm/5,4cm = 0,78
Rf2= 0,7cm/5,4cm = 0,13
Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano:ter etlico 8:2, 6 bandas
6) Analisar os cromatogramas obtidos por CCD e classificar as fases mveis
testadas quanto ao poder de resoluo e quanto ao poder de eluio. Indicar a
melhor e a pior fase mvel para a separao dos pigmentos.
Discutido durante a discusso dos resultados.

7) Considerando as estruturas qumicas dos grupos de compostos separados, as

polaridades da fase estacionria e fase mvel, comparar e explicar os
cromatogramas obtidos na parte I do experimento.
Discutido durante a discusso dos resultados.

8) Se os componentes no fossem coloridos, como as bandas na CCD poderiam ser

identificadas? Citar e explicar 2 mtodos.
As bandas na CCD podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues
de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, fluorescncias e radioatividade. Mas os
mtodos mais comuns para visualizao das bandas so os vapores de iodo e a luz UV,
no primeiro mtodo, os vapores de iodo reagem com muitos compostos orgnicos
formando complexos de cor marrom ou amarela. E sob a luz UV os compostos
geralmente aparecem como manchas brilhantes de prata.

9) Por que a coluna foi empacotada com hexano? Este procedimento poderia ser
realizado com a fase mvel selecionada na parte I do experimento? Qual a
conseqncia disso?
O hexano foi utilizado para o empacotamento da coluna para no comprometer o
resultado, por se tratar de uma substncia apolar. Se fosse utilizado uma fase mvel
selecionada na parte I do experimento poderia comprometer o resultado, pois elas
possuem uma maior polaridade e poderiam se dissolver no solvente utilizado.

10) Por que a coluna no deve possuir bolhas e no deve secar?

Se houver bolhas de ar dentro da coluna ou se o adsorvente secar a separao dos
componentes da mistura ser dificultada, pois estes fatores causam a inclinao das
bandas , separando parcialmente e no totalmente as substncias. As bolhas de ar so
causadas pela baixa temperatura no ambiente, caso haja estas bolhas deve ser feito um
curativo na coluna, envolvendo-a com algodo umedecido com um solvente voltil, a
fim de evitar estas irregularidades, o solvente retira calor da superfcie da coluna,
desfazendo assim as bolhas.

11) Qual grupo de compostos eluiu primeiro na coluna? Qual grupo de compostos
ficou mais retido? Explicar.
O composto que eluiu primeiro na coluna foi as xantofilas, do grupo dos carotenos, e a
que ficou mais retida foi o grupo da clorofila, isso por que os carotenos so mais
apolares, e como a fase mvel utilizada inicialmente foi o hexano essas substncias
tiveram maior afinidade eluindo primeiro, como as substncias do grupo das clorofilas
possuem uma maior polaridades, elas tiveram afinidade com a fase estacionria ficando
retidas, sendo eluidas conforme foi mudando a fase mvel, tornando-a mais polar, e
assim, a afinidades dessas substncias com a fase mvel foi aumentando.

12) Comparar o comportamento observado das bandas na CC com o observado na

CCD.
Na cromatografia em coluna, o caroteno eluiu primeiro, pois este teve uma maior
afinidade com a fase mvel. Na cromatografia em camada delgada os carotenos tambm
eluiram primeiro devido a maior afinidade do mesmo com a fase mvel, visualizou-se
na parte superior da placa as bandas amarelas que correspondem a este composto. Na
cromatografia em coluna em seguida, eluram as bandas cinza e verde respectivamente,
devido afinidade dos mesmos com a fase mvel e com a estacionria. Visualizamos
ento que tanto na CC como na CCD as bandas eluram na mesma ordem, os carotenos
(banda amarela) primeiro seguidos das clorofilas (bandas cinza e verde).

13) O que so eluio isocrtica e eluio por gradiente de polaridade? Que tipo
de eluio foi realizado neste experimento? Por qu
Eluio isocrtica a eluio realizada com a composio da fase mvel
constante, ou seja, eluio com um nico solvente ou com uma mistura de
solvente de composio constante. Eluio por gradiente de polaridade
aquele em que a polaridade da fase mvel alterada com o tempo. Durante o
experimento utilizou-se a eluio isocrtica, pois a polaridade da fase mvel
utilizada, mesmo a da mistura, no se alterou durante o experimento.
14) Qual o mecanismo de separao dos dois grupos de compostos neste
experimento? Explicar
O mecanismo de separao foi pela interao entre as fases estacionria e mvel com os
componentes da mistura, chamado de adsoro, que um processo de separao slido-
lquido baseado nas foras de atrao eletrostticas das substncias, o processo ocorre
na interface entre o slido e a fase mvel, devido presena de grupos ativos na sua
superfcie do mesmo.
.
15) Em uma tabela, indicar as fraes obtidas, aspecto fsico, massa, fase mvel e
rendimento percentual da separao. Quanto foi perdido do extrato na coluna
cromatogrfica?

16) Explicar como as fraes cromatogrficas obtidas na separao por CC

poderiam ser analisadas por CCD quanto pureza e quanto natureza qumica.
As fraes obtidas por cromatografia em coluna poderiam ser analisadas por CCD
utilizando placas com uma fase estacionria, as cubas cromatogrficas e uma fase mvel
e para cada fase fazer o teste com uma placa e uma cuba cromatogrfica. Seria feita uma
comparao com as fases e a polaridade da fase mvel com a fase estacionria. Caso
houvesse mais de uma banda, observar-se-ia que esta no estava pura, e seriam feitas
vrias anlises para cada fase, obtendo uma anlise em relao a natureza qumica e a
pureza das fraes obtidas por cromatografia em coluna.