PROYECTO-MICRO Avanzado

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Universidad Nacional de Ingeniera
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL
PROYECTO DE INVESTIGACIN
CALIDAD MICROBIOLOGICA DE EXPENDIOS ALIMENTICIOS ALREDEDOR DE

LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Integrantes:
Baca Huamn Brayan

Lpez Escalante Marko
Peafiel de la Cruz Alexis
Ramrez Quispe Flix
DOCENTE: Msc. Alejandro MENDOZA ROJAS
Lima, Per
2017
INDICE
MICROBIOLOGA AMBIENTAL FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

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Contenido
I. INTRODUCCIN.....................................................................................................3
II. RESUMEN............................................................................................................... 4
III. MARCO TEORICO .................................................................................................5
IV. MARCO LEGAL.....................................................................................................17
V. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA....................................................................18
VI. JUSTIFICACIN....................................................................................................18
VII. OBJETIVO............................................................................................................. 19
VIII. METODOLOGIA....................................................................................................19
IX. MATERIALES.........................................................................................................21
X. RESULTADOS.......................................................................................................22
XI. DISCUSIN DE RESULTADOS
XII. CONCLUSIONES
XIII. OBSERVACIONES
XIV. RECOMENDACIONES
XV. BIBLIOGRAFIA
XVI. ANEXO
1. INTRODUCCIN

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Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias
patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos
orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.
2. RESUMEN

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El laboratorio de microbiologa permite seguir con esta idea de conocimiento

prctico. Hace parte esencial tener claro los procesos que se necesitan en este tipo
de prctica que en realidad no son las mismas precauciones que se toman en un
laboratorio de qumica orgnica en este tipo de prcticas es necesario que el
ambiente y los objetos estn esterilizado esto para permitir un ambiente libre de
bacterias o microorganismos puesto que en el desarrollo de las actividades se
basan en inocular organismos especficos, en medio de cultivos ricos en sustancias
nutricionales. Se desarroll la interiorizacin conceptual sobre trminos del entorno
del laboratorio microbiolgica como parte de los objetos a alcanzar en la prctica
como lo fue los principios generales de la preparacin y tcnicas de esterilizacin de
los materiales y tcnicas de cultivo la orientacin fue a partir del conocimiento de los
profesores que nos ilustro acerca del uso de la autoclave, es pertinente para la
esterilizacin de medios de cultivos materiales de vidrio y cultivos bacterianos que
se desechen. Tambin se comprendi el concepto de medio de cultivo este
constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los
microrganismos este permite que la especie que se quiere cultivar crezca
dependiendo de su grupo microbiano su estado fsico su complejidad qumica y su
aplicacin. En nuestra practica se utiliz cinco tipos de medios distintos dado que
los microrganismos tenan distintas procedencias. En la preparacin para esterilizar
de los tubos o placas Petri se hizo en la autoclave envueltos por papel craft. en la
preparacin de los medios de cultivos se procedi en el pesaje y preparacin de los
distintos agares y caldos, luego se ajust para ser colocados en los Erlenmeyer y
tubos para luego ser distribuidos y llevados al autoclave y despus ala refrigeradora
En el procedimiento se llev a cabo la inoculacin de las distintas muestras de los
alimentos obtenidos de los restaurantes de la UNI que se iban a observar y despus
nos pusimos a sembrar las muestras unos en la placa petri y otros en los tubos de
ensayo dependiendo del medio si el slido o liquido luego lo llevamos a encubar y
esperamos cierto tiempo despus se observ las colonias formadas en el medio
slido y la turbidez en el medio lquido y pasamos a colocarlos en los portaobjetos
y le aadimos algunos colorantes qumicos, se hizo unas observaciones en el
microscopio.
3. MARCO TEORICO

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Medio de Cultivo
Un medio de cultivo es una tcnica de laboratorio (vase microbiologa) que consta

de un gel o una solucin que contiene los nutrientes necesarios para permitir, en
condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento
de virus, microorganismos, clulas, tejidos vegetales o incluso pequeas plantas.
Segn lo que se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones.
Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de
ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado slido, semislido o
lquido. El objetivo ltimo del cultivo es variado: antibiograma, identificacin,
multiplicacin.
Clasificacin:
Segn sus cualidades fsicas
Lquidos:
Se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de

clulas estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por
los medios slidos, por ejemplo, en la sntesis de exotoxinas, pigmentos,
enzimas, etc. Ejemplo: Agua peptonada, Caldo comn, Caldo Cerebro
Corazn, Caldo Saboureaud, etc.
Semislidos:
Se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor

porcentaje de agar, por lo que no solidifican totalmente a la temperatura
ambiente. - Ejemplo: Agar MIO, Agar SIM.
Slidos:
Se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formacin de colonias

sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfologa de
las colonias, lo que no permiten los medios lquidos. Se diferencian porque

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tienen una sustancia de sostn, que puede ser agar-agar. - Ejemplo: Agar
Comn, Agar SS, Agar Cerebro Corazn, Agar Saboureaud, etc. Los medios
slidos tienen generalmente agaragar como agente solidificante, espesante
o gelificante. El agar-agar es una sustancia hidroflica de carcter coloidal
procedente de diversas especies de algas marinas, especialmente del
gnero Gelidium, que tiene la propiedad de formar un gel. Qumicamente el
agar-agar es un polisacrido de cadena larga, dependiendo de su tamao el
poder gelificante.
Segn su origen
Naturales:
Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o

vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin
qumica no se conoce exactamente.
Sintticos:
Son los medios que contienen una composicin qumica definida

cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
Semisintticos:
Son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una
forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de
levadura.
Segn su formulacin
Qumicamente definidos:

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Se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el

medio.
Complejos:
Se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre,

etc.); no se conoce exactamente cul es la composicin del medio; sin
embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes todos o casi todos
los elementos que una clula puede requerir.
Segn su uso
Medio general:
Medio en donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto los que

necesitan condiciones especiales (por ejemplo, agar CLED).
Medio selectivo:
Permite seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado

(hongos, bacterias entricas, protozoos...).
Medio diferencial:
Permite identificar una especie con otra, ambas en el mismo medio. Puede
ser por su crecimiento, su metabolismo, su respiracin, etc. (por ejemplo,
medio de mcconkey).
Medio de enriquecimiento:
Contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia

variedad de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos
de microorganismos en un mismo medio.
Medio mnimo:

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Contiene la mnima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento

de una especie.
Medio de transporte:
Preparado para servir como almacenamiento temporal a especmenes

transportados o en transferencia; mantienen su viabilidad y su concentracin
simple.
Algunas condiciones para el cultivo de microorganismos:
Nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de

contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento.
Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de

oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de
variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se
desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En
un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en
condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy
reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz
de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
PH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento

de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios
con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos
cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades

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que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o

incluso alterar sus procesos metablicos normales.
Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo

productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios
en estado semislido o slido.
Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una
fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.
Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar
la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso
impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes
inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios
de cultivo es la autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente
esterilizante)
Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que

en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de
los microorganismos fotosintticos.
Temperatura

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En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de

temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprofitos tienen
rangos ms amplios.
Caldo Lauril Sulfato:
Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los

microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores
lentos.
La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un
sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de
la flora acompaante.
Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se
evidencia al utilizar las campanas Durham.
Caldo Brilla:
Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y

fecales, por la tcnica del nmero ms probable.
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram
negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con
produccin de cido y gas.
Agar EMB:
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento

selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas
exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la
familia Enterobacteriaceae.

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Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine,

para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La
diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y
aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina
y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas
bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter
spp. Presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la
lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que
las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de
Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en
profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans.
Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y
transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas
pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir, aunque las
cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se
debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este
medio se obtiene, adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y
Shigella.
Siembra:
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en

un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
1) Que se efecten aspticamente
2) Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
3) Que se realicen solo los manipuleos indispensables

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4) Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un

mechero o bien Flujo laminar.
Tipos de siembra (placa)
Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y

sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este
mtodo se utiliza para microorganismos aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin.

Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio
necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este
mtodo se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y
microaeroflicos.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo

fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con
ayuda de una esptula de Drigalsky se extiende el inculo hasta su
absorcin total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda
para microorganismos aerobios estrictos.
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo

fundido y se deja solidificar.
Siembra volumtrica: Este mtodo de siembra consiste en sembrar una

muestra liquida cuyo volumen no puede ser predeterminado, en medio de
cultivos slidos o lquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado vaginal
tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que
este tipo de pipeta carece de escala de graduacin, sin embargo, la orina
empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede

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determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente el volumen que ser

sembrado.
Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede

utilizar la esptula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se
esparce con la esptula por toda la superficie del medio de cultivo slido
imprimindo un movimiento en espiral. La siembra masiva tambin se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo lquido, procediendo a
su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.
Tcnicas de cultivo en placa:
- Tcnica de siembra por estra en placa
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello,

con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin
se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri
(a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van
haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie
del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la
regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la
misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso
varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se
incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten
un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada
colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos
asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado
una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un
cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien
aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern,
casi con toda seguridad, cultivos axnicos.

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- Tcnica de extensin en placa:
Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar,

extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se
absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas
tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el
mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que
aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado
por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el
proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que
permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra
por estra, por tanto, se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una
mezcla con varios tipos de microorganismos
Tipos de siembra (Tubo)
- Siembra por dilucin:
Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el caldo simple. Se toma
el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el
material bacteriolgico, se agita, con movimientos moderados.
- Siembra por estras en superficie:
Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de

ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica,
previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo
estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte
ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la parte ms
cerca de la boca del tubo.
- Siembra por puncin:
Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear ser la aguja de platino

y el medio de cultivo slido, generalmente, en tubo de ensayo. Las
manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son

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similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este

mtodo, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente
el medio de cultivo.
Tcnicas de siembra (tubo)
- Siembra por inoculacin o agitacin:
Con un asa bacteriolgica, esterilizada, se toma cantidad de inoculo, se introduce en

el centro del medio lquido, agitndose, no tocando la pared del tubo.
- Siembra por estra (en tubos de agar inclinado):
Muestra de material en asa de siembra, deslizar en zigzag, empezar por superficie

ms profunda. Siembra por picadura:
- Siembra por picadura:
Asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semislido, en el tubo de ensayo

hasta que la muestra quede bien impregnada al agar.
- Siembra por vertido en placa:
Diluciones en varios tubos, pipeta 1cc de muestra o dilucin, agregar tubo de

ensayo estril, se agrega medio licuado, mantener a 55C, movimientos rotatorios,
solidificar.
Bacterias Patgenas
Las bacterias patgenas son las bacterias que atacan al organismo. Se oponen a
las bacterias llamadas saprofitas que estn presentes en los organismos vivos y que
se alimentan de materia orgnica muerta sin que el organismo desarrolle
mecanismos de defensa contra ellas.
Las bacterias patgenas penetran en el organismo y pueden causar problemas ms

o menos severos desarrollndose en detrimento de este organismo. Pueden ser

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eliminadas de forma natural por las clulas inmunitarias que las reconocen como
extraas.
En caso de respuesta insuficiente del organismo o de resistencia de estas bacterias,

el tratamiento con antibiticos es necesario para combatir su proliferacin. Las
personas con el sistema inmunitario debilitado son ms susceptibles a las bacterias
patgenas.
Coliformes
La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas

que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante
como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria principal del grupo,
Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo alemn Theodor von Escherich en
1860. Von Escherich la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", del
griego , kolon, "intestino"). Con posterioridad, la microbiologa sistemtica
nombrara el gnero Escherichia en honor a su descubridor.
Coliformes Totales
Los coliformes totales son las Entero bacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un

grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento
que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Entero bacteriaceae y se
caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y
gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura
de incubacin comprendida entre 30-37C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del

grupo <<coliforme>> forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter,
Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los
animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo,
etc.
Una elevada proporcin de los coliformes que existen en los sistemas de

distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un

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recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es dificil distinguir

entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas
las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se
demuestre lo contrario.
Coliformes Fecales
Los coliformes fecales se definen como el grupo de organismos coliformes que

pueden fermentar la lactosa a 44-45 C. Incluyen bacterias del gnero Escherichia y
tambin especies de Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter. Aunque frecuentemente
su origen es fecal, organismos que dan positivo en este mtodo de prueba pueden
provenir de aguas enriquecidas, efluentes industriales y materia vegetal y suelo en
descomposicin, por lo que el trmino coliformes fecales no es siempre acertado (la
OMS recomienda el trmino coliformes termo resistentes).
Escherichia Coli
Escherichia coli es la especie bacteriana ms comn de la microbiota intestinal; se

presenta como un comensal del intestino humano pocas horas despus del
nacimiento. Es raro encontrar cepas comensales asociadas a enfermedad. Empero,
existen varios patotipos de E. coli implicados en un amplio espectro de
enfermedades agrupados en tres sndromes clnicos. (Iguchi et al., 2009).
Escherichia coli y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del
proceso digestivo, adems de ser responsables de producir vitaminas B y K. El
tamao promedio de los bacilos es de 0.5 de ancho por 3 de largo, cuando se
utiliza la tincin de Gram se tien de rojo (gramnegativas). Algunas especies son
mviles (por flagelos pertricos), no esporuladas, fermenta la glucosa y la lactosa
son catalasa positivos, oxidasa negativos y reduce nitratos a nitritos. El gnero
Escherichia incluye siete especies (E. adecarboxylata, E. alberti, E. blattae, E.
fergusonii, E. hermannii, E. vulneris y E. coli).
4. MARCO LEGAL

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- Decretos Supremo N 037-2008-PCM Establecen Lmites Mximos

Permisibles de Efluentes Lquidos para el Subsector Hidrocarburos.
- Aprueba Lmites Mximos Permisibles para los efluentes de Plantas de

Tratamiento de Aguas Residuales Domsticas o Municipales DECRETO
SUPREMO N 003-2010-MINAM.
- Aprueban los Estndares Nacionales de Calidad Ambiental para Agua

DECRETO SUPREMO N 002-2008-MINAM.
- Modificacin de los Estndares Nacionales de Calidad Ambiental para Agua

y establecen disposiciones complementarias para su aplicacin Decreto
Supremo N 015-2015-MINAM.
- DECRETO N 32327-S (Publicado en La Gaceta No. 84 del 3 de mayo del

2005) EL PRESIDENTE DE LA REPBLICA Y LA MINISTRA DE SALUD.
DECRETAN: Reglamento para la calidad del agua potable.
- Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano DS N 031-

2010-SA. Direccin General de Salud Ambiental Ministerio de Salud Lima
Per 2011.
- PRESIDENCIA DEL CONSEJO DE MINISTROS Aprueban Lmite Mximo

Permisible para el parmetro de "Coliformes Fecales" para efluente de la
Planta de Tratamiento de Aguas Residuales a ser proyectada en la zona
denominada Taboada DECRETD SUPREMO N 042-200B-PCM.
- Decreto Legislativo N 1280 APRUEBA LA LEY MARCO DE LA GESTIN Y

PRESTACIN DE LOS SERVICIOS DE SANEAMIENTO.

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- Aprobacin de la norma sanitaria que establece los criterios

microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas
de consumo humano RESOLUCIN MINISTERIAL N 591-2008/MINSA
- Aprueban Gua Tcnica para el Anlisis Microbiolgico de Superficies en

contacto con Alimentos y Bebidas RESOLUCIN MINISTERIAL N 461-
2007/MINSA
- Aprueban Norma Sanitaria para el Funcionamiento de Restaurantes y

Servicios Afines RESOLUCION MINISTERIAL N 363-2005-MINSA
(19.05.2005).
5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Es aceptable la calidad microbiolgica de los expendios alimenticios alrededor de

la Universidad Nacional de Ingeniera?
6. JUSTIFICACIN
Las ETAS son un importante problema para la salud pblica en el mundo. Se estima
que tan solo en Estados Unidos las ETAS son responsables de aproximadamente
36 millones de casos, 325000 hospitalizaciones y 5000 muertes al ao. En el Per y
en la UNI existen pocos trabajos de investigacin a nivel de restaurantes, por lo que
es importante generar informacin sobre la identificacin de microorganismos
patgenos en alimentos, en bases fundamentales para la prevencin y control de las
enfermedades gastrointestinales.
Este proyecto consiste en tomar muestras de dos restaurantes muy conocidos para
realizar un estudio comparativo y determinar que restaurante es el ms saludable.

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7. OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar la calidad microbiolgica de los expendios alimenticios

alrededor de la UNI.
Objetivos especficos
Determinar la concentracin de coliformes totales que hay en los

alimentos como el arroz, pollo y papas fritas (KFC) y pan, carne y aj
(Tambo).
Comprobar la existencia de Escherichia coli en las muestras de

alimentos del KFC y Tambo.
8. METODOLOGIA
1. Se pes la cantidad necesaria de acuerdo a los diferentes tipos de agar o

medio.
2. Se mezcl la sustancia con 100 ml de agua destilada en una probeta.
3. Se coloc en cada tubo de ensayo, una campana o tubo de ensayo Durham.
4. Se ech en cada tubo de ensayo cada 10 ml de la mezcla.
5. Se coloc tampones de algodn y envolver con papel craft en la cabeza de

los tubos de ensayo, esto para evitar su contaminacin.

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6. Se llev al autoclave y luego a la refrigeradora.
7. Se pas a recoger al da siguiente.
8. Se puso a preparar diferentes muestras de expendios alimenticios.
9. Mediante el uso del asa de colle, se recoga las diferentes muestras de

alimentos y se hizo la siembra por inoculacin. Agregar que siempre se us
el mechero bunsen para mantener la muestra esterilizada.
10. Ya hechos las siembras, se cubri con papel craft y se llev a la incubadora.
11. A los das siguientes, se hicieron las lecturas de cultivo.
12. Se procedi a preparar el Agar EMB.
13. Se pes la cantidad necesaria de acuerdo a los diferentes tipos de agar o

medio.
14. Se mezcl la sustancia con 100 ml de agua destilada en el Erlenmeyer.
15. Se homogeniz la mezcla.
16. Se calent con el mechero bunsen hasta uniformizar la mezcla y esta sea
lquido.
17. Se coloc tampones de algodn y envolver con papel craft en el cabezal del
Erlenmeyer para evitar su contaminacin.
18. Se llev a la refrigeradora.
19. Al siguiente da se procedi a disolverlo.
20. Una vez disuelto se tomaron 9 placas Petri y se verti el Agar EMB en cada
una de ellas.

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21. Se llev a la refrigeradora y se dej por 1 da
22. Usando el asa de colle, se procedi a sacar cada una de las muestras de
alimentos y esparcir en las placas Petri que contenan el Agar EMB
23. Al da siguiente se sembr con el asa de kolle a cada placa Petri y se llev al
bao mara a 44,5C por un da.
Usando el asa de colle, se procedi a sacar cada una de las muestras de alimentos
y esparcir en las placas Petri que contenan el Agar EMB
9. MATERIALES
Materiales para medio de cultivo solido:
- Balanza
- Asa de kolle
- Mechero bunsen
- Placas Petri
- Erlenmeyer
- Agua destilada
- Incubadora
- Autoclave
- Tapones para cubrir la entrada y evitar su contaminacin de la muestra
- El medio de cultivo
- Esptula
- Papel craft
- Refrigeradora
Materiales para medio de cultivo liquido:
- Balanza
- Autoclave
- Asa de kolle
- Mechero bunsen
- Incubadora

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- Tubos de ensayo
- Tapones para cubrir la entrada y evitar su contaminacin de la muestra
- Tubos de ensayo Durham (campanas)
- El medio de cultivo
- Refrigeradora
- Probeta
- Gradilla
- Esptula
10. RESULTADOS
TAMBO (Tpac Amaru)

Coliformes totales
Hamburguesa de carne
FASE PRESUNTIVA (Caldo lauril sulfato)
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3

Positivo Positivo Positivo
FASE CONFIRMATIVA (Caldo Brila)
Dilucin (mL) LECTURA NMP/g

-1
10 10-2 10 -3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100
Pan
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3


10

-1
10 10-2 10 -3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100
Crema de aj
FASE PRESUNTIVA (Caldo lauril)
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3


10-1 10-2 10-3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100
Escherichia Coli
Se not la presencia de colonias en las placas Petri, lo cual indica la presencia de
bacterias, sin embargo, no hubo presencia de Escherichia Coli
KFC (Habich)
Coliformes totales
Pieza de pollo
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3


10

10-1 10-2 10-3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100
Arroz
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3


-1
10 10-2 10 -3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100
Papa frita
Diluciones (mL)
10-1 10-2 10-3


10-1 10-2 10-3
3/3 3/3 3/3 3-3-3 >1100

10
Escherichia Coli
Se comprob la existencia de pequeas colonias de E. coli en las placas Petri de las
diluciones 10-1 arroz y en 10-2 pieza de pollo.
11. DISCUSIN DE RESULTADOS
Dado la fase presuntiva con el caldo lauril sulfato para las diferentes
muestras y sus respectivas diluciones, se corrobora que los tubos de ensayo
son positivos porque presentaron turbidez y presencia de gas en el tubo de
ensayo Durham o campanas.
De acuerdo a la tabla NMP por gramo de muestra e intervalos de confianza
del 95% utilizando 3 tubos con 0.1, 0.01 y 0.001g de muestra, para las
diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3 de las muestras de hamburguesa de carne,
pan, crema de aj para Tambo y las mismas diluciones de las muestras de
pieza de pollo, arroz y papa frita para KFC, encontramos que todos
presentaban triadas de 3-3-3 tubos de ensayo. Comparando con la
respectiva tabla, encontramos que la NMP/G es mayor a 1100.
En las placas Petri se comprob que existen colonias de E. Coli dado que las
colonias resultaron de color verde oscuro metlico. Este color indica que es
positivo, osea, la presencia de E. coli.
12. CONCLUSIONES
Se concluy mediante este proyecto de investigacin que el KFC ubicado en

la avenida habich contiene coliformes totales, los cuales fueron vistos en el
caldo brila y adems escherichia coli observados en el Agar EMB.
Tambin se concluye que la hamburguesa y el aj de tambo de la avenida
Tpac Amaru contiene coliformes totales, sin embargo, no se encontr
fecales (escherichia coli).
La presencia de escherichia coli en las muestras de KFC de la avenida
Habich nos pone en controversia del manejo adecuado que se les da a estos
alimentos (pieza de pollo y arroz)

10
13. OBSERVACIONES
El Agar EMB que se prepar para las muestras de Tambo, se torn de un

color marrn debido a que se guard errneamente en incubadora 35,5C,
cuando debi estar en el bao mara a 44,5C.
Al momento de preparar el Agar EMB no se calcul de manera correcta el
volumen de este, y como resultado no se complet el llenado de las placas
Petri.
Por una equivocacin, al momento de guardar el Caldo Brila con las
muestras ya sembradas, este se puso en la refrigeradora en vez de la
incubadora.
Al momento de sacar las muestras de caldo brila sin sembrar aun;
observamos que 1 tubo estaba roto y adems unos 15 tubos; ms de la
mitad; se encontraban agitados con los algodones empapados Caldo Brila.
Al sacar el caldo lauril sulfato se observ un anillo color verde en la

superficie de la muestra, lo cual nos indicaron que de seguro es por alguna
reaccin
14. RECOMENDACIONES
Usar guantes y paleta al momento de extraer la muestra y colocarla

rpidamente dentro de la bolsa ziploc para as evitar contaminaciones.
Colocarse guantes al momento de diluir el Agar EMB (solido) pues el
mechero podra causar quemaduras.
Introducir lentamente el asa de kolle al extraer la pelcula, para as evitar
choques con las paredes del tubo de ensayo.
Desinfectar con algodn y alcohol el lugar donde se trabajar para quitar
cualquier tipo de contaminacin.
Tener siempre el mechero cerca para esterilizar la muestra.

10
Abrir aproximadamente 15 la tapa de la placa Petri al echar el Agar EMB

debido a que puede ingresar aire, el cual contamine el medio.
Sellar bien las placas Petri antes de colocarlas en el bao mara para as
evitar que se filtre agua en el medio.
15. BIBLIOGRAFA
http://www.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2013/09/ds_003-2010-minam.pdf
http://www.minam.gob.pe/calidadambiental/wp-
content/uploads/sites/22/2013/10/ds_002_2008_eca_agua.pdf
https://www.senasa.gob.pe/senasa/wp-content/uploads/2015/07/CRITERIOS-
MICROBIOLOGICOS-RM-591-2008-MINSA.pdf
http://www.sanipes.gob.pe/normativas/8_RM_461_2007_SUPERFICIES.pdf
https://www.oefa.gob.pe/?wpfb_dl=3665
http://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-site/t-cnicas-y-tipos-de-sembrado
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lauril.htm
http://salud.ccm.net/faq/8871-bacteria-patogena-definicion
http://coli.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/escherichia-coli.html

10
16. ANEXOS
Tubos con caldo lauril sulfato con las muestras de alimentos (pan,
carne, crema de aj) de Tambo, sacados de la incubadora.

10
Tubos con caldo lauril sulfato con las muestras de alimentos

(pieza de pollo, arroz, papa) de KFC, sacados de la incubadora
Al momento de ver las muestras en los tubos nos dimos

cuenta de que sali un anillo de color verde

10
En las lecturas de las muestras nos sali colonias de color

verde brillante lo cual indica la presencia de escherichia coli
en las muestras de KFC(PAPA)
En las lecturas de las muestras nos sali colonias de color

verde brillante lo cual indica la presencia de escherichia coli
en las muestras de KFC(PIEZA DE POLLO)

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Universidad Nacional de Ingeniera

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

CALIDAD MICROBIOLOGICA DE EXPENDIOS ALIMENTICIOS ALREDEDOR DE

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DOCENTE: Msc. Alejandro MENDOZA ROJAS

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2) Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados

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4) Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un

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Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y

Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin.

Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo

Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo

Siembra volumtrica: Este mtodo de siembra consiste en sembrar una