ING BIOTECNOLOGIA

ELECTIVA INGENIERIA GENETICA

PRACTICA N 2
ANLISIS DE ENZIMAS DE RESTRICCIN

Mara Aurora Bareo COD: 1610798 Jonathan Jaimes COD:1610018 Izquel Sanchez COD:
1610871 Michel Arango COD:1610896

Ing. Luciano

RESUMEN
Las tcnicas introducidas en este ejercicio forman la base de tcnicas de tecnologa de ADN
recombinante, toma de huellas dactilares de ADN y anlisis de ADN forense. Este kit introduce a
los estudiantes a algunos principios importantes de la ingeniera gentica. Especficamente, se
destacarn las funciones de las enzimas de restriccin y su uso como herramientas de biologa
molecular. Usando electroforesis en gel de agarosa, se examinarn los patrones de digestin,
analizarn las distancias de migracin y determinarn el tamao de fragmentos de ADN
desconocidos. Las enzimas de restriccin eran un catalizador para la revolucin de la biologa
molecular, y ahora se conocen cientos de tales enzimas. En esta investigacin, las enzimas de
restriccin EcoRI, PstI y HindIII se usarn para digerir el ADN de bacterifago lambda. Se
emplear electroforesis en gel para separar los fragmentos de ADN resultantes.
PALABRAS CLAVES: Enzimas de restriccin, bacterifago Lambda, ADN genmico

INTRODUCCIN una enzima de restriccin har un corte en

Las enzimas de restriccin, tambin
conocidas como endonucleasas de restriccin,
son protenas que cortan el ADN en sitios
especficos. Cada enzima de restriccin
reconoce una secuencia de nucletidos
especfica en el ADN, denominada sitio de
restriccin, y corta la molcula de ADN slo
en esa secuencia especfica. Generan
fragmentos de ADN conocidos como
fragmentos de restriccin. Si un sitio de
restriccin especfico se produce en ms de
una localizacin en una molcula de ADN,
cada uno de esos sitios, dando como resultado
mltiples fragmentos de ADN. Por lo tanto, si
se corta una pieza dada de ADN lineal con
una enzima de restriccin cuya secuencia de
reconocimiento especfica se encuentra en
cinco localizaciones diferentes en la molcula
de ADN, el resultado ser seis fragmentos de
diferentes longitudes.
ADN Lambda, es el ADN genmico de un
virus bacteriano, o bacterifago (fago), que
ataca a las bacterias mediante la insercin de
su cido nucleico en la clula bacteriana de
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acogida. Lambda es un fago que se replica Objetivos

|rpidamente dentro de las clulas husped
Comprender el uso de enzimas de
hasta que las clulas estallan y liberan ms
restriccin como herramientas
fagos para llevar a cabo el mismo proceso de
biotecnolgicas
infeccin en otras clulas husped
bacterianas. Familiarizarse con los principios y tcnicas
de electroforesis en gel de agarosa
Dado que el genoma lambda es de
aproximadamente 48.000 pares de bases, cada Estimar tamaos de fragmentos de ADN a
enzima de restriccin cortar el ADN varias partir de datos de gel de agarosa
veces y generar fragmentos de restriccin de
diferentes tamaos. En esta actividad, se
cortarn tres muestras separadas de ADN
MATERIALES Y METODOS
lambda usando tres enzimas de restriccin
diferentes (EcoRI, HindIII, y PstI), y una PASO 1. Enzimas de restriccin
muestra permanecer sin digerir. Cada
muestra producir fragmentos de ADN cuyos Tu DNA Buffer PstI Eco Hind
tamaos se podrn estimar mediante un gel de bo RI III
agarosa usando electroforesis. Dado que los P 2 l 2.5 l 0.5
tamaos de los fragmentos son conocidos por l
la HindIII lambda digerida, se busca E 2 l 2.5 l 0.5
confirmar el procedimiento que se realiz l
mediante un patrn estndar de ADN o H 2 l 2.5 l 0.5 l
marcador ya analizados en otras L 2 l 3 l
investigaciones (Fig. 1).

PASO 2. Preparacin del gel para la

electroforesis

Buffer TAE 1X 10 ml temperatura

ambiente
Agarosa 1.5% 1.4 gr T. ambiente
Marcador molecular HindIII

Fig 1. Electroforesis del ADN lambda digerido utilizando tres enzimas

de restriccin diferentes. Carril 1, marcadores de ADN (HindIII lambda
digest); Carril 2, ADN lambda sin cortar; Carril 3, DNA lambda
digerido con PstI; Carril 4, ADN lambda digerido con EcoRI; Carril 5,
ADN de lambda digerido con HindIII.
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METODOLOGIA
PASO 1. Introduccin de las enzimas de
restriccin
1. Obtenga tubos de micro-prueba que
contengan cada solucin madre de enzima,
ADN lambda y tampn de restriccin.
Mantenga todas las soluciones madre sobre
hielo.
4. Mezcle los componentes que mueven
suavemente el tubo con el dedo y tocando
suavemente sobre la mesa para recoger el
lquido en el fondo del tubo. Haga girar los
tubos en una centrfuga para recoger todo el
lquido en el fondo, o golpearlos suavemente
en la mesa.
2. Obtener una de cada prueba de color micro
Los tubos y etiqutelos de la siguiente
manera:

5. Colocar los tubos en el estante flotante e

incubar durante 30 minutos a 37 C

6. Despus de la incubacin, coloque las

muestras en el refrigerador hasta el prximo
perodo de laboratorio, o proceda
3. Utiliza una punta limpia para cada muestra, directamente al paso 2.
pipetee los reactivos en cada tubo de acuerdo
con la anterior tabla lo indica:
PASO 2: Preparacin del gel
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1. Retire las muestras de ADN del 4. Coloque cuidadosamente la tapa en la

refrigerador cmara de electroforesis. Conecte los
cables elctricos en la fuente de
alimentacin, de rojo a rojo y de
negro a negro

5. Encienda la fuente de poder y haga

2. Prepare el del de agarosa 0.1 % ,
funcionar el gel a 100 V durante 30
Llenar la electroforesis Y cubrir el
minutos.
gel con 1x TAE Tampn

3. Introduzca 5 l la muestra en cada RESULTADOS

pozo en la cmara en el siguiente
orden:

M, marcador lambda DNA tubo amarillo

P, Pstl Lambda digerido tubo violeta
E, EcoRI lambda digerido tubo verde GRUPO 1 LAB: 1, 2, 3 4.

H, Hindlll lambda digerido tubo naranja GRUPO 2 LAB: 5, 6, 7, 8.


Enzima marcado Pst EcoR Hindll
Muestra r lambda l I l que deban de ser iguales puede que el
DNA
Bandas 1 9 5 7
esperadas
Muestra 1 6 5 7
#1
Muestra 1 9 1 4
#2
DISCUSIN
Comparando los resultados obtenidos
determinamos que en el carril 1 y el carril 5
no tienen enzimas de resticcion solo el
fragmento completo de ADN, lo cual indica
que se visualizo una banda en cada uno de los
carriles mencionados anteriormente.
Se pudo observar que EcoRI logro reonocer
diferentes sitios en el fragmento de ADN,
pero no se pudo comparar respecto al
marcador ya que solo se pudo visualizar 6
bandas en el carril 3 y carril 7, por lo tanto
esta enzima de restriccion es utilizada en
muchos aspectos de investigacion ya que
presenta muchos sitios de reconocimiento
para realizar cortes en la cadena de ADN; en
los carriles 3 y 7 de la electroforesis se aadio
la enzima de restriccin EcoRI en la cual se
observa notoriamente el tamao de las bandas
igual al del marcador molecular presente, este
para el carril 3; pero para el carril 7 se
determina que hay un error de laboratorio, ya
que posiblemente no tena la enzima o tena
muy poco ADN.
Para los ltimos carriles estudiados logramos
ver un error de laboratorio presente en el
carril nmero 8, ya que probablemente no
tena la enzima Hindlll; pero en el carril 5 si
se puede ver el tamao de las bandas muy
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similar a las del marcador, aunque se supona
marcados tenga mucho tiempo y no se
visualice de la mejor manera respecto a los
cortes que realizo la enzima Hindlll.
CONCLUSIN
Se puede determinar que las enzimas de
restriccion pueden estudiar y analizar varios
sitios de reconocimiento y asi realizar el corte
de ellos, sabiendo que las enzimas
implementadas tiene los sitios de
reconocimiento ya reconocidos y
estandarizados. Tambien se puede concluir
que la accion de las enzimas de restriccion
tiene como resultado un tamao de bandas ya
establecidas.
Se puede determinar claramente que las
enzimas de restriccion son cortadas y
reflejadas en el gel con claridad al mismo
tamao del marador molecular, si se sabe lo
que estamos cortando; en estapractica de
laboratorio podemos medir el tamao de las
banda en cada uno de los carriles, ademas que
el error de laboratorio presente se puede
evidenciar por que no se pudo observar las
bandas en los carriles 7 y 8 que esperabamos.
CUESTIONARIO
1. Cmo se fragmenta el ADN en piezas?
El ADN consiste en una serie de molculas
de bases nitrogenadas unidas por enlaces de
hidrgeno dbiles. Estos pares de bases estn
a su vez unidos a un esqueleto de azcar-
fosfato. Las cuatro bases nitrogenadas son
adenina, timina, guanina y citosina (A, T, G y

C). Recuerde que la regla de emparejamiento
de base es A - T y G - C.
En esta representacin del ADN, los
smbolos son los siguientes:
Columna vertebral:
S = molcula de azcar de cinco
carbonos conocida como
desoxirribosa
P = Grupo fosfato
Bases Nitrogenadas: CITOSINA
GUANINA TIMINA ADENINA
Si se diagrama un segmento de ADN
sin los azcares y los fosfatos, una
secuencia de pares de bases
podra aparecer como:
Observe la secuencia lineal de bases
(As, Ts, etc.) sobre cada una de las
hebras.
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Describa cualquier patrn que
pueda ver en la secuencia superior
de las bases.
No hay un tipo especfico de patrn
asociado con la secuencia superior de
bases.
Comparar las bases de la hebra
de ADN superior con las de la
hebra inferior. Describa cualquier
relacin que pueda ver.
A siempre se junta con T; G siempre
se combina con C.
Ahora mire la secuencia superior
de las bases y comprela con la
inferior. Te das cuenta de
cualquier agrupacin de bases que
cuando se lee hacia la derecha en el
filamento superior y se lee a la
izquierda en el filamento inferior
son exactamente los mismos?
CTTAAG.
Una enzima de restriccin corta entre
G y A en la secuencia palindrmica
GAATTC.
Cuntos pares de bases hay a la
izquierda del corte?
4
Cuntos pares de bases hay a la
derecha del corte?

10
Contando el nmero de pares de
bases, el fragmento derecho tiene
el mismo tamao que el fragmento
izquierdo?
No, es ms grande.
Cmo podras describir el
tamao del fragmento en
referencia al nmero de pares de
bases en el fragmento?
El fragmento 1 es un fragmento de 4
bases. El fragmento 2 es un
fragmento de 10 pares de bases.
Si el palndromo GAATTC se
repite cuatro veces en la misma
pieza de ADN lineal, y la enzima de
restriccin que reconoce que la
secuencia base est presente,
cuntos fragmentos de ADN se
producirn?
5 digestin y no se producirn
Si las repeticiones del palndromo
GAATTC estn aleatoriamente
espaciadas a lo largo de la hebra de
ADN, qu puede decir del tamao
de los fragmentos que se
producirn cuando el ADN se
digiere con una enzima de
restriccin que reconozca esa
secuencia?
Se producirn fragmentos de tamao
aleatorio.
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Describir la apariencia del ADN en
solucin.
El ADN es incoloro.
Es visible el ADN?
No. El ADN en solucin no es
visible.
En qu tubo no se esperan
cambios, es decir, no se producen
fragmentos de ADN?
El ADN en el tubo de ADN lambda
no cortado, que no tiene enzima, debe
permanecer intacto como una sola
banda.
Qu falta en ese tubo que te lleva
a esa decisin?
No se aaden enzimas de restriccin
a ese tubo, por lo que no se producir
fragmentos.
Este tubo (L) es el tubo de control.
Comparar el tubo P con el tubo
L; Qu esperas que ocurra en el
tubo P en comparacin con el tubo
L.
El tubo P contiene la enzima de
restriccin PstI. Debe haber una
digestin enzimtica que se produce
en ese tubo, lo que resulta en la
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produccin de fragmentos de produciran, si se corta por esa

restriccin. El tubo L slo contiene enzima?
ADN y ninguna enzima y por lo tanto
no debe producir ningn fragmento 3
de restriccin.

Por qu esperas esta diferencia?

Nmero de cada fragmento.
Las enzimas de restriccin digieren el
ADN en sitios especficos. Si el ADN
lambda contiene sitios de restriccin
para la enzima PstI, entonces el ADN
debe cortarse en fragmentos. Sin
enzimas aadidas, no debe producirse
ninguna digestin. Qu fragmento sera el ms
grande?
Si el ADN en el tubo L se
fragmenta al final de la reaccin, Fragmento 3.
qu puede concluir?
Qu fragmento sera el ms
Lo ms probable es que una enzima pequeo?
de restriccin fue aadida
inadvertidamente al tubo L. Esto Fragmento 2.
podra haber ocurrido aadiendo
accidentalmente una enzima al tubo, Dibuje una molcula de ADN que
o no cambiando las puntas de la tenga cinco sitios de restriccin
pipeta, lo que podra dar lugar a que espaciados aleatoriamente para un
la enzima se transporta entre los palndromo especfico. Cuntos
tubos. fragmentos se produciran si cada
uno de ellos fuera cortado por una
Hay algn cambio visible en el enzima de restriccin?
ADN despus de aadir enzimas de
restriccin? 6.

No. El ADN todava parece incoloro. Etiquetar cada fragmento

Si una molcula de ADN tiene dos

sitios de restriccin, A y B, para
una enzima de restriccin En este diagrama, A y B son
especfica, cuntos fragmentos se secuencias de palindromas diferentes

en una cadena de ADN. Slo est
presente la enzima de restriccin que
reconoce el sitio B.
Explique por qu slo se
produciran dos fragmentos.
La enzima se corta slo en el sitio B,
produciendo dos fragmentos de
ADN.
PASO 2
Un pedazo de ADN se corta en cuatro
fragmentos como se muestra en el
diagrama. Se coloca una solucin de
los cuatro fragmentos en un pocillo
en un gel de agarosa. Utilizando la
informacin dada anteriormente,
dibuja en el diagrama cmo piensas
que los fragmentos podran estar
separados. Etiquete cada fragmento
con su letra correspondiente.
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Haga que su maestro revise su
diagrama antes de continuar.
Dnde se ubicaran los
fragmentos ms grandes, aquellos
con el mayor nmero de pares de
bases; Hacia la parte superior del
gel o la parte inferior? Por qu?
Los grandes fragmentos estaran
hacia la parte superior del gel porque
es ms difcil que las piezas ms
grandes se tensen a travs del gel.
Suponga que tena 500 piezas de
cada uno de los cuatro fragmentos,
cmo aparecera el gel?
An habra solo 4 bandas presentes.
Si fuera posible pesar cada uno de
los fragmentos, cul sera el ms
pesado? Por qu?
El fragmento D sera ms pesado
porque es el fragmento ms grande
de ADN y tendra as la masa ms
grande.
Completar esta regla para el
movimiento de fragmentos de ADN
a travs de un gel de agarosa.
Cuanto mayor es el fragmento de
ADN, ms lentamente migra a travs
de un gel de agarosa.

Cuntos fragmentos fueron
producidos por la enzima de
restriccin HindIII?
8 se conocen el tamao exacto y la
En el diagrama de gel de la derecha,
muestre cmo cree que estos
fragmentos se resolvern durante la
electroforesis.
Etiquetar cada fragmento con su
nmero correcto de pares de bases.
PAS 3
Cuntos fragmentos fueron
producidos por la enzima de
restriccin HindIII?
Se producen ocho fragmentos
En el diagrama de gel, muestre cmo
cree que estos fragmentos se
resolvern durante la electroforesis.
Etiquetar cada fragmento con su
nmero correcto de pares de bases.
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Los datos introducidos para la
digerida lambda HindIII fueron las
posiciones relativas de las bandas de
ADN de tamao conocido. Dado que
posicin de estos fragmentos, pueden
usarse como puntos de referencia
estndar para estimar el tamao de
bandas de fragmentos desconocidas.
Un conjunto de fragmentos de
tamaos conocidos se llama una regla
molecular de peso o normas o
marcador (o, a veces una escalera
debido a la apariencia de las bandas).
Ahora mira el diagrama del gel de
agarosa (abajo). Muestra dos carriles.
Un carril es la columna debajo de un
pozo. El carril derecho contiene un
patrn de bandas a partir de cuatro
fragmentos de longitud conocida
(6.000, 5.000, 3.000 y 1.000 pb).
Qu carril contiene los estndares
de peso molecular? Cmo lo
sabes?
El carril de la derecha porque
contiene los fragmentos de ADN
conocidos.
Etiquete cada banda en el carril
derecho con su tamao de par de
base.
Comparar los dos carriles de bandas.
Estime el tamao de los fragmentos
en el carril izquierdo.
Banda superior: 5000 pb
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Banda inferior: 4000 pb

Cmo determin el tamao de las

dos bandas en el carril izquierdo?

El tamao se estima comparando las

bandas desconocidas con las bandas
del marcador molecular.