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cidos Nucleicos

ACIDOS NUCLEICOS

ndice:
1. Introduccin.
2. Nucletidos y Nuclesidos.
3. Sntesis de Nucletidos y Nuclesidos.
4. Aplicaciones en Medicina.
5. cidos desoxirribonucleico (DNA).
6. El RNA y la sntesis de protenas.
7. Determinacin de la secuencia de las bases del DNA.
8. Sntesis de laboratorio de los oligonucletidos.
9. Reaccin en cadena de la polimerasa.

1. INTRODUCCIN:
Los cidos nucleicos, cido desoxirribonucleicos (DNA) y cido ribonucleicos
(RNA) son, respectivamente, las molculas que preservan la informacin
hereditaria y que la transcriben y traducen de manera que sea posible la sntesis de
las diversas protenas celulares. En algunas ocasiones, estos polmeros biolgicos
se encuentran asociados con las protenas, en tal caso, se les conoce como
nucleoprotenas.
Gran parte del conocimiento, an incompleto, de la forma en que se preserva la
informacin gentica, como es que pasa a las generaciones sucesivas y la manera
en que se transforma en las partes funcionales de la clula, proviene del estudio de
los cidos nucleicos. Por estas razones, la atencin se concentrar sobre las
estructuras y propiedades de los cidos nucleicos y sus componentes, los
nucletidos y nuclesidos.

2. NUCLETIDOS Y NUCLESIDOS:
La degradacin ligera de los cidos nucleicos genera sus unidades monomricas,
los compuestos llamados nucletidos.
NH 2
7 6
N 5 1
N
8
2
9N 4
N
O 3
5'
HO P O CH 2
O
4'
OH H H 1'

H 3' 2' H
OH OH

Acido Adenlico

La hidrlisis completa de un nucletido da:

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cidos Nucleicos
Una base heterocclica, ya sea una purina o una pirimidina.
Un monosacrido, pentacarbonado, ya sea D-ribosa o 2-desoxi-D-ribosa.
Un in fosfato.
La parte central del nucletido es el monosacrido, y siempre est presente como
un anillo de cinco miembros, es decir, como furansido. La base heterocclica de
un nucletido se une a travs de un enlace N-glucosdico al C1 de la unidad
ribosa o desoxirribosa, y dicho enlace siempre es de tipo . El grupo fosfato de un
nucletido se encuentra como ster de fosfato y puede unirse en las posiciones
C5 o C3 (en los nucletidos, los tomos de carbono de la porcin de
monosacridos se designa con nmeros primos, es decir 1, 2, 3, etc.).
La eliminacin del grupo fosfato de un nucletido lo convierte en un compuesto
conocido como nuclesido. Todos los nuclesidos que se pueden obtener a partir
del DNA contienen 2-desoxi-D-ribosa como su componente azcar y una de
cuatro bases heterocclicas, ya sea adenina, guanina, citosina o timina:
NH 2 O NH 2 O

N H3C
N NH N NH
N

N NH 2 O O
N H N N N
H N H H

Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Timina (T)

Purinas Pirimidinas

Los nucletidos que se obtienen del RNA contienen D-ribosa como su

componente azcar, y como base heterocclica puede ser adenina, guanina,
citosina y uracilo.
O

NH

O
N
H

Uracilo (U)
(una pirimidina)
Las bases heterocclica que se obtienen de los nuclesidos son capaces de existir
en ms de una forma tautomrica. Las formas que se muestran aqu son las que
predominan en las bases cuando se encuentran en los cidos nucleicos.

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cidos Nucleicos
NH 2 O

N N
N NH

N N
N NH 2
N
HO
HO
O
O
H H
H H
H H
H H OH H
OH H
2'desoxiguanosina
2'-desoxiadenosina
NH 2 O

H3C
N NH

N O N O
HO HO

O O
H H H H

H H H H
OH H OH H

2-desoxicitidina 2-desoxitimidina
Los nucletidos que pueden obtenerse del DNA.
Existen varias nomenclaturas para los nucletidos. Por ejemplo, el cido adenlico
se llama a veces cido 5-adenlico, para designar la posicin del grupo fosfato;
tambin se denomina 5-fosfato de adenosina o simplemente monofosfato de
adenosina (AMP). El cido uridlico se llama cido 5-uridlico, 5-fosfato de
uridina o monofosfato de uridina (UMP), y as sucesivamente.
Los nuclesidos y nucletidos se encuentran en lugares distintos adems de
formar la estructura de DNA y el RNA. Por ejemplo, se ha visto que las unidades
de adenosina son parte de las estructuras de dos coenzimas importantes, el NADH
y la coenzima A. El 5-trifosfato de adenosina es, desde luego, la importante
fuente de energa llamada ATP. El compuesto que se denomina cido adenlico 3,
5-cclico (o AMP cclico) es un regulador importante de la actividad hormonal.
Las clulas sintetizan este compuesto a partir del ATP a travs de la accin de una
enzima adenil ciclasa. El cido adenlico 3,5-cclico se prepara en el laboratorio
con dicicloheilcarbodiimida mediante la deshidratacin del cido5-adenlico.

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cido 5'-adenlico
adenil ciclasa

ATP Diciclohexilcarbodiimina

Pirofosfato NH 2

N
N

CH 2 N
O N
O

O P
O OH
O-
cido Adenlico 3'-5'-cclico
Su biosntesis y su sntesis de laboratorio

3. SNTESIS DE NUCLETIDOS Y NUCLESIDOS:

Se han creado una gran variedad de mtodos para la sntesis de nuclesidos. En
una tcnica se aplican las reacciones que integran los nuclesidos de derivados de
ribosa adecuadamente protegidos y activados y bases heterocclicas. La siguiente
sntesis de la adenosina es ejemplo de lo anterior:
NHCOCH 3

CH 2OOCCH 3
O H N
H H N -HgCl2
Cl
+

OCOCH 3 OCOCH 3 N
N

HgCl
NHCOCH 3 NH 2

N N
N N

N N
N N
HO
CH 2OOCCH 3
O OH- O
H H H2O H H

H H
OCOCH 3 OCOCH 3 OH H

ADENOSINA

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cidos Nucleicos
Otra tcnica incluye la formacin de la base heterocclica en un derivado
ribosilamina protegido.
O
CH 2OOCC 6H5
NH 2
O C
H H HC NH (- 2 C2H5OH)
+
CH C O
OCOC 6H5 OCOC 6H5

OC2H5 OC2H5

2,3,5-tri-O-benzoil- -etoxi-N-etoxi-
-D-ribofuranosilamina carbonilacrilamina
O O

NH NH

N O N O

HO HO
OH-
O O
H2O
H H H H

H H H H
OH OH OH OH

URIDINA
Una tercera tcnica incluye la sntesis de un nuclesido con un sustituyente en el
anillo heterocclico que puede reemplazarse con otros grupos. Este mtodo se
emplea de manera extensa para sintetizar nuclesidos poco comunes que no se
encuentran necesariamente en la naturaleza. El siguiente ejemplo utiliza un
derivado de 6-cloropurina que se obtiene del cloruro de ribofuranosilo adecuado y
cloromercuripurina.
NH 2

N
NH3 N

N
N
R
Adenosina
Cl

N S
N
N
H2S NH

CH 2OH N
O N
N
R= N
R

OH OH
N
Ni N

N
N
R

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cidos Nucleicos
Se han empleado numerosas fosforilantes para convertir los nuclesidos en
nucletidos. Uno de los ms tiles es el fosfocloridato de dibencilo.

H2CO O

H2CO Cl

Fosfocloridato de dibencilo
La fosforilacin especfica del 5-OH se logra mediante la proteccin de los
grupos 2 y 3-OH del nuclesido, con un grupo isopropilideno.
O
CH 2OH base
O (C6H5CH2O)2P O CH 2 base
O
O
H H piridina
(C6H5CH2O)2P Cl + H H
H H
O O H H
O O
C
C
H3C CH 3
H3C CH 3
grupo protector
isopropilideno
(1) H3O+ , H2O
(2) H2/Pd

O
HO P O CH 2 base
O
OH H H

H H
OH OH

Nucletido

La hidrlisis ligeramente catalizada por cido elimina el grupo isopropilideno y la

hidrogenlisis rompe los enlaces del fosfato de bencilo.

4. APLICACIONES EN MEDICINA:
Al principio de la dcada de los aos cincuenta, Gertrude Elion y George
Hitchings (de los Wellcome Research Laboratories) descubrieron que la 6-
mercaptopurina posea propiedades antitumorales y antileucmicos. Este
descubrimiento condujo a la generacin de otros derivados de purina y dems
compuestos relacionados, incluidos los nuclesidos, de importancia mdica
considerable. Los siguientes son tres ejemplos:

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cidos Nucleicos
SH OH O

N N
N N
N HN

N N
N H N H2N N
H N

6-mercaptopurina HO
Alopurinol O

Aciclovir
La 6-mercaptopurina se usa en combinacin con otras sustancias
quimioteraputicas para tratar la leucemia aguda en los nios, y se han curado casi
el 80% de los nios tratados. El alopurinol, otro derivado de la purina, es un
tratamiento estndar para aliviar la gota. El aciclovir, un nuclesido que carece de
dos tomos de carbono en su anillo de ribosa, posee gran eficacia en el
tratamiento de enfermedades ocasionadas por ciertos virus del herpes, incluido el
herpes simplex tipo 1 (fuegos por fiebre), tipo 2 (herpes genital) y varicela-
zoster (zona).

5. ACIDOS DESOXIRRIBONUCLEICO:
ESTRUCTURA PRIMARIA: Los nucletidos poseen la misma relacin con
respecto al cido nucleico que los aminocidos respecto a una protena: son sus
unidades monomricas. Los enlaces de conexin en las protenas son los grupos
amida; en los cidos nucleicos son enlaces de ster de fosfato. Los steres de
fosfato unen los 3 OH de una ribosa (o desoxirribosa), con el 5 OH de otra.
Esto hace que el cido nucleico sea una cadena larga y sin ramificaciones con un
esqueleto de unidades de azcar y fosfato con bases heterocclicas que
sobresalen de la cadena a intervalos regulares. La direccin de las bases se
indicara de la manera siguiente:
5' A T G C 3'
Es, como se ve ms adelante, la secuencia de las bases, es decir, su orden a lo
largo de la cadena del DNA, la que contiene la informacin del cdigo gentico, o
clave gentica. La secuencia de las bases se puede determinar mediante tcnicas
basadas en hidrlisis enzimticas selectivas. La secuencia o acomodo de bases
reales se han determinado ya para un gran nmero de cidos nucleicos.

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cidos Nucleicos

ESTRUCTURA SECUNDARIA: Fue la propuesta, ahora comn, de Watson y

Crick (hecha en 1953 y verificada poco despus por el anlisis de rayos X de
Wilkins), la que proporcion un modelo para la estructura secundaria del DNA.
Esta estructura posee importancia especial debido a que permite entender la
manera en que se conserva la informacin gentica, la forma en que se transmite
durante el proceso de la divisin celular, y la forma en que se transcribe para
proporcionar un patrn para la sntesis de protenas.
Para Watson y Crick tuvo importancia primordial la observacin previa (al final
de los 40) de E. Chargaff: era posible encontrar ciertas irregularidades en los
porcentajes de bases heterocclicas que se obtenan del DNA de una gran variedad
de especies. En la siguiente tabla se dan resultados comunes que se esperara
obtener:
TABLA: Composicin del DNA de diferentes especies
PROPORCIN DE LAS BASES (mol%)
G+A A+T
ESPECIES G A C T A/T G/C
C+T G+C
Sarcina lutea 37,1 13,4 37,1 12,4 1,02 0,35 1,08 1,00

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Escherichia coli K12 24,9 26,0 25,2 23,9 1,08 1,00 1,09 0,99
Germen de trigo 22,7 27,3 22,8 27,1 1,00 1,19 1,01 1,00
Timo de bovino 21,5 28,2 22,5 27,8 0,96 1,27 1,01 0,96
Staphylococcus aureus 21,0 30,8 19,0 29,2 1,11 1,50 1,05 1,11
Timo humano 19,9 30,9 19,8 29,4 1,01 1,52 1,05 1,01
Hgado humano 19,5 30,3 19,9 30,3 0,98 1,54 1,00 0,98

Chargaff tambin not que la relacin que varia de una especie a otra es la razn
(%A + %T)/(%G + %C). Adems, seal que aunque esta relacin es
caracterstica para el DNA de una especie dada, es la misma para el DNA que se
obtiene de los diferentes tejidos del mismo animal y no varia en forma apreciable
con la edad o las condiciones de crecimiento de los organismos individuales
dentro de la misma especie.
Watson y Crick tambin contaban con los datos provenientes de los rayos X
acerca de las longitudes y los ngulos de enlace de las purinas y pirimidinas de
compuestos modelo. Adems, contaban con la informacin de Wilkins, que
indicaba una distancia de repeticin notablemente alta, 34, en le DNA natural.
A partir de estos datos, Watson y Crick propusieron un modelo de doble hlice
para la estructura secundaria del DNA. De acuerdo con este modelo, dos cadenas
de cidos nucleicos se mantienen unidas por enlaces de hidrgeno entre los pares
de bases de las bandas opuestas. Esta doble cadena se enrolla para formar una
hlice en la cual ambas bandas comparten el mismo eje. Los pares de bases se
encuentran en el interior de la hlice, y el esqueleto de azcar-fosfato se encuentra
en el exterior. La inclinacin de la hlice es tal, que 10 pares sucesivos de
nucletidos dan lugar a una vuelta completa en 34 (la distancia de repeticin).
La anchura exterior de la espiral se acerca a los 20 y la distancia interna entre las
posiciones 1 de las unidades de ribosa en las cadenas opuestas se aproximan a los
11.

Por medio de modelos moleculares a escala, Watson y Crick pudieron observar

que la distancia interna de la doble hlice es tal que slo permite un tipo un tipo
de enlace de hidrgeno purina-pirimidina entre los pares de bases. Los pares de
bases purina-purina no se presentan porque sera demasiado grande para encajar, y
los pares primidina-pirimidina no existen porque estaran excesivamente
separados para formar enlaces de puente de hidrgeno eficientes.
Watson y Crick dieron un paso muy importante en su proposicin. Bajo la
suposicin de que las bases heterocclicas que contenan oxigeno se encontraban

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cidos Nucleicos
en forma ceto, afirmaron que la formacin de los pares de bases por enlaces de
hidrogeno poda ocurrir nada ms de una manera especifica.

Las longitudes de enlaces de estos pares de bases se muestran a continuacin:

La formacin de pares especficos de bases de esta manera concuerda con el

descubrimiento de Chargaff de que %A/%T 1 y %G/%C 1.
La formacin de pares especficos de bases tambin significa que las dos cadenas
de DNA son complementarias. Siempre que aparece adenina en una cadena, debe
aparecer timina en la opuesta; siempre que hay citosina en una cadena, debe
existir guanina en la otra.

Hay que sealar que, aunque el esqueleto de azcar y fosfato del DNA es por
completo regular, el orden de los pares de bases heterocclicas a lo largo de dicho
esqueleto puede asumir muchas permutaciones diferentes. Esto es importante
debido a que es la secuencia precisa de los pares de bases la que lleva la
informacin gentica. Tambin hay que observar que una cadena de la doble
hlice es el complemento de la otra. Cuando se conoce el orden de las bases a lo
largo de una de las cadenas, es posible escribir la secuencia a lo largo de la otra,
porque la A siempre se empareja con T, y la G siempre se complementa con C.
Esta capacidad de ambas bandas para formar parejas es la que explica la forma en
la que la molcula de DNA forma una rplica de s misma en el momento de la
divisin celular y, por lo tanto, transmite la informacin gentica a cada una de las
dos clulas hijas.
REPRODUCCIN DEL DNA: Justo antes de la divisin celular, la doble banda
del DNA comienza a desenrollarse por uno de sus extremos. Se forman bandas
complementarias a lo largo de cada una de las cadenas que se separaron. Cada una
de estas cadenas acta, de hecho, como un patrn para la formacin de su
complemento. Cuando se complementan el desenrollamiento y la duplicacin, se

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encuentran dos molculas idnticas de DNA donde antes slo exista una. Estas
dos molculas pueden ahora pasarse: una a cada clula hija.

6. EL RNA Y LA SNTESIS DE PROTENAS:

Poco despus de que se publicara la hiptesis de Watson y Crick, los cientficos
comenzaron a ampliarla para dar lugar a lo que Crick llam el dogma central de
la gentica molecular. Este dogma afirma que la informacin gentica fluye de:
DNA RNA protenas.
Desde luego, la sntesis de protenas es de importancia primordial apra la funcin
celular, porque dichas protenas (como enzimas), catalizan sus reacciones. Incluso
las clulas muy primitivas de las bacterias requieren hasta 3000 enzimas
diferentes. Esto significa que las molculas de DNA de estas clulas deben
contener un nmero correspondiente de genes para dirigir la sntesis de estas
protenas. Un gen es aquel segmento de la molcula del DNA que contiene la
informacin necesaria para dirigir la sntesis de una protena (o un polipptido).
El DNA se encuentra principalmente en el ncleo de la celula. La sntesis de
protenas tiene lugar en forma esencial en aquella parte de la celula llamada
citoplasma. La sntesis de protenas requiere que dos procesos principales se
presenten; el primero sucede en el ncleo celular, el segundo en el citoplasma. El
primero es la transcripcin, un proceso en el cual se transcribe el mensaje gentico
a una forma de RNA llamado RNA mensajero (mRNA). En el segundo proceso
participan las otras dos formas de RNA, llamadas RNA ribosomal (rRNA) y RNA
de transferencia (tRNA).
SINTESIS DE RNA MENSAJERO TRANSCRIPCIN: La sntesis de
protenas se inicia en el ncleo celular con la sntesis del RNA mensajero. Una
parte de la doble hlice del DNA se desenrolla lo suficiente para exponer una sola
cadena de una parte correspondiente por lo menos a un gen. Los ribonucletidos,
presentes en el ncleo celular, se acomodan a lo largo de la cadena expuesta del
DNA y forman parejas con las bases del DNA. Los patrones para formar pares
son los mismos que en el DNA, con la excepcin de que en el RNA el uracilo
toma el lugar de la timina. Las unidades de ribonucletidos del mRNA se unen en
cadena mediante una enzima llamada RNA polimerasa.

Una vez que se sintetiza el mRNA en el ncleo celular, ste migra al citoplasma,
donde, como se ve ms adelante, funciona como patrn para la sntesis de
protenas.

RIBOSOMAS-rRNA: Dispersos en el citoplasma de la mayora de las clulas se

encuentran pequeos cuerpos llamados ribosomas. Por ejemplo, los ribosomas de
la Escherichia coli (E. coli) miden aproximadamente 180 de dimetro y estn
compuestos de cerca de un 60% de RNA (RNA ribosomal) y 40% de protenas.
Segn parece, existen como dos subunidades asociadas llamadas subunidades 50S
y subunidades 30S; las cuales, juntas forman un ribosoma 70S. aunque los
ribosomas se encuentran en el sitio e la sntesis de protenas, el rRNA por si solo

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cidos Nucleicos
no dirige dicha sntesis. En lugar de lo anterior, un gran nmero de ribosomas se
une a una cadena de mRNA y constituye lo que se denomina como polisoma. Es a
lo largo de este polisoma (donde el mRNA acta como patrn) que se lleva a cabo
la sntesis de protenas. Una de las funciones del rRNA es unir el ribosoma a la
cadena de mRNA.
S significa unidad de svedberg; la cual se emplea para explicar el comportamiento
de las protenas en una ultracentrfuga.

RNA DE TRANSFERENCIA: El tRNA cuenta con un peso molecular muy bajo

en comparacin con el del mRNA o el rRNA. En consecuencia, el RNA de
transferencia es mucho ms soluble que los otros dos tipos de RNA y, con
frecuencia, se le denomina RNA soluble. La funcin del tRNA es transportar
aminocidos a zonas especficas del mRNA del polisoma. Por tanto, existen por lo
menos 20 formas diferentes de tRNA, uno por cada uno de os 20 aminocidos que
se incorporan a las protenas.
Ya se han determinado las estructuras de la mayora de los tRNA. Se componen
de un nmero pequeo de unidades de nucletido (70 a 90 unidades) dobladas en
varios brazos a travs de la formacin de pares de bases a lo largo de la cadena.
Cada brazo termina siempre con la secuencia citosina-citosina-adenina. En este
brazo es donde se une un aminocido especifico a travs de un enlace ster en el
extremo 3-OH de la adenosina terminal. Esta reaccin de enlace se cataliza con
una enzima que es especfica para el tRNA y el aminocido. Es posible que la
especificidad se derive de la capacidad de la enzima para reconocer secuencias de
bases a lo largo de los otros brazos del tRNA.
En el asa de otro de los brazos se encuentra una secuencia especfica de bases,
llamada anticodn. Este ltimo posee gran importancia porque permite que el
tRNA se una con un sitio especfico (denominado codn) del mRNA. El orden en
el cual el tRNA transfiere los aminocidos correspondientes al filamento de
mRNA se determina por la secuencia de codones. Por tanto, dicha secuencia
constituye un mensaje gentico. Las unidades individuales de este mensaje (las
palabras individuales que corresponde cada una a un aminocido) son tripletes de
nucletidos.
EL CODIGO GENETICO: La correspondencia entre los tripletes de mRNA y los
aminocidos se denomina cdigo gentico o clave gentica. La clave debe estar
formada por tres bases, no una o dos, ya que existen 20 aminocidos diferentes
que se usan en la sntesis de protenas, pero existen nada ms cuatro bases
diferentes en el mRNA. Si nicamente se emplearan dos bases, habra slo 42 16
combinaciones posibles, un nmero demasiado pequeo para incluir todos los
aminocidos posibles. Sin embargo, con una clave de tres bases, son posibles 43,
es decir, 64 secuencias o acomodos distintos. Esto es mucho ms de lo necesario,
y permite que existan formas mltiples de especificar un aminocido. Tambin
permite la existencia de secuencias para la puntuacin de la sntesis de protenas,
es decir, arreglos que indican, de hecho, comenzar aqu y terminar aqu.

Tanto la metionina (met) como la N-formilmetionina (metformyl) poseen el mismo

cdigo mRNA (AUG); no obstante, la N-formilmetionina es transportada por un
tRNA diferente al de la metionina. Segn parece, la N-formilmetionina es el

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cidos Nucleicos
primer aminocido que se incorpora en la cadena de protenas de las bacterias, y el
tRNA que transporta la Metformyl parece ser el signo de puntuacin que dice
comenzar aqu. Antes de que termine la sntesis del polipptido, la N.-
formilmetionina se elimina de la cadena de protena mediante una hidrlisis
enzimtica.

Ahora es posible ver la manera en la cual puede llevarse a cabo la sntesis de un

polipptido hipottico. Imagine un largo filamento de mRNA que se encuentra en
el citoplasma de una clula y que est en contacto con los ribosomas. Tambin en
el citoplasma, se encuentran los 20 aminocidos diferentes, cada uno acilado con
su propio tRNA especfico.
Un tRNA que transporta la Metformyl utiliza su anticodon para asociarse con el
codn apropiado (AUG) en la parte del mRNA que est en contacto con un
ribosoma, el siguiente triplete de bases en esta cadena de mRNA particular es
AAA; ste es el codn que especifica la lisina. Un lisil-tRNA con el anticodon
correspondiente UUU, se une con este sitio. Los dos aminocidos, Metformyl y Lis,
se encuentran ahora en la posicin adecuada para que una enzima las una,
mediante un enlace peptdico. Despus de que esto sucede, el ribosoma se
desplaza sobre la cadena de manera que entra en contacto con el siguiente codn.
Este, GUA, especifica la valina. Un tRNA que lleva a la valina (y con el codn
adecuado), se une en este sitio. Se produce otra reaccin enzimtica que une la
valina a la cadena polipeptdica. A continuacin, el proceso completo se repite
una y otra vez. El ribosoma se desplaza sobre la cadena de mRNA, otros tRNA se
mueven con sus aminocidos, se forman nuevos enlaces peptdicos y crece la
cadena polipeptdica. En un punto determinado, una reaccin enzimtica elimina
la Metformyl del principio de la cadena. Por ltimo, cuando la cadena adquiere la
longitud apropiada, el ribosoma llega a un signo de puntuacin, UAA, que indica
detenerse aqu. El ribosoma se separa de la cadena de mRNA, y lo mismo
sucede con la protena.

Antes de que est completa la cadena polipeptdica, sta comienza a formar sus
estructuras secundarias y terciarias especficas. Esto se debe a que su estructura
primaria es la correcta, sus aminocidos estn ordenados justo de la manera
adecuada. Se forman enlaces de hidrgeno, los cuales dan lugar a los segmentos
especficos de hlice , lmina plegada y anillos o espirales. A continuacin, toda
la estructura se dobla y enrolla; las enzimas generan los enlaces disulfuro y,
cuando la cadena est completa, la protena resultante cuenta con la forma exacta
necesaria para efectuar sus funciones.

Si resulta que esta protena es lisozima, contar con una hendidura profunda o
quijada, donde se ajusta un polisacrido especfico. Y si es lisozima y pasa cerca
una cierta bacteria, esta hendidura comienza a trabajar; y muerde por la mitad a
su primer polisacrido.
Mientras tanto otros ribosomas cercanos al principio de a cadena de mRNA se
encuentran ya en movimiento, al sintetizar cada uno de ellos otra molcula del
polipptido. El tiempo que se requiere para sintetizar una protena depende, desde
luego, del nmero de residuos amino que contiene; aunque existen indicios de que

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cidos Nucleicos
cada ribosoma puede lograr que se formen 150 enlaces peptdicos cada minuto.
Entonces, una protena como la lisozima, que contiene 129 residuos de
aminocidos, requiere menos de 1 minuto para su sntesis. Sin embargo, si existen
cuatro ribosomas en accin sobre una sola cadena de mRNA, el polisoma puede
producir una molcula de lisozima cada 13 segundos.
Pero, cabe preguntar si es necesaria toda esta sntesis de protenas, en especial en
un organismo maduro. La respuesta es que las protenas no son permanentes; no
se sintetizan una sola vez ni permanecen intactas en la clula durante toda la vida
del organismo. Se sintetizan cuando y donde se necesitan. Luego se dividen de
nuevo en aminocidos; hay enzimas que rompen a las enzimas. Algunos
aminocidos se metabolizan para obtener energa; otros (los nuevos) provienen de
los alimentos que se ingieren, y el proceso completo vuelve a iniciarse.

7. DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE LAS BASES DEL DNA:

La estrategia bsica que se emplea para encontrar el orden del DNA se parece a
los mtodos que se utilizan para las protenas. Debido a que las molculas de
DNA son tan grandes, primero es necesario romperlas en fragmentos menores,
ms fciles de manejar. La secuencia de dichos fragmentos se determina en forma
individual, y luego, mediante la identificacin de los puntos de sobreposicin, se
ordenan los fragmentos de manera que revelen el orden de los nucletidos del
cido nucleico original.
La primera parte del proceso se logra por el uso de enzimas denominadas
endonucleasas de restriccin. Estas enzimas rompen el DNA de doble filamento
en puntos especficos. En la actualidad se conocen varios cientos de
endonucleasas de restriccin. Una de ellas, llamada AluI, rompe la secuencia
AGCT entre G y C. otra, denominada EcoRI, rompe GAATTC entre G y A. la
mayora de los sitios que identifican las enzimas de restriccin tienen acomodos
de pares de bases con el mismo orden en ambos filamentos cuando se leen en la
direccin 5 a 3. Por ejemplo:
5 G A A T T C 3
3 C T T A A G 5
Estas secuencias se conocen como palndromos (los palndromos son palabras u
operaciones que se leen igual hacia adelante o hacia atrs. Por ejemplo radar o
Anita lava la tina)
La determinacin del orden de las bases en los fragmentos (llamados fragmentos
de restriccin) se efecta de manera qumica o con ayuda de enzimas. El primer
mtodo qumico fue introducido en 1977 por Allan M. Maxam y Walter Gilbert,
de la Universidad de Harvard; Frederick Sanger introdujo el primer mtodo
enzimtico ese mismo ao.
Gilbert y Sanger compartieron el premio nobel con Paul Berg en 1980 por su
trabajo con los cidos nucleicos. Sanger pionero en la determinacin de los
aminocidos de las protenas, gan antes el nobel, en 1958, por la determinacin
de la estructura de la insulina.
DETERMINACIN POR MEDIO QUMICO: Para determinar la secuencia de
bases en un DNA, el primer paso consiste en marcar el fragmento de restriccin

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cidos Nucleicos
de doble filamento en el extremo 5 con un grupo fosfato que contenga fosfato
radiactivo. Despus de esto, los filamentos se separan y purifican. A continuacin,
el fragmento de un solo filamento marcado se trata con reactivos que atacan bases
especificas y las modifican de manera que permiten romper la cadena en sitios
contiguos a bases especficas. Por ejemplo, si se tiene una cadena como la
siguiente (leda de 5 3, de izquierda a derecha),
32
p GCAATCACGTC
El tratamiento del fragmento con hidracina (NH2NH2) en NaCl 1,5M ataca (en una
forma que no es posible estudiar aqu) los residuos de citocina, de manera que el
tratamiento posterior con piperidina provocar la particin en el lado 5 de los
residuos C. Esto produce el siguiente conjunto de fragmento marcados en 5.
32
p GCAATCACGT
32
p GCAATCA
32
p GCAAT
32
pG
Estos fragmentos se pueden separar a continuacin por medio de una tcnica
llamada electroforesis en gel. Una muestra que contiene una mezcla de los
fragmentos se coloca en un extremo de una banda delgada del gel preparado con
una poliacrilamida [(CH2CHCONH2)n]. El gel est diseado para separar los
fragmentos marcados con radiactividad cuando se aplica una diferencia de
potencial en los extremos del gel. Los fragmentos se mueven a travs de dicho gel
a velocidades diferentes, dependiendo del nmero de grupos fosfato con carga
negativa que contienen y de su tamao. Los fragmentos pequeos se mueven con
mayor rapidez. Despus de la separacin, el gel se coloca en contacto con una
placa fotogrfica. La radiacin proveniente de un fragmento que contiene 5-
fosfato radiactivo genera una mancha oscura sobre la placa en el sitio opuesto en
que se localiza el fragmento en el gel. La placa expuesta se llama autorradiografa,
lo mismo que esta tcnica. Tambin existen fragmentos sin marcar
correspondientes a la parte media de la cadena, pero stos no aparecen en la placa
y por tanto se les ignora.
El DNA cuya secuencia se desea determinar debe romperse en pares especficos
sometiendo las partes separadas a cuatro tratamientos diferentes. Adems de la
particin especifica junto a C, que se menciona antes, existen reactivos que
rompen slo del lado 5 de G, en el lado 5 de A y G y en el lado 5 de C y T.
despus de la particin las partes separadas se someten a la electroforesis
simultnea en cuatro pistas paralelas del gel. Cuando se efecta la
autorradiografa, los resultados, permiten leer la secuencia del DNA directamente
del gel.

8. SNTESIS DE LABORATORIO DE LOS OLIGONUCLETIDOS:

Un gen es una heliografa para una protena, que se encuentra codificada en una
serie particular de pares de bases del DNA. Qu hacen los genes individuales y
cmo lo hacen? Estas son dos de las preguntas que tratan de resolver en la
actualidad los bilogos y bioqumicos. Al hacerlo, utilizan un enfoque nuevo por

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cidos Nucleicos
completo para estudiar la gentica, llamada gentica inversa. La forma tradicional
de estudio de la gentica incluye la alteracin o destruccin al azar de los genes
por la induccin de mutaciones en un organismo, y la observacin posterior de
estos efectos en un progenie. Este mtodo presenta serias desventajas cuando se
estudian los organismos superiores, como los vertebrados. El tiempo de
generacin es inconvenientemente prolongado, el nmero de vstagos es escaso y
las mutaciones ms interesantes por lo general son letales, lo cual dificulta su
propagacin y estudio.
El enfoque de la gentica inversa consiste en comenzar con un gen ya clonado y
manipulado para investigar cmo funciona. Un acercamiento a dicha
manipulacin consiste en sintetizar cadenas o filamentos de DNA
8oligonucletidos de cerca de 15 bases) complementarios para ciertas partes del
gen. Estos oligonucletidos sintticos, llamados nucletidos antisentido, o
contrasentido, son capaces de unirse con lo que se llama la secuencia con sentido
del DNA. Al hacerlo, alteran la actividad del gen, o incluso lo inactivan por
completo. Por ejemplo, si la parte con sentido del DNA en un gen fuera:
AGACCGTGG
El oligonucletido de antisentido sera:
TCTGGCACC
La capacidad para desactivar genes especficos de esta manera significativa una
gran promesa en la medicina. Muchos virus y bacterias, durante sus ciclos vitales,
utilizan un mtodo como ste para regular algunos de sus propios genes. La
esperanza, por tanto, consiste en sintetizar oligonucletidos antisentido que
buscarn y destruirn a los virus en las clulas de una persona al unirse con
secuencias esenciales del DNA o RNA virales. La sntesis de esta clase de
oligonucletidos es un rea activa de investigacin hoy en da, y esta dirigida
contra muchas enfermedades virales, incluso el SIDA.
Los mtodos actuales para la sntesis de oligonucletidos son parecidos a los que
se emplean para sintetizar protenas, incluso el uso de tcnicas automatizadas de
fase solida. Un nucletido protegido de forma adecuada se une a una fase solida
llamada vidrio de poro controlado, por medio de un enlace que puede romperse
en la fase final. Se aade el siguiente nucletido protegido en forma de
fosforamidita, y se genera la unin mediante un agente de copulacin, por lo
general, 1,2,3,4-tetrazol. El trister de fosfito resultante se oxida con yodo a
trister de fosfato, lo cual produce una cadena que aument en un nucletido. El
grupo dimetoxitritilo, que se emplea para proteger el extremo 5 del nucletido
que adicion, se elimina por un tratamiento con cido, y se repiten los pasos de
copulacin, oxidacin y destritilacin. (Todos los pasos se efectan en disolventes
no acuosos). Con los sintetizadores automticos, el proceso puede repetirse por lo
menos 50 veces, y el tiempo requerido para completar un ciclo es de 40 minutos o
menos. Despus de sintetizar el oligonucletido deseado, ste se desprende de su
soporte slido y se eliminan los distintos grupos protectores, incluidos los de las
bases.

9. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA:

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cidos Nucleicos
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo extraordinariamente
simple y efectivo para ampliar las secuencias de DNA. La reaccin en cadena de
la polimerasa puede generar, a partir de una sola molcula de DNA, 100 mil
millones de copias de sta en una sola tarde. La reaccin es fcil de llevar a cabo;
requiere nicamente unos cuantos reactivos, un tubo de ensayo y una fuente de
calor.
El PCR ya ha tenido un efecto importante en la biologa molecular. Se utiliza en
medicina para diagnosticar enfermedades infecciosas y genticas. Uno de los
objetivos originales al crear el PCR fue utilizarla para aumentar la rapidez y
efectividad del diagnstico prenatal de la anemia de las clulas falciformes. Ahora
se le aplica tambin en el diagnstico prenatal de un gran nmero de otras
enfermedades genticas, las cuales incluyen la distrofia muscular y la fibrosis
qustica. Entre las enfermedades infecciosas, se ha empleado el PCR para detectar
al citomegalovirus y a los virus que causan el SIDA, ciertos carcinomas
cervicales, la hepatitis, el sarampin y la enfermedad de Epstein-Barr.
El PCR se ha empleado en las ciencias forenses, en la gentica humana y en la
biologa evolutiva. La muestra de DNA que se copia puede provenir de una gota
de sangre o semen, o de un cabello encontrado en la escena de un crimen. Incluso
puede provenir del cerebro de una momia o de un mamut lanudo de 40 000 aos
de antigedad.
Kary B. Mullis y sus colaboradores crearon y perfeccionaron el PCR en la Cetus
Corporation. Utiliza la enzima DNA polimerasa descubierta en 1955 por Arthur
Kornberg y su grupo en la Universidad de Stanford. En las clulas vivas, las DNA
polimerasas ayudan a reparar y reproducir el DNA. El PCR utiliza una propiedad
especial de las DNA polimerasas: su capacidad para unir nucletidos adicionales
a un oligonucletido corto o ncleo, cuando este ltimo se encuentra unido a un
filamento complementario de DNA denominado patrn. Los nucletidos se unen
en el extremo 3 del ncleo, y el nucletido que la polimerasa une ser el
complementario a la base que se encuentra en la posicin adyacente en el
filamento del patrn. Si el nucletido adyacente del patrn es G, la polimerasa
agrega C al ncleo, si el nucletido adyacente en el patrn es A, entonces la
polimerasa adiciona T, y as sucesivamente. La polimerasa repite este proceso una
y otra vez, mientras los nucletidos requeridos (como trifosfatos) se encuentren
presentes en la solucin, hasta que alcanza el extremo 5 del patrn.
En la siguiente figura se muestra un ciclo de la PCR en la forma que se lleva a
cabo comnmente. No es necesario conocer la secuencia del nucletido del blanco
del PCR. Sin embargo, es necesario conocer el orden de una pequea porcin de
cada lado del blanco en cuestin para poder sintetizar dos oligonucletidos de un
solo filamento (de cerca de 20 nucletidos) que acten como ncleos. Estos
ltimos deben contar las secuencias de nucletidos que son complementarios para
las series laterales de cada filamento de DNA.

Al iniciarse el PCR, el DNA de doble filamento (dplex) se calienta para separar

dichos filamentos. Los ncleos (uno para cada filamento) se adicionan y unen a
sus respectivas series laterales. A continuacin se aaden la DNA polimerasa y
los trifosfatos de nucletidos y la polimerasa hace que cada ncleo se extienda a
lo largo de la secuencia blanco de cada filamento, si la longitud de un ncleo dado
es suficiente, incluir la secuencia complementaria del otro ncleo. En

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cidos Nucleicos
consecuencia, cada nuevo producto de extensin puede, una vez que se separan
los filamentos, servir como patrn para otro ciclo.
Cada ciclo duplica la cantidad de DNA blanco. Esto significa que la cantidad de
DNA aumenta en forma exponencial. Despus de n ciclos, la cantidad de DNA
habr aumentado 2n veces. Despus de 10 ciclos, habr aproximadamente 1000
veces ms DNA; despus de 20 ciclos, cerca de 1 milln de veces ms DNA. La
aplicacin del PCR es muy rpido y en la actualidad se ha automatizado; es
posible llevar a cabo 25 ciclos en 1 hora.

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