UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS FORESTALES

Practica N3

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Curso : BIOTECNOLOGIA FORESTAL

Alumno : LUIS DEL CASTILLO, Jos

Docente : Ing. HEMERYTH BARTRA, Jhinmy

Ciclo acadmico : 2017 - I

Tingo Mara Per

2017
 I. INTRODUCCION

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el

laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido
preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado, (es decir se le aaden
organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan al
crecimiento microbiano

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en

concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el
crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el
Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin,
conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los
resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes
tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en
forma slida. Usualmente para preparar un medio slido, se parte de un medio
lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la
slicagel.

Para asegurar el cultivo puro e necesario tomar una muestra de una

colonia con un alambre esteril y trasladarlo a un tubo de medio estril fresco

Para esta prctica tenemos los siguientes objetivos:

- Practicar los clculos para la preparacin de medio de cultivo

- Conocer las labores rutinarias e identificar los cuidados requeridos para
la preparacin
- Aprender las frmulas para clculos en la preparacin de medios de
cultivo
- Demostrar y practicar ejercicios de conversin de unidades de
concentracin
- Resolver problemas de disoluciones
- Preparacin de soluciones stock y el significado de las soluciones X
- Clculos para hallar la concentracin en trminos de molaridad o
porcentaje
 II. REVISON DE LITERATURA

2.1. Medios de cultivo

(SANTABROSIO, 2009) Un medio de cultivo es un conjunto de

nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las
condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La
diversidad metablica de estos es tan grande que la variedad de medios de
cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para
todos ellos, ni siquiera refirindonos a las bacterias con exclusividad.

2.2. Constituyentes habituales de los medios de cultivo

(SANTABROSIO, 2009) A continuacin, se da una idea general

sobre algunos de los constituyentes habituales de los medios de cultivo

2.2.1. Agar

(SANTABROSIO, 2009) Se utiliza como agente gelificante para dar

solidez a los medios de cultivo. En el agar bacteriolgico el componente
dominante es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas y que
presenta la indudable ventaja de que a excepcin de algunos
microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al
1-2% se licua alrededor de los 100C y se gelifica alrededor de los 40C,
dependiendo de su grado de pureza.

2.2.2. Extractos

(SANTABROSIO, 2009) Su preparacin consiste en que ciertos

rganos o tejidos animales o vegetales (p.e. carne, hgado, cerebro, semillas,
etc.) son extrados con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la
forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo
empleados en la elaboracin de los medios de cultivo. Los ms utilizados son
el extracto de carne, de levadura y el de malta.

2.2.3. Peptonas
 (SANTABROSIO, 2009) Son mezclas complejas de compuestos
orgnicos, nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja casena carne,
etc.). Las peptonas son muy ricas en ppticos y aminocidos, pero pueden
ser deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales.

2.2.4. Sistemas amortiguadores

(SANTABROSIO, 2009) Para mantener el pH dentro del rango

optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario aadir algunos
componentes al medio de cultivo. Debido a que la mayora de as bacterias
son neutrfilas, se suelen emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos
bipotsicos u otras sustancias como las peptonas para prevenir la desviacin
del pH

2.2.5. Indicadores de ph

(SANTABROSIO, 2009) Con el objeto de poder detectar variaciones

en el pH debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a
veces aadir indicadores acido-base que nos lo indiquen
 III. MATERIALES Y MTODOS
3.1. Materiales
- Placa Petri
- Sacarosa
- Pipetas
- Pipet
- Phmetro
- Matraz
3.2. Equipos
- Microondas
- Autoclave

3.3. Metodologa

3.3.1. Preparacin y esterilizacin del material

. Una caracterstica esencial de cultivo de tejidos es la conservacin

del material y medio nutritivo sin contaminacin, principalmente de
microorganismos.

El material de vidrio e instrumental de diseccin se envolvi bien en

papel de envoltura y se esterilizo a 15 libras de presin y 121 c durante 20
minutos

3.3.2. Preparacin del medio de cultivo

Inicialmente se preparan stocks de los componentes principales del

medio de cultivo MS, es decir los stocks de macronutrientes , micronutrientes
y de vitaminas

Se identific los materiales que vamos a utilizar en cada prctica, en

su debido orden correspondiente

3.3.3. Caractersticas evaluadas en la instalacin de segmentos

nadales
 3.3.4. Porcentajes de contaminacin

%contaminacin = # semillas contaminadas x 100 / # total de semillas

Das a la formacin de brotes

Se determina los das transcurridos desde la siembra de los explantes en el

medio de cultivo hasta el inicio de formacin de los brotes. Se calcular el
porcentaje de brotes en base el total de repeticiones en el tratamiento

Das a la formacin de races

Se determinar los das transcurridos desde la siembra en el medio de cultivo

hasta el inicio de formacin de races

Se calcular el porcentaje de formacin de races en base al total de repeticiones

en el tratamiento

3.3.5. Para la preparacin del medio de cultivo se debe seguir el

siguiente orden:
- Elegir los recipientes con los cuales preparar el medio de cultivo
- Realizar los clculos de las disoluciones que se van a realizar a partir de
las soluciones stock
- Agregar un pequeo volumen de agua destilada al frasco
-
 IV. RESULTADOS

4.1. Conocimiento de la cantidad de cada reactivo utilizado

- Macronutrientes 50 ml
- Micronutrientes 5 ml
- Hierro 1ml
- Mioinositol 1ml
- Acido nicotnico 1ml
- Piridoxina HCL 1ml
- Tiamina 1ml
- Glicina 1ml

4.2. Preparacin

Adicionamos 30 gr de sacarosa (concentracin final 3 %)

Adicionar las concentraciones de hormonas : giberilinas o auxinas y citoquininas

de acuerdo a los tratamientos

Terminado enrazamos con agua destilada hasta los 1000 ml

Con el phmetro nos dimos cuenta que legue a 5.8

Calentamos la solucin en el microondas unos 5 minutos

Despus de dispenso 30 ml del medio en frascos de vidrio

Seguidamente pusimos en 34 placas Petri

Lo hemos envuelto con papel todas las placas y luego pasamos a poner todas
las placas al autoclave donde se mantendr por 15 min. A una temperatura de
15 minutos

4.3. Para la solucin stock de macronutrientes (20x ) a pesar

NH4NO3 16500 mg

KNO3 19000 mg

Cacl2 2H2O 440 mg

MgSO4 7H2O 3700 mg

KH2PO4 1700mg

Se disolvi en 500 ml de H2O destilada

4.4. Para la solucin Stock de micronutrientes (100x) pesar

MnSo4 4 H2O 2230mg

ZnSO4 7 H2O 860 mg

H3BO3 620 mg

KL 83 mg

Na2MoO4 2 H2O 25mg

CuSO4 5 H2O 2.5 mg

CoCL2 6 H2O 2.5 mg

Se disolvi en 500 ml de H2O destilada

 V. CONCLUSIONES

De acuerdo a todo el procedimiento realizado se puedo realizar los clculos

para la preparacin de medios de cultivo

Se pudo conocer las labores rutinarias e identificar los cuidados requeridos

para la preparacin

Con la ayuda de algunos ejercicios se pudo prender las frmulas para clculos
en la preparacin de medios de cultivo

Resolvimos problemas de disoluciones con la ayuda de la tabla peridica

CUESTIONARIO

1. Stejido?
- A)-reas del ncleo del laboratorio del cultivo de tejidos

1. . rea de preparacin de medio de cultivo

(CALLES, 2012) Se utiliza principalmente para preparar los medios
de cultivo, pero debe proveer tambin un espacio para almacenar los materiales
de vidrio y de plstico y los reactivos qumicos. Este ambiente debe contar con
mesas de trabajo para la preparacin de los medios y para colocar las balanzas,
el medidor de pH, los platos calientes con agitacin, y otros elementos; tambin
debe incluir vitrinas, estanteras y espacio para el equipo de refrigeracin, y para
la incubadora o la cmara de crecimiento

2. rea de lavado y esterilizacin

 (CALLES, 2012) Puede estar constituida por dos reas conectadas
entre s, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del rea general
de preparacin

3. rea de transferencia

(CALLES, 2012) Esta rea del laboratorio se realiza el trabajo de

excisin, inoculacin, y transferencia de los explantes a los medios de cultivo.
Dado que este trabajo demanda los ms altos niveles de limpieza ambiental, se
recomienda la instalacin de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire
filtrado bajo presin, o la construccin de cuartos de transferencia

4. rea de incubacin

(CALLES, 2012) Se instalan estanteras metlicas o de madera para

colocar los cultivos. Estas estanteras pueden tener dimensiones variables: el
ancho entre 0.3 m 1 m, el largo de acuerdo con el tamao del cuarto, y la altura
total de 1.8 a 2.2 m; la distancia entre peldaos es de 0.2 a .5 m.

5. rea de observacin y examen

(CALLES, 2012) El objetivo de esta rea es realizar observaciones

peridicas de los cultivos, tanto en medios semislidos como en medios lquidos.

2. Cules son los primeros auxilios que se deben tomar en cuenta en el

laboratorio de cultivo de tejidos?
- Botiqun
- Vendas
- Extintores
- Gafas
- Luz de emergencia
3. Cul es la diferencia entre estril y asptico? de cinco ejemplos
donde se aplicaran en un laboratorio de cultivo in vitro

Estril

Eliminacin o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o

sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden
contaminarse nuevamente..(MUOZ, 2006)
Asptico Que est libre de suciedad y grmenes que puedan producir contaminacin
y evitar ingresos de plagas y otros, slo pueden aplicarse externamente sobre seres
vivos ((MEDEROS, et al,2004)

--Aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas para mejoramiento gentico

- semillas sintticas formadas por embriones somticos, obtenidos por cultivo

de clulas, encapsulados en una matriz inerte
-Aplicacin en mejora gentica para obtener hbridos, para introducir material
gentico
-Produccin de hbridos (frutos puros)
-Clonacin de individuos de caractersticas agronmicas muy deseables
durante todo el ao

4. Cul es la diferencia entre esterilizacin, desinfeccin y

desinfestacion?
Esterilizacin
Eliminacin o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o
sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden
contaminarse nuevamente. (MUOZ, 2006)

Desinfeccin

la eliminacin de todos los microbios patgenos que se encuentran (o se

sospecha que podran encontrarse) en un substrato o sobre una superficie.
Existen numerosos agentes desinfectantes, tanto qumicos como fsicos .

Desinfestacion

Cualquier proceso fsico o qumico por medio del cual se destruyan o

eliminen animales pequeos indeseables, especialmente artrpodos o
roedores, que se encuentren en el cuerpo, ropas, o ambiente de una
persona o animal domstico.

5. Qu mtodos de esterilizacin existen? Explicar cada uno

Agentes fsicos: El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos

formas: el calor hmedo el cual destruye a los microorganismos por
desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los
microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. (GAMBOA,
2008)

El calor es considerado como el mtodo de esterilizacin por excelencia siempre

y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo
de dao.. .(GAMBOA, 2008)

Agentes mecnicos: La filtracin permite la remocin de todos los

microorganismos presentes en un lquido o un gas retenindolos sobre la
superficie de un material. (GAMBOA, 2008)

Agentes qumicos: Algunas sustancias qumicas pueden ser usadas como

agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o ms
reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los
microorganismos (protenas, membranas, etc.) .(GAMBOA, 2008)

6. Explique las ventajas y desventajas de la esterilizacin por calor

hmedo

Ventajas

-No deja residuos

las autoclaves modernas son sencillos de manejar y es un mtodo rpido de

esterilizacin.

ste es el mtodo de eleccin para esterilizar materiales termoestables y no

sensibles a la humedad como medios de cultivo, cultivos de microorganismos
para descartar, lencera, uniformes, instrumentos quirrgicos, etc

Desventajas

estn que no permite la esterilizacin de materiales sensibles al calor y

materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas.
7. Qu son las sustancias termolbiles? De algunos ejemplos

sustancia que se descompone o se desnaturaliza por el calor, perdiendo,

generalmente, su actividad.
Alaxina
Enzimas
Insulinas
 VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

SANTABROSIO, 2009, reas de laboratorio de cultivo de tejidos en el instituto

tecnolgico de CD. Altamirano

GAMBOA, 2008, Mtodos de esterilizacin, laboratorio de microbiologa

MEDEROS, et al, 2004), Biotecnologa vegetal, obtencin de plantas in vitro,

Universidad de Laguna, Tenerife, Islas Canarias, Espaa

Muoz de Malajovich, M. A. ,2006. Biotecnologa. Editorial Universidad Nacional

de Quilmes Barcel et al. 1980, Fisiologa vegetal. Editorial Pirmide

Unidad de investigacin en biotecnologa (UIB), Centro internacional de

agricultura tropical (CIAT), 2001, Establecimiento de un laboratorio para cultivo
de vegetales
 ANEXOS

Materiales estriles
Lugar de materiales de vidrio
 Cmara de incubamiento

Explicacin en la sala de cultivo in vitro