UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN

ALIMENTOS
INGENIERA BIOQUMICA
INGENIERA GENTICA

TEMA: TECNOLOGA DE ADN

RECOMBINANTE
Integrantes:
Samantha Cabezas.
Amy Rivadeneira.
Mayra Telenchana.

Octavo U Ing. Yunis Prez

 INTRODUCCIN
Uno de los desafos de la
gentica molecular es aislar
segmentos de ADN y
asignarles una secuencia y
por lo tanto una posible
funcin.
Igualmente para el ARN, su
aislamiento e identificacin
son cruciales para entender
los mecanismos moleculares
que ocurren en la clula.
 Electroforesis
GENERALIDADES ELECTROFORSIS EN GEL DE AGAROSA
La electroforesis se define como el
movimiento de molculas cargadas en un
campo elctrico.
El ADN est negativamente cargado.
La electroforesis se realiza usando un gel
(agarosa).
El gel, una vez formado, tendr una malla
de pequeos poros.
Las molculas ms pequeas viajan ms
fcilmente.
Las molculas ms grandes son retardadas.
El ADN se aislar de acuerdo a su tamao.
Las molculas muy grandes son retenidas y
la migracin no se da del todo.
 Electroforesis
PROCEDIMIENTO
Mezclar las cantidades correctas de
agarosa en el buffer apropiado y verte
dentro de una cmara/cubeta y dejar al ser
dispersarse y solidificarse.
Colocar un peine (formacin de pocillos en
el gel).
Tambin se puede usar poliacrilamida
(aislamiento de protenas).
Mezclar las muestras con un colorante
cargado (azul de bromofenol).
Las molculas de ADN son analizadas junto
a una muestra de ADN de peso molecular
conocido.
VISUALIZACIN
Inclusin del gel de un colorante
intercalante (bromuro de etidio)
Remojando el gel en el colorante
despus de que se ha corrido.
El gel es despus colocado en un
transilumindados, el cual emite luz
UV.
Cualquier bromuro de etidio que
esta conectado con el ADN se ver
fluorescente.
Esto se usa para fotografiar los
resultados.
 Pureza y Concentracin de ADN

Determinacin realizada antes

de realizar experimentos
genticos moleculares para
evaluar la contaminacin de
ADN con nucletidos, protenas
o lpidos.
Parmetros evaluados por
Espectroscopa y Electroforesis
en gel.
 Espectroscopa
cidos nucleicos con un patrn de absorbancia de
luz caracterstico.
 Electroforesis en gel
Usado cuando se manipula ARN por su
inestabilidad para evaluar su integridad y pureza.
 Anlisis por Transferencia
Transferencia Southern
Reportada en 1975.
Desarrollo de anlisis de transferencia para ARN
(Transferencia Northern) y protenas (Transferencia
Western).
Transferencia Southern
Transferencia Southern
 Transferencia Northern
Se utilizan sondas de ARN para identificar
qu bandas del gel contienen secuencias
complementarias a la de la sonda
Se utiliza para identificar y localizar las
secuencias de ARNm
El gel incluye formamida, siendo un
desnaturalizante
Una de las ventajas del anlisis Northern es
que es cuantificable.
La oscuridad de la banda en el gel se
refiere a la cantidad de ARNm presente
Es posible medir los niveles de expresin, y
con escneres densitmetros modernos
 Transferencia Dot
el ARN no es sometido a
electroforesis sino que se sita
directamente sobre la membrana.
No ofrece informacin sobre el
tamao de las bandas del ARN
hibridado
Adems, si dos molculas de
diferentes tamaos son
detectadas, se seguir viendo
como un solo punto.
Por lo tanto el dot blot slo
puede confirmar la presencia o
ausencia de una ARN especifico
que pueden ser detectados por
las sondas de ARN.
 Transferencia Dot
En un experimento particular:
las clulas de levadura fueron cultivadas en
un medio que contena 32P con el fin de
producir radiactivo ARNt (sondas) y fueron
luego asladas.
Colonias de E. coli indica la presencia de un
plsmido hbrido - fueron cultivadas y
transferidas directamente a doce filtros de
nitrocelulosa, cada uno con 95 clones.
En preparacin para el sondeo, se lisaron las
clulas y se desnaturalizo el ADN.
El ADN del plsmido dentro de las clulas de
cada clon fue el hibridado con las sondas
radiactivas tRNA.
En una autorradiografa, los puntos oscuros
(radiactividad) indican clones portadores de
genes de ARNt de levadura
la hibridacin de ADN clonado se da sin una
etapa de separacin.
 Transferencia de Western
Se utiliza para un producto de
protena.
Mediante electroforesis se
separan las diferentes
protenas por su diferente
peso molecular.
Se transfieren a papel de
nitrocelulosa.
el sondeo se realiza con
anticuerpos especficos para
una protena particular, en
lugar de que una sonda de
oligonucletidos radioactiva.
Por ejemplo, al buscar la
expresin de una protena en
particular en los clones.
Los clones seran transferidos a
una membrana de nitrocelulosa
en donde seran lisadas.
un anticuerpo especfico para
la protena particular, es
aplicado a los filtros.
La autorradiografa podra
despus localizar la presencia
de los anticuerpos y por lo
tanto indicar cul de los clones
contiene el gen particular y se
est expresando.